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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen
Polymerpartikeln und die daraus erhältlichen Partikel, besonders
für die
Verwendung als Trennmedien, insbesondere für das Trennen einer Zielsubstanz
von einer Probe, wie zum Beispiel einer biologischen Probe.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Verschiedene
Arten von Trennmedien sind für
die Verwendung zum Isolieren von Zielsubstanzen in chemischen oder
biologischen Proben erhältlich.
In der molekularen Biologie werden verschiedene Materialien in Fraktionierungsverfahren
verwendet, einschließlich
Agarose und Polyacrylamid in der elektrophoretischen Fraktionierung,
und Gelpermeation, Ionenaustausch und Affinititätsmaterialien für die Chromatographie.
Unter solchen Materialien finden sowohl organische Polymere als
auch auf Silizium basierende Partikel Verwendung bei den Trennungen
von Zielsubstanzen, wie zum Beispiel Nukleinsäuren. Bei jeder Art von Trennung
gibt es ab einem gewissen Punkt eine Notwendigkeit physikalisch
eine flüssige
Phase von den Partikeln in der festen Phase zu entfernen. Dies kann
durch das Immobilisieren von den Partikeln, zum Beispiel in der
Form einer Säule
oder auf einer Gelplatte, und dem Eluieren der flüssigen Phase
oder durch das Aggregieren der Partikel durch das Anwenden von Zentrifugationskräften oder
unter Verwendung von Magnetismus erreicht werden. Die Verwendung
von Magnetismus, um Partikel von anderen Komponenten der Probe zu trennen,
erfordert, dass die Partikel auf ein magnetisches Feld ansprechen.
Da organische oder auf Silizium basierende Materialien selbst nicht
auf Magnetismus ansprechend sind, gibt es einen Bedarf, um Verfahren
zur Herstellung von magnetischen Partikeln, die sowohl eine magnetische
Komponente als auch eine Polymerkomponente vereinigen, bereitzustellen.
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US 5945525 beschreibt ein
Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von magnetischen
Partikeln, die mit Silika beschichtet sind. Beschichtete Partikel
werden durch die Ablagerung von Silika aus einer Teteraethoxysilan/Alkohol-Lösung auf
die Oberfläche
von Fe(III)-tetraoxid-Partikel, die einen Durchmesser von 200 bis
400 nm aufweisen, gebildet. Magnetische Partikel umfassend einen
von Silika umschlossenen magnetischen Kern werden durch eine Reaktion
zwischen den beschichteten Partikeln und Natriumsilikat gebildet.
US 5352481 beschreibt ein
Verfahren zur Bildung von Partikeln mit einer gleichmäßigen Größenverteilung mittels
dem sogenannten Sol-Gel-Verfahren.
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Pulverisierte
Kernpartikel aus Titandioxid werden mit einem Silikagel beschichtet,
indem es einer alkoholischen Lösung
aus Siliziumtetraethoxid erlaubt wird, hydrolisiert zu werden, so
dass ein Sol-Gel aus Silika als eine Beschichtung gebildet wird.
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Ein
Problem bei diesen Verfahren ist, wenn sie verwendet werden, um
magnetische Polymerpartikel herzustellen, dass sie mehrere Schritte
umfassende Verfahren darstellen, bei denen es sehr schwierig ist,
die Menge an magnetischer Komponente und seine Verteilung in den
Partikeln zu kontrollieren. Im Allgemeinen weisen solche Partikel
eine nichtgleichmäßige Verteilung
der magnetischen Komponente auf, da sich die magnetische Komponente
nur im Kern des Partikels befindet. Dies beeinflusst nachteilig
die Wirksamkeit der Partikel bei den Trennungsverfahren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Nachteile des Standes
der Technik zu überwinden.
In einem ersten Aspekt stellt entsprechenderweise die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel
zur Verfügung
umfassend:
- (a) Bereitstellung einer wäßrigen Phase
enthaltend darin homogen dispergierte magnetische Komponenten;
- (b) Wobei die wäßrige Phase
entweder in Kontakt gebracht wird mit einem polymerisierbaren Metall enthaltenden
oder organischem Monomer, das in der wäßrigen Phase löslich ist,
oder dieses Monomer enthält
und
- (c) Polymerisieren des Monomers in der Gegenwart der magnetischen
Komponenten, um so magnetische Polymerteilchen, in denen die magnetische
Komponenten im Wesentlichen gleichmäßig verteilt sind, zu bilden;
wobei
zumindest ein Teil des Polymerisierungsschrittes (c) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion durchgeführt wird,
in der die wäßrige Phase,
enthaltend die darin homogen dispergierten magnetischen Komponenten,
als eine diskontinuierliche Phase in einer kontinuierlichen Öl-Phase
vorhanden ist.
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Es
ist überraschenderweise
festgestellt worden, dass, falls zumindest ein Teil der Bildung
der Polymermatrix der magnetischen Polymerpartikel in einer in Wasser-in-Öl-Emulsion
stattfindet, die Kontrolle über
die Verteilung der magnetischen Komponenten in den Partikeln erlangt
werden kann. Es ist festgestellt worden, dass eine im Wesentlichen
gleichmäßige Verteilung
der magnetischen Komponente innerhalb des Partikels an den Stellen
erfolgt, an denen die magnetische Komponente während der Polymerisation ausreichend
homogen in der wäßrigen Phase
dispergiert ist.
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Es
ist möglich,
die Polymerisation in der wäßrigen Phase
zu starten, und anschließend
eine Öl-Phase
dazuzugeben, um die Emulsion während der
Polymerisation herzustellen. Es wird jedoch bevorzugt, dass die
wäßrige Phase
als Teil der Wasser-in-Öl-Emulsion
zur Verfügung
gestellt wird, so dass das Monomer beim Start des Polymerisationsverfahrens
direkt mit der Emulsion in Kontakt gebracht werden kann. Zusätzlich kann
durch das Ändern
der dazugegebenen Menge an Monomer, die Quellfähigkeit des sich bildenden
Polymerpartikels, fein eingestellt und kontrolliert werden. Wasser
agiert als ein Porogen, und so kann durch das Vergrößern der
Menge an Wasser die Porosität
des Polymerpartikels vergrößert werden.
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In
einem Aspekt wird das Monomer mit der wäßrigen Phase in situ in Kontakt
gebracht. Dies kann unter Verwendung einer Precursor-Verbindung erreicht
werden, die in situ in das Monomer umgewandelt wird. Vorteilhafterweise
wird die Emulsion mit einer Öl-löslichen
Silizium enthaltenden oder organischen Precursor-Verbindung unter
Bedingungen gemischt, unter denen die Precursor-Verbindung in das
Monomer umgewandelt wird. Vorzugsweise wird die Precursor-Verbindung
durch Hydrolyse in ein Monomer umgewandelt. Entsprechend dieser
Ausführungsform
umfasst die Precursor-Verbindung funktionelle Gruppen oder Substituenten,
die hydrolysierbar sind, um das Monomer zu bilden. Die Precursor-Verbindung kann ein
Metallalkoxid umfassen, bei der das Metall vorzugsweise aus Silizium,
Bismut, Bor, Titan, Tantal, Zirkon oder Aluminium ausgewählt wird.
Silizium ist das bevorzugte Metall. Das Alkoxid kann eine Di-, Tri-
oder Tetraalkoxyverbindung, vorzugsweise ein Siloxan, sein. Typische
Alkoxide stellen C1-C5 Alkoxide
dar, von denen Methoxid und Ethoxid bevorzugt werden, insbesondere
Methoxid.
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In
den Fällen,
in denen die Precursor-Verbindung durch Hydrolyse in das Monomer
umgewandelt wird, kann ein pH-Wert in einem Bereich von 1 bis 14, typischerweise
von 1,5 bis 12, vorzugsweise von 1,5 bis 11, verwendet werden. Es
wird bevorzugt, dass die wäßrige Phase
sauer oder alkalisch ist, um so die Hydrolyse zu erleichtern. Geeignete
pH-Werte liegen in einem Bereich von 1 bis 5 und von 8 bis 14. Ein saurer
pH-Wert wird bevorzugt, besonders in einem Bereich von 1 bis 2.
Es ist ebenfalls möglich,
einen Katalysator in die wäßrige Phase
für das
Erleichtern der Hydrolyse einzufügen,
wie zum Beispiel eine organische oder anorganische Säure oder
ein Amin. Ein Reagens für
das Unterstützen
der Kondensation oder der Polymerisation kann ebenfalls eingefügt werden.
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Es
wird, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, als möglich angenommen,
dass die Umwandlung der Precursor-Verbindung in das Monomer entweder
innerhalb der wäßrigen Phase
oder an der Grenzfläche
zwischen der wäßrigen Phase
und der kontinuierlichen Öl-Phase stattfindet.
Es wird angenommen, dass diese in situ Herstellung des reaktiven Monomeren
es der Polymerbildung ermöglicht,
in dem innigen Gemisch mit der magnetischen Komponente vorzukommen,
um so die gleichmäßige Verteilung
der magnetischen Komponente in dem so gebildeten Polymerpartikel
zu erleichtern.
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Die
Verteilung der magnetischen Komponente in den Polymerpartikeln kann
durch jedes dem Fachmann auf diesem Gebiet bekanntes Verfahren ausgewertet
werden.
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In
einem weiteren Aspekt wird die wäßrige Phase
mit einem polymerisierbaren Metall enthaltenden oder organischem
Monomer, das darin aufgelöst ist,
zur Verfügung
gestellt, und die wäßrige Phase enthält darin
homogen dispergierte magnetische Komponenten. Die wäßrige Phase
kann zur Verfügung
gestellt werden, indem zuerst das Monomer aufgelöst wird, und dann die magnetische
Komponente dazugegeben wird oder indem zuerst die magnetische Komponente
dazugegeben wird, und dann das Monomer aufgelöst wird. An einem geeigneten Punkt,
in der Regel nach der Bildung der wäßrigen Phase, wird eine Ölphase,
und wahlweise ein Stabilisator, wie zum Beispiel ein Detergens,
zusammen gemischt, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden. Dann
wird das Monomer in der Gegenwart der magnetischen Komponenten polymerisiert,
typischerweise durch das Anpassen der Bedingungen, an die Bedingungen,
unter denen die Polymerisation gestartet wird. Die Polymerisation
kann durch das Dazugeben der Komponenten, wie zum Beispiel sauren
oder basischen Komponenten oder einem Katalysator, durch die kontinuierliche
Phase hindurch gestartet werden.
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Die
wäßrige Phase
der Emulsion umfasst vorzugsweise Wassertropfen. Die Größe der Wassertropfen
kann während
der Emulsionsbildung leicht kontrolliert werden, zum Beispiel durch
die Geschwindigkeit und Kraft des Mischens der Öl-Phase mit der wäßrigen Phase,
durch die Viskosität
der kontinuierlichen/diskontinuierlichen Phase, durch die Art und
Menge des Stabilisators und durch die Temperatur. Das Mischen der
Wassertropfen mit der Öl-Phase kann
durch jedes geeignete Verfahren bewerkstelligt werden, einschließlich der
Homogenisierung, der Ultraschallbe-handlung und der Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmischern.
Es ist durch das Kontrollieren der Größe der Wassertropfen unter
Verwendung der Mischbedingungen möglich, die Größe des magnetischen
Polymerpartikelprodukts, das durch das Verfahren gebildet wird,
zu kontrollieren. Je größer die
Wassertropfen-größe, umso
größer ist das
Partikelprodukt. Entsprechend der Erfindung sind die Partikel typischerweise
im Wesentlichen sphärisch.
Im Allgemeinen weisen sie einen Durchmesser in einem Bereich von
0,1 bis 100 µm,
vorzugsweise in einem Bereich von 0,5 bis 50 µm, und am bevorzugtesten in
einem Bereich von 1 bis 10 µm, auf.
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Es
ist ebenfalls festgestellt worden, dass durch das Kontrollieren
der Größe der Wassertropfen auf
diese Art und Weise eine relativ enge Verteilung der Partikelgröße erhalten
werden kann. Vorzugsweise werden Verteilungen der Partikelgröße mit einem CD
von weniger als 30 % erhalten, wie mittels Lichtstreuung unter Verwendung
von zum Beispiel einem Coulter-Zähler (LS
230) gemessen.
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Die
Kontrolle der Partikelgröße und die
Enge der Verteilung der Partikelgröße stellen wichtige Aspekte
der vorliegenden Erfindung dar. Es ist schwierig, unter Verwendung
der Verfahren des Standes der Technik eine enge Verteilung der Partikelgröße zu erreichen.
Außerdem
können
Silikapartikel, die entsprechend dem Stand der Technik aus Magnetitkörnern gemacht
wurden, keine Größe aufweisen,
die kleiner ist als die Größe der ursprünglichen
Körner.
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Die
magnetische Komponente der vorliegenden Erfindung ist ein Material,
das in der Lage ist, in der Gegenwart eines magnetischen Feldes
magnetisiert zu werden, aber die Komponente ist in der Abwesenheit
von solch einem Feld bei der Einsatztemperatur der magnetischen
Polymerpartikel selber nicht magnetisch. Die magnetischen Komponenten sollten
deshalb keine verbleibende Magnetisierung oder Remanenz besitzen,
nachdem sie dem magnetischen Feld ausgesetzt wurden. Solche Materialien schließen paramagnetische
und superparamagnetische Materialien ein. Sie schließen ebenfalls
ferromagnetische und ferrimagnetische Materialien ein, vorausgesetzt,
dass sie eine ausreichend niedrige Curie Temperatur aufweisen, so
dass beim Einsatz, die magnetischen Polymerpartikel in der Abwesenheit
eines angelegten magnetischen Feldes nicht magnetisch sind. Typische
Materialien umfassen magnetische Metalloxide, vorzugsweise ein Eisenoxid, wie
zum Beispiel Fe(III)-tetraoxid oder Eisensesquioxid. Nützliche
magnetische Metalloxide umfassen Eisenoxide, in denen wahlweise
das ganze oder ein Teil des Eisen(II) durch ein zweiwertiges Übergangsmetall,
wie zum Beispiel Cadmium, Chrom, Kobalt, Kupfer, Magnesium, Mangan,
Nickel, Vanadium und/oder Zink ersetzt ist.
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Ganz
gleich, welche magnetische Komponente verwendet wird, sie muss in
der wäßrigen Phase
dispergiert sein.
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Die
homogene Dispersion kann visuell durch Lichtmikroskopie oder durch
UV-Absorptionsspektroskopie an kleinen Proben bewertet werden, um
die Veränderung
an dem Gehalt der magnetischen Komponente zu quantifizieren. Die
homogene Dispersion wird am besten mit magnetischen Komponenten
erreicht, deren Größe im Vergleich
mit der typischen Tropfengröße für Wasser
klein ist. Ein vorteilhafter Größenbereich
für die
magnetische Komponente beträgt
nicht mehr als 100 nm, vorzugsweise nicht mehr als 50 nm, bevorzugter
nicht mehr als 25 nm, und liegt am bevorzugtesten in einem Bereich
von 1 bis 15 nm. Im Allgemeinen sind die magnetischen Komponentenpartikel
mit einer Größe von 200
nm oder größer so groß, dass
sie nicht in der wäßrigen Phase der
Wasser-in-Öl-Emulsionen,
die typischerweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
homogen dispergiert werden können.
Größere ferromagnetische
Partikel können
ebenfalls eine Remanenz aufweisen.
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Es
wird bevorzugt, dass die magnetische Komponente als eine magnetische
Flüssigkeit
geliefert wird, am bevorzugtesten als ein Ferrofluid. Ferrofluide
weisen typischerweise eine durchschnittliche Partikelgröße von ungefähr 8,5 nm
auf.
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Makroskopisch
betrachtet, all die Wassertropfen der Emulsion der Erfindung beachtend,
sind diese sehr klein und können
durch das Mischen mit Geschwindigkeit in einem Bereich von 0,1 bis
100 µm,
vorzugsweise von 0,1 bis 10 µm,
fein eingestellt werden. Diese kleinen Wassertropfen mit kleinen
magnetischen Partikeln (wie zum Beispiel Ferrofluide) in einem Bereich
von 1 bis 15 nm werden letztendlich immer eine homogene und kontrollierte
Konzentration an magnetischen Partikeln in im Wesentlichen allen
Wassertropfen der gesamten Emulsion aufweisen. Es wird im Gegensatz
dazu bei magnetischen Partikeln mit einer Größe von 200 – 400 nm in der gleichen Wasser-in-Öl-Emulsion
keine Kontrolle über die
gesamte Anzahl an magnetischen Partikeln in jedem Wassertropfen
der Emulsion geben, da die Größe der magnetischen
Partikel im Vergleich zu der des Wassertropfens groß ist. Makroskopisch
betrachtet, wird es eine nicht-homogene Verteilung der magnetischen
Partikel geben, da offensichtlich jeder dieser Wassertropfen nicht
eine einheitliche Konzentration an magnetischen Partikeln enthalten
wird.
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Entsprechend
der vorliegenden Erfindung ist in dem Falle eines 1,0 µm großen Wassertropfens
die Größe der magnetischen
Partikel in diesem Tropfen klein im Vergleich mit dem Tropfenvolumen,
wodurch eine statistisch einheitliche Konzentration an magnetischen
Partikeln in allen Tropfen der gleichen Größe zugelassen wird. Entsprechend
dem Stand der Technik von
US
5945525 beträgt
die Größe des magnetischen
Partikels tatsächlich
nicht mehr als 1/5 der Tropfengröße. Für diesen
Fall wird man in einigen Tropfen x magnetische Partikel finden,
in einigen Tropfen wird man 2x magnetische Tropfen finden und in
einigen Tropfen wird man keine magnetischen Partikel finden; es
wird deshalb kein statistisch einheitliches Konzentrationsverhältnis an
magnetischen Partikeln in allen Wassertropfen geben.
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Deshalb
ist ein kleines magnetisches Partikel (Ferrofluid) für das Kontrollieren
der magnetischen Ladung (Menge an Ferrofluid) in den endgültigen Polymerpartikeln
vorteilhaft. Mikroskopisch betrachtet, sich nur auf einen Wassertropfen
konzentrierend, werden die magnetischen Partikel (z.B. 10 nm) entsprechend
der vorliegenden Erfindung homogen in dem Wassertropfen (z.B. 0,5 µm) mit
einem Verhältnis
von 1/50 (10 nm magnetische Partikel/0,5 µm Wassertropfen) dispergiert
sein. Im Gegensatz dazu beträgt
in
US 5,945,525 das
Verhältnis
ungefähr ½ (0,2 µm magnetische
Partikel/0,5 µm
Wassertropfen). So werden die magnetischen Partikel viel weniger
homogen in dem Wassertropfen dispergiert sein, und der Effekt wird
bei abnehmender Größe der Wassertropfen
ausgeprägter
sein, und in der Tat für sehr
kleine Tropfen (0,1 bis 0,2 µm)
unmöglich.
In einem relativ großen
Abschnitt des Tropfens wird man einen magnetischen Partikel vorfinden,
und in einem anderen Abschnitt des gleichen Tropfens wird es keine
Partikel geben. Deshalb wird der endgültige Partikel keine gleichmäßige Verteilung
an Eisen aufweisen. Im Gegensatz dazu werden entsprechend der vorliegenden
Erfindung sogar kleine Abschnitte des Tropfens magnetische Partikel
enthalten, und der endgültige
Partikel wird dann eine gleichmäßige Verteilung
an Eisen in der gesamten Polymermatrix aufweisen.
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Durch
das Erhöhen
der Konzentration an magnetischen Komponenten in der wäßrigen Phase kann
die Konzentration an magnetischer Komponente in dem Polymerpartikelprodukt
kontrolliert werden. Dies ist dadurch vorteilhaft, dass einige Anwendungen
dieser Partikel erfordern können,
dass sie stärker auf
ein angelegtes magnetisches Feld ansprechen als andere Partikel.
In einigen Fällen
ist eine langsame Absetzzeit für
in Lösung
befindliche Partikel erforderlich. In Überein-stimmung mit der vorliegenden Erfindung
ist dies leicht erreichbar und dies stellt einen weiteren Vorteil über den
Stand der Technik dar, bei welchem größere Metallkorngrößen in schweren Partikeln
resultieren.
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Von
den durch das vorliegende Verfahren erhältlichen magnetischen Polymerpartikeln,
in denen die magnetische Komponente im Wesentlichen gleichmäßig verteilt
ist, wird angenommen, dass sie gegenüber jenen magnetischen Polymerpartikeln, die
gegenwärtig
erhältlich
sind, überlegen
sind. Es ist unter Verwendung der Lichtmikroskopie festgestellt worden,
dass magnetische Polymerpartikel, die momentan erhältlich sind,
Magnetit oder andere Metalloxide nur in einer aggregierten nicht-homogenen Form
als sichtbare Metallkerne, die mit Schichten von Silika beschichtet
sind, einbauen. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung
eine magnetische Komponente zur Verfügung, die über die gesamte Partikelmatrix
hinweg homogen und gleichmäßig verteilt
ist. Dies weist einen wichtigen Vorteil gegenüber den magnetischen Partikeln
des Standes der Technik auf, indem eine einheitliche und potentiell schnelle
Reaktion auf ein magnetisches Feld, sobald es verwendet wird, zur
Verfügung
gestellt wird. Dies macht die Aggregation der Partikel auf die Oberfläche mit
einer einheitlichen Geschwindigkeit durch das Anlegen eines magnetischen
Feldes möglich, was
eine wesentliche Eigenschaft darstellt, wenn solche Partikel, zum
Beispiel in einem automatisierten Trennungssystem, verwendet werden.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER
ERFINDUNG
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Nur
beispielsweise wird nun die Erfindung genauer unter Bezugnahme auf
die folgenden Beispiele beschrieben werden.
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Beispiele
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1. Partikelbildung bei
einem niedrigen pH-Wert:
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- a) Ein saures wäßriges Ferrofluid (5,0 g, pH-Wert 1,4,
177 mg Magnetit/g) wird mit einem Paraffinöl oder Toluol(50 g), welche
3 Gew.-% Span 65 enthalten, gemischt. Die Mischung wurde unter Verwendung
eines Ultraturax für
2 Min. emulgiert, resultierend in einer W/O Emulsion, bei der das
Magnetit homogen über
das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion wird
ausreichend gerührt,
um das Absetzen der magnetischen Tropfen zu verhindern, und TMOS (Tetramethosysilan,
9 g) in Toluol wird nach und nach dazugegeben. Nach dem kontinuierlichen Rühren für l0 Std.
bei 30°C
wird eine Base (0,1 M NaOH oder 0,5 M wäßriges Ammoniak) dazugegeben.
Das Rühren
wird für
weitere 3 Std. fortgesetzt, und die magnetischen Partikel werden
unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert. Anschließend werden
die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser
gewaschen. Die Partikel können
z.B. direkt zum Isolieren von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt,
gefolgt von einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.
- b) Während
des Rührens
bei 0°C
wird TMOS (9 g) zu einer sauren Ferrofluid (4,5 g, pH-Wert 1,2,
205 mg Magnetit/g) gegeben. Die Suspension wird für weitere
15 Min. bei Raumtemperatur gerührt,
bevor ein Paraffinöl
oder Toluol(50 g), welche 3 Gew.-% Span 65 enthalten, dazugegeben
wird. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Ultraturax für 3 Min.
emulgiert, resultierend in einer W/O Emulsion, bei der das Magnetit
homogen über
das gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Das Rühren wird
für 10
Std. bei 30°C
mit einer Geschwindigkeit durchgeführt, die ausreichend ist, damit
sich die Wassertropfen nicht absetzen, wonach eine Base (0,1 M NaOH oder
0,5 M wäßrigen Ammoniak)
dazugegeben wird. Das Rühren
wird für
weitere 3 Std. fortgesetzt, und die magnetischen Polymerpartikel
werden unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert.
Anschließend
werden die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser
gewaschen. Die magnetischen Polymerpartikel können z.B. direkt zum Isolieren
von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt, gefolgt von
einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.
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2. Partikelbildung bei
einem hohen pH-Wert
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Ein
wäßriges Ferrofluid
(5,0 g, pH-Wert 11, 50 mg Magnetit/g) wird mit einem Paraffinöl oder Toluol(50
g), welche 3 Gew.-% Span 65 enthalten, gemischt. Die Mischung wurde
unter Verwendung eines Ultraturax für 2 Min. emulgiert, resultierend
in einer W/O Emulsion, bei der das Magnetit homogen über das
gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion
wird ausreichend gerührt, um
das Absetzen der magnetischen Tropfen zu verhindern, und TMOS (Tetramethosysilan,
9 g) in Toluol wird nach und nach dazugegeben. Nach dem kontinuierlichen
Rühren
für 5 Std.
bei 30°C
wird 1 g einer Base (0,1 M NaOH oder 0,5 M wäßriges Ammoniak) dazugegeben.
Das Rühren
wird für
eine weitere Std. fortgesetzt, und die magnetischen Polymerpartikel werden
unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung isoliert. Anschließend werden
die magnetischen Polymerpartikel mit Toluol, Methanol und Wasser
gewaschen. Die magnetischen Polymerpartikel können z.B. direkt zum Isolieren
von DNA verwendet werden oder ein Trockungsschritt, gefolgt von
einer Resuspension in Wasser, kann eingefügt werden.
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3. Verwendung von Natriumsilikat
als Monomer
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Eine
Suspension eines wäßrigen Ferrofluids (7,5
g, pH-Wert 11) in Natriumsilikat (Natronwasserglas) (7,5 g) wird
gemischt, um ein anderes Ferrofluid zu erhalten. Toluol oder ein
Norpar-Öl
(die kontinuierliche Phase), welche z.B. 3 % Stabilisator (Span
65 oder Span 80) enthalten, wird zu der Ferrofluid gegeben, und
eine W/O Emulsion wird mittels Ultraschallbehandlung oder Verwendung
eines Ystral (Ultraturax) hergestellt. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops
kann man klar verifizieren, dass das Magnetit homogen über das
gesamte Volumen der Wassertropfen hinweg verteilt ist. Die Emulsion
wird für
4 Std. bei 25°C
(150 Upm) gerührt,
wonach eine Emulsion aus 1 ml 25%-igem NH4OH
in 10 ml kontinuierlicher Phase dazugegeben wird. Nach 5-minütigem Rühren werden
2 ml einer 20%-igen Lösung
aus H2O in EtOH dazugegeben. Die Emulsion
wurde für
12 Std. bei 50°C
gerührt,
und die magnetischen Polymerpartikel wurden mehrere Male mit MeOH
unter Verwendung einer magnetischen Vorrichtung gewaschen.