Bioaktive und biokompatible Konjugate mit magnetischen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf bioaktive und biokompatible Konjugate mit magnetischen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 13.
Im Stand der Technik findet man eine Reihe von magnetisch manipulierbaren Materialien, die sich in ihrer Größe, Zusammensetzung und Wirkung auf Zielstrukturen stark unterscheiden. Verfahren zur Herstellung magnetisch beweglicher, biologisch aktiver Partikel sind bekannt. So sind sogenannte „magnetische Beads" (Technical Handbook 3rd Edition 1998 „Biomagnetic Techniques in Molecular Biology") bekannt, die aus uniformen, superpara- magnetischen, monodispersen Mikrometer-Polymerteilchen (z.B. Polystyrol) bestehen, die etwa 10 Gew. % magnetische Nano-Magnetitteilchen enthalten und deren Oberfläche mit unterschiedlichen Biomolekülen wie z.B. Nukleinsäurefragmenten, Dextran oder Antikörpern beschichtet wurden und die in der molekularbiologischen Forschung und der klinischen Diagnostik Einsatz finden. Diese Teilchen besitzen einen Durchmesser von 0,5-100 Mikrometern und sind für einen direkten Einsatz im klinischen Bereich zu groß. Die Biomoleküle sind ausschließlich auf der Oberfläche der Polymerkugeln fixiert.
Verfahren zur Herstellung von Dispersionen kolloidaler, superparamagnetischer und/oder ferromagnetischer Partikel sind vielfach beschrieben. So werden z.B. in
der DE 196 54 965 dispergierbare Partikel, die super- paramagnetische/ferromagnetische Kristalle und/oder maßgeschneiderte di-, tri- oder Blockcopoly ere enthalten, in der DE 196 24 426 magnetische Flüssigkeiten für den Transport von diagnostischen oder therapeutisch wirksamen Substanzen, in der DE 4309333 superparamagnetische Teilchen, Verfahren zur Herstellung und Verwendung, in der DE 19736736 Verfahren zum Beschichten von Oberflächen mit definierten Molekülschichten, in der DE 19758335 eine Magnetflüssigkeit auf der Basis unpolarer Trägerflüssigkeit und Verfahren zur Herstellung, in der DE 19758350 eine magnetische Flüssigkeit und Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung, in der DE 4325386 eine magnetische Flüssigkeit auf der Basis einer wassrigen Trägerflüssigkeit, in der DE 19702710 stabile und/oder unstabile Dispersionen superparamagnetischer und/oder ferromagnetischer Kristalle und in der DE 3709851 NMR- Diagnostische Flüssigkeitszusammensetzungen beschrie- ben.
All diesen Verfahren ist gemeinsam, dass sie zunächst magnetische Partikel präparieren und diese danach mit biologischen Material in Kontakt bringen. Die Bio- Aktivität und Bio-Kompatibilität der Materialien ist nachteiligerweise gering und wurde nie vergleichend untersucht .
Weiterhin ist bekannt, vorgebildete magnetische Nanopartikel mit Biomolekülen zu beschichten. So wird im U.S. Pat. No . 5,512,332 ein Verfahren zur Her- Stellung von beschichteten magnetischen Partikeln durch Inkubation von magnetischen Partikeln mit beschichtenden Materialien beschrieben. Als Beschichtungsmaterialien werden natürliche oder synthetische Materialien wie z.B. Polypeptide, Proteine
oder Antikörper verwendet. Dabei werden ausgehend von einer Teilchenpräparation z.B. durch Beschallung zunächst sehr kleine magnetische Teilchen hergestellt und diese mit den Beschichtungsmaterialien inkubiert.
In U.S. Pat. No. 3,970,518 und 4,018,886 wird die physikalische Beschichtung von magnetischen Partikeln über Adsorptionskräfte beschrieben. Es wird dabei die Herstellung von Nickel-Teilchen mit einem Durchmesser von lμm durchgeführt, die mit Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet sind. Bei Präparationen dieser Art wird von enormen Auswaschungen von nichtadsorbiertem Material
(U.S. Pat. No. 5,512,332) berichtet. In U.S. Pat. No.
4,554,088 wurde gezeigt, dass bei Präparationen dieser Art an die Oberfläche von Eisenoxiden adsorbierte Antikörper durch Inkubation mit IM Kochsalz leicht abgelöst werden können, so dass nur sehr wenig adsorbiertes Material an der Oberfläche zurückbleibt. Diese Ergebnisse können von eigenen Untersuchungen bei der Adsorption von BSA an Magnetitpräparationen gestützt werden.
Aus U.S. Pat. No. 4,230,685 ist die Präparation von Magnetit-Teilchen, die Albumin und Protein A durch eine Emulsionspolymerisation bekannt.
In U.S. Pat. No. 4,554,088 wird eine Silanisierung von magnetischen Metalloxiden versucht, um diese kovalent an bioaktive Moleküle zu binden. Damit ist aber die freie Beweglichkeit, die für entsprechende Nachweis- reaktionen oder sogar pharmakologische Wirkungen erforderlich ist, stark eingeschränkt.
In U.S. Pat. No. 4,452,773 wird die Herstellung von „kolloidalen" Eisenoxid-Partikeln, die mit nichtionischen Polysacchariden beschichtet sind, durch Bildung des Magnetits in 25%-iger Polysaccharidlosung beschrieben. Danach werden die Biomoleküle mittels chemischer Vernetzungstechnologie an den Partikeln fixiert.
Aus U.S. Pat. No. 4,795,698 ist eine Koprazipitation von Metalloxiden und von Polymeren oder Proteinen von 0,1-lmg/ml durch Titration mit einer Base in den schwach alkalischen Bereich, Waschschritten und anschließender Beschallung bekannt. Dabei wird fast das gesamte Polymer oder Protein gefällt.
Es hat sich gezeigt, dass ähnliche Präparationen unter Verwendung von Proteinen nachteiligerweise eine stark reduzierte biologische Aktivität (z.B. Erkennbarkeit durch Antikörper) der adsorbierten Biomoleküle zeigen. Auf Grund der Präparationstechniken besitzen die beschriebenen Teilchenpräparationen eine eingeschränkte Bio-Kompatibilität .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Präparation von magnetisch separierbaren Konjugaten mit hoher Bioaktivität und Biokompatibilität zu ermöglichen.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den kennzeichnenden Teilen der Ansprüche 1 und 13. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, dass magnetisch separierbare, bioaktive und biokompatible
Konjugate hergestellt werden, die Netzstrukturen mit superparamagnetischen oder ferromagnetischen Eigenschaften aufweisen, die teilweise aus Biomolekülen und/oder Zellen, die gegebenenfalls mit Ankergruppen versehenen sind, und einer oder mehreren von hohlen Kanälen durchbrochenen, vernetzten Schichten, durch die die Biomoleküle und/oder Zellen biochemisch erreichbar sind und die teilweise aus magnetischen Eisenoxiden oder Mischoxiden der Formel MeO-Fe203 bestehen, wobei Me zweiwertige Metallionen wie Fe, Ba, Sr, Mn, Zn oder Co und Fe203 γ- Fe203 oder magnetische Reinmetalle, wie Kobalt und Eisen sind, aufgebaut sind.
Diese Konjugate können nach unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung magnetisch separierbarer, bioaktiver und biokompatibler Konjugate ist dadurch gekennzeichnet, dass gegebenenfalls mit Ankergruppen versehene Biomoleküle und/oder Zellen mit einer Lösung, die Schwermetallsalze enthält, vermischt werden und das Gemisch auf einen alkalischen pH-Wert eingestellt wird, bzw. die gegebenenfalls mit Ankergruppen versehenen Biomoleküle und/oder Zellen auf einen alkalischen pH- Wert eingestellt werden und mit einer Lösung, die Schwermetallsalze enthält, vermischt werden, die entstandenen magnetisch beweglichen separierbaren Konjugate ggf. anschließend gewaschen und danach mit chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden behan- delt werden, die die Schwermetalloxidabscheidung partiell auflösen.
Dabei sind die ggf. mit Ankergruppen versehene Biomoleküle und/oder Zellen bei der Bildung der Konjugate direkt anwesend und können zwischen den
Schichten der sich bildenden magnetischen Komponente eingelagert werden.
In einer Weiterbildung der Erfindung sind die Biomoleküle synthetische und/oder natürliche Oligomere oder Polymere, wie z.B. Peptide und/oder Proteine und/oder Nukleinsäurefragmente und/oder Nukleinsäuren und/oder Oligo- oder Polysaccharide .
Zellen sind Bakterienzellen oder humane Zellen, die bioaktiv sein können.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Ankergruppen sind ionisch bindende Gruppen und/oder chelatbildende Gruppen und/oder kovalent bindende Gruppen und/oder über biologische Affinität bindende Gruppen, wie z.B. Biotin, und/oder antikörperbindende Gruppen und/oder Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Weiterreaktion der Biomoleküle und/oder Zellen geeignet sind.
Die Volumenkonzentrationen der eingesetzten magnetischen Eisenoxide oder Mischoxide betragen 0,0001% bis 10 Vol%, insbesondere 0,01 % bis 1 Vol%.
Kernteilchengrößen der magnetischen Komponente „betragen 1 bis 1000 nm.
Die durchbrochenen, vernetzten Schichten, die teilweise aus der magnetischen Komponente bestehen, sind von Hohlräumen, die einen Durchmesser von 0,1 nm bis 1000 nm besitzen, durchbrochen.
In einer weiteren Ausbildung der Erfindung liegen die Konjugate in dispergierter Form in wassrigen oder mit
Wasser mischbaren Lösungen vor, wobei die Teilchengröße der Konjugate in Kugelform von 1 nm bis 500 μm oder als ausgedehnte Objekte bis zu 10 cm Länge und Breite beträgt .
In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden gegebenenfalls mit Ankergruppen versehene Biomoleküle und/oder Zellen mit einer Lösung, die zweiwertige Metallionen und dreiwertige Eisenionen enthält, vermischt und das Gemisch auf einen alkalischen pH-Wert eingestellt wird, bzw. die gegebenenf lls mit Ankergruppen versehenen Biomoleküle und/oder Zellen auf einen alkalischen pH-Wert eingestellt werden und mit einer Lösung, die zweiwertige Metallionen und dreiwertige Eisenionen enthält, vermischt werden, die entstandenen magnetisch beweglichen separierbaren Konjugate anschließend ggf. gewaschen und mit chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden behandelt werden, die die oxidischen Bestandteile partiell auflösen.
Vorgebildete magnetisch separierbare Konjugate mit Biomolekülen und/oder Zellen, die ggf. mit Ankergruppen versehen sind, werden inkubiert und danach mit chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden behandelt, die die oxidischen Bestandteile partiell auflösen.
Vorgebildete magnetisch separierbare Konjugate werden mit chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden behandelt, die die Oxidabscheidung partiell auflösen
und danach werden sie mit Biomolekülen und/oder Zellen, die ggf. mit Ankergruppen versehen sind, inkubiert und anschließend ggf. gewaschen und magnetisch separiert.
Positiv geladene, in Wasser -dispergierte magnetische Nanoteilchen werden mit Biomolekülen und/oder Zellen vermischt, anschließend ggf. gewaschen und die magnetisch separierbaren Konjugate mit chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden behandelt, die die Oxidabscheidung partiell auflösen.
Als ggf. mit Ankergruppen versehene Biomoleküle werden Proteine eingesetzt, wie z.B. Serumproteine, Albumine, wie Humanserumalbumin, und Enzyme.
Als ggf . mit Ankergruppen versehene Biomoleküle werden Nukleinsäuren oder deren Fragmente eingesetzt.
Als Ankergruppen werden ionisch bindende und /oder chelatbildende Gruppen und/oder zur kovalenten Bindung befähigte Gruppen und/oder über biologische Affinität bindende Gruppen, wie zB. Biotin, und/oder zur Bindung von Antikörpern befähigte Gruppen und/oder Fluoreszenzfarbstoffe, sowie Fluoreszein eingesetzt.
Die Schwermetallsalzlösung kann erfindungsgemäß Eisen(II)- und Eisen (III) -Salze enthalten. Die Metallsalzlösung kann weiterhin Kobalt- oder Nickel-Salze enthalten.
Der alkalische pH-Wert wird durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxid NaOH oder KOH eingestellt.
Als Substanzen, die die Metalloxidabscheidungen partiell auflösen, werden organische oder anorganische Säuren eingesetzt. Insbesondere eignen sich dazu organische Säuren, wie Citronensäure, Weinsäure und Oxalsäure. Oxalsäure wird hierbei in einer Konzentration von 10 - 0,1% und bei einer Temperatur von 0°C - 50°C eingesetzt.
Darüberhinaus werden zum Auflösen der Metalloxidabscheidungen anorganische Säuren, wie Salzsäure, verwendet.
Als physikalische bzw. physiko- oder biochemische Methode, die die Metalloxidabscheidungen partiell auflösen, werden Ionenstrahl- und/oder Laserstrahl- techniken sowie elektrochemische Methoden und Bio- Korrosions-Methoden verwendet.
Die Bildung der magnetischen Konjugate wird entweder dadurch erreicht, dass man eine Lösung die Schwermetallsalze enthält mit den Biomolekülen und/oder Zellen vermischt und das Gemisch anschließend auf einen alkalischen pH-Wert einstellt, bzw. dadurch, dass man die gelösten Biomoleküle und/oder Zellen zunächst auf einen stark alkalischen pH-Wert einstellt und zu dieser Lösung die Lösung, die Schwermetallsalze enthält, zugibt. Die Reihenfolge der Verfahrensschritte ist dabei von der Art der verwendeten Biomoleküle und/oder Zellen abhängig und von dem beabsichtigten Verwendungszweck der hergestellten Konjugate. Die entstandenen magnetisch separierbaren Konjugate werden danach ggf. dadurch gewaschen, dass sie mittels eines Magneten von der Lösung abgetrennt werden, in dem Waschmedium, meist Wasser, resuspendiert werden und erneut magnetisch abgetrennt werden. Die Zahl der
Waschschritte hängt von der Art der herzustellenden Konjugate ab und beträgt üblicherweise 3-4. Bei einigen Herstellungsvarianten kann durchaus auf den Waschzwischenschritt verzichtet werden. Überraschend wurde gefunden, dass eine Behandlung von magnetisch separierbaren Konjugaten dieser Art mit bestimmten chemischen Substanzen, bzw. mit physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden, die die Schwermetalloxidabscheidung partiell auflösen, zu einer wesentlichen Erhöhung der Bio- Aktivität und Bio-Kompatibilität der Konjugate führt.
Dabei zeigte sich, dass unbehandelte Konjugate teilweise völlig biologisch inaktiv sind und erst durch den die magnetische Komponente partiell auflösenden Verfahrensschritt aktiviert werden.
In einer bevorzugten Verfahrensvariante werden als Schwermetallsalze Salze von zweiwertigen Metallionen gemeinsam mit dreiwertigen Eisenionen eingesetzt.
In einer weiteren Verfahrensvariante werden vorbildete magnetisch separierbare Konjugate mit Biomolekülen und/oder Zellen inkubiert und danach mit chemischen Substanzen, aber auch mittels physikalischen, physiko- chemischen oder biochemischen Methoden behandelt, die die Schwermetalloxidabscheidung partiell auflösen. Diese Verfahrensvariante arbeitet nicht mit allen vorgebildeten Konjugaten und ist offensichtlich stark von der Struktur der gebildeten Konjugate abhängig. Dabei kann es teilweise zur völligen Auflösung der gesamten magnetisch separierbaren Konjugate kommen, bzw. die behandelten Konjugate besitzen eine reduzierte biologische Aktivität.
In einer weiteren Verfahrensvariante werden vorgebildete magnetische Konjugate zunächst mit chemischen Substanzen, aber auch mittels physikalischen, physiko-chemischen oder biochemischen Methoden, die die Schwermetalloxidabscheidung partiell aufgelösen, behandelt und anschließend mit Biomolekülen und/oder Zellen inkubiert. Dabei wird zunächst durch eine partielle Auflösung von Schwermetalloxidschichten die Struktur der vorgebildeten Konjugate verändert, so dass eine verbesserte An- oder Einlagerung der Biomoleküle und/oder Zellen erfolgen kann. Dies kann besonders für niedermolekulare Biomoleküle sehr wichtig sein. In einer bevorzugten Verfahrensvariante werden positiv geladene, in Wasser dispergierte magnetische Nanoteilchen eingesetzt. Dies kann von Vorteil sein, wenn die Bindung der Biomoleküle und/oder Zellen über ionische Wechselwirkungen erfolgen soll. Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren bio- kompatible, das heißt bioverträgliche, Biomoleküle und/oder Zellen eingesetzt, da die entsprechenden Konjugate teilweise innerhalb von Therapiestrategien verwendet werden können. Dies- schließt eine Kombination von biokompatiblen Biomolekülen und/oder Zellen mit pharmakologisch wirksamen Biomolekülen und/oder Zellen in Konjugaten ein. Als Zellen werden innerhalb von Therapiestrategien z.B. humane Eigenzellen nach Zellzucht verwendet. In dem Verfahren werden bioaktive Biomoleküle und/oder Zellen eingesetzt. Der Begriff „bioaktiv" muß im breitesten Sinne verstanden werden und umfaßt z.B. enzymatische Aktivitäten und/oder Bindungsaktivitäten für und von Antikörpern und/oder Hybridisationsaktivitäten von Nukleinsäurefragmenten oder Nuklein-
säuren und/oder Bindungsaktivitäten über biologische Affinitäten, wie z.B. des Systems Biotin/Streptavidin oder z.B. die biologischen Aktivitäten von Proteaseinhibitoren. Als Zellen werden z.B. Bakterienzellen mit enzymatischer Aktivität oder humane Zellen mit Affinitäten zu anderen Zelltypen verwendet. Zur Herstellung von Konjugaten, die zur Verwendung innerhalb von Therapiestrategien vorgesehen sind, werden pharmakologisch wirksame Biomoleküle und/oder Zellen eingesetzt.
Der Einsatz erfolgt dabei durchaus in Kombination mit anderen Biomolekülen und/oder Zellen. Die pharmakologisch wirksamen Biomoleküle können durchaus auch niedermolekulare chemische Verbindungen, die z.B. eine cancerostatische Wirkung aufweisen, sein. Diese können sich zum z.B. im Innern der von uns hergestellten Konjugate, gemeinsam mit bio-kompatiblen Biomolekülen und/oder Zellen befinden und nach magnetophoretischer Konzentration am beabsichtigten Wirkungsort gezielt freigegeben werden. Als Zellen werden z.B. Bakterienzellen mit enzymatischer Aktivität oder humane Zelllinien mit Affinität zu bestimmten Tumoren eingesetzt. Als Biomoleküle werden in dem Verfahren bevorzugt Proteine eingesetzt. Sie sind sehr gut in die magnetisch separierbaren Konjugate integrierbar, werden durch die die Schwermetalloxidabscheidung partiell auflösenden Verfahrensschritte nicht aus den Konjugaten herausgelöst und erhalten dadurch eine erhöhte Bio- aktivität. Durch Verwendung von Serumproteinen, bevorzugt Albumine, z. B. Humanserumalbumin (HSA) wird dem beabsichtigten Anwendungsgebiet innerhalb humaner Therapiestrategien Rechnung getragen. So besitzen z.B. magnetisch separierbare Konjugate, die HSA enthalten
und deren magnetische Komponente mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren auf das mindest erforderliche Ausmaß beschränkt wur,de, eine sehr hohe Biokompatibilität im humanen Blutsystem. Bevorzugt werden in unserem Verfahren als Proteine Enzyme verwendet. Dabei werden magnetisch separierbare Konjugate hergestellt, die innerhalb diagnostischer Tests Einsatz finden, wobei z.B. Enzyme wie alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1.) und Peroxidase (EC 1.11.1.7) verwendet werden, als auch andere Enzyme für organische Synthesen wie z.B. Cholesterol Esterase (EC 3.1.1.13), Trypsin (EC 3.4.21.4), Älkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) und Enzyme, die therapeutisch interessant sind. Als Biomoleküle können Nukleinsäuren oder deren Fragmente verwendet werden. Dabei kann sowohl RNA als auch DNA bzw. Fragmente davon (z.B. Oligonukleotide) zum Einsatz kommen. Die hergestellten magnetisch separierbaren Konjugate reagieren mit Zielmolekülen über Hybridisationsreaktionen und können in diagnostischen Verfahren und innerhalb therapeutischer Strategien zur Anwendung kommen.
An den Biomolekülen können sich ggf. Ankergruppen befinden. Dies können ionisch bindende und /oder chelatbildende Gruppen und/oder zur kovalenten Bindung befähigte Gruppen und/oder über biologische Affinität bindende Gruppen, wie zB. Biotin, und/oder zur Bindung von Antikörpern befähigte Gruppen und/oder Fluoreszenzfarbstoffe sein. Diese Ankergruppen können sowohl zur nachträglichen Vernetzung von Molekülen innerhalb der magnetisch separierbaren Konjugate, als auch zur Kopplung an Zielstrukturen und die Bindung von diägnostich oder therapeutisch interessanten Molekülen genutzt werden. So können z.B. über zur kovalenten
Bindung befähigte Gruppen unter Beteiligung chemischer Crosslinker weitere für die entsprechende Anwendung interessante Moleküle gekoppelt werden oder ein biotinyliertes Protein innerhalb des Konjugates kann durch Reaktion mit Streptavidin mit weiteren Partnern verknüpft werden. Dabei kann z.B. ein weiterer, diagnostisch bzw. therapeutisch interessanter Antikörper an das magnetisch separierbare Konjugat gebunden werden. Bei Benutzung von Fluorescein- Ankergruppen kann z.B. mittels eines Anti-Fluoreszein- Antikörpers eine entspechende Nachweiskette aufgebaut werden.
Bevorzugt werden in dem Verfahren in der Schwermetallsalzlösung Eisen(II)- und Eisen(III) -Salze eingesetzt. Das entstehende Magnetit besitzt gute magnetische Eigenschaften und ist sehr gut für die weiteren Verfahrensschritte geeignet. Durch Einsatz von Kobalt- und Nickel-Salzen können die magnetischen Eigenschaften und Strukturen der Konjugate verändert werden und die Verfahrensschritte zur partiellen Auflösung der magnetischen Metalloxidabscheidungen beeinflußt werden.
Eine bevorzugte Variante der Einstellung des alkalischen pH-Wertes ist die Zugabe von konzentriertem Ammoniak. Dadurch werden möglichst kleine (10-50 nm) Primärpartikelgrößen erreicht. Geeignete Biomoleküle und/oder Zellen können auch als stark alkalische Lösung zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäße partielle Auflösung der magnetischen Schwermetalloxidabscheidung spielt die entscheidende Rolle bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate. Dazu werden bevorzugt
organische oder anorganische Säuren verwendet. Diese „ätzen" erreichbare Teile der magnetischen Schwer- metalloxidabscheidungen an und aktivieren damit die biologische Aktivität der Konjugate. Bevorzugt werden organische Säuren, wie Citronensäure, Weinsäure und Oxalsäure verwendet. Schwermetallkomplexierende Verbindungen eignen sich ebenfalls.
Ein bevorzugtes Verfahren arbeitet mit 10 - 0,l%iger Oxalsäure. Durch Veränderung der Verfahrensbedingungen (z.B. Konzentration, Temperatur) können unterschiedliche Konjugate (unterschiedliche Eigenschaften, unterschiedliche Konjugatgrößen) hergestellt werden. Bevorzugt wird eine Reaktionstemperatur zwischen 0°C und 50°C, bei der die partielle Auflösung der Schwermetalloxidabscheidungen gut gesteuert werden kann. Salzsäure, als anorganische Säure, ist für das Verfahren ebenfalls geeignet, erfordert aber eine sehr genaue Abstimmung auf die entsprechenden Biomoleküle und/oder Zellen. Als Mittel, die magnetischen Schwermetalloxidschichten partiell aufzulösen, können auch physikalische Methoden, wie der Einsatz von Ionenstrahl- oder Laserstrahltechniken, verwendet werden. Dabei werden unterschiedlich große Hohlräume (Kanäle) in die entsprechenden magnetischen Schichten geschossen bzw. Schichten partiell abgetragen. Zu partiellen Auflösung der magnetischen Schwermetalloxidschichten können auch elektrochemische Verfahren, bei denen die Schwermetalloxidschichten durch Bildung elektrochemischer Lokalelemente aufgelöst werden und Bio-Korrosions-Methoden, bei denen unter Einwirkung von Mikroorganismen (z.B. Bakterien) die magnetischen Schwermetalloxidschichten partiell durch die Mikroorganismen zersetzt werden, eingesetzt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 2ml einer Lösung von FITC-markiertem BSA (Fluoreszein- isothiocyanat-markiertes Rinderserumalbumin, 0,5 mg/ml) gemischt und mit 1 ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 2 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die FITC-markiertes BSA. enthalten. Aus Fluoreszenzmessung der Überstände kann kalkuliert werden, dass ca. 90% des FITC-BSA in den Konjugaten enthalten sein müssen. In einem Tüpfeltest auf Nitrocellulose und Fluorometer kann aber keine Fluoreszenz auf der Oberfläche der Konjugate nachgewiesen werden. Dies spricht für eine Position der fluoreszenzmarkierten Moleküle im Innern der Konjugate bzw. für eine Löschung der Fluoreszenz durch die Magnetitabscheidung .
Beispiel 2 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 2ml einer Lösung von BSA (Rinderserumalbumin, 0,5 mg/ml) gemischt und mit 1ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 2 ml
Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die BSA enthalten. Die Konjugate werden in ca. 5 ml Wasser suspendiert und aliquotiert.
Parallel wird eine Konjugat-Präparation ohne BSA durchgeführt. Von den Konjugat-Suspensionen werden Verdünnungsreihen in Wasser (1:10, 1:100) hergestellt. Die Testung der Konjugat-Präparationen erfolgt in einem Nitrocellulose -Streifentest:
Auf einem Streifen Nitrocellulose (NC, 7 x 8,4 cm) werden die Verdünnungsreihen der Konjugate mit und ohne BSA in der Präparation, und eine BSA-Verdünnungsreihe als Positivkontrolle getüpfelt (1 μl, Doppelwerte). Es werden mehrere NC-Streifen parallel getüpfelt.
Nach Lufttrocknung bleibt ein Streifen unbehandelt, andere Steifen werden 5 Minuten bei Zimmertemperatur mit organischen oder anorganischen Säuren [5% Oxalsäure, 5% Weinsäure, 5% Citronensäure und Salzsäure (1:10 Verdünnung)] behandelt, kurz mit Wasser gewaschen und 30 Minuten in eine Blocklösung (PBS, 0,5% Gelatin) gelegt. Danach erfolgt eine gemeinsame Inkubation der unbehandelten und behandelten Streifen mit einem FITC- markierten Antikörper gegen BSA (Chicken, affinitätsgereinigt, , 1:100 Verdünnung) . Nach der Antikörperreaktion (4 Stunden, Zimmertemperatur) werden die Streifen mit PBS gewaschen und unter UV-Licht auf Bindung von Anti-BSA Antikörpern geprüft: Die Positivkontrolle aller Streifen (unbehandelt und säurebehandelt) hat reagiert, die BSA-Verdünnungsreihe zeigt deutliche grüne Fluoreszenz.
Die Negativkontrolle (Konjugat-Präparation ohne BSA) zeigt keine Fluoreszenz auf allen Streifen (unbehandelt und säurebehandelt) .
Von der Konjugat-Präparation mit BSA fluoresziert die Verdünnungsreihe auf dem mit Oxalsäure behandeltem Streifen strark grün (bis 1:100 Verdünnung) während die anderen Streifen, einschließlich des unbehandelten Streifens, nicht fluoreszieren.
Offensichtlich wird durch die Oxalsäurebehandlung das BSA im Innern der Konjugate der Antikörperreaktion zugängig gemacht . Dies spricht wiederum für eine Abschirmung des BSA durch eine äußere magnetische Schicht in der ersten Phase der Präparation der Konjugate und für die Möglichkeit der partiellen Zerstörung und damit biologischen Erreichung des BSA im Innern der Konjugate durch Behandlung mit Säuren.
Beispiel 3
2ml einer Lösung von FITC-markiertem BSA
(Fluoreszeinisothiocyanat-markiertes Rinderserum- albumin, 0,5 mg/ml) werden mit 1 ml konzentriertem
Ammoniak vermischt.
Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2x4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 2 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt.
Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt . Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die FITC-markiertes BSA enthalten. Der Überstand nach
Ausfällung der Konjugate wird fluorometrisch vermessen.
Im Überstand sind nur noch ca. 10% des FITC-markierten
BSA nachweisbar. Damit müßten ca. 90% des FITC-
markierten BSA in der Konjugat-Präparation enthalten sein.
Im Tüpfeltest auf NC und im Fluorometer zeigen die Konjugate keine Fluoreszenz, was wiederum für eine Positionierung des FITC-BSA im Innern der Konjugate auch bei dieser Variante des ersten Teiles der Präparation spricht.
Die BSA-Konjugat-Präparation zeigt optisch weiterhin ihre braunschwarze Färbung, was für ihre magnetische Beweglichkeit spricht, während die Färbung der Konjugat-Präparation ohne BSA ihre schwarze Färbung nach Behandlung mit Oxalsäure völlig verloren hat (völlige Zerstörung der Teilchen) .
Beispiel 4
2ml einer Lösung von BSA (Rinderserumalbumin, 0,5 mg/ml) werden mit 1 ml konzentriertem Ammoniak vermischt . Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 X 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt.
Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 2 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, dieBSA enthalten. Die Konjugat-Präparation wird analog der Präparation aus Bsp. 2 aliquotiert, auf NC getüpfelt, säurebehandelt und mit einem FITC-markierten Antikörper gegen BSA inkubiert. Nach PBS Waschung wird mittels UV-Lampe auf Fluoreszenz geprüft: Wie in Bsp. 2 arbeiten alle Positiv- und Negativkontrollen korrekt.
Wie in Bsp 2 fluoresziert auch bei dieser Konjugat- Präparation nur die mit Oxalsäure gewaschene Präparation (grüne Fluoreszenz bis 1:100 Verdünnung) was wiederum für eine Positionierung des BSA im Innern der Konjugate und die Möglichkeit der partiellen Öffnung von Magnetitschichten durch Säurebehandlung spricht .
Die BSA- Konjugat-Präparation zeigt optisch weiterhin ihre braunschwarze Färbung, was für ihre magnetische Beweglichkeit spricht, während die Färbung der Konjugat-Präparation ohne BSA ihre Färbung nach Behandlung mit Oxalsäure völlig verloren hat (völlige Zerstörung der Teilchen) .
Beispiel 5
Analog Bsp. 2 werden magnetische Konjugate mit und ohne BSA präpariert .
Die Konjugate werden nach Waschung mit Wasser in 5ml Wasser suspendiert. 50 μl der Teilchensuspension werden mit 50 μl 5%iger Oxalsäure versetzt. Die Reaktion erfolgt 5 Min. bei Raumtemperatur. Nach ca. 2 Min. lösen sich die ohne BSA präparierten magnetischen Konjugate völlig auf. Nach 5 Min. werden die mit BSA präparierten Konjugate mittels eines Magneten von der Lösung abgetrennt, mehrmals mit Wasser gewaschen und in 50 μl Wasser resuspendiert.
Jeweils 1 μl der Überstände und der Konjugate werden analog Bsp.2 (einschließlich Positivkontrollen (BSA- Verdünnungsreihe), Negativkontrolle: Konjugate ohne Oxalsäurebehandlung) auf Nitrocellulose getüpfelt, mit mit Anti-BSA Antikörper (FITC-markiert) behandelt. Nach Waschung wird der NC-Streifen unter UV-Licht ausgewertet .
Nur die BSA-Verdünnungsreihe (Positivkontrolle) und die mit Oxalsäure behandelten Konjugate (BSA-Konjugate) zeigen eine deutliche grüne Fluoreszenz.
Die Konjugate waren gut magnetisch abscheidbar und sind damit magnetisch und biologisch aktiv. Die Überstände nach der Oxalsäurebehandlung fluoreszieren ebenfalls nicht, was für eine hohe Stabilität des BSA in den Konjugaten spricht.
Beispiel 6
Analog zu Bsp 5 werden Konjugat-Präparationen durchgeführt. Die Säurebehandlung der Konjugate wird 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 1% Oxalsäure durchgeführt, die Auswertung erfolgt mittels des NC- Streifentestes unter Verwendung des FITC-markierten Antikörpers gegen BSA. Die Ergebnissen werden mit denen von Bsp. 5 verglichen. Die präparierten, säurebehandelten magnetischen Konjugate zeigen eine starke Reaktion mit dem Antikörper. Nicht mit Säure behandelte Konjugate zeigen keine oder nur sehr schwache Reaktion mit dem Antikörper. Dies spricht für eine Freilegung und/ oder Aktivierung biologischer Funktionen durch die Behandlung mit Säuren.
Beispiel 7
Die Konjugat-Präparation erfolgt zunächst analog zu Bsp 2 ohne BSA. Danach werden die Teilchen 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit einer BSA-Lösung (5mg/ml) inkubiert, mehrmals mit Wasser gewaschen, magnetisch abgetrennt und aliquotiert. Überstandsmessungen zeigen eine adsorptive Bindung von BSA. Aliqots der Teilchensuspension werden mit Säuren behandelt.
Im NC-Streifentest werden säurebehandelte mit unbehandelten Konjugate und analog Bsp. 2 mit BSA präparierten Konjugate verglichen.
Die hier präparierten Konjugate zeigen keine Antikörperreaktion bzw. lösen sich in 5-1%-iger Oxalsäure völlig auf.
Dies spricht für einen völlig anderen Konjugat-Aufbau bei den durch nachträgliche Beschichtung mit BSA hergestellten Konjugaten im Vergleich zur Präparation der Konjugate unter Beteiligung von BSA.
Beispiel 8
Die Konjugat-Präparation erfolgt ausgehend von positiv geladenen, in Wasser dispergierten magnetischen Nanoteilchen. 2 ml einer 0,5 molaren (100g/l) wassrigen Nanoteilchen-Dispersion werden 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit einer BSA-Lösung (5mg/ml) inkubiert, mehrmals mit Wasser gewaschen, magnetisch abgetrennt und aliquotiert. Überstandsmessungen ergeben eine deutliche Bindung von BSA. Aliqots der Konjugat- Suspension werden mit Säuren behandelt.
Im NC-Streifentest werden säurebehandelte mit unbehandelten Konjugate und analog Bsp. 2 mit BSA präparierten Konjugate verglichen. Die hier präparierten Konjugate zeigen keine bzw. sehr schwache Antikörperreaktion, lösen sich aber in 5-1%- iger Oxalsäure nicht völlig auf.
Die Säureresistenz spricht für einen anderen Konjugat- Aufbau als bei den durch nachträgliche Beschichtung (Bsp.7) hergestellten Konjugaten. Im Vergleich mit den unter Beteiligung von BSA während der Präparation hergestellten Konjugaten zeigen die hier hergestellten Konjugate aber eine wesentlich schwächere Antikörperreaktion. Dies weist auf eine andere Bindung
der Biomoleküle bzw. eine andere Konjugat-Struktur in den Konjugaten hin.
Beispiel 9 Verkapselung von Peroxidase ohne Trägerprotein
1,3 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die 150 Einheiten Alkalische Phosphatase (Röche) gemischt und mit 0,5ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 20 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal mit größeren Volumina Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Peroxidase enthalten. Aus Messungen der Enzymaktivität der Überstände kann kalkuliert werden, dass ca. 95% des Enzyms in den Konjugaten enthalten sein müssen. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 5 Minuten mit 3ml l%iger Oxalsäure behandelt. Und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen. Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines Enzymaktivitätstestes unter Verwendung von BM blue POD Substrat (Röche) in Lösung (Mikrotiterplatte, lOOμl) vermessen. Die mit Oxalsäure behandelten Konjugate zeigen eine Enzymaktivität, die einer 1:5 Verdünnung des unbehandelten Enzymes entspricht. Dabei ist zu berücksichtigen, dass während des aktivierenden Oxalsäureschrittes ein Teil des verkapselten Enzymes in der nicht magnetisch beweglichen Fraktion erscheint. Der Nachweis der Enzymaktivität der magnetisch
beweglichen Konjugate kann über mehrere Tage bei Zimmertemperatur geführt werden.
Beispiel 10 Verkapselung von Peroxidase mit Trägerprotein
1,3 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die 10 mg Humanserumalbumin (HSA) und 300 Einheiten Alkalische Phosphatase (Röche) gemischt und mit 0,5 ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 20 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal mit größeren Volumina Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Peroxidase enthalten. Aus Messungen der Enzymaktivität der. Überstände kann kalkuliert werden, dass ca. 80% des Enzyms in den Konjugaten enthalten sein müssen. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 5 Minuten mit 3 ml l%iger Oxalsäure behandelt. Und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen. Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines Enzymaktivitätstestes unter Verwendung von BM blue POD Substrat (Röche) in Lösung (Mikrotiterplatte, lOOμl) vermessen. Die mit Oxalsäure behandelten Konjugate zeigen eine Enzymaktivität, die einer 1:4 Verdünnung des unbehandelten Enzymes entspricht. Dabei ist zu berücksichtigen, dass während des aktivierenden Oxalsäureschrittes ein Teil des verkapselten Enzymes in der nicht magnetisch beweglichen Fraktion erscheint. Der Nachweis der Enzymaktivität der magnetisch
beweglichen Konjugate kann über mehrere Tage bei Zimmertemperatur geführt werden.
Beispiel 11
Verkapselung von Alkalischer Phosphatase ohne Trägerprotein
1,3 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die lOμl (150 Einheiten) Alkalische Phosphatase (Röche) gemischt und mit 0 , 5 ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch viermal mit 40 ml Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Alkalische Phosphatase enthalten. Aus Messungen der Enzymaktivität der Überstände kann kalkuliert werden, dass ca. 90% des Enzyms in den Konjugaten enthalten sein müssen. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 10 Minuten mit 5ml 0,l%iger Oxalsäure behandelt. Und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen.
Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines
Enzymaktivitätstestes unter Verwendung von BM purple
Alkalische Phosphatase Substrats (Röche) in Lösung
(Mikrotiterplatte, 200μl) vermessen. Die mit Oxalsäure behandelten Konjugate zeigen eine Enzymaktivität, die einer 1:10 Verdünnung des unbehandelten Enzymes entspricht. Dabei ist zu berücksichtigen, dass während des aktivierenden Oxalsäureschrittes ein Teil des verkapselten Enzymes in der nicht magnetisch
beweglichen Fraktion erscheint. Der Nachweis der Enzymaktivität der magnetisch beweglichen Konjugate kann über mehrere Tage bei Zimmertemperatur geführt werden.
Beispiel 12
Verkapselung von Alkalischer Phosphatase mit
Trägerprotein
1,3 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die 5mg Humanserumalbumin (HSA) und lOμl (150 Einheiten) Alkalische Phosphatase (Röche) gemischt und mit 0,5 ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch viermal mit 40 ml Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Alkalische Phosphatase enthalten. Aus Messungen der Enzymaktivität der Überstände kann kalkuliert werden, dass ca. 90% des Enzyms in den Konjugaten enthalten sein müssen. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 10 Minuten mit 5 ml 0,l%iger Oxalsäure behandelt. Und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen. Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines Enzymaktivitätsteεtes unter Verwendung von BM purple Alkalische Phosphatase Substrats (Röche) in Lösung (Mikrotiterplatte, 200μl) vermessen. Die mit Oxalsäure behandelten Konjugate zeigen eine Enzymaktivität, die einer 1:8 Verdünnung des unbehandelten Enzymes entspricht. Dabei ist zu berücksichtigen, dass während des aktivierenden
Oxalsäureschrittes ein Teil des verkapselten Enzymes in der nicht magnetisch beweglichen Fraktion erscheint. Der Nachweis der Enzymaktivität der magnetisch beweglichen Konjugate kann über mehrere Tage bei Zimmertemperatur geführt werden.
Beispiel 13
Verkapselung von Glukoseoxidase ohne Trägerprotein
2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x
6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die 8 mg (260 Einheiten/ml) Glukoseoxidase (GOD)
(Serva) gemischt und mit 1ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch viermal mit 40 ml Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Glukoseoxidase enthalten. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 10 Minuten mit 5 ml 0,l%iger Oxalsäure behandelt, und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen. Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines Enzymaktivitätstestes unter Verwendung von o-Dianisidin als Farbsubstrat und Peroxidase als Zweitenzym in Lösung bestimmt. Die Auswertung erfolg mittels Spektralphotometer bei 436 nm. Die magnetisch beweglichen Konjugate zeigen nach Renaturierung bei 4°C über Nacht deutliche Enzymaktivität.
Beispiel 14
Verkapselung von Glukoseoxidase mit Trägerprotein
2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3 x 6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, werden mit 1ml PBS, die 5 mg Humanserumalbumin (HSA) und 4 mg (260 Einheiten/ml) Glukoseoxidase (GOD) (Serva) gemischt und mit 1ml konzentriertem Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden magnetischen Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt', geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch viermal mit 40 ml Wasser wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile magnetische Konjugate, die Glukoseoxidase enthalten. Die magnetischen Konjugate werden aliquotiert. Ein Teil des Konjugates wird 10 Minuten mit 5 ml 0,l%iger Oxalsäure behandelt. und anschließend unter magnetischer Abscheidung mit Wasser 4x gewaschen. Die Enzymaktivität der Konjugate wird mittels eines Enzymaktivitätstestes unter Verwendung von o-Dianisidin als Farbsubstrat und Peroxidase als Zweitenzym in Lösung bestimmt. Die Auswertung erfolg' mittels Spektralphotometer bei 436 nm. Die magnetisch beweglichen Konjugate zeigen deutliche Enzymaktivität.
Beispiel 15
Verkapselung von Nukleinsäurefragmenten mit
Trägerprotein
2 ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 0,5 mg/ml) und beschallter FITC-markierter Heringssperma- DNA (0,5 mg/ml) werden mit 1 ml konzentriertem Ammoniak vermischt .
Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt.
Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, dieHSA und Heringssperma-DNA enthalten. Die Konjugat- Präparation wird analog der Präparation aus Bsp. 2 aliquotiert, auf NC getüpfelt, säurebehandelt und mit einem Peroxidase-markierten Antikörper gegen FITC inkubiert. Nach PBS Waschung wird mittels ECL- Nachweissystem auf Peroxidaseaktivität geprüft. Die FITC-markierte DNA ist in den säurebehandelten Präparationen deutlich nachweisbar. Die DNA kann in einem Hybridisationsassay mit 32P-markierter homologer DNA in einer Verdünnung bis 1:104 nachgewiesen werden.
Beispiel 16
Verkapselung von Nukleinsäurefragmenten ohne Trägerprotein
2 ml einer Lösung beschallter FITC-markierter Heringssperma-DNA (0,5 mg/ml) werden mit 1ml konzentriertem Ammoniak vermischt.
Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die
Heringssperma-DNA enthalten. Die Konjugat-Präparation wird analog der Präparation aus Bsp. 2 aliquotiert, auf NC getüpfelt, säurebehandelt und mit einem Peroxidase- markierten Antikörper gegen FITC inkubiert. Nach PBS Waschung wird mittels ECL-Nachweissystem auf Peroxidaseaktivität geprüft. Die FITC-markierte DNA ist in den säurebehandelten Präparationen deutlich nachweisbar. Die DNA kann in einem Hybridisationsassay mit 32P-markierter homologer DNA in einer Verdünnung bis 1:104 nachgewiesen werden.
Beispiel 17
Verkapselung von Antibiotika (Kanamycin) mit Trägerprotein
2 ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 0,5 mg/ml) und Kanamycinsulfat (20 mg/ml) werden mit 1ml konzentriertem Ammoniak vermischt .Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt .Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die HSA und Kanamycin enthalten. Die Konjugat- Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Oxalsäure (0,01% 10 %) 3 Min. behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Aliquots der
Präparationen werden auf Nähragarplatten aufgetüpfelt .
Die Agarplatten werden mit einer Bakterienkultur
(Kanamycin-empfindlich) beimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet. Die saürebehandelten Präparationen zeigen
eine deutliche Hemmung des Bakterienwachstums um den Auftragungsort der magnetischen Präparate. Die höchste Hemmung wird durch Präparate nach Behandlung mit 0,1-1% Oxalsäure erzielt.
Beispiel 18
Verkapselung von Antibiotika (Ampicillin) mit
Trägerprotein
2ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 0,5 mg/ml) und Kanamycinsulfat (10 mg/ml) werden mit 1ml konzentriertem Ammoniak vermischt .Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:10 verdünnt, versetzt und umgeschüttelt .Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die HSA und Ampicillin enthalten. Die Konjugat- Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Oxalsäure (0,01%-10%) 3 Minuten behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Aliquots der Präparationen werden auf Nähragarplatten aufgetüpfelt . Die
Agarplatten werden mit einer Bakterienkultur
(Ampicillin-empfindlich) beimpft und über Nacht bei
37°C bebrütet. Die saürebehandelten Präparationen zeigen eine deutliche Hemmung des Bakterienwachstums um den Auftragungsort der magnetischen Präparate. Die höchste Hemmung wird durch Präparate nach Behandlung mit 0,05%-l% Oxalsäure erzielt.
Beispiel 19
Verkapselung von Bakterienzellen
2 ml einer Nährlösung, die 106 E.coli Zellen (Ampicillin-resistenter Stammm) enthalten werden mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt, umgeschüttelt und danach mit 1ml Ammoniak versetzt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die E.coli- Zellen enthalten. Die Konjugat-Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Oxalsäure (0,01% -10%) 3 Min. behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Aliquots der Präparationen werden auf Nähragarplatten, die Ampicillin enthalten, überimpft. Die Agarplatten werden 2 Tage bei 37°C bebrütet. Parallel werden Agarplatten ohne Zellen, Magnetit- Präparationen ohne Zellen und Präparationen ohne Säurebehandlung als Kontrolle mitgeführt. Die saürebehandelten Präparationen zeigen eine kolonieförmiges Bakterienwachstum. Das höchste Bakterienwachstum wird durch Präparate nach Behandlung mit 0,1-1% Oxalsäure erzielt.
Beispiel 20 Verkapselung von Farbstoffen (Dextranblau) mit Trägerprotein, Oxalsäurebehandlung
2 ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 5 mg/ml) und Dextranblau (10 mg/ml) werden mit 1 ml
konzentriertem Ammoniak vermischt. Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:10 verdünnt, versetzt und durchmischt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt . Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt . Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Magnetit- Konjugate, die HSA und Dextranblau enthalten. Die Waschlösungen werden spektralphotometrisch vermessen und die Menge des verkapselten Farbstoffes kalkuliert. Die Kalkulation ergibt, dass ca. 70% des Dextranblaus mittels Magnetit verkapselt wurden. Die Konjugat- Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Oxalsäure (0,01%
10%) 3 Min. behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Eine Probe bleibt unbehandelt. Die Magnetit-Konjugate werden in 1ml destilliertes Wasser aufgenommen und in Eppendorfröhrchen überführt . Die Proben werden zunächst 3 Stunden bei Zimmertemperatur und danach bei 4°C über Nacht gelagert. Danach werden die Magnetit-Konjugate mittels Magnet von den Überständen abgetrennt und diese spektralphotometrisch vermessen. Nach dieser Lagerung befindet sich kein Dextranblau in den Überständen der säurebehandelten und der unbehandelten Präparationen. Anschließend werden die Proben zwei Stunden bei 80 °C gemeinsam im Wasserbad erhitzt, die Magnetit-Konjugate erneut mittels Magnet von den Überständen getrennt und vermessen. Nur bei den säurebehandelten Magnetit-HSA- Dextranblau-Konjugaten kann eine deutliche Blaufärbung der Überstände nachgewiesen werden, während die nicht mit Säure behandelten Präparationen kein Dextranblau in den Überstand abgeben. Die stärkste Freisetzung von
Farbstoff wird bei einer Oxalsäurekonzentration von 0,05-4% gemessen. Auch diese Experimente sprechen für eine völlig veränderte Struktur der säurebehandelten Magnetitkonjugate mit geöffneten Porenstrukturen.
Beispiel 21
Verkapselung von Farbstoffen (Dextranblau) mit
Trägerprotein, Salzsäurebehandlung
2 ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 5 mg/ml) und Dextranblau (10 mg/ml) werden mit 1ml konzentriertem Ammoniak vermischt. Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl x 4H20, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:10 verdünnt, versetzt und durchmischt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Magnetit-Konjugate, die HSA und Dextranblau enthalten. Die Waschlösungen werden spektralphotometrisch vermessen und die Menge des verkapselten Farbstoffes kalkuliert. Die Kalkulation ergibt, dass ca. 70% des Dextranblaus mittels Magnetit verkapselt wurden. Die Konjugat-Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Salzsäure (0,01n -In) 3 Minuten behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Eine Probe bleibt unbehandelt. Die Magnetit-Konjugate werden in 1 ml destilliertes Wasser aufgenommen und in Eppendorf- röhrchen überführt . Die . Proben werden zunächst 3 Stunden bei Zimmertemperatur und danach bei 4°C über Nacht gelagert. Danach werden die Magnetit-Konjugate mittels Magnet von den Überständen abgetrennt und diese
spektralphotometrisch vermessen. Nach dieser Lagerung befindet sich kein Dextranblau in den Überständen der säurebehandelten und der unbehandelten Präparationen. Anschließend werden die Proben zwei Stunden bei 80°C gemeinsam im Wasserbad erhitzt, die Magnetit-Konjugate erneut mittels Magnet von den Überständen getrennt und vermessen. Nur bei den säurebehandelten Magnetit-HSA- Dextranblau-Konjugaten kann eine deutliche Blaufärbung der Überstände nachgewiesen werden, während die nicht mit Säure behandelten Präparationen kein Dextranblau in den Überstand abgeben. Die stärkste Freisetzung von Farbstoff wird bei einer Salzsäurekonzentration von 0,1 bis 0,3n gemessen. Auch diese Experimente sprechen für eine völlig veränderte Struktur der säurebehandelten Magnetitkonjugate mit geöffneten Porenstrukturen.
Beispiel 22
Verkapselung von Farbstoffen (Bromphenolblau) mit Trägerprotein, Oxalsäurebehandlung
2 ml einer Lösung von HSA (Humanserumalbumin, 5 mg/ml) und Bromphenolblau (10 mg/ml) werden mit 1ml konzentriertem Ammoniak vermischt. Die alkalische Lösung wird mit 2 , 6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H0, 54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:10 verdünnt, versetzt und durchmischt. Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit
30 ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch dreimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Magnetit-Konjugate, die HSA und Bromphenolblau enthalten. Die Waschlösungen werden spektralphotometrisch vermessen und die Menge des verkapselten Farbstoffes kalkuliert. Die Kalkulation ergibt, dass
ca. 60% des Bromphenolblaus mittels Magnetit verkapselt wurden. Die Konjugat-Präparation wird aliquotiert und die Aliquots mit unterschiedlichen Konzentrationen Oxalsäure (0,01%-10%) 3 Min. behandelt und anschließend mit jeweils 30 ml Wasser dreimal gewaschen. Eine Probe bleibt unbehandelt. Die Magnetit-Konjugate werden in lml destilliertes Wasser aufgenommen und in Eppendorfröhrchen überführt. Die Proben werden zunächst 3 Stunden bei Zimmertemperatur und danach bei 4°C über Nacht gelagert. Danach werden die Magnetit-Konjugate mittels Magnet von den Überständen abgetrennt und diese spektralphotometrisch vermessen. Nach dieser Lagerung befindet sich kein Bromphenolblau in den Überständen der säurebehandelten und der unbehandelten Präparationen. Anschließend werden die Proben zwei Stunden bei 80°C gemeinsam im Wasserbad erhitzt, die Magnetit-Konjugate erneut mittels Magnet von den Überständen getrennt und vermessen. Nur bei den säurebehandelten Magnetit-HSA-Bromphenolblau-Konjugaten kann eine Blaufärbung der Überstände nachgewiesen werden. Die stärkste Freisetzung von Farbstoff wird bei einer Oxalsäurekonzentration von 0,05-4% gemessen. Auch diese Experimente sprechen für eine völlig veränderte Struktur der säurebehandelten Magnetitkonjugate mit geöffneten Porenstrukturen.
Beispiel 23
Verkapselung von Proteinen mit zusätzlichen funktioneilen Gruppen, immunologischer Nachweis
2 ml einer Lösung von FITC-markiertem BSA (Rinderserumalbumin, 5 mg/ml) werden mit 1 ml ammoniakalischer Lösung • vermischt. Die alkalische Lösung wird mit 2,6 ml Fe-Stammlösung (21g FeCl2 x 4H20,
54,7g FeCl3x6H20 + 200 ml H20) , 1:20 verdünnt, versetzt und durchmischt.
Die schwarz ausfallenden Konjugate werden sofort mittels eines Magneten abgetrennt und mit 30ml Wasser versetzt, geschüttelt und wieder magnetisch abgetrennt. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt. Der gewaschene Niederschlag enthält stabile Konjugate, die FITC-BSA enthalten. Die Konjugat-Präparation wird aliquotiert. Eine Probe bleibt unbehandelt, andere werden mittels unterschiedlicher Konzentrationen (0,1- 5%) Oxalsäure behandelt und anschließend dreimal mit je 30 ml Wasser gewaschen, in lml Wasser aufgenommen und in ein Eppendorfröhrchen überführt. Jeweils 3 μl der Präparate werden analog zu Bsp. 2 auf Nitrocellulose getüpfelt und mit einem Peroxidase-markierten Antikörper gegen FITC inkubiert. Nach PBS Waschung wird mittels ECL-System auf Peroxidaseaktivität (Auswertung über Chemolumineszenz) geprüft: Wie in Bsp. 2 arbeiten alle Positiv- und Negativkontrollen korrekt. Nur die mit Oxalsäure behandelten Präparationen zeigen deutliche Signale. Das heißt der gegen FITC gerichtete Antikörper konnte das FITC am BSA erreichen und immunologisch erkennen. Die optimale Oxalsäure- konzentration liegt bei 0,1-1%.