WO2009156446A1 - Kompos itstruk tur umfassend ein nanoteilchen und ein dentritisches makromolekuel mit saccharid-einheiten - Google Patents

Kompos itstruk tur umfassend ein nanoteilchen und ein dentritisches makromolekuel mit saccharid-einheiten Download PDF

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dendritic
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branched
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Dietmar Appelhans
Mathias Lakatos
Wolfgang Pompe
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Endress+Hauser Conducta Gesellschaft Für Mess- Und Regeltechnik Mbh+Co. Kg
Leibnitz-Institut für Polymerforschung Dresden e.V.
Technische Universität Dresden, Institut Für Werkstoffwissenschaften
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Definitions

  • the invention relates to a composite structure comprising at least one nanotech and at least one dendritic macromolecule which stabilizes the nanotechings.
  • a composite structure can be used in biochemistry or biophysics, in particular in biotechnology and in biosensorics.
  • Markers are used in biochemistry, biophysics, medicine and bioprocess engineering, for example for the following purposes:
  • biomolecules are understood to mean molecules that play a role in biological, biochemical or biophysical systems, for example a ligand or a receptor in a ligand / receptor system, a bioactive molecule, a bioactive macromolecule, a biological recognition sequence , in particular an oligo- or polynucleotide or a peptide-containing recognition sequence.
  • markers for example, luminescence markers, in particular
  • Fluorescent marker or magnetic markers in question.
  • Detection of the labeled biomolecules for example, the spatial distribution of labeled biomolecules, for example, in cells to determine.
  • intensity of the marker response for example, emitted fluorescent light or a magnetic field relaxation in magnetic markers
  • concentration of labeled biomolecules can be determined.
  • Luminescence markers for example, play an important role in biosensing, for example in the known EIA / ELISA assay method.
  • Magnetic markers are used, for example, in magnetic relaxation immunoassays (MARIA).
  • luminescence markers should preferably be multiply and / or permanently excitable and chemically and photochemically robust.
  • Common fluorescent labels include, for example, aromatics, heterocycles or modified fluorescent DNA bases. Such organic molecules degrade after a series of optical excitations or a longer-lasting optical excitation, so that a sufficient photochemical stability is not guaranteed. This effect is also known by the term "photobleacher”.
  • the marking In the field of biosensing, it is also advantageous if the marking remains stable over the widest possible range of environmental variables, for example over a broad pH range and temperature range.
  • the biocompatibility of the marker plays an important role.
  • EP 1 473 347 B1 describes inorganic fluorescent core-shell nanoparticles and their use as labels in a bioassay method, in particular in a FRET (fluorescence resonance energy transfer) or an RET (resonance energy transfer) assay method.
  • These luminescent nanoparticles comprise a core of a first metal salt or metal oxide which surrounds a shell of a second metal salt which is luminescent and has non-semiconductor properties.
  • Such fluorescent inorganic nanoparticles should have a higher photochemical stability than, for example, organic fluorescent dyes such as fluorescein or rhodamine. However, the synthesis of such particles is relatively expensive. In order to bind the inorganic core-shell nanoparticles as labels to biomolecules, further functionalization of their surface is required, which as a rule requires several further synthesis steps.
  • Nanoparticles is attributed to the polyethylene oxide group present in the middle of the polymer chain of the diamine block polymer.
  • Groups of the diamine block polymer, after formation of the nanoparticles, can be used to covalently attach proteins or nucleic acids to the nanoparticles.
  • a disadvantage of these nanoparticles is that the ligand shell formed from diamine block polymer is still relatively open and flexible, thus offering uncontrollable non-covalent interactions with the metallic core or ligand shell, resulting in coupling of the individual within the ligand shell relieved of metallic cores.
  • nanoparticle markers are to be provided which are chemically robust, remain stable over a large number and / or a long duration of excitations, in particular fluorescence excitations, and preferably have high biocompatibility and good functionality.
  • a composite structure comprising: at least one nanoparticle, in particular with luminescence properties or magnetic properties, and at least one dendritic macromolecule which has an inner region with branched, in particular highly branched to perfectly branched
  • a periphery comprising surface groups of the dendritic macromolecule, characterized in that a plurality, in particular more than 50%, of the surface groups in the periphery of the dendritic macromolecule are each at least one functional Group of the first type, wherein the functional group of the first type comprises at least one monosaccharide, oligosaccharide and / or polysaccharide unit, wherein the dendritic macromolecule stabilizes the nanoparticle.
  • a dendritic macromolecule is understood as meaning not only highly branched (also hyperbranched) polymers but also dendrimers ais representatives of the perfectly branched macromolecules. Further details can be found in the review articles by Voit (Acta Polymer, 1995, 46, pp. 87-99), Tomalaea (Angew Chem 1990, 102, pp. 119-157) and Vögtie (Prague, Polym. 25, p. 987-1041) for the construction of dendritic polymers or dendritic macromolecules, where dendrimeric spherical molecular forms and highly branched polymers have globular or more open molecular structures.
  • FIG. 5 shows characteristic structural units of dendrimers and hyperbranched polymers.
  • Fig. 5 a shows a perfectly branched dendrimer with a branching kernel K.
  • branching kernel K branched dendritic units D branch off like a tree structure, to which further dendritic units D are connected.
  • a perfectly branched dendrimer structure thus means a structure in which all branchings are used, ie where a degree of branching of 100% is present.
  • the number of levels of dendritic units D is referred to as the "generation" of the dendrimer
  • the periphery of the dendrimer is formed by terminal units T to which no further branching units D connect In the example of Fig. 5 a), the terminal units T each have two surface groups B.
  • Fig. 5 b shows a highly branched dendritic polymer Starting from a focal group A propagate as branching units dendritic units D, wherein not every branching point is used. The degree of branching of a highly branched dendritic polymer is thus below 100%, often between 40 and 70%. In such structures, highly branched structures are used. As in the case of the dendrimer shown in FIG.
  • cavities C are present in the inner region of the highly branched dendritic polymer within the highly branched structure.
  • the periphery of the hyperbranched dendritic polymer is formed by terminal units T carrying one or more end groups B and by linear units L carrying one or more end groups B.
  • the linear units In contrast to the terminal units T, to which no further branching units D connect, the linear units likewise have one or more terminal groups B which do not lead to any further branching, but they are connected by at least one bond to further branching units D, which do not form an end group 8, but contribute to the branched structure.
  • a part of the end groups B of the linear units L can therefore be present in the inner region of the highly branched dendritic polymer, while a further part of the end groups B of the linear units I can be present as surface groups of the hyperbranched dendritic polymer in the periphery.
  • the surface groups of the dendritic macromolecule may in turn comprise one or more functional groups.
  • a functional group may in principle be formed from an atom or a group of atoms.
  • a plurality of the surface groups of the dendritic macromolecule each comprise at least one functional group of the first type, the functional group of the first type comprising at least one monosaccharide,
  • Oligosaccharid- and / or polysaccharide unit has.
  • a Oligosaccharide is understood to mean a carbohydrate composed of several identical or different monosaccharides linked by glycosidic linkages. Depending on the number of monosaccharide units present, one speaks of di-, tri-, tetra-, pentasaccharides, etc., which may be both linear (unbranched), and also branched.
  • the distinction between oligosaccharides and polysaccharides is fluid and depends on whether a defined structure with a certain molecular weight is present (oligosaccharide), or only a statistical distribution of the molecular size is to be determined (polysaccharide).
  • the functional group of the first kind may have further groups beyond the mono-, oligo- and / or polysaccharide unit.
  • the plurality of surface groups having a first-order functional group may be, in particular, monosaccharide, oligosaccharide or polysaccharide groups or functional groups formed from a derivative of a monosaccharide, an oligosaccharide or a polysaccharide.
  • the nanoparticle of the described composite structure forms the component serving for the actual marking, ie the nanoparticle has detectable properties, in particular luminescence properties or magnetic properties.
  • Luminescence characterizes the property of the nanoparticles to absorb energy (eg in the form of light of the IR, VIS or UV spectrum), which is then radiated again as light of lower energy.
  • the at least one dendritic macromolecule having a plurality of surface groups comprising at least one first-order functional group having at least one mono-, oligo- or polysaccharide-type serves to stabilize the nanoparticle in the composite structure.
  • saccharide-functionalized dendritic macromolecule The structural unit of the composite structure formed from the dendritic macromolecule and its functional groups is abbreviated hereafter as “saccharide-functionalized dendritic macromolecule” or, as far as the dendritic macromolecule is a highly branched polymer or a Dendrimer, referred to as “saccharide-functionalized hyperbranched polymer” or as “saccharide-functionalized dendrimer”.
  • the shape of the nanotech may be e.g. acicular, ellipsoidal or spherical, with the latter two options being preferred.
  • the nanoparticle preferably has a size of 0.5 to 20 nm measured along its longest axis. A size of 0.5 to 10 nm or 0.5 to 5 nm or even 0.5 to 2 nm is even more advantageous.
  • a plurality, in particular at least 50%, of the surface groups of the dendritic macromolecule have at least one functional group with a mono-, oligo- or polysaccharide unit
  • these functional groups of the first kind form a densely packed "saccharide shell" around the dendritic macromolecule formed structural unit of the composite structure is so tightly packed and rigid that it effectively prevents the aggregation of the nanoparticles and also reduces an interaction of the nanoparticles with chemical substances in the environment.
  • a dendrimer based on polyamines whose surface groups are 50%
  • each terminal moiety may have a first surface group comprising a mono-, oligo-, or polysaccharide group, wherein the second surface group of the terminal amine moiety is formed by, for example, a hydrogen atom can be.
  • the saccharide shell offers the advantage of high biocompatibility of the entire composite structure, especially in comparison to a "free"
  • Saccharide shell readily functionalized, i. it can with little effort and with known methods of saccharide chemistry, a variety of different types of functional groups of the second kind to the functional mono-, oligo- or
  • Polysaccharide groups become attached to these functional groups second type to connect other molecules, in particular Biomoieküle with the composite structure.
  • the existing hydroxide groups of the mono-, oligo- or polysaccharide groups can also serve as functional groups of the second kind for attachment to further molecules, in particular to biomolecules.
  • the nanoparticle may have luminescent properties.
  • a luminescent nanoparticle may comprise one or more metals, in particular noble metals, for example the nanoparticle may consist of gold, silver or copper or a mixture of at least two of these metals.
  • a fluorescent nanodiamond comes here as nanoparticles in question.
  • Luminescent nanoparticles can also be so-called quantum dots (quantum dots). These are semiconductor nanoparticles, in particular M-VI or Ifl-V semiconductors, which may be doped, and which are characterized by a quantum confinement of both the electrons and the holes in all three spatial directions. Such nanoparticles are suitable, for example, for applications as luminescence markers in an assay based on an optical transduction principle.
  • the nano-particles may additionally or alternatively also have magnetic properties.
  • a magnetic nanoparticle may comprise, for example, one or more metals from the group iron, cobalt, nickel or a metal oxide, wherein the metal oxide is in particular formed from the group consisting of iron oxide, in particular magnetite Fe 3 O 4 or ⁇ -Fe 2 O 3 , barium ferrite, strontium ferrite , Chromdäoxid and iron oxides with manganese, copper, nickel or cobalt additives may be selected.
  • the magnetic nanoparticle may be used to label biomolecules in a magnetic assay, ie, an assay based on a magnetic transduction principle.
  • Luminescent metal nanoparticles advantageously have an extent of less than 2 nm along their longest axis, in particular between 0.5 and 1.5 nm.
  • Magnetic metal or metal oxide nanoparticles advantageously have an extent of between 0.5 and 50 nm along their longest axis, preferably between 0.5 and 20 nm, or even between 0.5 and 10 nm.
  • the nanoparticle has on its surface a multiplicity of moieties which are bound to the surface
  • Dispersionstabiiisators that form a shell around the nanoparticles on.
  • Dispersion stabilizer may in particular be an n-alkanethioi, a thiol- and / or amine-functionalized phenol, or a carboxyl-functionalized alkanethiol, for example octadecanethiol, aminothiophenol or mercaptoundecanoic acid or a derivative of octadecanethiol, aminothiophenol or
  • Be mercaptoundecanoic acid Be mercaptoundecanoic acid.
  • These dispersion stabilizers are particularly well suited for the stabilization of metal nanoparticles in the synthesis in organic or aqueous solution. Night-covalent interactions between the free end groups of the dispersion stabilizer molecules and the dendritic macromolecule make a significant contribution to the stabilization of the nanoparticle by means of the saccharide-functionalized dendritic polymer.
  • a dendrimer in particular of the third to tenth generation, as the dendritic macromolecule in the above-described composite structure which is selected from the group consisting of polypropyleneimines (PPI) 1 polyamidoamines (PAMAM) and polyetherimines (PEI ) and their derivatives.
  • PPI polypropyleneimines
  • PAMAM polyamidoamines
  • PEI polyetherimines
  • the dendritic macromolecule may be a highly branched polymer, preferably having an average molecular weight of less than 10,000 g / mol, which is selected from the group preferably consisting of highly branched poly (ethyleneimines), highly branched polyglycerols, highly branched polyamides, hyperbranched polylysines, hyperbranched polyester esters and derivatives thereof,
  • the functional group of the first kind may be a monosaccharide group, a linear or branched oligosaccharide group, a linear or branched polysaccharide group, a derivative of a monosaccharide, a derivative of a linear or branched oligosaccharide, or a derivative of a linear one or branched polysaccharide.
  • glucose, fructose, gaiactose, maltose, lactose, cellobiose, mannose, dimannose, melobiose, maltotriose and / or maltoheptaose groups and / or derivatives of these groups are suitable.
  • a multiplicity, in particular more than 50%, of the terminal units present in the periphery comprises one, two or more functional groups of the first type.
  • the fluorescent nanoparticle in the inner region of the dendritic macromolecule in a cavity, also referred to as dendritic cage ("dendritic box” or “dendritic cage”) is included.
  • the second possibility is that at least two saccharide-functionalized dendritic macromolecular units are adjacent to the nanoparticle with their peripherals and can be bound by interactions, in particular by noncovalent interactions, such as, for example, van der Waals. Interactions with the ligand shell of the nanoparticle formed from the above-mentioned dispersion stabilizer stabilize.
  • the composite structure described above is characterized by a slight functionalizability with known processes in the field of sugar chemistry. This can be exploited for the purpose of binding the composite structure to a biomolecule. It is particularly advantageous in this context if at least one surface group of the dendritic macromolecule and / or at least one functional group of the first type belonging to a surface group of the dendritic macromolecule comprises a functional group of the second kind which is particularly suitable with a biomolecule, in particular a ligand or a receptor of a ligand / receptor system, a bioactive molecule, a bioactive macromolecule, a biological recognition sequence, in particular an oligo or polynucleotide, or a peptidic recognition sequence.
  • the functional group of the second kind may, for example, form a surface group bonded to a terminal unit or a linear unit of the dendritic macromolecule.
  • the functional group of the second type may be also bonded to a functional group of the first type containing surface group, for example a bonded to a terminal unit or linear functional mono-, oligo- or Polysaccha ⁇ 'd group.
  • a ligand / receptor system consists of two molecules, a ligand and a receptor that bind specifically to one another. Such systems are used in biosensing to detect an analyte in a sample.
  • the analyte forms the ligand of the system bound to a receptor that binds specifically to the ligand.
  • the binding of the composite structure to a biomolecule can be produced by attaching one or more functional groups of the second type to a surface group of the dendritic macromolecule or to a functional group of the first type, in particular a mono-, oligo- or polysaccharide group a biomass molecule are capable.
  • the biomolecule may accordingly have a functional group of the third kind, which preferably binds to the functional group of the second kind of the composite structure.
  • the second-order functional group may be a streptavidin group
  • the biomolecule may have a biotin group accordingly. This will generally result in the bonding between the composite structure and biomolecule being preferentially formed via a biotin-streptavidin compound.
  • the term "functional group” in this context is not limited to reactive groups that form covalent bonds with the optionally functionalized biomolecule, but also includes chemical groups that result in a night-covalent interaction, eg, ionic interaction or hydrogen bonding It is possible that the binding of the composite structure takes place via already existing surface groups of the dendritic macromolecule and from the outset functional groups of the biomolecule It is also possible for the surface groups of the macromolecule and / or the biomolecule to close first Functionaläsieren to produce the corresponding bond.
  • hydroxide groups of the mono-, oligo- or polysaccharide units comprising functional groups of the first kind may serve as functional groups for attachment to a functional group of the biomolecule.
  • the binding of the composite structure can furthermore also take place via an enzymatic reaction between a mono-, oligo- or polysaccharide group bound to the dendritic macromolecule and the biomolecule.
  • the functional group of the second kind is bonded directly to a surface group of the dendritic macromolecule, it may be, for example, an amino group, an acid group, an epoxide group, an azide group, an alkyne group, an alkene group, an activated ester group, an aldehyde group, an amide derivative group, a SuifonTexreamidderivatsti, a Suifataff, a sulfonate group, a halogen group, an activated ether group or a thiol group.
  • the functional group of the second kind is bound to a functional group of the first kind, it may be, for example, a hydroxy group, a
  • Amino group an acid group, an epoxide group, an azide group, a
  • the functional group of the third kind that is the one to the Biomoiekü! bonded functional group is selected so that it preferably binds with the present functional group of the second kind, is therefore considered as a functional group of the third kind, an amino group, an acid group, an epoxide group, an azide group, an alkyne group, an alkene group, a activated ester group, aldehyde group, amide derivative group, sulfonic acid amide derivative group, sulfate group, sulfonate group, halogen group, activated ether group or thio group.
  • stabilized nanoparticles in particular with a diameter of less than 10 nm, preferably between 0.8 and 2 nm, are dispersed in an aqueous solution of dendritic macromolecules with a dispersion stabilizer, the dendritic macromolecules forming an inner region with branched, in particular perfectly branched to highly branched, structures and one Periphery comprising soft surface groups of the dendritic macromolecules, wherein a plurality of the surface groups of the dendritic macromolecules each have at least one functional group of the first kind, wherein the functional group of the first kind comprises at least one mono-, oligo- or polysaccharide unit.
  • an n-alkanethiol, a thiol- and / or amine-functionalized phenol, or a carboxyl-functionalized alkanethiol for example, octadecanethiol, aminothiophenol or mercaptoundecanoic acid or a derivative of octadecanethioi, aminothiophenol or mercaptoundecanoic acid can be used.
  • the described composite structures can be used for labeling biomolecules in a biological, biochemical, biophysical or medical process, in particular in the field of biosensing, in competitive or non-competitive assays, in particular based on an optical or magnetic transduction principle.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the composite structure a) in a first variant, in which the nanoparticle is arranged in a cavity in the inner region of a dendritic macromolecule; b) in a second variant, in which the nanoparticle is surrounded by several saccharide-functionalized dendritic macromolecules and thus stabilized;
  • Fig. 2 a a structural formula of a first saccharide-functionalized
  • Dendrimers b) a structural formula of a second saccharide-functionalized
  • Fig. 4 a a structural formula of a first saccharidfunktionalisäerten
  • Dendrimers having an additional second-order functional group on a saccharide moiety for attachment to a biomolecule b) a structural formula of a second saccharidfunktionaläs possess
  • Dendrimers having an additional second-order functional group at an end-group of the dendrimer for attachment to a biomolecule
  • Fig. 5 a) the structure A of a dendrimer; b) Structure B of a highly branched polymer.
  • FIG. 1 a shows a schematic representation of the composite structure 1 in a first variant, in which the nanoparticle 2 is arranged in a cavity in the inner region of the dendritic macromolecule 4, on the periphery of which a multiplicity of functional mono-, oligo- or polysaccharide- Groups are present which form a saccharide shell 5.
  • a composite structure 1 may, for example, as nanoparticles 2, a gold nanoparticle having a diameter of 0.5 to 2 nm measured along its longest axis and a dendritic macromolecule 4 a fourth generation PPI dendrimer whose terminal amine units each have two surface groups , include.
  • the nanoparticle 2 is surrounded by a dispersion stabilizer shell 3, in the present example a gold nanoparticle, for example of n-alkanethiol molecules.
  • N-alkanethiols can be used in the synthesis of the gold nanoparticles as a dispersion stabilizer, as described in more detail below. Due to the hydrophobic properties of the inner region of the PPI dendrimers, the nanomaterials 2 can be taken up and stabilized with their dispersion stabilizer layer 3 within a cavity of the branched structure of the dendrimer 4.
  • FIG. 2 a) shows a fourth generation saccharide-functionalized PP! Dendrimer 4 "which can be used, for example, in a composite structure according to FIG. 1 a) as the dendritic macromolecule stabilizing the gold nanotech 2.
  • the PPI dendrimer 4" has a branching nucleus 6 "from which repetitive units propagate, each nitrogen atom serving as a branching point, from which two new" branches “emerge. In this way, a substantially spherical shape of the PPi dendrimer 4 "results. Within the sphere formed in this way are cavities 7", in which a nanotech 2 (not shown in FIG.
  • a dispersion stabilizer layer 3 eg a gold nanotech with a n-Alkanthiol-Hü! le, can be taken and stabilized.
  • a functional group R eg a gold nanotech with a n-Alkanthiol-Hü! le
  • the terminal units 8 "of the dendrimer 4" are each bound two surface groups comprising a functional group R.
  • the functional groups R are maltose groups, ie di-saccharide groups. Since each terminal unit 8 "has two di-saccharide groups each, a densely packed oligosaccharide shell results around the dendrimer 4". This leads to an increased rigidity of the entire molecule.
  • Nanomaterials 2 'with its dispersion stabilizer layer 3' is stabilized by several saccharide-functionalized dendritic macromolecules which surround it spatially.
  • An example of such a composite structure 1 ' comprises Gold nanoparticles surrounded by a shell of n-alkanethiol molecules, each having a terminal acid group, for example an ⁇ -mercapto-alkanoic acid.
  • the dendrimer 4 'used in this example is again the PPI dendrimer 4 "of the fourth generation shown in FIG. 2 a) with terminal units 8" functionalized twice by maltose groups, thereby forming a di-saccharide shell 5'.
  • the acid groups of the ⁇ -mercapto-alkanoic acid molecules can interact both with nitrogen atoms of the branched structure of the PPI dendrimer in its inner region and with nitrogen atoms on the periphery of the PPI dendrimer, in the latter case a composite structure 1 'is formed, in which the nanotube 2 'of several saccharide-functionalized dendrimers 4' is surrounded and shielded.
  • the nanoparticle 2 ' is also effectively shielded from the chemical environment, so that both interactions with other nanoparticles 2', in particular Ostwald ripening, as well as chemical influence by ions or molecules in solution are effectively impeded or prevented.
  • FIG. 2 b shows a further example of a saccharide-functionalized dendrimer 4 '"suitable for forming a composite structure with a nanoparticle, in particular a gold nanoparticle, which is a PPI dendrimer having a branching core 6'" and outgoing amine branch units.
  • the terminal units 8 '''of the PPI dendrimer in this case each have two surface groups, one surface group each comprising only one hydrogen atom, while the other surface group comprises an OSigosaccharide unit R, wherein the oligosaccharide unit R in the present example is a maltotriose group Due to the greater space requirement of maltotriose compared to the maltose of the example shown in Fig.
  • maltose or maitotriose functional groups and their derivatives are also other functional groups, the mono- or
  • dendrimer 4, 4 ', 4 ", 4'” be functionalized with different mono- or oligosaccharide groups, in particular with
  • the preparation of fluorescent gold nanoparticles in an organic medium can be carried out, for example, according to a method described in Zheng J., Flourescent Noble Metal Nanoclusters, Dissertation, Georgia Institute of Technology, April 2005.
  • the reduction of HAUCI 4 ⁇ 2 O to form colloidal nanoparticles is carried out by adding sodium borohydride NaBH 4 at room temperature. For a substantially complete reaction conversion, the solution is then allowed to stand for one day.
  • the thiol-stabilized nanotechings thus obtained can be converted into an aqueous solution by means of the dendrimer structures described with reference to FIGS. 2 a) and b) and stabilized therein.
  • the gold nanoparticles with their octadecanethiol or aminothiophenol shell are first separated from the organic solvent by a centrifugation step.
  • the centrifugation is preferably carried out for about 30 minutes at 25,000 g.
  • the sediment is suspended in an aqueous solution with a dendrimer content of 0.1% by weight.
  • a solution of saccharide-functionalized fourth generation PPI dendrimer e.g. as shown in FIG.
  • the ratio of the concentration of dendrimer to nanoparticles is chosen in the range of 0.7 to 1.7.
  • the gold nanoparticles are absorbed and stabilized in the cavities in the dendrimer structure due to the described non-covalent interaction between their octadecanethiol or aminothiophenol shell and the nitrogen atoms present in the inner region of the dendrimers.
  • the fluorescence signals (see Figures 3a and b)) of the nanoparticles remain stable even after the formation of the composite structure by nanoparticles and stabilizing saccharide-functionalized PPI dendrimer, in particular, no shift of the signals to higher or lower wavelengths is observed.
  • the preparation of fluorescent gold Nanoteiichen in aqueous solution is carried out with tetrachloroauric acid HAuCI 4 -H 2 O as starting material, for example in a 0.3 molar sodium hydroxide solution containing 0.3 mol / l mercaptoundecanoic acid.
  • tetrachloroauric acid HAuCI 4 -H 2 O
  • Tetrachloroauric acid is added accordingly in a concentration dependent on the desired fluorescence wavelength.
  • the formation of the gold nanoparticles starts from a concentration ratio between tetrachloroauric acid and mercapto-decanoic acid of more than 0.01.
  • the use of an additional reducing agent is not necessary in the aqueous solution.
  • the preparation of about 1 ml solution of reddish fluorescent gold nanoparticles is described here. To this is added 10 ⁇ l of the mercapto-decanoic acid solution in 0.3 M sodium hydroxide solution to 1 ml of 0.25 mM tetrachloroauric acid HAuCl 4 H 2 O at room temperature. For the fullest possible reaction conversion, the solution is then allowed to stand for about one day.
  • the gold nanoparticles formed may be centrifuged as described above and then suspended in an aqueous solution of a saccharide-functionalized dendrimer, for example as described above, in an aqueous solution containing sativo-functionalized PPI dendrimer of the fourth generation of 0.1% by weight ,
  • the ratio of the concentration of dendrimer to nanoparticles is chosen in the range of 0.7 to 1.7.
  • the preparation of composite structures 1, 1 'with a Nanoteiichen 2 and one or more nanoparticles 2 stabilizing dendritic macromolecules 4 with functional groups comprising mono- or oligosaccharide units and are so densely packed that they have a Saccharidhülle 5 to the dendritic macromolecule 4 can, for a variety of metal or metal oxide nanoparticles and dendritic macromolecules with mono-, oligo- or polysaccharid phenomenon in an analogous manner, as described here by means of specific examples, carried out.
  • Metal salts are used as metal-containing reactants.
  • Suitable dispersion stabilizers are in principle alkanethiols, for example octadecanethiol or dodecanethiol or thiophenols, for example aminothiophenol or, in general, thiols or mercaptans and derivatives of these, for example, with acid groups functionalized alkanethiols or thiophenols.
  • This two - stage synthesis process in which the nanoparticles are first synthesized and subsequently stabilized by a saccharide - functionalized dendritic macromolecule, in particular for conversion into an aqueous solution, for example by embedding in a cavity within the branched structure, permits very precise adjustment of combinations of properties of the nanoparticles or nanoparticles the saccharide shell of the composite structure.
  • the fluorescence wavelength can be adjusted in the first synthesis step by choice of dispersion stabilizer, concentration ratios, or other reaction conditions, while desired peripherial properties of the composite, such as desired functionalization, as described below, are independently set and only in the second Syntheseschrätt the composite structure can be added.
  • the resulting composite structures show high stability even under extreme chemical conditions, for example in solutions over a wide pH range between 1 and 13 and / or with high salt concentrations.
  • Another advantage of the composite structures described herein is that the functional groups having a mono- or oligosaccharide moiety can be equipped with a variety of functional groups by standard saccharide chemistry techniques. These functional groups can serve to bind the composite structure as a label to biomolecules in biological, biochemical or biophysical systems.
  • FIG. 4 a) shows the fourth generation PPI dendrimer shown in FIG. 2 a) wherein the nitrogen atom of each terminal amine unit is two Having surface groups each comprising a functional group R.
  • the functional groups R are maltose groups.
  • One of the maltose groups is further functionalized with an acetic acid group (-CH 2 COOH) and so biases a total of R 1 .
  • the acetic acid group can be used as a functional group to attach a composite structure formed from one or more molecules of the saccharide-functionalized dendrimer shown in FIG. 4 a and a nanotechings optionally surrounded by a dispersion bar sheath to a biomolecule by means of a functional group complementary to the acetic acid group Biomoieküls serve.
  • FIG. 4 b) shows the PPI dendrimer shown in FIG. 2 a) with two maltose surface groups on each of the terminal units of the dendrimer, wherein an ⁇ -lipoic acid is substituted on a nitrogen atom of an end group of the dendrimer instead of a maltose group Group is bound.
  • the ⁇ -lipoic acid group is bonded to the nitrogen atom 9 of a terminal amine moiety of the dendrimer A.
  • the ⁇ -lipoic acid group may be used to attach a functional group of a biomolecule, e.g. a thiol group, serve.
  • a biomolecule which originally has no thiol group, can also be bound to the ⁇ -uroic acid functionalized composite structure of the present example by the biomolecule! previously functionalized with a thiol group.
  • the composite structure has luminescent properties, its use in biosensors that are designed according to common optical transduction principles, such as in ELISA / EIA tests or investigations of biological systems using a fluorescence microscope.
  • the composite has magnetic properties, it may be used, for example, as a label in a magnetic assay, e.g. MARIA, to be applied.

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Abstract

Eine Kompositstruktur, beispielsweise zur Markierung von Biomoiekülen in einem biologischen, biochemischen oder medizinischen System, umfasst: mindestens ein Nanoteilchen und mindestens ein dendritisches Makromolekül, welches einen inneren Bereich mit verzweigten, insbesondere perfekt verzweigten bis hochverzweigten, Strukturen und eine Peripherie aufweist, welche Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls umfasst, wobei eine Vielzahl, insbesondere mehr als 50% der Oberflächengruppen in der Peripherie des dendritischen Makromoleküls jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art aufweisen, wobei die funktionelle Gruppe erster Art mindestens eine Monosaccharid-, Oligosaccharid- und/oder Polysaccharid-Einheit umfasst, und wobei das dendritische Makromolekül das Nanoteilchen stabilisiert.

Description

Kompositstruktur
Die Erfindung betrifft eine Kompositstruktur, umfassend mindestens ein Nanoteüchen und mindestens ein dendritisches Makromolekül, welches das Nanoteüchen stabilisiert. Eine derartige Kompositstruktur kann in der Biochemie oder Biophysik, insbesondere in der Biotechnologie und in der Biosensorik, Anwendung finden.
Markierungen werden in der Biochemie, Biophysik, Medizin und Bioverfahrenstechnik beispielsweise für folgende Zwecke eingesetzt:
- Zur Bestimmung der Affinität zweier Biomoleküie bis hin zur quantitativen Bestimmung der Kompiexbildungskonstanten;
- Zur räumlichen und/oder zeitlichen Beobachtung von Transportvorgängen, beispielsweise von bioaktiven Molekülen, in Zeilen, insbesondere auch für diagnostische und therapeutische Anwendungen;
- Zur Detektion und/oder Konzentratäonsbestimmung eines Analyten in einer Probe mittels eines Biosensors auf Basis einer affinen Wechselwirkung, z.B. Antikörper/Antigen oder DNA-Einzelstrang/dazu komplementäre DNA- Sequenz, mittels gängiger Assay-Verfahren; - Zur Untersuchung bzw. Detektion von Protein/Protein-Wechselwirkungen.
Wenn im Folgenden von Biomolekülen die Rede ist, sind Moleküle gemeint, die in biologischen, biochemischen oder biophysikalischen Systemen eine Rolle spielen, beispielsweise ein Ligand oder ein Rezeptor in einem Ligand/Rezeptor-System, ein bioaktives Molekül, ein bioaktives Makromolekül, eine biologische Erkennungssequenz, insbesondere ein Oligo- oder Polynukleotid oder eine peptidäsche Erkennungssequenz.
Bedarf besteht in all diesen Anwendungen an langlebigen, chemisch robusten Markern. Als Marker kommen beispielsweise Lumineszenzmarker, insbesondere
Fluoreszenzmarker, oder magnetische Marker in Frage. Mittels ortsaufgelöster Detektion der markierten Biomoleküle lässt sich beispielsweise die räumliche Verteilung markierter Biomoleküle z.B. in Zellen, bestimmen. Durch Messung der Intensität der Markerantwort, beispielsweise von abgestrahlten Fluoreszenzlicht bzw. einer Magnetfeldrelaxation bei magnetischen Markern, kann die Konzentration markierter Biomoleküle ermittelt werden. Lumineszenzmarker spielen beispielsweise in der Biosensorik, beispielsweise im bekannten EIA/ELISA Assay- Verfahren, eine wichtige Rolle. Magnetische Marker werden beispielsweise in magnetischen Relaxations-Immunoassays (MARIA) angewendet.
Marker mit Lumineszenzeigenschaften, sogenannte Lumineszenzmarker, sollen vorzugsweise vielfach und/oder dauerhaft anregbar und chemisch sowie photochemisch robust sein. Gängige Fluoreszenzmarkierungen umfassen beispielsweise Aromaten, Heterozyklen oder modifizierte fluoreszierende DNA- Basen. Solche organischen Moleküle degradieren nach einer Reihe von optischen Anregungen oder einer länger andauernden optischen Anregung, so dass eine ausreichende photochemische Stabilität nicht gewährleistet ist. Dieser Effekt ist auch unter dem Begriff „Photobleachäng" bekannt.
Im Bereich der Biosensorik ist es zudem vorteilhaft, wenn die Markierung über einen möglichst breiten Bereich von Umgebungsvariablen, beispielsweise über einen breiten pH-Wert- und Temperaturbereich stabil bleibt. Bei der Beobachtung von Transportvorgängen in Zellen spielt die Biokompatibilität des Markers eine wichtige Rolle.
In EP 1 473 347 B1 werden anorganische fluoreszierende Kern-Mantel- Nanoteilchen und deren Verwendung als Markierungen in einem Bioassay- Verfahren, insbesondere in einem FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)- bzw. einem RET (Resonanzenergietransfer)- Assayverfahren beschrieben. Diese lumineszenten Nanopartikel umfassen einen Kern aus einem ersten Metallsalz oder Metalloxid, welcher umgeben äst von einer Schale aus einem zweiten Metallsalz, das lumineszent ist und Nicht-Halbleiter-Eigenschaften aufweist. Derartige fluoreszierende anorganische Nanopartikel sollen eine höhere photochemische Stabilität aufweisen als beispielsweise organische Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescein oder Rhodamin. Die Synthese solcher Partikel ist jedoch relativ aufwändig. Um die anorganischen Kern-Mantel- Nanoteilchen als Markierungen an Biomoleküie zu binden, ist weiterhin eine Funktionalisierung ihrer Oberfläche erforderlich, die in der Regel mehrere weitere Syntheseschritte erfordert.
In DE 10 2008 016 712 A1 werden Nanopartikel mit einem aus Metall bestehenden Kernpartikel und einer Hülle aus einem Diamin-Blockpolymer, sowie deren Verwendung in einem biochemischen, chemischen oder biologischen
Verfahren, beispielsweise zur Markierung von Antikörpern oder Nukleinsäuren oder als Träger daran gekoppelter Enzyme, beschrieben. Diese Partikel sollen besonders stabil gegen Aggregation und damit lang lagerfähig, relativ temperaturbeständig und leicht modifizierbar sein. Die Stabilisierung des
Nanopartikels wird der in der Mitte der Polymerkette des Diamin-Blockpolymers vorliegenden Polyethylenoxid-Gruppe zugeschrieben. Die endständigen NH2-
Gruppen des Diamin-Blockpolymers können nach der Bildung der Nanopartikel dazu verwendet werden, Proteine oder Nukleinsäuren kovalent an die Nanopartikel zu binden.
Ein Nachteil dieser Nanopartikel besteht darin, dass die aus Diamin-Blockpolymer gebildete Ligandenhülle immer noch relativ offen und flexibel ist und so in unkontrollierbarer Weise nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem metallischen Kern oder der Ligandenhülle anbietet, was die Kopplung der einzelnen, innerhalb der Ligandenhülle vorliegenden metallischen Kerne erleichtert.
Aus Zheng J., Fluorescent Noble Metal Nanoclusters, Dissertation, Georgia
Institute of Technology, April 2005, sind Kompositstrukturen aus in Dendrimeren eingebetteten Gold- oder Silber-Nanoteilchen, bekannt. Beschrieben werden dort beispielsweise OH-terminierte Polyamidoamine (PAMAM) der zweiten bis vierten Generation, in die Gold-Nanopartike! eingebettet sind, welche fluoreszierende Eigenschaften aufweisen. Diese Kompositstrukturen werden durch Reduktion von HAuCI4 SH2O mittels NaBH4 in Gegenwart von PAMAM in wässriger Lösung oder in Methanol erzeugt. Das Dendrimer steuert hier sowohl die Keimbildung als auch die Größe der Metall-Nanoteilchen durch Inhibierung ihres Wachstums, insbesondere durch Unterdrückung der Ostwald-Reifung.
Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Strukturen wie die zuvor beschriebenen Liganden-Hülien noch zu offen und flexibel sind, um die eingebetteten Metall- Nanoteilchen ausreichend über lange Zeiträume bezüglich Aggregation und chemischer Angriffe zu schützen.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, Nanoteilchen insbesondere zur Anwendung als Markierung in biochemischen Systemen anzugeben, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere sollen Nanoteilchen- Markierungen bereit gestellt werden, die chemisch robust sind, über eine hohe Anzahl und/oder eine lange Dauer von Anregungen, insbesondere Fluoreszenzanregungen, stabil bleiben, und dabei vorzugsweise eine hohe Biokompatibilität und eine gute Funktionalisierbarkeät aufweisen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Kompositstruktur, umfassend: mindestens ein Nanoteilchen, insbesondere mit Lumineszenzeigenschaften oder magnetischen Eigenschaften, und mindestens ein dendritisches Makromolekül, welches einen inneren Bereich mit verzweigten, insbesondere mit hoch verzweigten bis perfekt verzweigten
Strukturen, und eine Peripherie aufweist, welche Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl, insbesondere mehr als 50%, der Oberflächengruppen in der Peripherie des dendritischen Makromoleküls jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art aufweisen, wobei die funktionelle Gruppe erster Art mindestens eine Monosaccharid-, Oligosaccharid- und/oder Poiysaccharid-Einheit umfasst, wobei das dendritische Makromolekül das Nanoteilchen stabilisiert.
Unter einem dendritischen Makromolekül werden neben hochverzweigten (auch: hyperverzweigten) Polymeren auch Dendrimere ais Vertreter der perfekt verzweigten Makromoleküle verstanden. Weitere Einzelheiten sind aus den Übersichtsartikeln von Voit (Acta Polymer. 1995, 46, S. 87-99), Tomaläa (Angew. Chem. 1990, 102, S. 119-157) und Vögtie (Prag. Polym. Sei. 2000, 25, S. 987- 1041 ) zum Aufbau von dendritischen Polymeren bzw. dendritischen Makromolekülen zu entnehmen, wobei Dendrimere sphärische Molekülformen und hochverzweigte Polymere eher globuläre bzw. offenere Molekülstrukturen aufweisen. In Fig. 5 sind charakteristische Struktureinheiten von Dendrimeren und hochverzweigten Polymeren dargestellt.
Fig. 5 a) zeigt ein perfekt verzweigtes Dendrimer mit einem Verzweig ungs kern K. An den Verzweigungskern K schließen gleich einer Baumstruktur verästelte dendritische Einheiten D an, an die wiederum weitere dendritische Einheiten D anschließen. Unter einer perfekt verzweigten Dendrimer-Struktur ist also eine Struktur zu verstehen, bei der aüe Verzweigungen benutzt sind, d.h. bei der ein Verzweigungsgrad von 100 % vorliegt. Die Anzahl der Ebenen von dendritischen Einheiten D wird a!s „Generation" des Dendrimers bezeichnet. Die Peripherie des Dendrimers wird durch terminale Einheiten T gebildet, an die keine weiteren Verzweigungseinheiten D anschließen. Im Beispiel der Fig. 5 a) weisen die terminalen Einheiten T jeweils zwei Oberflächengruppen B auf. Diese Oberflächengruppen B bilden somit Endgruppen auf einer Verzweigungsgruppe des Dendrimers, die zu keiner weiteren Verzweigung führen. Im inneren Bereich des Dendrimers liegen in Zwischenräumen der perfekt verzweigten Struktur Kavitäten C, die sogenannten dendritischen Käfige (dendritic cages), vor. Fig. 5 b) zeigt ein hochverzweigtes dendritisches Polymer Ausgehend von einer fokalen Gruppe A pflanzen sich als Verzweigungseinheiten dendritische Einheiten D fort, wobei nicht jede Verzweigungsstelle genutzt wird. Der Verzweigungsgrad eines hoch verzweigten dendritischen Polymers liegt somit unter 100%, häufig zwischen 40 und 70%, Man spricht bei derartigen Strukturen von hoch verzweigten Strukturen. Wie bei dem in Fig. 5 a) gezeigten Dendrimer liegen im inneren Bereich des hochverzweigten dendritischen Polymers innerhalb der hochverzweigten Struktur Kavitäten C vor. Die Peripherie des hochverzweigten dendritischen Polymers wird durch terminale Einheiten T, weiche eine oder mehrere Endgruppen B tragen, und durch lineare Einheiten L, welche eine oder mehrere Endgruppen B tragen, gebildet. Im Unterschied zu den terminalen Einheiten T, an die keine weiteren Verzweigungseinheiten D anschließen, weisen die linearen Einheiten zwar ebenfalls eine oder mehrere Endgruppen B auf, die zu keiner weiteren Verzweigung führen, sie sind jedoch über mindestens eine Bindung mit weiteren Verzweigungseinheiten D verbunden, die keine Endgruppe 8 bilden, sondern zur verzweigten Struktur beitragen. Ein Teil der Endgruppen B der linearen Einheiten L kann daher im inneren Bereich des hochverzweigten dendritischen Polymers vorliegen, während ein weiterer Teil der Endgruppen B der linearen Einheiten l_ als Oberflächengruppen des hochverzweigten dendritischen Polymers in der Peripherie vorliegen kann.
Die Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls, insbesondere eines Dendrimers oder eines hochverzweigten dendritischen Polymers, können wiederum eine oder mehrere funktionelle Gruppen umfassen. Eine funktionelle Gruppe kann grundsätzlich aus einen Atom oder einer Gruppe von Atomen gebildet sein.
Erfindungsgemäß umfassen eine Vielzahl der Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art, wobei die funktionelle Gruppe erster Art mindestens eine Monosaccharid-,
Oligosaccharid- und/oder Polysaccharideinheit aufweist. Unter einem Oligosaccharid wird ein Kohlenhydrat verstanden, das aus mehreren gleichen oder verschiedenen Monosacchariden aufgebaut ist, die durch glykosidische Bindungen miteinander verbunden sind. Entsprechend der Anzahl der vorhandenen Monosaccharid-Einheiten spricht man von Di-, Tri-, Tetra-, Pentasacchariden usw., die sowohl linear (unverzweigt), also auch verzweigt sein können. Die Abgrenzung zwischen Oligo- und Polysacchariden ist fließend und hängt davon ab, ob eine definierte Struktur mit bestimmter Molekülmasse vorliegt (Oligosaccharid), oder nur eine statistische Verteilung der Molekülgröße zu ermitteln ist (Polysaccharid). Die funktionelle Gruppe erster Art kann über die Mono-, Oligo- und/oder Polysaccharid-Einheit hinaus noch weitere Gruppen aufweisen. Bei der Vielzahl von Oberflächengruppen, die eine funktionelle Gruppe erster Art aufweisen, kann es sich insbesondere um Monosaccharid-, Oligosaccharid- oder Polysaccharid-Gruppen oder um aus einem Derivat eines Monosaccharids, eines Oligosaccharids oder eines Polysaccharids gebildete funktionelle Gruppen handeln.
Das Nanoteilchen der beschriebenen Kompositstruktur bildet die der eigentlichen Markierung dienende Komponente, d.h. das Nanoteilchen besitzt detektierbare Eigenschaften, insbesondere Lumineszenzeigenschaften oder magnetische Eigenschaften. Lumineszenz kennzeichnet die Eigenschaft der Nanoteilchen, Energie (z.B. in Form von Licht des IR-, VIS- oder UV-Spektrums) zu absorbieren, welche dann als Licht niedrigerer Energie wieder abgestrahlt wird. Das mindestens eine dendritische Makromolekül, das eine Vielzahl von Oberflächengruppen besitzt, die mindestens eine funktioneile Gruppe erster Art umfassen, welche mindestens eine Mono-, Oligo- oder Polysaccharidetnheit aufweist, dient in der Kompositstruktur zur Stabilisierung des Nanoteilchens. Die aus dem dendritischen Makromolekül und seinen funktionellen Gruppen gebildete Struktureinheit der Kompositstruktur wird im Folgenden verkürzt als „saccharidfunktionalisiertes dendritisches Makromolekül" bzw., soweit es sich bei dem dendritischen Makromolekül um ein hochverzweigtes Polymer bzw. um ein Dendrimer handelt, als „saccharidfunktionalisiertes hochverzweigtes Polymer" bzw. als „saccharidfunktionaiisiertes Dendrimer" bezeichnet.
Die Formgestalt des Nanoteüchens kann z.B. nadeiförmig, eilipsoid oder kugelförmig sein, wobei die letzteren beiden Optionen bevorzugt sind. Das Nanoteilchen weist vorzugsweise eine entlang seiner längsten Achse gemessene Größe von 0,5 bis 20 nm auf. Eine Größe von 0,5 bis 10 nm oder 0,5 bis 5 nm oder sogar 0,5 bis 2 nm äst noch vorteilhafter.
Da eine Vielzahl, insbesondere mindestens 50%, der Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls mindestens eine funktioneile Gruppe mit einer Mono-, Oligo- oder Polysaccharideinheit aufweisen, bilden diese funktionellen Gruppen erster Art eine dicht gepackte „Saccharid-Hülle" um das dendritische Makromolekül. Die so gebildete Struktureinheit der Kompositstruktur ist so dicht gepackt und rigide, dass die Aggregation der Nanoteilchen wirkungsvoll verhindert und auch eine Wechselwirkung der Nanoteiichen mit chemischen Substanzen in der Umgebung verringert werden. Als ein Beispiel sei ein Dendrimer auf Basis von Polyaminen genannt, dessen Oberflächengruppen zu 50% mindestens eine Mono- , Oligo- oder Polysaccharidgruppe umfassen. Hierzu kann beispielsweise jede terminale Einheit eine erste Oberflächengruppe aufweisen, die eine Mono-, Oligo- oder Polysaccharidgruppe umfasst, wobei die zweite Oberflächengruppe der terminalen Amin-Einheit z.B. durch ein Wasserstoff-Atom gebildet sein kann.
Gleichzeitig bietet die Saccharid-Hülle den Vorteil hoher Biokompatibilität der gesamten Kompositstruktur, insbesondere im Vergleich zu einem „freien"
Nanoteilchen ohne das stabilisierende saccharidfunktionalisierte dendritische
Makromolekül. Darüber hinaus sind einzelne oder eine Vielzahl von Gruppen der
Saccharidhülle leicht funktionaiisierbar, d.h. es können mit geringem Aufwand und mit bekannten Verfahren der Saccharid-Chemie eine Vielzahl verschiedenartiger funktioneller Gruppen zweiter Art an die funktionellen Mono-, Oligo- oder
Polysaccharidgruppen gebunden werden, um über diese funktionellen Gruppen zweiter Art weitere Moleküle, insbesondere Biomoieküle mit der Kompositstruktur zu verbinden. Auch die vorhandenen Hydroxidgruppen der Mono-, Oligo-, oder Polysaccharidgruppen können als funktionelle Gruppen zweiter Art zur Anbindung an weitere Moleküle, insbesondere an Biomoleküle dienen.
Das Nanoteilchen kann Lumineszenzeigenschaften aufweisen. Ein lumineszierendes Nanoteilchen kann ein oder mehrere Metalle, insbesondere Edelmetalle, umfassen, beispielsweise kann das Nanoteilchen aus Gold, Silber oder Kupfer oder einer Mischung aus mindestens zweien dieser Metalle bestehen. Auch ein fluoreszierender Nanodiamant kommt hier als Nanoteilchen in Frage. Lumineszierende Nanoteälchen können auch sogenannte Quantenpunkte (Quantum Dots) sein. Dabei handelt es sich um Halbleiter-Nanoteilchen, insbesondere M-Vl- oder Ifl-V-Halbleiter, die dotiert sein können, und die durch eine Quantenbegrenzung sowohl der Elektronen als auch der Löcher in allen drei Raumrichtungen gekennzeichnet sind. Solche Nanoteilchen eignen sich beispielsweise für Anwendungen als Lumineszenzmarker in einem auf einem optischen Transduktionsprinzip beruhenden Assay.
Das Nanoteiichen kann zusätzlich oder alternativ auch magnetische Eigenschaften aufweisen. Ein magnetisches Nanoteilchen kann beispielsweise ein oder mehrere Metalle aus der Gruppe Eisen, Cobalt, Nickel oder ein Metalloxid umfassen, wobei das Metalloxid insbesondere aus der Gruppe gebildet aus Eisenoxid, insbesondere Magnetit Fe3O4 oder γ-Fe2θ3, Bariumferrit, Strontiumferrit, Chromdäoxid und Eisenoxiden mit Mangan-, Kupfer-, Nickel- oder Cobaltzusätzen ausgewählt sein kann. Das magnetische Nanoteilchen kann beispielsweise in einem magnetischen Assay, d.h. einem Assay, der auf einem magnetischen Transduktionsprinzip basiert, zur Markierung von Biomolekülen verwendet werden. Lumineszierende Metail-Nanoteilchen weisen vorteilhafterweise entlang ihrer längsten Achse eine Ausdehnung von weniger als 2 nm, insbesondere zwischen 0,5 und 1 ,5 nm, auf.
Magnetische Metall- oder Metalloxid-Nanoteilchen weisen vorteilhafterweise entlang ihrer längsten Achse eine Ausdehnung zwischen 0,5 und 50 nm, vorzugsweise zwischen 0,5 und 20 nm, oder sogar zwischen 0,5 und 10 nm auf.
In einer vorteilhaften Weiterbildung weist das Nanoteilchen an seiner Oberfläche eine Vielzahl von an die Oberfläche angebundenen Moieküien eines
Dispersionsstabiiisators, die eine Hülle um das Nanoteilchen bilden, auf. Der
Dispersionsstabilisator kann insbesondere ein n-Alkanthioi, ein thiol- und/oder aminfunktionalisiertes Phenol, oder ein carboxylfunktionalisiertes AJkanthiol, beispielsweise Octadekanthiol, Aminothiophenol oder Mercaptoundekansäure oder ein Derivat von Octadekanthiol, Aminothiophenol oder
Mercaptoundekansäure sein. Diese Dispersionsstabilisatoren sind besonders gut geeignet zur Stabilisierung von Metail-Nanoteilchen bei der Synthese in organischer oder wässriger Lösung. Nächt-kovalente Wechselwirkungen zwischen den freien Endgruppen der Dispersionsstabilisator-Moleküle und dem dendritischen Makromolekül leisten einen wesentlichen Beitrag zur Stabilisierung des Nanoteilchens mittels des saccharidfunktionalisierten dendritschen Polymers.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, ein Dendrimer, insbesondere der dritten bis zehnten Generation, als dendritisches Makromolekül in der oben beschriebenen Kompositstruktur zu verwenden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropyleniminen (PPI)1 Polyamidoaminen (PAMAM) und Polyetheriminen (PEI) und deren Derivaten.
In einer alternativen Ausgestaltung kann als dendritisches Makromolekül ein hochverzweigtes Polymer, bevorzugt mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 10.000 g/mol, dienen, welches ausgewählt ist aus der Gruppe vorzugsweise bestehend aus hochverzweigten Poly(ethyleniminen), hochverzweigten Polyglycerolen, hochverzweigten Polyamiden, hochverzweigten Polylysinen, hochverzweigten Poiyestern und deren Derivaten,
Die funktionelle Gruppe erster Art kann eine Monosaccharid-Gruppe, eine lineare oder verzweigte Oligosaccharid-Gruppe, eine lineare oder verzweigte Polysaccharid-Gruppe, eine aus einem Derivat eines Monosaccharids, eine aus einem Derivat eines linearen oder verzweigten Oligosaccharids oder eine aus einem Derivat eines linearen oder verzweigten Polysaccharids gebildete Gruppe sein.
Dabei kommen vorzugsweise Giucose-, Fructose-, Gaiactose-, Maltose-, Lactose-, Cellobiose-, Mannose-, Dimannose-, Melobiose-, Maltotriose- und/oder Maltoheptaose-Gruppen und/oder aus Derivaten von diesen gebildete Gruppen in Frage.
In einer speziellen Ausgestaltung des dendritischen Makromoleküls als Dendrimer umfasst eine Vielzahl, insbesondere mehr als 50%, der in der Peripherie vorliegenden terminalen Einheiten ein, zwei oder mehr funktionelle Gruppen erster Art.
Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten der Stabilisierung des Nanoteilchens durch das saccharidfunktionalisierte dendritische Makromolekül. Die erste Möglichkeit besteht darin, dass das fluoreszierende Nanoteilchen im inneren Bereich des dendritischen Makromoleküls, in einer Kavität, auch als dendritischer Käfig (engl: „dendritic box" oder „dendritic cage") bezeichnet, aufgenommen ist.
Die zweite Möglichkeit besteht darin, dass mindestens zwei saccharidfunktionalisierte dendritische Makromoleküleinheiten mit ihrer Peripherie an das Nanoteilchen angrenzen und es durch Wechselwirkungen, insbesondere durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie z.B. van der Waals- Wechselwirkungen mit der aus dem oben erwähnten Dispersionsstabilisator gebildeten Ligandhülie des Nanoteilchens, stabilisieren.
Die voranstehend beschriebene Kompositstruktur zeichnet sich durch eine leichte Funktionalisierbarkeit mit bekannten Verfahren aus dem Gebiet der Zuckerchemie aus. Dies kann zu dem Zweck ausgenutzt werden, die Kompositstruktur an ein Biomolekϋl zu binden. Es ist in diesem Zusammenhang besonders vorteilhaft, wenn mindestens eine Oberflächengruppe des dendritischen Makromoleküls und/oder mindestens eine zu einer Oberflächengruppe des dendritischen Makromoleküls gehörige funktionelle Gruppe erster Art eine funktionelle Gruppe zweiter Art umfasst, welche insbesondere geeignet ist, mit einem Biomolekül, insbesondere einem Liganden oder einem Rezeptor eines Ligand/Rezeptor- Systems, einem bioaktiven Molekül, einem bioaktiven Makromolekül, einer biologischen Erkennungssequenz, insbesondere einem Oiigo- oder Polynukleotid, oder einer peptidischen Erkennungssequenz, zu reagieren.
Die funktionelle Gruppe zweiter Art kann beispielsweise eine an eine terminale Einheit oder eine lineare Einheit des dendritischen Makromoleküs gebundene Oberflächengruppe bilden. Die funktionelle Gruppe zweiter Art kann auch an eine eine funktionelle Gruppe erster Art umfassende Oberflächengruppe, beispielsweise an eine an einer terminalen oder linearen Einheit gebundene funktionelle Mono-, Oligo- oder Polysacchaπ'd-Gruppe, gebunden sein.
Ein Ligand/Rezeptorsystem besteht beispielsweise aus zwei Molekülen, nämlich einem Liganden und einem Rezeptor, die spezifisch aneinander binden. Derartige Systeme werden in der Biosensorik angewendet, um einen Analyten in einer Probe nachzuweisen. Dabei bildet zum Beispiel der Analyt den Liganden des Systems, der an einem spezifisch an den Liganden bindenden Rezeptor gebunden wird. Die Bindung der Kompositstruktur an ein Biomoleküi kann erzeugt werden, indem an einer Oberflächengruppe des dendritischen Makromoleküls oder an einer funktionellen Gruppe erster Art, insbesondere einer Mono-, Oligo- oder Polysaccharidgruppe, eine oder mehrere funktionelle Gruppen zweiter Art gebunden werden, die zur Bindung an ein BiomoSekül befähigt sind. Das BiomoleküS kann entsprechend eine funktionelle Gruppe dritter Art aufweisen, die bevorzugt an die funktionelle Gruppe zweiter Art der Kompositstruktur bindet. Zum Beispiel kann die funktionelle Gruppe zweiter Art eine Streptavidin-Gruppe sein, während das Biomolekül entsprechend eine Biotin-Gruppe aufweist. Dies wird im allgemeinen dazu führen, dass die Bindung zwischen Kompositstruktur und Biomolekül bevorzugt über eine Biotin-Streptavidin-Verbindung gebildet wird.
Der Begriff „funktionelle Gruppe" ist in diesem Zusammenhang nicht auf reaktive Gruppen, die kovalente Bindungen mit dem gegebenenfalls funktionalisierten Biomolekü! bilden, eingeschränkt, sondern schließt auch chemische Gruppen ein, die zu einer nächt-kovalenten Wechselwirkung, z.B. einer ionischen Wechselwirkung oder einer Wasserstoffbrückenbindung, mit dem oder den Biomolekülen führen. Es ist möglich, dass die Bindung der Kompositstruktur über ohnehin vorhandene Oberflächengruppen des dendritischen Makromoleküls und von vornherein vorliegende funktionelle Gruppen des Biomoleküls erfolgt. Es ist auch möglich, die Oberflächengruppen des Makromoleküls und/oder des Biomoleküls zunächst zu funktionaläsieren, um die entsprechende Bindung zu erzeugen.
So könen die Hydroxid-Gruppen der Mono-, Oligo- oder Polysaccharid-Einheiten umfassenden funktionellen Gruppen erster Art als funktionelle Gruppen zur Anbindung an eine funktionelle Gruppe des Biomoleküls dienen. Die Anbindung der Kompositstruktur kann weiterhin auch über eine enzymatische Reaktion zwischen einer an das dendritische Makromolekül gebundenen Mono-, Oligo- oder Polysaccharid-Gruppe und dem Biomolekül erfolgen. Soweit die funktionelle Gruppe zweiter Art unmittelbar an eine Oberflächengruppe des dendritischen Makromoleküls gebunden ist, kann es sich beispielsweise um eine Aminogruppe, eine Säuregruppe, eine Epoxidgruppe, eine Azidgruppe, eine Alkingruppe, eine Alkengruppe, eine aktivierte Estergruppe, eine Aldehydgruppe, eine Amidderivatgruppe, eine Suifonsäureamidderivatgruppe, eine Suifatgruppe, eine Sulfonatgruppe, eine Halogengruppe, eine aktivierte Ethergruppe oder eine Thiolgruppe handeln.
Soweit die funktioneile Gruppe zweiter Art an eine funktionelle Gruppe erster Art gebunden ist, kann es sich beispielsweise um eine Hydroxygruppe, eine
Aminogruppe, eine Säuregruppe, eine Epoxidgruppe, eine Azidgruppe, eine
Aikingruppe, eine Aikengruppe, eine aktivierte Estergruppe, eine Aldehydgruppe, eine Amidderivatgruppe, eine Suifonsäureamidderivatgruppe, eine Sulfatgruppe, eine Sulfonatgruppe, eine Haiogengruppe, eine aktivierte Ethergruppe oder eine Thäolgruppe handeln.
Die funktionelle Gruppe dritter Art, also die an das Biomoiekü! gebundene funktionelle Gruppe, ist so gewählt, dass sie mit der vorliegenden funktionellen Gruppe zweiter Art bevorzugt eine Bindung eingeht, in Betracht kommt als funktionelle Gruppe dritter Art daher eine Aminogruppe, eine Säuregruppe, eine Epoxidgruppe, eine Azidgruppe, eine Alkingruppe, eine Alkengruppe, eine aktivierte Estergruppe, eine Aldehydgruppe, eine Amidderivatgruppe, eine Suifonsäureamid-derivatgruppe, eine Sulfatgruppe, eine Sulfonatgruppe, eine Halogengruppe, eine aktivierte Ethergruppe oder eine Thioigruppe.
Bei einem Verfahren zur Herstellung der beschriebenen Kompositstruktur werden mit einem Dispersionsstabilisator stabilisierte Nanoteilchen, insbesondere mit einem Durchmesser von weniger als 10 nm, bevorzugt zwischen 0,8 und 2 nm, in einer wässrigen Lösung von dendritischen Makromolekülen dispergäert, wobei die dendritischen Makromoleküle einen inneren Bereich mit verzweigten, insbesondere perfekt verzweigten bis hochverzweigten, Strukturen und eine Peripherie aufweisen, weiche Oberflächengruppen der dendritischen Makromoleküle umfasst, wobei eine Vielzahl der Oberflächengruppen der dendritischen Makromoleküle jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art aufweisen, wobei die funktionelle Gruppe erster Art mindestens eine Mono-, Oligo- oder Polysaccharid-Einheit umfasst.
Als Dispersionsstabilisator kann ein n-Alkanthiol, ein thiol- und/oder amin- funktionaiisiertes Phenol, oder ein carboxylfunktionalisiertes Alkanthiol, beispielsweise Octadekanthiol, Aminothiophenol oder Mercaptoundekansäure oder ein Derivat von Octadekanthioi, Aminothiophenol oder Mercaptoundekansäure verwendet werden.
Die beschriebenen Kompositstrukturen können zur Markierung von Biomolekülen in einem biologischen, biochemischen, biophysikalischen oder medizinischen Verfahren, insbesondere im Bereich der Biosensorik, in kompetitiven oder nicht kompetitiven Assays, insbesondere basierend auf einem optischen oder magnetischen Transduktionsprinzip, verwendet werden.
Die Erfindung wird nun anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Kompositstruktur a) in einer ersten Variante, bei der das Nanoteilchen in einer Kavität im inneren Bereich eine dendritischen Makromoleküls angeordnet ist; b) in einer zweiten Variante, bei der das Nanoteilchen von mehreren saccharidfunktionalisierten dendritischen Makromolekülen umgeben und so stabilisiert ist;
Fig. 2 a) eine Strukturformel eines ersten saccharidfunktionalisierten
Dendrimers ; b) eine Strukturformel eines zweiten saccharidfunktionaiisierten
Dendrimers; Fig. 3 Fluoreszenzspektren von a) gelb/rötlich fluoreszierenden Gold-Nanoteiichen für eine Kompositstruktur b) blau fluoreszierenden Gold-Nanoteilchen für eine Kompositstruktur
Fig. 4 a) eine Strukturformel eines ersten saccharidfunktionalisäerten
Dendrimers mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe zweiter Art an einer Saccharid-Einheit zur Bindung an ein Biomoleküi; b) eine Strukturformel eines zweiten saccharidfunktionaläsierten
Dendrimers mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe zweiter Art an einer Endgruppe des Dendrimers zur Bindung an ein Biomolekül;
Fig. 5 a) die Struktur A eines Dendrimers; b) die Struktur B eines hochverzweigten Polymers.
Fig. 1 a) zeigt eine schematische Darstellung der Kompositstruktur 1 in einer ersten Variante, bei der das Nanoteilchen 2 in einer Kavität im inneren Bereich des dendritischen Makromoleküls 4 angeordnet ist, an dessen Peripherie eine Vielzahl von funktionellen Mono-, Oligo- oder Polysaccharid-Gruppen vorliegen, die eine Saccharidhülle 5 bilden. Eine derartige Kompositstruktur 1 kann beispielsweise als Nanoteilchen 2 ein Gold-Nanoteilchen mit einem entlang seiner längsten Achse gemessenen Durchmesser von 0,5 bis 2 nm und als dendritisches Makromolekül 4 ein PPI-Dendrimer der vierten Generation, dessen terminale Amin-Einheiten jeweils zwei Oberflächengruppen aufweisen, umfassen. Das Nanoteilchen 2 ist mit einer Dispersionsstabiläsatorhülle 3, beim vorliegenden Beispiel eines Gold-Nanoteilchens beispielsweise aus n-Alkanthiolmolekülen, umgeben. N-Alkanthiole können, wie weiter unten noch näher beschrieben, bei der Synthese der Gold-Nanoteilchen als Dispersionsstabilisator verwendet werden. Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften des inneren Bereiches des PPI-Dendrimers können die Nanoteiichen 2 mit ihrer Dispersionsstabilisatorhülie 3 innerhalb einer Kavität der verzweigten Struktur des Dendrimers 4 aufgenommen und stabilisiert werden.
In Fig. 2 a) ist ein saccharidfunktionalisiertes PP!-Dendrimer 4" der vierten Generation dargestellt, das beispielsweise in einer Kompositstruktur gemäß Fig. 1 a) als das Gold-Nanoteüchen 2 stabilisierendes dendritisches Makromolekül verwendet werden kann. Das PPI-Dendrimer 4" weist einen Verzweigungskern 6" auf, von dem ausgehend sich repetitive Einheiten fortpflanzen. Jedes Stickstoff- Atom dient als Verzweigungsstelle, von dem ausgehend sich jeweils zwei neue „Äste" ausspannen. Auf diese Weise ergibt sich eine im Wesentlichen sphärische Form des PPi-Dendrimers 4". Innerhalb der so gebildeten Sphäre liegen Kavitäten 7", vor, in denen ein von einer Dispersionsstabilisatorhülie 3 umgebenes Nanoteiichen 2 (in Fig. 2 a) nicht eingezeichnet), z.B. ein Gold-Nanoteüchen mit einer n-Alkanthiol-Hü!le, aufgenommen und stabilisiert werden kann. An die terminalen Einheiten 8" des Dendrimers 4" sind jeweils zwei Oberflächengruppen gebunden, die eine funktionelle Gruppe R umfassen. Im Beispiel der Fig. 2 a) handelt sich bei den funktionellen Gruppen R um Maltose-Gruppen, also um Di- Saccharid-Gruppen. Da jede terminale Einheit 8" jeweils zwei Di-Saccharid- Gruppen aufweist, ergibt sich eine dicht gepackte Oligosaccharidhülle um das Dendrimer 4". Dies führt zu einer erhöhten Rigidität des gesamten Moleküls. Auf diese Weise werden Wechselwirkungen zwischen den in einer Kavität 7" aufgenommenen Nanoteiichen 2 mit der außerhalb der Kompositstruktur 1 vorliegenden chemischen Umgebung bzw. mit anderen, gegebenenfalls ebenfalls in einer derartigen Kompositstruktur 1 eingebundenen Nanoteiichen 2 erschwert oder unterbunden, was zu einer Stabilisierung der Nanoteiichen 2 beiträgt.
In Fig. 1 b) ist ein andere Variante der Kompositstruktur V dargestellt, bei der das
Nanoteiichen 2' mit seiner Dispersionsstabilisatorhülie 3' durch mehrere saccharidfunktionalisierte dendritische Makromolekülen stabilisiert ist, die es räumlich umgeben. Ein Beispiel für eine derartige Kompositstruktur 1 ' umfasst ein Gold-Nanoteilchen, das von einer Hülle aus n-Alkanthiolmolekülen umgeben ist, die jeweils eine endständige Säuregruppe besitzen, beispielsweise eine ω- Mercapto-Alkansäure. Als Dendrimer 4' dient in diesem Beispiel wiederum das in Fig. 2 a) dargestellte PPI-Dendrimer 4" der vierten Generation mit zweifach durch Maltose-Gruppen funktionalisäerten terminalen Einheiten 8", wodurch eine Di- Saccharid-Hülle 5' gebildet wird. Die Säuregruppen der ω-Mercapto- Alkansäuremoieküle können sowohl mit Stickstoffatomen der verzweigten Struktur des PPI-Dendrimers in dessen innerem Bereich als auch mit Stickstoffatomen an der Peripherie des PPI-Dendrimers wechselwirken, im letzteren Fall bildet sich eine Kompositstruktur 1 ', bei der das Nanoteälchen 2' von mehreren saccharidfunktionalisierten Dendrimeren 4' umgeben und abgeschirmt wird. Auf diese Weise wird das Nanoteilchen 2' ebenfalls wirkungsvoll von der chemischen Umgebung abgeschirmt, so dass sowohl Wechselwirkungen mit weiteren Nanoteilchen 2', insbesondere Ostwald-Reifung, als auch chemische Beeinflussung durch in Lösung befindliche Ionen oder Moleküle wirksam erschwert oder unterbunden werden.
In Fig. 2 b) ist ein weiteres Beispiel für ein zur Bildung einer Kompositstruktur mit einem Nanoteilchen, insbesondere einem Gold-Nanoteilchens, geeigneten saccharidfunktionalisierten Dendrimers 4'" dargestellt. Es handelt sich dabei um ein PPI-Dendrimer mit einem Verzweigungskern 6'" und davon ausgehenden Amin-Verzweigungseinheiten. Die terminalen Einheiten 8'" des PPI-Dendrimers weisen in diesem Fall jeweils zwei Oberflächengruppen auf, wobei die eine Oberflächengruppe jeweils nur ein Wasserstoffatom umfasst, während die andere Oberflächengruppe eine OSigosaccharideinheit R umfasst, wobei die Oligosaccharideinheit R im vorliegenden Beispiel eine Maltotriose-Gruppe ist. Aufgrund des größeren Raumbedarfs der Maltotriose im Vergleich zur Maltose des in Fig. 2 a) dargestellten Beispiels ist trotz dieser nur einfachen Funktionaiisierung der terminalen Einheiten 8'" eine ausreichende Dichtigkeit und Steifheit des saccharidfunktionalisierten Dendrimers 4'" zur Stabilisierung eines Nanoteilchens (nicht in Fig. 2 b) dargestellt) im inneren Bereich des Dendrimers 4'", insbesondere innerhalb einer Kavität 7'" gewährleistet.
Ansteile der beschriebenen funktionellen Maltose- bzw. Maitotriose-Gruppen und deren Derivaten sind auch andere funktionelle Gruppen, die Mono- oder
Oligosaccharid-Einheiten aufweisen, zur Funktionalisierung des Dendrimers 4, 4\
4", 4'" geeignet, insbesondere Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Lactose,
Cellobiose, Mannose, Dimannose, Melobiose oder Maltoheptaose, sowie Derivate von diesen. Weiterhin kann das Dendrimer 4, 4', 4", 4'" mit verschiedenen Mono- oder Oligosaccharid-Gruppen funktionalisiert sein, insbesondere mit
Kombinationen aus den zuvor genannten Mono- und Oligosaccharidgruppen.
Die Herstellung der beschriebenen Kompositstrukturen wird im Folgenden anhand zweier Synthesebeispiele in organischer und wässriger Lösung für fluoreszierende Gold-Nanoteilchen beschrieben.
Die Herstellung fluoreszierender Gold-Nanoteilchen in einem organischen Medium kann beispielsweise nach einem in Zheng J., Flourescent Noble Metal Nanoclusters, Dissertation, Georgia Institute of Technology, April 2005, beschriebenen Verfahren erfolgen. Dabei werden 0,5 μmol Tetrachlorgoldsäure HAuCI4 H2O und 0,25 μmol Octadekanthiol in 2 ml Lösung bestehend aus 90 % Chloroform und 10% Ethanol, gemischt. Die Reduktion des HAUCI4Η2O zur Bildung kolloidaler Nanoteilchen erfolgt durch Zugabe von Natriumborhydrid NaBH4 bei Zimmertemperatur. Für einen weitgehend vollständigen Reaktionsumsatz wird die Lösung anschließend einen Tag stehen gelassen. Die so gebildeten Gold-Nanoteiichen weisen entlang ihrer längsten Achse einen Durchmesser von 1 bis 1.5 nm auf und zeigen gelb/rötliche Fluoreszenz. Bei Verwendung von Aminothiophenol anstelle von Octadekanthiol als Dispersionsstabilisator werden blau fluoreszierende Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser entlang ihrer längsten Achse von weniger als 1 nm erhalten. Die gemessenen Fluoreszenzsignale für die wie beschrieben synthetisierten Gold- Nanoteiichen sind in Abbildung 3 a) für die gelb/rötlich fluoreszierenden Nanoteüchen und in Fig. 3 b) für die blau fluoreszierenden Nanoteiichen dargestellt. !n der rechten oberen Ecke jedes Diagramms ist jeweils das entsprechende Extinktionsspektrum der Nanoteiichen dargestellt.
Die so erhaltenen thiolstabilisierten Nanoteüchen können mit Hilfe der anhand Fig. 2 a) und b) beschriebenen Dendrimer-Strukturen in eine wässrige Lösung überführt und in dieser stabilisiert werden. Hierzu werden die Gold-Nanoteilchen mit ihrer Octadekanthiol- bzw. Aminothiophenol-Hülle zunächst durch einen Zentrifugationsschritt von dem organischen Lösungsmittel getrennt. Die Zentrifugation erfolgt vorzugsweise über etwa 30 min bei 25.000 g. Der Bodensatz wird in einer wässrigen Lösung mit einem Dendrimergehalt von 0,1 Gew-% suspendiert. Im vorliegenden Beispiel wurde eine Lösung von saccharidfunktionalisiertem PPI-Dendrimer der vierten Generation, z.B. gemäß Fig. 2 a) mit Maltosegruppen als funktionellen Saccharidgruppen, verwendet. Das Verhältnis der Konzentration von Dendrimer zu Nanoteiichen (in mol/l) wird im Bereich von 0,7 bis 1 ,7 gewählt. Die Gold-Nanoteilchen werden aufgrund der beschriebenen nicht-kovalenten Wechselwirkung zwischen ihrer Octadekanthiol- bzw. Aminothiophenol-Hülle und den im inneren Bereich der Dendrimere vorliegenden Stickstoff-Atomen innerhalb der Kavitäten in der Dendrimerstruktur aufgenommen und dort stabilisiert. Die Fluoreszenzsignale (vgl. Fig. 3 a) und b)) der Nanoteiichen bleiben auch nach Bildung der Kompositstruktur durch aus Nanoteiichen und stabilisierendem saccharidfunktionalisiertem PPI-Dendrimer stabil, insbesondere ist keine Verschiebung der Signale zu höheren oder niedrigeren Wellenlängen zu beobachten.
Die Herstellung fluoreszierender Gold-Nanoteiichen in wässriger Lösung erfolgt mit Tetrachlorgoldsäure HAuCI4-H2O als Edukt beispielsweise in einer 0,3 molaren Natriumhydroxidlösung mit einem Gehalt von 0,3 mol/l Mercaptoundekansäure. Je nach Konzentrationsverhältnis aus Tetrachlorgoldsäure zu Mercaptoundekansäure lassen sich bei unterschiedlichen Weilenlängen fluoreszierende Gold-Nanoteiichen herstellen. Tetrachlorgoldsäure wird entsprechend in einer von der gewünschten Fluoreszenzwellenlänge abhängigen Konzentration zugesetzt. Die Bildung der Gold-Nanoteiichen setzt dabei ab einem Konzentrationsverhäitnis zwischen Tetrachlorgoldsäure und Mercaptoundekansäure von mehr als 0,01 ein. Die Verwendung eines zusätzlichen Reduktionsmittels ist in der wässrigen Lösung nicht notwendig.
Als spezielles Ausführungsbeispiel wird hier die Herstellung von etwa 1 ml Lösung rötlich fluoreszierender Gold-Nanoteilchen beschrieben. Hierzu werden 10 μl der Mercaptoundekansäurelösung in 0,3 M Natriumhydroxidlösung zu 1 ml 0,25 mM Tetrachlorgoldsäure HAuCI4 H2O bei Zimmertemperatur zugesetzt. Für einen möglichst vollständigen Reaktionsumsatz wird die Lösung anschließend etwa einen Tag lang stehen gelassen. Die gebildeten Gold-Nanoteilchen können wie oben beschrieben abzentrifugiert und anschließend in einer wässrigen Lösung eines saccharidfunktionalisierten Dendrimers, beispielsweise wie oben beschrieben, in einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an saccharidfunktionalisiertem PPI-Dendrimer der vierten Generation von 0,1 Gew.-% suspendiert werden. Das Verhältnis der Konzentration von Dendrimer zu Nanoteiichen (in mol pro Liter) wird im Bereich von 0,7 bis 1 ,7 gewählt.
Die Herstellung von Kompositstrukturen 1 , 1 ' mit einem Nanoteiichen 2 und einem oder mehreren das Nanoteiichen 2 stabilisierenden dendritischen Makromolekülen 4 mit funktionellen Gruppen, die Mono- oder Oligosaccharid-Einheiten umfassen und so dicht gepackt sind, dass sie eine Saccharidhülle 5 um das dendritische Makromolekül 4 bilden, kann für eine Vielzahl von Metall- bzw. Metalloxid- Nanoteilchen und dendritischen Makromolekülen mit Mono-, Oligo- oder PoIy- saccharidgruppen in analoger Weise, wie hier anhand spezieller Beispiele beschrieben, durchgeführt werden. Dabei werden als metallhaltige Reaktanden Metailsalze eingesetzt. Als Dispersionsstabilisatoren eignen sich grundsätzlich Alkanthiole, zum Beispiel Octadekanthiol oder Dodekanthiol bzw. Thiophenole, wie beispielsweise Aminothiophenol oder ganz allgemein Thiole bzw. Mercaptane und Derivate von diesen, beispielsweise mit Säuregruppen funktionalisierte Alkanthiole oder Thiophenole.
Dieser zweistufige Syntheseprozess, bei dem zunächst die Nanoteilchen synthetisiert und anschließend durch ein saccharidfunktionalisiertes dendritisches Makromolekül, insbesondere zur Überführung in eine wässrige Lösung, stabilisiert werden, beispielsweise durch Einbettung in eine Kavität innerhalb der verzweigten Struktur, erlaubt eine sehr präzise Einstellung von Eigenschaftskombinationen der Nanoteilchen bzw. der Saccharid-Hülle der Kompositstruktur. So kann beispielsweise bei fluoreszierenden Nanoteilchen die Fiuoreszenzwelienlänge im ersten Syntheseschritt durch Wahl des Dispersionsstabilisators, der Konzentrationsverhältnisse oder sonstiger Reaktionsbedingungen eingestellt werden, während gewünschte Eigenschaften der Peripherie der Kompositstruktur, beispielsweise eine gewünschte Funktionalisierung, wie weiter unten noch beschrieben, unabhängig davon eingestellt werden und erst im zweiten Syntheseschrätt der Kompositstruktur hinzugefügt werden können.
Die so erhaltenen Kompositstrukturen zeigen eine hohe Stabilität auch unter extremen chemischen Bedingungen, beispielsweise in Lösungen über einen breiten pH-Wertbereich zwischen 1 und 13 und/oder mit hohen Salzkonzentrationen.
Ein weiterer Vorteil der hier beschriebenen Kompositstrukturen besteht darin, dass die funktionellen Gruppen, die eine Mono- oder Oligosaccharideinheit aufweisen, mit Standard-Methoden der Saccharid-Chemie mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen ausgestattet werden können. Diese funktionellen Gruppen können dazu dienen, die Kompositstruktur als Markierung an BiomoleküJe in biologischen, biochemischen oder biophysikaiischen Systemen zu binden.
Als Beispiel ist in Fig. 4 a) das in Fig. 2 a) dargestellte PPI-Dendrimer vierter Generation gezeigt, wobei das Stickstoffatom jeder terminalen Amin-Einheit zwei Oberflächengruppen aufweist, welche jeweils eine funktionelle Gruppe R umfassen. Im hier gezeigten Beispiel handelt es sich bei den funktionellen Gruppen R Maltose-Gruppen. Eine der Maltosegruppen ist weiterhin mit einer Essigsäuregruppe (-CH2COOH) funktionalisiert und biidet so insgesamt einen Rest R1. Die Essigsäuregruppe kann als funktionelle Gruppe zur Anbindung einer aus einem oder mehreren Molekülen des in Fig. 4 a) gezeigten saccharidfunktionalisierten Dendrimers und einem, gegebenenfalls von einer Dispersionsstabiiisator-Hülle umgebenen, Nanoteüchen gebildeten Kompositstruktur an ein Biomolekül mittels einer zu der Esssigsäuregruppe komplementären funktionellen Gruppe des Biomoieküls dienen.
Alternativ können funktionelle Gruppen zur Bindung an ein Biomoleküi auch direkt an eine terminale oder zur Peripherie gehörenden linearen Einheit des dendritischen Makromoleküls, beispielsweise an einem Stickstoff-Atom einer terminalen Einheit der in Fig. 2 a) oder b) dargestellten PPl-Dendrimere angebracht sein. In Fig. 4 b) ist das in Fig. 2 a) gezeigte PPl-Dendrimer mit jeweils zwei Maltose-Oberflächengruppen an jeder der terminalen Einheiten des Dendrimers dargestellt, wobei an einem Stickstoffatom einer Endgruppe des Dendrimers statt einer Maltose-Gruppe eine α-Lipoinsäure-Gruppe gebunden ist. Die α-Lipoinsäure-Gruppe ist an dem Stickstoff-Atom 9 einer terminalen Amin- Einheit des Dendrimers A gebunden. Die α-Lipoinsäure -Gruppe kann zur Anbindung einer funktionellen Gruppe eines Biomoleküls, z.B. einer Thiolgruppe, dienen. Auch ein Biomoiekül, das ursprüngiich keine Thiolgruppe aufweist, kann an die mit α-Üpoinsäure funktionalisierte Kompositstruktur des vorliegenden Beispiels gebunden werden, indem das Biomolekü! zuvor mit einer Thiolgruppe funktionalisiert wird.
Die Funktionaiisierung des dendritischen Makromoleküls mit solchen funktionellen
Gruppen zweiter Art, welche zur Anbindung der Kompositstruktur an ein Bäomolekül geeignet sind, kann nach der, voranstehend beschriebenen
Herstellung der Kompositstrukturen aus Nanoteüchen und saccharidfunktionalisierten dendritischen Makromolekülen erfolgen, indem an mindestens eine Oberflächengruppe oder an mindestens eine terminale Einheit eines dendritischen Makromoleküls der Kompositstrukturen eine funktionelle Gruppe zweiter Art gebunden wird. Es ist auch möglich, zuerst die saccharidfunktionalisierten dendritischen Makromoleküle etnsprechend zu funktionalisieren, bevor sie mit den nanoteilchen zusammengegeben werden, um Kompositstrukturen zu bilden.
Die Verwendung der voran stehend beschriebenen Kompositstrukturen im Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Detektion von Analyten in Flüssig- und Festphasen, beispielsweise in einem Biosensor, in einem Assay oder zur Untersuchung von Transportvorgängen in Zellen wird durchgeführt, indem zunächst an den zu untersuchenden Prozessen beteiligte Biomoleküle oder ein spezifisch an den Analyten bindendes Molekül mit der Kompositstruktur markiert wird, die markierten Moleküle zu der zu vermessenden oder zu analysierenden Probe gegeben werden, und unter Verwendung der Lumineszenz- oder magnetischen Eigenschaften der Kompositstruktur die Menge der an die nachzuweisenden Anaiyten gebundenen Moleküle oder die Verteilung der markierten Moleküle im zu untersuchenden System bestimmt und ausgewertet wird. Besitzt die Kompositstruktur beispielsweise Lumineszenzeigenschaften, kommt ihre Verwendung in Biosensoren, welche nach gängigen optischen Transduktionsprinzipien ausgestaltet sind, in Frage, wie beispielsweise bei ELISA/EIA-Tests oder bei Untersuchungen von biologischen Systemen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Weist die Kompositstruktur magnetische Eigenschaften auf, so kann sie beispielsweise als Marker in einem magnetischen Assay, z.B. MARIA, angewendet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Kompositstruktur (1 , 1 ') umfassend mindestens ein Nanoteilchen (2, 2') und mindestens ein dendritisches Makromolekül {4, 4', 4", 4'"), welches einen inneren Bereich mit verzweigten, insbesondere perfekt verzweigten bis hochverzweigten, Strukturen und eine Peripherie aufweist, welche Oberflächengruppen (B) des dendritischen Makromoleküls (4, 4', 4", 4'") umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl, insbesondere mehr als 50% der Oberflächengruppen (B) in der Peripherie des dendritischen Makromoleküls (4, 4', 4", 4"') jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art (R) aufweisen, wobei die funktionelle Gruppe erster Art (R) mindestens eine Monosaccharid-, Oligosaccharid- und/oder Polysaccharid-Einheit umfasst, und wobei das dendritische Makromolekül (4, 4', 4", 4"') das Nanoteilchen (2, 2') stabilisiert.
2. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 1 , wobei das Nanoteilchen (2, 2') fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
3. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 2, wobei das Nanoteilchen (2, 2') ein Metallteilchen, insbesondere aus einem Edelmetall oder einem Gemisch mehrerer Edelmetalle, insbesondere Gold, Silber oder Kupfer, einen Quantenpunkt, insbesondere ein Halbleiter-Nanoteilchen aus einem dotierten oder nicht dotierten H-Vl- oder Ii-V-Halbleiter, oder einen Nanodiamanten umfasst.
4. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 1 , wobei das Nanoteilchen (2, 2') magnetische Eigenschaften aufweist.
5. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 4, wobei das Nanoteiichen (2, 2') ein Metallteilchen aus einem oder einem Gemisch mehrerer der Metalle Eisen, Cobalt, Nickel, oder ein Metalloxidteilchen, insbesondere aus einem Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Eisenoxid, Bariumferrit, Strontiumferrit und Chromdioxid, oder ein
Eisenoxidteilchen mit Mangan-, Kupfer-, Nickel- oder Cobaltzusätzen ist.
6. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Nanoteiichen (2, 2') entlang seiner längsten Achse mindestens einen Durchmesser von 0,5 bis 20 nm, insbesondere zwischen 0,5 und 2 nm, aufweist.
7. Kompositstruktur (1 , 11) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nanoteiichen (2, 2r) an seiner Oberfläche eine Vielzahl von an die Oberfläche angebundenen Molekülen eines Dispersionsstabilisators (3, 3') aufweist, wobei der Dispersionsstabilisator (3, 3') insbesondere Octadekanthiol, Aminothiophenol oder Mercaptoundekansäure oder ein Derivat von Octadekanthiol, Aminothiophenol oder Mercaptoundekansäure ist.
8. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das dendritische Makromolekül (4, 4', 4", 4'") ein Dendrimer, insbesondere der dritten bis zehnten Generation, umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypropyleniminen (PPI), Polyamidoaminen (PAMAM) und Polyetheriminen (PEI) und deren Derivaten.
9. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das dendritische Makromolekül (4, 4', 4", 4'") ein hochverzweigtes Polymer bevorzugt mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 10.000 g/mol umfasst, weiches ausgewählt ist aus der Gruppe vorzugsweise bestehend aus hochverzweigten Poly(ethyleniminen), hochverzweigten Polyglycerolen, hochverzweigten Polyamiden, hochverzweigten Polylysinen, hochverzweigten Poiyestern und deren Derivaten.
10. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens eine funktionellen Gruppe erster Art (R) eine Monosaccharid-Gruppe, eine lineare oder verzweigte Oligosaccharid-Gruppe, eine lineare oder verzweigte Polysaccharid-Gruppe, eine aus einem Derivat eines Monosaccharids, eine aus einem Derivat eines linearen oder verzweigten Oligosaccharids oder eine aus einem Derivat eines linearen oder verzweigten Polysaccharids gebildete Gruppe ist.
11. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 10, wobei die mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art (R) ausgewählt ist aus der Gruppe vorzugsweise bestehend aus Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Mannose, Dimannose, Melobiose, Maltotriose und Maltoheptose und Derivaten von diesen.
12. Kompositstruktur (1 , 1') nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das dendritische Makromolekül (4, 4\ 4", 4'") ein Dendrimer ist, wobei eine Vielzahl, insbesondere mehr als 50% von in der Peripherie des Dendrimers vorliegenden terminalen Einheiten (8, 8', 8") eine, zwei oder mehr funktionelle Gruppen erster Art (R) umfassen.
13. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Nanoteilchen (2, 2') im inneren Bereich des dendritischen Makromoleküls aufgenommen ist.
14. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei mindestens zwei dendritische Makromoleküle (4, 4') mit ihrer Peripherie an das Nanoteilchen (2, 2') angrenzen und dieses stabilisieren.
15. Kompositstruktur (1 , 11) nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei mindestens eine Oberflächengruppe (B) des dendritischen Makromoleküls (4, 4', 4", 4"') und/oder mindestens eine von einer Oberflächengruppe (B) des dendritischen Makromoleküls (4, 4', 4", 4'") umfasste funktionelle Gruppe erster Art (R) eine funktionelle Gruppe zweiter Art aufweist, welche insbesondere geeignet ist, mit einer weiteren funktionellen Gruppe dritter Art eines weiteren Moleküls, insbesondere eines Biomoleküls, eines Liganden/Rezeptors, eines bioaktiven Moleküls, eines bio-aktiven Makromoleküls, eines biologischen Liganden/Rezeptor oder einer biologischen Erkennungssequenz, insbesondere eines Oligo- und Polynukleotids oder einer peptidischen Erkennungssequenz, zu reagieren.
16. Kompositstruktur (1 , 1 ') nach Anspruch 15, wobei die funktionelle Gruppe zweiter Art des dendritischen Makromoleküls eine Aminogruppe, Säuregruppe, Epoxidgruppe, Azidgruppe, Alkingruppe, Alkengruppe, aktivierte Estergruppe, Aldehydgruppe, Amädderivatgruppe,
Sulfonsäureamidderivatgruppe, Sulfatgruppe, Sulfonatgruppe, Halogengruppe, aktivierte Ethergruppe oder Thiolgruppe ist, und wobei die funktionelle Gruppe zweiter Art der funktionellen Gruppe erster Art eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe, eine Säuregruppe, Epoxidgruppe, Azidgruppe, Alkingruppe, Alkengruppe, aktivierte Estergruppe, Aldehydgruppe, Amidderivatgruppe, Sulfonsäureamidderivatgruppe, Sulfatgruppe, Sulfonatgruppe, Halogengruppe, aktivierte Ethergruppen und/oder Thiolgruppe ist, und wobei die weitere funktionelle Gruppe dritter Art eine Aminogruppe, Säuregruppe, Epoxidgruppe, Azädgruppe, Alkingruppe, Alkengruppe, aktivierte Estergruppe, Aldehydgruppe, Amidderivatgruppe, Sulfonsäureamidderivatgruppe, Sulfatgruppe, Sulfonatgruppe, Halogengruppe, aktivierte Ethergruppen oder Thiolgruppe ist.
17. Verfahren zur Herstellung der Kompositstruktur (1 ,1 ") nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei dem mit einem Dispersionsstabilisator (3, 3') stabilisierte Nanoteilchen (2, 2'), insbesondere mit einer Länge entlang seiner längsten Achse von 0, 5 bis 2 nm, insbesondere zwischen 0,8 und 1 ,5 nm, in einer wässrigen Lösung von dendritischen Makromolekülen (4, 4', 4", 4'") , welche einen inneren Bereich mit verzweigten, insbesondere perfekt verzweigten bis hochverzweigten, Strukturen, und eine Peripherie, welche Oberfiächengruppen (B) der dendritischen Makromoleküle (4, 4', 4", 4'") umfasst, aufweisen, wobei eine Vielzahl der Oberflächengruppen der dendritischen Makromoleküle (4, 4', 4", 41") jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe erster Art (R) aufweisen, wobei die funktionelle Gruppe erster Art (R) mindestens eine Mono-, Oligo- oder Polysacchahd-Einheit umfasst, dispergiert werden.
18. Verwendung einer Kompositstruktur (1 , 1 ') nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Markierung von Biomolekülen in einem biologischen, biochemischen oder medizinischen System, insbesondere in einem Biosensor, einem optischen oder magnetischen Assay, insbesondere in einem kompetitiven Assay.
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