DE102016221875B4

DE102016221875B4 - Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, Verwendungen hiervon und Verfahren zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch

Info

Publication number: DE102016221875B4
Application number: DE102016221875.1A
Authority: DE
Inventors: Ralph Sperling; Ralf Himmelreich; Tobias Schunck; Raphael Thiermann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2018-06-28
Anticipated expiration: 2036-11-09
Also published as: CN110199197A; DE102016221875A1; WO2018087093A1; US10775374B2; US20190285628A1

Abstract

Es wird eine stationäre Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft. Die feste Phase enthält mindestens eine erste Zone, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist, eine zweite Zone, auf der ein Rezeptor immobilisiert ist, wobei der Rezeptor zur Bindung von einem Liganden geeignet ist und eine dritte Zone, auf der Quantum Dots immobilisiert sind, die als FRET-Donor funktionieren und über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem geeigneten FRET-Akzeptor verbunden sind. Die stationäre Phase weist eine verbesserte Detektionssensitivität auf und erlaubt eine gleichzeitige und multiparametrische Detektion verschiedenster Analyten. Verwendungen der stationären Phase werden vorgeschlagen und ferner ein Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt.

Description

Es wird eine stationäre Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft. Die feste Phase enthält mindestens eine erste Zone, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist, eine zweite Zone, auf der ein Rezeptor immobilisiert ist, wobei der Rezeptor zur Bindung von einem Liganden geeignet ist und eine dritte Zone, auf der Quantum Dots immobilisiert sind, die als FRET-Donor funktionieren und über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem geeigneten FRET-Akzeptor verbunden sind. Die stationäre Phase weist eine verbesserte Detektionssensitivität auf und erlaubt eine gleichzeitige und multiparametrische Detektion verschiedenster Analyten. Verwendungen der stationären Phase werden vorgeschlagen und ferner ein Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt.
Stationäre Phasen, beispielsweise solche von Lateralflussstreifen (engl.: „Lateral Flow Strips“) sind bereits seit Jahrzehnten bekannt. Das Problem bekannter stationärer Phasen von Lateralflussstreifen ist, dass sie für die Detektion mancher Analyten nicht sensitiv genug sind. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurde unter anderem versucht, die in diesen stationären Phasen als Reporterpartikel enthaltenen Gold-Nanopartikel durch andere Partikelarten zu ersetzen. Bekannt ist es, statt der Gold-Nanopartikel sog. „Quantum Dots“ (kurz: „QD‟), „nanophosphors‟, Kohlenstoffnanopartikel und/oder Magnetpartikel einzusetzen.
Quantum Dots sind fluoreszierende kolloidale Partikel, die aus anorganischen Halbleitermaterialien bestehen. Die Fluoreszenzeigenschaften ergeben sich aus der Bandlücke des Materials sowie der Partikelgröße im Bereich einiger Nanometer („quantum confinement effect“). Um sie in ihrem flüssigen Trägermedium stabil zu halten, ist die Oberfläche der QDs in der Regel mit einer Schicht organischer Moleküle überzogen, die für sterische oder elektrostatische Abstoßung sorgt. Weitere Moleküle, insbesondere Biomoleküle, lassen sich über unterschiedliche Strategien chemisch kovalent an die QDs koppeln, oder durch Chemisorption an die anorganische Oberfläche der QDs binden und dabei die ursprünglich vorhandenen Stabilisatormoleküle verdrängen. Auf diese Weise dienen die QDs nicht nur als optisch aktive Spezies, sondern dienen auch als Trägerpartikel für weitere (bio-)molekulare Spezies bzw. Funktionalitäten.
Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer, auch Förster-Resonanzenergietransfer (kurz: „FRET‟) bezeichnet einen nichtstrahlenden Energieübertrag von einem angeregten Spezies (FRET-Donor, z.B. ein fluoreszierendes Molekül oder QD) auf ein anderes (FRET-Akzeptor). Bei diesem Energieübertrag geht der Akzeptor seinerseits in einen angeregten Zustand über, aus dem er ggf. ein Photon emittieren kann (Fluoreszenz), während der Donor seinen angeregten Zustand verlässt, ohne ein Photon emittiert zu haben (Quenching). Notwendig für einen solchen resonanten Übertragungsprozess ist ein spektraler Überlapp zwischen Donor-Emission und Akzeptor-Absorption, sowie eine örtliche Nähe zwischen Donor und Akzeptor. Die Effizienz des Übertrages fällt mit der sechsten Potenz des Abstandes ab, so dass u.a. molekulare Konformationsänderungen mit diesem Prozess beobachetet werden können, was sich für biologische Nachweisreaktionen auf vielfältige Weise ausnutzen lässt.
Neben einer Veränderung der Reporterpartikel wurde zur Erhöhung der Detektionssensitivität von Lateralflussstreifen versucht, ein anderes Detektionsverfahrens einzusetzen. Bei den ursprünglichen stationären Phasen der Lateralflusstreifen wurde noch einfach visuell das molekulare Bindungsereignis abgelesen. Später kamen hierfür Fluoreszenzdetektoren und Resonanz-Spulen-Magnetometer zum Einsatz.
Neben der Änderung der Art der Partikel und des Detektionsverfahrens ist im Stand der Technik bekannt, die Detektionssensitivität durch den Einsatz von Enzymen zu erhöhen, welche die Bildung eines Farbstoffs katalysieren.
Die US 2013/0210028 A1 offenbart codierte Mikropartikel, die bei der Untersuchung vieler verschiedener biologischer Wirkstoffe in Multiplex-Assays nützlich sind, beispielsweise um verschiedene Analyten von Interesse zu reinigen, zu isolieren und/oder zu detektieren.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine stationäre Phase (z.B. für Lateralflussstreifen) zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitzustellen, die eine hohe Detektionssensitivität und eine multiparametrische Detektion von mehreren Analyten gleichzeitig, d.h. in einem Anwendungsschritt, ermöglicht.
Die Aufgabe wird gelöst durch die stationäre Phase mit den Merkmalen von Anspruch 1, das Kit mit den Merkmalen von Anspruch 16, das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 17 und die Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 18. Die abhängigen Ansprüche zeigen bevorzugte Ausgestaltungsformen auf.
Erfindungsgemäß wird eine stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft, wobei die feste Phase mindestens

a) eine erste Zone enthält, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist;
b) eine zweite Zone enthält, auf der ein Rezeptor zur Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer immobilisiert ist; und
c) eine dritte Zone enthält, auf der Quantums Dot als FRET-Donor immobilisiert sind, wobei die Quantum Dots jeweils über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind.

Die erfindungsgemäße stationäre Phase erlaubt die Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer zur spezifischen Bindung des zu detektierenden, bestimmten Analyten. Zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch kann nun eine Reaktionslösung verwendet werden, die stöchiometrische Komplexe aus Antikörper/Aptamer und einem Analyt-Nuklease-Konjugat enthält. Unter Analyt-Nuklease-Konjugat werden auch solche Konjugate verstanden, bei denen die Nuklease - optional über einen Spacer - an ein Moleküle gebunden ist, das im Wesentlichen die Struktur des Analyten aufweist, wobei damit gemeint ist, dass der zu bestimmende Analyt dazu geeignet ist, den Komplex aus Antikörper/Aptamer und dem Analyt-Nuklease-Konjugat zu dissoziieren. Wird dieser Reaktionslösung nun eine Testprobe zugegeben, die den bestimmten Analyten enthält (= flüssige Probe), so dissoziiert der freie flüssige Analyt den Komplex aus Antikörper/Aptamer und dem Analyt-Nuklease-Konjugat (kompetitive Verdrängungsreaktion).
Mit anderen Worten wird dadurch eine zu der Menge an bestimmten Analyt in der Testprobe proportionale Menge an Analyt-Nuklease-Konjugat freigesetzt und ist nicht mehr an den Antikörper bzw. das Aptamer gebunden. Folglich wird diese Menge an bestimmten Analyt auch nicht an der zweiten Zone gebunden, wenn die flüssige Probe von der ersten Zone zur zweiten Zone strömt. Folglich erreicht diese Menge an bestimmten Analyt die dritte Zone, in der die an den Analyt gebundene Nuklease den Oligonukleotid-Linker zwischen FRET-Donor und FRET-Akzeptor schneidet und damit den FRET-Effekt zerstört. Folglich gelingt der Nachweis über die Gegenwart des zu detektierenden, bestimmten Analyten mithilfe der erfindungsgemäßen stationären Phase und FRET-Spektroskopie.
Ferner wird betont, dass die Nuklease-katalysierte Spaltung des Oligonukleotid-Linkers eine enzymatische Amplifikation des Detektionssignals und damit eine hohe Detektionssensitivität bewirkt. Zudem ist die erfindungsgemäße stationäre Phase kostengünstig bereitstellbar.
Darüberhinaus ergibt sich die Möglichkeit zur multiparametrischen Detektion: Im Falle eines selbst fluoreszierenden FRET-Akzeptors verschiebt sich im Falle eines positiven Signals die emittierte Strahlung von höherer zu niedrigerer Wellenlänge (Blauverschiebung der Fluoreszenz durch die Aufhebung des FRET-Effektes). Im Falle eines reinen, d.h. nicht emittierenden „Quenchers‟ als FRET-Akzeptors ist keine Blauverschiebung zu beobachten, sondern lediglich ein Anstieg der Fluoreszenz im Bereich der Emissionswellenlänge des FRET-Donors. Die Verwendung eines emittierenden Fluoreszenzfarbstoffs ist hierbei von Vorteil, da durch eine ratiometrische Detektion das Verhältnis von Donor- zu Akzeptorkonzentration direkt bestimmt werden kann, was eine robustere quantitative Detektion ermöglicht.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform sind die Quantum Dots jeweils über mehrere Oligonukleotid-Linker mit mehreren, bevorzugt mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens fünf, insbesondere mindestens 10, (bevorzugt identischen) FRET-Akzeptoren verbunden. Eine höhere Anzahl an FRET-Akzeptoren pro einzelnem Quantum Dot hat den Vorteil, dass die Signalstärke zunimmt (höhere Sensitivität) und sich das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltungsform ist die feste Phase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus feste Phase eines Lateralflussstreifens, feste Phase in einer Kammer und/oder in einem Kanal (z.B. einer Kapillare, eines Rohrs und/oder einer Säule) eines mikrofluidischen Chips, feste Phase einer Chromatographie-Säule und Kombinationen hiervon. Besonders bevorzugt ist die feste Phase die feste Phase eines Lateralflussstreifens.
Die feste Phase kann

i) anorganische Partikel und/oder einen anorganischen Faserstoff enthalten oder daraus bestehen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumoxid, Glasfaser, Mineralwollefaser, Steinwollefaser und Mischungen hiervon; und/oder
ii) organische Partikel und/oder einen organischen Faserstoff enthalten oder daraus bestehen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymerpartikel, Polymerfaserstoffe und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Nylon, Nylonderivate, Polyethersulfon, Kohlenstoffnanoröhrchen und Mischungen hiervon.

Die erste Zone der festen Phase kann

i) an einem ersten Ende der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule); oder
ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).

Die zweite Zone der festen Phase kann neben der ersten Zone auf der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der zweiten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die zweite Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).
Der auf der zweiten Zone immobilisierte Rezeptor kann

i) chemisch kovalent an die feste Phase gebunden sein; und/oder
ii) über nicht-kovalente Bindungen an die feste Phase gebunden sein, bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag-, Ni-NTA-Bindung und Kombinationen hiervon; und/oder
iii) Biotin oder Derivate hiervon enthalten oder daraus bestehen; und/oder
iv) Streptavidin oder Derivate hiervon enthalten oder daraus bestehen.

Die dritte Zone kann

i) an einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der dritten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule); oder
ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die dritte Zone in mehrere, voneinander räumlich separierte Unterzonen unterteilt und auf jeder einzelne dieser Unterzonen sind Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert, die über einen Oligonukleotid-Linker mit jeweils mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind wobei der Oligonukleotid-Linker jeder Unterzone eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist und die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle für alle Unterzonen unterschiedlich ist. Durch diese Ausgestaltungsform wird der gleichzeitige Nachweis einer Vielzahl verschiedenster Analyten ermöglicht (z.B. über die Kopplung der verschiedenen zu detektierenden Analyten an verschiedene Endonukleasen, wobei jede der verschiedenen Endonukleasen spezifisch für eine Schnittstelle ist, die sich nur in einer bestimmten Unterzone findet). Vorteilhaft ist diese Ausgestaltungsform auch deswegen, da neben dem bestimmten Analyten Markermoleküle (z.B. bestimmte Proteine pathogener und harmloser Bakterien) gleichzeitig mit erfasst werden können und die Markermoleküle somit als eine Art interner Standard dienen können. In dieser Ausgestaltungsform erfolgt die multiparametrische Detektion ortsaufgelöst, unter Verwendung der gleichen fluoreszierenden Spezies. In einer anderen Ausgestaltungsform kann die Detektion unterschiedlicher Spezies durch spektrales Multiplexing erfolgen, d.h. jedem Analyten wird ein eignes FRET-Paar zugeordnet, das dann in einer Mischung durch seine unterscheidbare Fluoreszenzemission detektiert werden kann.
Die Quantum Dots können ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus II-VI-Halbleiter, III-V-Halbleitern, Elementen der 4. Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, PbSe, Mischungen hiervon und Legierungen hiervon, bevorzugt ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HgTe, HgSe, HgS, CdTe, CdSe, ZnTe, ZnSe, ZnS, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, Ge, Si und PbSe, wobei die Quantum Dots insbesondere eine Form aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus sphärische Form, Stäbchenform, verzweigte Form, Kern-Schale Partikel und Kombinationen hiervon.
Der Oligonukleotid-Linker kann

a) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweisen; und/oder
b) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
c) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
d) ein erstes, ein zweites, ein drittes und/oder ein viertes einzelsträngiges Oligonukleotid aufweisen.

Das erste, ein zweite, ein dritte und/oder vierte einzelsträngige Oligonukleotid kann

i) eine Länge im Bereich von 5 bis 100 Basenpaaren aufweisen; und/oder
ii) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweisen; und/oder
iii) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
iv) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
v) den FRET-Akzeptor gebunden haben, wobei bevorzugt das dritte einzelsträngige Oligonukleotid den FRET-Akzeptor gebunden hat.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite einzelsträngige Oligonukleotid mit dem ersten Oligonukleotid zumindest bereichsweise hybridisiert, das dritte einzelsträngige Oligonukleotid mit dem zweiten Oligonukleotid zumindest bereichsweise hybridisiert und/oder das vierte einzelsträngige Oligonukleotid mit dem dritten Oligonukleotid zumindest bereichsweise hybridisiert.
Die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle kann an dem ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen Oligonukleotid lokalisiert sein. Entsprechendes gilt für die eine oder die mehreren Ankergruppe(n) zur Immobilisierung der Quantum Dots auf der dritten Zone und auch für den FRET-Akzeptor, wobei der FRET-Akzeptor besonders bevorzugt mit dem dritten einzelsträngigen Oligonukleotid verbunden ist.
Der Oligonukleotid-Linker kann ein Oligonukleotid enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, PNA, LNA, CeNA, NP, tcDNA, xDNA, Hybride hiervon und Mischungen hiervon.
Die feste Phase kann eine Kontrollenzymzone enthalten, die bevorzugt zwischen der ersten Zone und der zweiten Zone angeordnet ist, wobei auf der Kontrollenzymzone eine bestimmte Kontroll-Endonuklease immobilisiert ist, die bevorzugt über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die feste Phase gebunden ist.
Die feste Phase kann eine Kontrolloligonukleotidzone enthalten, die bevorzugt zwischen der zweiten Zone und einer Saugzone für Flüssigkeiten angeordnet ist, wobei auf der Kontrolloligonukleotidzone ein Quantum Dot als FRET-Donor immobilisiert ist, der über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Donor verbunden ist, wobei der Oligonukleotid-Linker bevorzugt eine für eine bestimmte Kontroll-Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist.
Die feste Phase kann eine Saugzone für Flüssigkeiten enthält, die bevorzugt an einem zweiten Ende der stationären Phase angeordnet ist, wobei die Saugzone bevorzugt ein Saugkissen („Saugpad“) enthält oder daraus besteht.
Die zweite Zone, die Kontrollenzymzone, die dritte Zone und/oder die Kontrolloligonukleotidzone kann zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet sein, bevorzugt in der Reihenfolge zweite Zone, Kontrollenzymzone, dritte Zone und dann Kontrolloligonukleotidzone, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die Zone (bzw. die Zonen) kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).
Erfindungsgemäß wird ferner ein Kit zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße stationäre Phase und eine Reaktionslösung, wobei die Reaktionslösung

a) eine Nuklease enthält, wobei die Nuklease chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist; und
b) einen Antikörper und/oder ein Aptamer enthält, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden;

Die Bindung der Nuklease an den mindestens einen bestimmten Analyten (oder ein Analyt-Analoges Molekül) kann über nicht-kovalente chemische Wechselwirkungen (z.B. nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag-, Ni-NTA-Bindung und Kombinationen hiervon) oder eine chemisch kovalente Bindung sein. Bevorzugt ist die Bindung eine chemisch kovalente Bindung.
Darüberhinaus wird Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt, umfassend die Schritte

a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend eine Nuklease, die chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist, und einen Antikörper und/oder ein Aptamer, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden, und wobei die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt;
b) Mischen der Reaktionslösung mit einem Gemisch, das den mindestens einen bestimmten Analyten enthalten könnte;
c) Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone der festen Phase der stationären Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche;
d) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie bevor die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat;
e) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie nachdem die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat;
f) Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals; und
g) Bestimmung der Anwesenheit des bestimmten Analyten in dem Gemisch anhand des in Schritt f) bestimmten Unterschieds.

Der Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals in Schritt f) kann einmalig am Ende des Verfahrens erfolgen (Endpunktmessung) und/oder kann mehrmalig bis zum Ende des Verfahrens, d.h. zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen, um die Kinetik der Entwicklung des FRET-Signals aufzunehmen.
Auch in dem Verfahren gilt, dass die Bindung der Nuklease an den mindestens einen bestimmten Analyten (oder ein Analyt-Analoges Molekül) über nicht-kovalente chemische Wechselwirkungen (z.B. nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag-, Ni-NTA-Bindung und Kombinationen hiervon) oder eine chemisch kovalente Bindung ausgestaltet sein kann. Bevorzugt ist die Bindung eine chemisch kovalente Bindung.
Letztlich wird die Verwendung einer erfindungsgemäßen stationären Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch mithilfe von FRET-Spektroskopie vorgeschlagen. Bevorzugt ist die Verwendung zur Detektion mindestens eines Analyten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein, DNA, RNA, organisches Molekül mit einer Masse ≤ 500 Da, anorganisches Molekül, anorganische Partikel, Zellen, Viren, Virenbestandteile und Kombinationen hiervon, insbesondere bakterielle Toxine, Antibiotika, bakterielle Zellen und Kombinationen hiervon.
Anhand der nachfolgenden Beispiele und Figuren soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden ohne diesen auf die hier gezeigten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.
Bezugszeichenliste

1:: Antikörper/Aptamer
2:: Ankergruppe (z.B. Biotin)
3:: Rezeptor (z.B. Streptavidin)
4:: zweite Zone der festen Phase
5:: Nuklease (Endonuklease oder Exonuklease)
6:: an Nuklease gebundener zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül
7:: freier zu bestimmender Analyt
8:: FRET-Akzeptor
9:: Oligonukleotid-Linker
10:: Quantum-Dot (= FRET-Donor)
11:: dritte Zone der festen Phase
11':: dritte Zone der festen Phase mit mehreren Unterzonen
12:: Reaktionslösung mit Nuklease-Analyt-Antigen/Aptamer-Komplex
13:: Zugabe von zu bestimmenden Analyt(en) zur Reaktionslösung
14:: Lichtemission bei FRET (z.B. Emission von rotem Licht)
15:: Lichtemission ohne FRET (z.B. Emission von grünem Licht)
16:: zweiter zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül
17:: dritter zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül
18:: erste Zobe der festen Phase zur Aufnahme einer flüssigen Probe
19:: Kontrolloligonukleotidzone
20:: Saugzone (enthält z.B. ein Saugpad)
21:: Kontrollenzymzone
22:: Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone
23:: Ankergruppe zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers
24:: Ankergruppe zur Verankerung an der dritten Zone
25:: erstes einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers
26:: zweites einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers
27:: drittes einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers
28:: erste mögliche Schnittstelle für Nuklease
29:: zweite mögliche Schnittstelle für Nuklease
30:: Spaltung des Oligonukleotid-Linkers über Nuklease

1 zeigt einen Antikörper 1 (bzw. ein Aptamer), der chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) an eine Ankergruppe 2 (z.B. Biotin) gebunden ist. Ferner ist ein Rezeptor 3 (z.B. Streptavidin) dargestellt, der auf der zweiten Zone 4 der festen Phase immobilisiert ist. Desweiteren zeigt 1 eine Nuklease 5 (z.B. eine Endonuklease oder Exonuklease), die chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) an den bestimmender Analyt 6 (bzw. ein zu diesem analoges Molekül) gebunden ist. Darüberhinaus ist der freie zu bestimmende Analyt 7 dargestellt. Letztlich stellt 1 ein an der dritten Zone 11 der festen Phase immobilisiertes Quantum Dot 10 (= FRET-Donor) dar, wobei das Quantum Dot 10 chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) über einen Oligonukleotid-Linker 9 mit einem FRET-Akzeptor (z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff) verbunden ist. Die Bezugszeichen für die in 1 dargestellten Symbole gelten ebenso für die 2 bis 4.
2 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. In die Reaktionslösung 12, die einen stöchiometrischen Komplex aus Nuklease-Analyt und dem Antikörper/Aptamer enthält erfolgt eine Zugabe 13 von zu bestimmenden Analyt(en). Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Reaktionslösung auf die erste Zone der festen Phase der stationären Phase aufgetragen 22. Über Kapillarkräfte wird die flüssige Reaktionslösung entlang der stationären Phase transportiert, wobei die in der Reaktionslösung enthaltenen Moleküle die zweite Zone 4 der festen Phase passieren. Dort werden alle Antikörper/Aptamere und daran gebundene Moleküle immobilisiert, sodass nur nicht an Antikörper/Aptamer gebundene Nuklease-Analyt-Komplexe die dritte Zone 11 der festen Phase erreichen können. Dort treffen diese auf das Quantum-Dot (FRET-Donor) und den FRET-Akzeptor, die über den Oligonukleotid-Linker miteinander verbunden sind und Lichtemission 14 bei FRET zeigen (z.B. Emission von rotem Licht). Die Nuklease schneidet nun den Oligonukleotid-Linker, wodurch die räumliche Nähe zwischen FRET-Donor und FRET-Akzeptor zerstört wird und kein FRET mehr stattfinden kann. Folglich entsteht in der dritten Zone der festen Phase eine Lichtemission 15 ohne FRET (z.B. Emission von grünem Licht). Diese Änderung in der Emissionswellenlänge des Lichts kann spektroskopisch gemessen werden.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Hier werden drei verschiedene zu bestimmende Analyten 6, 16, 17 der Reaktionslösung 12 zugegeben, wobei die Reaktionslösung für jeden der zu bestimmenden Analyten einen entsprechenden stöchiometrischen Komplex aus Nuklease-Analyt und dem Antikörper/Aptamer enthält. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Reaktionslösung auf die erste Zone 18 der festen Phase der stationären Phase aufgetragen 22. Über Kapillarkräfte wird die flüssige Reaktionslösung entlang der stationären Phase transportiert, wobei die in der Reaktionslösung enthaltenen Moleküle die hier zunächst eine Kontrollenzymzone 21 passieren, bevor sie zu der zweite Zone 4 der festen Phase gelangen. In der zweiten Zone 4 der festen Phase werden alle Antikörper/Aptamere und daran gebundene Moleküle immobilisiert, sodass nur nicht an Antikörper/Aptamer gebundene Nuklease-Analyt-Komplexe die in dieser Ausführungsform mehrere Unterzonen enthaltende dritte Zone 11' der festen Phase erreichen können. Dort treffen diese in jeder der Unterzonen der dritten Zone 11' auf jeweils eine spezifische Paarung aus Quantum-Dot (FRET-Donor), FRET-Akzeptor und Oligonukleotid-Linker. Hierfür ist beispielsweise ausreichend, dass jede Unterzone einen Oligonukleotid-Linker mit einer bestimmten Schnittstelle aufweist, die entweder nur von der Nuklease des ersten Analyten 6, der Nuklease des zweiten Analyten 16 oder der Nuklease des dritten Analyten 17 geschnitten werden kann. Trifft einer der spezifischen Analyten 6, 16, 17 mit seiner spezifischen Nuklease auf diese Unterzone, verschwindet die Lichtemission 14 bei FRET (z.B. Emission von rotem Licht) und es entsteht in dieser Unterzone eine Lichtemission 15 ohne FRET (z.B. Emission von grünem Licht). Diese Änderung in der Emissionswellenlänge des Lichts kann für jede Unterzone der dritten Zone 11' separat ausgelesen werden. In dieser Ausführungsform enthält die stationäre Phase zudem eine Kontrolloligonukleotidzone 19 und eine Saugzone (enthält z.B. ein Saugpad).
4 zeigt eine mögliche Verbindung von einem Quantum Dot 10 (FRET-Donor) über einen Oligonukleotid-Linker zu einem FRET-Akzeptor 8. Hierbei ist ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid 25 des Oligonukleotid-Linkers über eine Ankergruppe 23 (z.B. einen 6xHis-tag) an dem Quantum Dot 10 gebunden (Chelatbindung). Das erste einzelsträngige Oligonukleotid 25 ist mit einem zweiten einzelsträngigen Oligonukleotid 26 hybridisiert, wobei das zweite einzelsträngige Oligonukleotid 26 eine Ankergruppe 24 zur Verankerung an der drittem Zone aufweist. An der Hybridisierungsstelle des ersten einzelsträngigen Oligonukleotids 25 und zweiten einzelsträngigen Oligonukleotids 26 kann erste Schnittstelle 28 für eine Nuklease codiert sein. Ferner ist in dieser Ausgestaltungsform ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid 27 an das zweite einzelsträngige Oligonukleotid 26 hybridisiert, wobei hier optional eine zweite Schnittstelle 29 für eine Nuklease codiert sein kann. Das dritte einzelsträngige Oligonukleotid 27 trägt den FRET-Akzeptor 8 und bringt diesen in unmittelbare räumliche Nähe zum Quantum Dot 10 (FRET-Donor). In 4 ist zudem dargestellt, wie die Struktur nach Spaltung 30 des Oligonukleotid-Linkers durch Einwirken der Nuklease aussieht. Es wird deutlich, dass der FRET-Akzeptor 8 nach der Spaltung nicht mehr in unmittelbarer Nachbarschaft zum Quantum Dot 10 (FRET-Donor) angeordnet ist und damit kein FRET mehr stattfinden kann.

Beispiel 1 - Beispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch
In einer Vorinkubation wird ein Gemisch, das den gesuchten Analyten enthalten könnte („Probe“) mit einer Reaktionslösung vermengt, die Biotinmodifizierte Antikörper und Antigen-Nuklease-Konjugate enthält, wobei sich die Antikörper gegen das Antigen richten und mindestens ein Antigen dem gesuchten Analyten entspricht. Alle Antigen-Nuklease-Konjugate der Reaktionslösung liegen in Antikörper-gebundenen Zustand vor (d.h. sind mit Antikörper komplexiert). Nach Zugabe der Probe läuft eine kompetitive Bindungsreaktion ab: Bei Anwesenheit von einem zum Antigen strukturell identischen Analyten in der Probe werden die am Antikörper gebundenen Antigen-Nuklease-Konjugate teilweise vom Antikörper verdrängt und liegen nun frei in der Reaktionslösung vor.
Die mit dem Gemisch versetzte Reaktionslösung wird anschließend auf die erste Zone der stationäre Phase aufgebracht. Nach dem Aufbringen auf die erste Zone der stationären Phase wandern die gelösten Moleküle getrieben über Kapillarkraft - optional über eine Kontrollenzymzone - zur zweiten Zone der stationären Phase („Fängerzone“). Auf der zweiten Zone ist ein Rezeptor (hier: Streptavidin) immobilisiert, der zur Anbindung von einem biotinylierten Antikörper geeignet ist (Streptavidin-Biotin-Bindung). Folglich werden in der zweiten Zone über die Biotin-Streptavidin-Bindung alle biotinylierten Antikörper (und die an sie gebundenen Antigen-Nuklease-Konjugate) gebunden und können nicht weiter in Richtung dritte Zone der stationäre Phase gelangen.
Nur die vorher durch kompetitive Wechselwirkung freigesetzten bestimmten Antigen-Nuklease-Konjugate, d.h. solche Antigen-Nuklease-Konjugate, deren Antigen strukturell analog oder identisch mit dem Analyt ist, werden über Kapillarkraft weiter zur dritten Zone der stationäre Phase („Detektionszone“) transportiert. In der dritten Zone treffen die Antigen-Nuklease-Konjugate auf Quantum-Dots als FRET-Donor, die auf der dritten Zone immobilisiert sind und über einen Oligonukleotid-Linker an einen FRET-Akzeptor gebunden sind. Die räumliche Nähe des FRET-Donors und FRET-Akzeptors sorgt dafür, dass FRET stattfindet. Trifft nun jedoch das Analyt-Nuklease-Konjugat auf die dritte Zone wird der Oligonukleotid-Linker durch die enzymatische Wirkung der Nuklease gespalten. Dies bewirkt, dass durch die Brown'sche Molekularbewegung und den durch Kapillarkraft getriebenen Fluss die räumliche Nähe zwischen FRET-Donor und FRET-Akzeptor verloren geht. Der FRET zwischen dem QD als FRET-Donor und seinem FRET-Akzeptor kommt zum Erliegen, was als positives Signal über FRET-Spektroskopie ausgelesen werden kann. Beispielsweise wird das Signal über einen Lateral Flow Reader mit bildgebender und spektral aufgelöster Fluoreszenzdetektion ausgelesen. Das kann mit einem Spektrometer erfolgen, aber auch mit zwei Farbfiltern.
Wegen des katalytischen Charakters der Reaktion kann ein Nukleasemolekül mehrere oder viele Abspaltungsreaktionen bewirken, wodurch es zu einer Signalamplifikation kommt.
Beispiel 2 - Herstellung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Linkers
Um die Hybridisierung einzelsträngiger Oligonukleotide bei Raumtemperatur (25 °C) stabil zu halten sind ca. 10 bis 20 komplementäre Basenpaare nötig. Enthält der Oligonukleotid-Linker eine spezifische Schnittstelle einer Restriktions-Endonuklease, so befindet sich diese idealerweise inmitten der komplementären Basenpaare. Für den Fall, dass die Restriktions-Endonuklease den Oligonukleotiddoppelstrang mit überhängenden Enden schneidet, darf der Überhang nicht zu lang sein, um nicht nach dem Schnitt bei Raumtemperatur zu hybridisieren. Diese Voraussetzung trifft jedoch für einen Großteil aller bekannten Restriktions-Endonuklease zu.
Aufbau mit zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden („II“-Form)
Ein erfindungsgemäßer Oligonukleotid-Linker zwischen dem QD als FRET-Donor und dem FRET-Akzeptor (z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff) kann aus zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden aufgebaut sein. Die einzelsträngigen Oligonukleotide sind hierfür zumindest bereichsweise miteinander hybridisiert. Enthalten die beiden Oligonukleotide eine spezifische Schnittstelle für eine Restriktions-Endonuklease, so befindet sich diese innerhalb des hybridisierten Bereichs.
Aufbau mit drei einzelsträngigen Oligonukleotiden („Y“-Form)
In diesem Aufbau wird zunächst ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid („Bindungs-Oligonukleotid“) über eine Ankergruppe an die Oberfläche eines QD gebunden (z.B. über das 3'-Ende des Oligonukleotids). Das erste einzelsträngige Oligonukleotid enthält eine Spacer-Sequenz S (z.B. am 3'-Ende) und eine Linker-Sequenz L (z.B. am 5'-Ende). An die Linker-Sequenz L des ersten einzelsträngigen Oligonukleotids wird dann ein zweites einzelsträngiges Oligonukleotid („Linker-Oligonukleotid“) über dessen Linker-Sequenz L’ (z.B. am 3'-Ende des zweiten Oligonukleotids) hybridisiert. Das zweite einzelsträngige Oligonukleotid weist zudem eine Schnittstellensequenz A (z.B. am 5'-Ende des zweiten Oligonukleotids) auf, die für eine bestimmte Restriktions-Endonuklease spezifisch ist. An die Schnittstellensequenz A des zweiten Oligonukleotids wird dann ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid („Reporter-Oligonukleotid“) über dessen Schnittstellensequenz A’ (z.B. am 3'-Ende des dritten Oligonukleotids) hybridisiert. Das dritte einzelsträngige Oligonukleotid weist (z.B. chemisch kovalent gebunden) den FRET-Akzeptor (z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff) auf (z.B. am 5'-Ende des dritten Oligonukleotids).
Durch den Aufbau über drei einzelsträngige Oligonukleotide ist es möglich, zunächst nur eine Art von DNA-funktionalisierter QD herzustellen, nämlich lediglich mit dem Bindungs-Oligonukleotid modifizierte QD. Anschließend kann auf flexible Art und Weise durch das Hinzufügen des Linker-Oligonukleotids und des Reporter-Oligonukleotids eine Spezifität des Oligonukleotid-Linkers für bestimmte Restriktions-Endonukleasen eingeführt werden. Durch die Y-Geometrie des Oligonukleotid-Linkers ist die vom Enzym zu schneidende Oligonukleotidsequenz sterisch gut zugänglich und der Farbstoff befindet sich so nah wie möglichen am QD, um eine hohe FRET-Effizienz zu ermöglichen.
Aufbau mit vier einzelsträngigen Oligonukleotiden (immobilisierte „Y“-Form)
Das modulare Konzept für den Aufbau des Oligonukleotid-Linkers vereinfacht die Präparation und Optimierung der einzelnen Komponenten und erlaubt eine ganze Reihe von möglichen Varianten. So kann z.B. an das Bindungs-Oligo neben den Linker-Oligos auch ein weiteres, viertes Oligonukleotid angebracht werden, das von der Nuklease nicht geschnitten wird und die Immobilisierung des QD in der dritten Zone auf der festen Phase der stationären Phase vermittelt (z.B. über chemisch kovalente Bindung von Biotin an das vierte Oligonukleotid, wenn die feste Phase der dritten Zone der stationäre Phase immobilisiertes Streptavidin aufweist).
Mischung von mit Oligonukleotiden
Neben den oben beschriebenen Linker-Oligonukleotiden, über die der FRET-Akzeptor an der Oberfläche der QD angebunden wird, können diese zusätzlich mit anderen Oligonukleotiden oder anderen geeigneten Molekülen ausgestattet werden, um weitere Funktionalitäen zu erhalten (z.B. weitere chemische Ankergruppen, z.B. für die Immobilisierung) oder die Stabilität des QD-FRET Systems zu erhöhen. Gemeint ist die kolloidale Stabilität sowie die Stabilität bei Trocknung, Lagerung und Befeuchtung während der Nachweisreaktion.
Beispiel 3 - Konjugation von Oligonukleotid-Linker an QD und FRET-Akzeptor
Quantum Dots (QD) sind kolloidale Halbleiter-Nanopartikel mit Fluoreszenzeigenschaften. Diese werden für die erfindungsgemäße Verwendung über einen Oligonukleotid-Linker (bevorzugt einen über sequenzspezifische Nukleasen spaltbaren Oligonukleotid-Linker) mit einem FRET-Akzeptor (z.B. ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül) konjugiert. Der FRET-Akzeptor wird hierbei in Abhängigkeit der Art des QD so ausgewählt, dass die Fluoreszenzanregung des QD über Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auf sie übertragen wird. Als FRET-Akzeptor kann hierbei ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül eingesetzt werden, das bei FRET durch das QD rotes Licht emittiert. Alternativ kann als FRET-Akzeptor ein sog. „Quencher“ verwendet werden, der selbst nicht emittiert, aber die Intensität der Fluoreszenzemission des QD schwächt bis vollständig unterdrückt. In diesem Falle ist bei FRET keine Emissionsintensität bei der Emissionswellenlänge des QD (z.B. grünes Licht) zu beobachten. Die Konjugation der QD über den Oligonukleotid-Linker an den FRET-Akzeptor erfolgt bevorzugt chemisch kovalent.
Durch den Einsatz unterschiedlicher Oligonukleotid-Linker können unterschiedliche Analyten nachgewiesen werden. Hierfür werden die zu detektierenden Analyten (Antigene) an Nukleasen gekoppelt, welche nur in einer bestimmten Nukleotidsequenz des Oligonukleotid-Linkers schneiden (sog. Restriktions-Endonukleasen). Besteht die Detektionszone der stationäre Phase aus mehreren Subzonen, so kann jede einzelne Subzone einen spezifischen Oligonukleotid-Linker aufweisen, der sich nur durch eine bestimmte Restriktions-Endonuklease schneiden lässt und damit nur durch diese bestimmte Antigen-Nuklease-Kombination in der Subzone ein Signal generiert wird. Die für die jeweilige Nuklease spezifische Sequenz besteht in der Regel aus ca. drei Basenpaaren, der Schnitt kann je nach ausgewähltem Enzym glatt oder versetzt erfolgen. Durch die Verwendung der spezifischen Nukleasen und spezifischen Schnittstellen in den Oligonukleotid-Linkern lassen sich mittels einer ortsaufgelösten (bildgebenden) Detektion gleichzeitig mehrere Analyten nachweisen.

Claims

Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, enthaltend eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft, wobei die feste Phase mindestens a) eine erste Zone enthält, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist; b) eine zweite Zone enthält, auf der ein Rezeptor zur Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer immobilisiert ist, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden; c) eine dritte Zone enthält, auf der Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, wobei die Quantum Dots jeweils über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind.
Stationäre Phase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus feste Phase eines Lateralflussstreifens, feste Phase in einer Kammer und/oder in einem Kanal eines mikrofluidischen Chips, feste Phase einer Chromatographie-Säule und Kombinationen hiervon.
Stationäre Phase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase i) anorganische Partikel und/oder einen anorganischen Faserstoff enthält oder daraus besteht, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumoxid, Glasfaser, Mineralwollefaser, Steinwollefaser und Mischungen hiervon; und/oder ii) organische Partikel und/oder einen organischen Faserstoff enthält oder daraus besteht, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymerpartikel, Polymerfaserstoffe und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Nylon, Nylonderivate, Polyethersulfon, Kohlenstoffnanoröhrchen und Mischungen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zone der festen Phase i) an einem ersten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils; oder ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zone neben der ersten Zone der festen Phase auf der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der zweiten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die zweite Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der zweiten Zone der festen Phase immobilisierte Rezeptor i) chemisch kovalent an die feste Phase gebunden ist; und/oder ii) über nicht-kovalente Bindungen an die feste Phase gebunden ist, bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag-NiNTA-Bindung und Kombinationen hiervon; und/oder iii) Biotin oder Derivate hiervon enthält oder daraus besteht; und/oder iv) Streptavidin oder Derivate hiervon enthält oder daraus besteht.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Zone der festen Phase i) an einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der dritten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils; oder ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Zone in mehrere, voneinander räumlich separierte Unterzonen unterteilt ist und auf jeder einzelne dieser Unterzonen Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, der über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind, wobei der Oligonukleotid-Linker jeder Unterzone eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist und die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle für alle Unterzonen unterschiedlich ist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantum Dots ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus II-VI-Halbleiter, III-V-Halbleitern, Elementen der 4. Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, PbSe, Mischungen hiervon und Legierungen hiervon, bevorzugt ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HgTe, HgSe, HgS, CdTe, CdSe, ZnTe, ZnSe, ZnS, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, Ge, Si und PbSe, wobei die Quantum Dots insbesondere eine Form aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus sphärische Form, stäbchenform, verzweigte Form, Kern-Schale Partikel und Kombinationen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotid-Linker a) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist; und/oder b) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder c) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder d) ein erstes, ein zweites, ein drittes und/oder ein viertes einzelsträngiges Oligonukleotid aufweist, das bevorzugt i) eine Länge im Bereich von 5 bis 100 Basenpaaren aufweist; und/oder ii) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist; und/oder iii) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder iv) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder v) den FRET-Akzeptor gebunden hat, wobei bevorzugt das dritte einzelsträngige Oligonukleotid den FRET-Akzeptor gebunden hat.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotid-Linker ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, PNA, LNA, CeNA, NP, tcDNA, xDNA, Hybride hiervon und Mischungen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine Kontrollenzymzone enthält, die bevorzugt zwischen der ersten Zone und der zweiten Zone angeordnet ist, wobei auf der Kontrollenzymzone eine bestimmte Kontroll-Endonuklease immobilisiert ist, die bevorzugt über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die feste Phase gebunden ist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine Saugzone für Flüssigkeiten enthält, die bevorzugt an einem zweiten Ende der stationären Phase angeordnet ist, wobei die Saugzone bevorzugt ein Saugkissen enthält oder daraus besteht.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine Kontrolloligonukleotidzone enthält, die bevorzugt zwischen der zweiten Zone und einer an einem zweiten Ende der stationären Phase angeordneten Saugzone für Flüssigkeiten angeordnet ist, wobei auf der Kontrolloligonukleotidzone Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, die über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Donor verbunden sind, wobei der Oligonukleotid-Linker bevorzugt eine für eine bestimmte Kontroll-Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zone, die Kontrollenzymzone, die dritte Zone und/oder die Kontrolloligonukleotidzone zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, bevorzugt in der Reihenfolge zweite Zone, Kontrollenzymzone, dritte Zone und dann Kontrolloligonukleotidzone, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die Zonen kontaktierenden Bauteils.
Kit zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, enthaltend mindestens ein stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche und eine Reaktionslösung, wobei die Reaktionslösung a) eine Nuklease enthält, wobei die Nuklease chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist; und b) einen Antikörper und/oder ein Aptamer enthält, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden; dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt.
Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend eine Nuklease, die chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist, und einen Antikörper und/oder ein Aptamer, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden, und wobei die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt; b) Mischen der Reaktionslösung mit einem Gemisch, das den mindestens einen bestimmten Analyten enthalten könnte; c) Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone der festen Phase der stationären Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche; d) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie bevor die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat; e) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie nachdem die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat; f) Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals; und g) Bestimmung der Anwesenheit des bestimmten Analyten in dem Gemisch anhand eines in Schritt f) bestimmten Unterschieds.
Verwendung einer stationären Phase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch mithilfe von FRET-Spektroskopie.