ES2545232T3 - Ensayo de detección de analito - Google Patents

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ES2545232T3 ES09827053.1T ES09827053T ES2545232T3 ES 2545232 T3 ES2545232 T3 ES 2545232T3 ES 09827053 T ES09827053 T ES 09827053T ES 2545232 T3 ES2545232 T3 ES 2545232T3
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Edin Nuhiji
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Abstract

Un método para la detección de un analito de ácido nucleico en una solución acuosa, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos al analito de ácido nucleico a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído que están marcadas con un fluoróforo o que comprenden un punto cuántico; (ii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial; (iii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito de ácido nucleico durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito de ácido nucleico y su respectivo ligando; y (iv) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección mediante modos de galería de murmullos (WGM) para la detección de un acontecimiento de unión.

Description

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13-08-2015
Tabla 1
Sumario de los identificadores de secuencia
ID. DE SECUENCIAS Nº
DESCRIPCIÓN
1
oligonucleótido-enl
2
oligonucleótido -α-enl
3
oligonucleótido -α-enl de 40 bases
4
oligonucleótido -α-enl de 20 bases
5
oligonucleótido -α-enl de 10 bases
6
oligonucleótido -Control (secuencia objetivo aleatoria no específica)
7
Secuencia de ADN objetivo SNP humano -rs 10434
8
Secuencia de sonda de ADN complementario de SNP humano rs10434 -α-rs10434 A
9
Secuencia de sonda de ADN desemparejado de SNP humano rs 0434 -α-rs10434 B
10
Región del SNP humano rs 10434
11
Cebador directo
12
Cebador inverso
Breve descripción de las figuras
Algunas figuras contienen representaciones o entidades en color. Las fotografías en color están disponibles previa solicitud al Titular de la Patente o en una Oficina de Patentes apropiada. Pueden aplicarse cargos si se obtiene a partir de una Oficina de Patentes.
La Figura 1 es una representación gráfica de un biosensor de ADN mediante WGM que muestra unos desplazamientos coherentes y medibles después de la unión. Estas mediciones se han llevado a cabo en una solución acuosa que contiene tampones de pH y un electrólito. Se observó un desplazamiento demostrable en el perfil de WGM para cada una de las microesferas 9, 10, 11 y 12 (A, B, C y D respectivamente) después de que las microesferas o las partículas microesferoidales se pusieran en contacto con un analito de ácido nucleico complementario del compañero de unión del analito de ácido nucleico anclado en la superficie de las microesferas. Cada una de las microesferas tenía un diámetro de 5,6 µm.
La Figura 2 es una representación esquemática del medio de detección y del aparato de WGM.
La Figura 3 es una representación gráfica de espectros de WGM generados con una luz incidente de 6,3 µW, de 50,2 µW, de 214,5 µW y de 1.160,5 µW (A, B, C y D respectivamente). La fuente luminosa tenía una longitud de onda de 532 nm y el tiempo de exposición era de 200 ms.
La Figura 4 es una representación gráfica del perfil de WGM generado después de la iluminación de las partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 µW) durante 10, 60, 200 y 1.000 ms (A, B, C y D, respectivamente). La visibilidad disminuyó gradualmente hasta un tiempo de exposición de 5 segundos (E).
La Figura 5 es una imagen fotográfica de las partículas microesferoidales de la presente invención inmovilizadas en la superficie de un cubreobjetos de vidrio.
La Figura 6 es una representación fotográfica que muestra las etapas de la reacción química simplificadas mediante el uso de una partícula de sílice funcionalizada con grupos mercaptano. Mediante la unión covalente se consigue la conjugación fragmentos de nucleótidos-acriloílo marcados fluorescentemente. Este proceso da lugar a una fabricación robusta y rentable de microesferas fluorescentes que propagan los WGM.
La Figura 7 es una representación gráfica que muestra la gráfica de las posiciones de los picos de los cuatro picos principales de WGM a partir de una única microesfera, en función de la fase del ensayo en la que fueron registrados. La gráfica muestra claramente los principales desplazamiento hacia el rojo de los picos durante la hibridación, el desplazamiento hacia el azul durante la desnaturalización y de nuevo el desplazamiento hacia el rojo tras una exposición de nuevo al objetivo.
La Figura 8 es una representación fotográfica que muestra una visión general de la síntesis de partículas y del ensayo de hibridación mediante WGM. Parte A) indica las características clave de las microesferas de SiO2 de 7,50 µm modificadas con el oligonucleótido enl de 70 bases. TMR = colorante de marcaje de tetrametil rodamina;
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Las partículas microesferoidales descritas en el presente documento pueden comprender un material elegido de la lista que consiste en: melamina o un derivado químico de la misma tal como melamina formaldehído; sílice; látex; titanio; dióxido de estaño; ytrio; alúmina; otros óxidos metálicos binarios; perovskitas y otros óxidos metálicos piezoeléctricos; PLGA; sacarosa; agarosa; y otros polímeros.
Las partículas microesferoidales descritas en el presente documento pueden estar funcionalizadas por fracciones químicas tales como con grupos amina, aldehído, sulfato o tiol, carboxilo, carboxilasa y/o hidroxilo. Las partículas microesferoidales pueden ser partículas de amina-aldehído tales como, pero no se limitan a, partículas de melamina formaldehído (MF), las partículas usadas de acuerdo con la invención. Las partículas de MF proporcionan un robusto sustrato de conjugación para los oligonucleótidos objetivo modificados con acriloílo y las proteínas a las que se unen. El enlace covalente permanece intacto después de la exposición a soluciones con un pH elevado y a temperaturas extremas, por lo que pueden conseguirse unos WGM de alta calidad tras el tratamiento.
La melamina es un trímero de cianamida y también se conoce como: 1,3,5-triazin-2,4,6-triamina; 2,4,6-triamino-striazina; cianurotriamida; cianurotriamina o cianuramida. En los métodos de la invención, la melamina es melamina formaldehído.
También se describe en el presente documento el uso de partículas magnéticas en el ensayo de WGM. Dichas partículas podrían presentarse en unas posiciones fijas muy precisas. La inmovilización de partículas facilitada magnéticamente permite el análisis individual de partículas aisladas y aliviar la necesidad de fabricar sustratos de inmovilización a medida.
Pueden seleccionarse partículas con un elevado índice de refracción que soporten los WGM en disolución, tales como sílice coloidal, zirconio o titanio. Alternativamente, los materiales de las microesferas con cubierta con un índice de refracción mayor proporcionan una útil plataforma de sensor ideal. Estas partículas contienen unos elevados modos de orden radial en la capa adsorbida y, como resultado, deberían permitir la adquisición de espectros de WGM de Q elevado, que contienen los modos de orden mayor.
El empleo de nanocristales semiconductores (por ejemplo, de CdSe, CdTe, CdS) proporciona otra alternativa fluorescente robusta. Una partícula fluorescentemente estable que soporta los WGM en disolución puede ser producida mediante la adsorción de una monocapa de nanocristales a una microesfera homogénea, seguido de una cubierta estabilizante con un elevado índice de refracción. A continuación se proporciona una lista de materiales y de partículas con un elevado índice de refracción, disponibles comercialmente:
El término fluoróforo es general y no se limita a los colorantes orgánicos, sino que incluye cualquier producto químico, molécula o material, que tiene la propiedad de emitir luz con una longitud de onda bien definida cuando es iluminada. Esto incluye, pero no se restringe a; colorantes orgánicos, complejos organometálicos, puntos cuánticos (incluyendo nanovarillas, nanocables y otras morfologías, QD recubiertos y no recubiertos, aleaciones y mezclas de los mismos), iones de tierras raras o mezclas de los mismos, conversores ascendentes y también fluoróforos emisores de infrarrojo, que pueden ser ventajosos en las muestras absorbentes. También pueden incorporarse otros materiales tales como materiales fluorescentes defectuosos tales como diamantes que contienen defectos o vacíos inducidos por nitrógeno.
Los WGM pueden ser generados por fluoróforos que están unidos a la superficie de la microesfera, pero también pueden ser generados cuando el fluoróforo está incluido o distribuido en la microesfera. La distribución de los fluoróforos afecta a la intensidad de los diferentes modos de WGM, pero para los propósitos de esta invención, no se hace ninguna distinción en si los fluoróforos están en la superficie o dentro de la microesfera.
Metales
Titanio,TiO2 (2,20), Aluminio Al2O3 (1,77), Mylar (1,65), Cobre Cu (2,43), Platino Pt (2,33)
Minerales (gemas)
Diamante (2,42), Cuarzo (1,54 -1,55), Rubí (1,76 -1,78), Zafiro (1,76 -1,78), Estrella de zafiro (1,76 -1,77), Granate (1,79 -1,81), Espinela (1,72 -1,73), Espinela azul (1,72 -1,74), Espinela roja (1,71 -1,74), Rubí estrella (1,76 -1,77), Tanzanita (1,69 -1,70), Topacio (1,61 -1,63), cristal (2,00)
Plásticos
La resina de Melamina Formaldehído (C5H8N6O)n [no debe confundirse con melamina] (1,68), se elabora mediante un proceso de polimerización de melamina con formaldehído
Cerámicas
Cerámica de Silicato de Zirconio (2,00 -2,20), Zirconio ZnO2 (2,40)
Vidrio
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BsiWI
4 GTAC
BsmAI
4 Variable
BsmBI
4 Variable
BsmFI
4 Variable
BsoBI
4 Variable
BspEI
4 CCGG
BshHI
4 CATG
BspMI
4 Variable
BsrFI
4 CCGG
BsrGI
4 GTAC
BssHII
4 CGCG
BssKI
4 CCNG
BssSI
4 TCGT
BstEII
4 GTNA
BstYI
4 GATC
BtgI
4 Variable
DpnII
4 GATC
EaeI
4 GGCC
KasI
4 GCGC
MboI
4 GATC
MfeI
4 AATT
MluI
4 CGCG
NcoI
4 CATG
NgoMIV
4 CCGG
NheI
4 CTAG
NotI
4 GGCC
PaeR7I
4 TCGA
PspGI
4 Variable
SalI
4 TCGA
Sau3AI
4 GATC
SexAI
4 Variable
SfcI
4 Variable
SgrAI
4 CCGG
SpeI
4 CTAG
StyI
4 Variable
TliI
4 TCGA
Tsp45I
4 Variable
Tsp509I
4 AATT
XbaI
4 CTAG
XhoI
4 TCGA
XmaI
4 CCGG
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La Tabla 3 recoge un subconjunto de endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II que generan salientes en 3', en su mayor parte de cuatro bases de longitud.
Tabla 3
Salientes en 3', en su mayor parte de 4 bases, de endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II
Enzima
Longitud del saliente Secuencia
AatII
4 ACGT
ApaI
4 CCGG
BanII
4 Variable
Bme1580I
4 Variable
BsiHKAI
4 Variable
Bsp1286I
4 Variable
BstXI
4 Variable
FseI
4 GGCC
HaeII
4 CGCG
Hpy99
4 Variable
KpnI
4 GTAC
NlaIII
4 GTAC
NsiI
4 ACGT
NspI
4 GTAC
PstI
4 TGCA
SacI
4 TCGA
SphI
4 GTAC
TspRI
8 Variable
5 "Exonucleasa", según se usa en el presente documento, significa una enzima nucleasa que hidroliza nucleótidos de los extremos de hebras de ADN. Un ejemplo de una enzima exonucleasa adecuada para la preparación de los ligandos de unión al analito y/o de los analitos que se van a detectar es una exonucleasa lambda (λ). La exonucleasa lambda es una exonucleasa de ADN bicatenario que degrada los ADN bicatenarios en la dirección de
10 5'-hacia 3'-. La exonucleasa lambda requiere que el extremo 5'-del ADN sea bicatenario y esté fosforilado. La digestión con la exonucleasa lambda puede usarse preferiblemente para degradar hebras específicas de ADN bicatenario para generar ligandos de unión al analito y analitos de ADN monocatenario que van a ser detectados.
En una forma de realización específica, las partículas microesferoidales de la presente invención están recubiertas
15 con ácidos nucleicos derivados de un agente patógeno tal como un virus, una bacteria, una levadura o un parásito. La detección de un acontecimiento de unión es indicativa de la presencia de ácidos nucleicos complementarios en la muestra, y por lo tanto es indicativa de la presencia del agente en la muestra y/o en la fuente de la muestra.
"Complementario”, según se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un emparejamiento preciso
20 entre dos nucleobases de un compuesto oligomérico. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico) es capaz de unirse a través de un puente de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, siendo dicho ácido nucleico objetivo una molécula de ADN, de ARN o de un oligonucleótido, entonces la posición del puente de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo se considera una posición complementaria. El oligonucleótido y la molécula adicional de
25 ADN, de ARN o de un oligonucleótido son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias de cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden unirse entre sí a través de puentes de hidrógeno. Por lo tanto, "hibridable específicamente " y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o de complementariedad a lo largo de un número suficiente de nucleobases, de forma que se produzca un enlace estable y específico entre el oligonucleótido y un ácido nucleico
30 objetivo.
La presente memoria descriptiva describe partículas microesferoidales que son útiles para comprobar la presencia de una amplia variedad de analitos en una muestra individual.
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la industria alimentaria, en los ensayos de aguas medioambientales, en la industria de la agricultura, en los ensayos de bio-terrorismo y en los ensayos farmacológicos.
Las partículas también pueden ser recicladas para un uso continuo y para el cribado de alto rendimiento.
Los cambios en el WGM indican la presencia de un analito. También es posible recoger información adicional a partir de los cambios en las intensidades relativas, en los anchos de la línea y en las longitudes de onda de los picos de WGM de una microesfera en particular.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.
EJEMPLO 1
Las partículas microesferoidales (QSand-Marca registrada) conjugadas con una multiplicidad de ligandos de ADN muestran desplazamientos coherentes de los WGM cuando se unen a un analito
Las partículas microesferoidales conjugadas con un fluoróforo (QSand [marca registrada: partículas de sílice]) conjugadas con una multiplicidad de ligandos de ADN mostraron una diferencia medible y coherente después de su unión a un analito específico. Las partículas microesferoidales, de 4,87, de 5,6, de 6,8 o de 7,5 µm de diámetro, estaban conjugadas con una multiplicidad de moléculas de ADN de 22-mer con una etiqueta de TMR en la posición del nucleótido 1. Los WGM se adquirieron antes y después de la hibridación con el 22-mer complementario (Figura 1).
EJEMPLO 2
Optimización del aparato de WGM para la biodetección
Se evaluaron diversos parámetros con objeto de determinar si el sistema de detección de WGM podía ser adaptado para una miniaturización, autocontención y portabilidad.
La Figura 2 proporciona una ilustración esquemática del sistema de detección de WGM. En primer lugar se modificó la potencia de la fuente luminosa para determinar su efecto sobre la resolución de los WGM. Una potencia incidente de la fuente luminosa (532 nm, 200 milisegundos) de 6,3, de 50,2, de 214,5 o de 1.160,5 µW fue suficiente para resolver los WGM (Figura 3 B). Dicha potencia puede conseguirse con un láser de bajo coste estándar (un puntero luminoso).
Se modificó el tiempo de excitación con objeto de determinar su efecto sobre los WGM. Los WGM se evaluaron después de una exposición durante 10, 60, 200 y 1.000 milisegundos de luz incidente (50 µW, 532 nm). Se determinó que un tiempo de exposición tan corto como 200 ms era suficiente para resolver los WGM (Figura 4 C), disminuyendo la visibilidad hasta un tiempo de exposición de 5 segundos (Figura 4 E).
Se demostró que 200 milisegundos de exposición a una potencia luminosa de 50 microvatios eran adecuados para unos WGM de alta calidad.
EJEMPLO 3
Prototipo del biosensor de WGM
El prototipo del biosensor de WGM se construye según unas especificaciones que dan como resultado unos espectros de WGM bien resueltos antes y después de la unión de un analito a una partícula microesferoidal. El dispositivo mide aproximadamente 30 x 15 x 15 cm y pesa 2 -5 kg, y está completamente autocontenido comprendiendo una fuente de potencia, una fuente luminosa, cámaras portadoras de muestras y un espectrofotómetro.
EJEMPLO 4
Inmovilización de las partículas microesferoidales
Las partículas microesferoidales (QSand [marca registrada: partículas de sílice]) se inmovilizaron en la superficie de un cubreobjetos de vidrio de microscopio en una configuración aleatoria (Figura 5). El cubreobjetos con las partículas QSand inmovilizadas (marca registrada) pudo ser acoplado directamente en la ranura del espectrómetro.
EJEMPLO 5
Desarrollo y caracterización de una plataforma de partícula única para la detección de oligonucleótidos objetivo no marcados, mediante el uso de Modos de galería de murmullos en microesferas fluorescentes individuales
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