CN110747257A - 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒。检测包括下述步骤1)一步荧光循环衰减法：待检测miRNA与二氧化硅微球‑DNA‑荧光编码纳米球探针DNA互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的DNA，导致二氧化硅微球表面荧光纳米球释放，并保持miRNA完整不被切割，进而引发靶标循环，实现荧光循环衰减及信号放大；2)使用流式二氧化硅微球荧光定量检测，本申请的传感操作简便，一步法即可实现高效检测，无需复杂的清洗分离等步骤，在肿瘤早期检测及临床治疗领域具有良好的应用前景。

Description

非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒。
背景技术
微小RNA(miRNA)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使RNA结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，多种miRNA的异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤和癌症密切相关。实现多种miRNA的高通量同检有助于提高检测的准确性。目标miRNA-21和Let-7d作为重要肿瘤标志物,可用于肿瘤的的临床诊断治疗及术后监测，具有重要的指导意义。然而，由于miRNA自身具有一些特征：如含量低、序列短、易降解、和同源性高等，实现miRNA的简单、准确、灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中缺陷，提供一种非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，包括下述步骤：
1)一步荧光循环衰减法：待检测miRNA与二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的DNA，导致二氧化硅微球表面荧光纳米球释放，并保持miRNA完整不被切割，进而引发靶标循环，实现荧光循环衰减及信号放大；
2)使用流式二氧化硅微球荧光定量检测。
步骤1)中二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA的制备方法为：
1)二氧化硅微球-DNA探针的制备：将氨基化二氧化硅微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，然后加入羧基化DNA，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的DNA，得到二氧化硅微球-DNA探针；
2)将羧基化荧光编码纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温反应15-30min,然后加入二氧化硅微球-DNA探针，室温下反应3h；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的羧基化荧光编码纳米球得到二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA。
所述的羧基化DNA为ssDNA-21或者ssDNA-7d；ssDNA-21为COOH-TTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTT-NH2；ssDNA-7d为COOH-TTTAACTATGCAACCTACTACCTCTTTT-NH2。
步骤1)的具体步骤为：将二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、待检miRNA按照体积比为1-3:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1-0.6U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及荧光信号衰减.
优选的，反应温度为45℃，反应时间为120分钟。
优选的，加入0.5U双链特异性核酸酶。
优选的，二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、待检miRNA的体积比为1:1。
本发明还包括一种所述的检测miRNA的试剂盒，包括二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、以及双链特异性核酸酶。
用于检测miRNA-21、let-7d或者混和物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明基于DSN辅助靶标循环回收及一步法荧光循环衰减，结合流式荧光纳米球编码技术，实现了miRNA-21及Let-7d的分检以及同检研究。
双链特异性核酸酶DSN是一种热稳定性核酸酶，能够选择性地切割双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，但对RNA或者单链DNA几乎没有作用。此外，DSN酶具有高度特异性，这种切割降解作用仅针对于至少十二个完全匹配的核苷酸序列。本申请设计了二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针，当待检物miRNA存在时，miRNA基于碱基互补配对与探针DNA杂交形成DNA/miRNA二聚体，此时DSN能够特异性切割DNA，导致荧光纳米球循环释放，基于DSN特异性辅助靶标循化回收及一步法荧光衰减策略，保证了实验的灵敏度以及特异性。基于流式纳米球编码技术，实现待检物的同检研究。该方法通过一步法实现，操作简便快捷，无需复杂的清洗分离等步骤，为肿瘤的早期监测及预后治疗提供了良好的应用前景。
本发明制备的一种基于一步荧光循环衰减法实现miRNA的检测研究及应用优势在于：1、本发明构建了一种一步法荧光衰循环减微纳生物传感器，基于DSN特异性切割，保证了实验的特异性；2、基于DSN辅助靶标循化回收及荧光循环衰减，提高了检测的灵敏度；3、基于流式纳米球编码技术，实现待检物的高通量同检研究。4、该传感操作简便，一步法即可实现高效检测，无需复杂的清洗分离等步骤，在肿瘤早期检测及临床治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的进行miRNA-21的检测的绿色二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针示意图以及荧光表征。
图2为本发明基于不同反应温度进行miRNA-21检测图。
图3为本发明基于不同反应时间进行miRNA-21检测图。
图4为本发明实施例12用于miRNA-21的检测图。图4a为荧光强度值变化对，miRNA-21的定量检测；图4b为miRNA-21检测的标准曲线。
图5为本发明实施例15用于miRNA-21与Let-7d的单独与同时检测图。
图6为本发明同时检测的示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
(1)将氨基化二氧化硅微球(市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：2比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，然后加入羧基化DNA(ssDNA-21:COOH-TTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTT-NH2)，室温下反应过夜；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的ssDNA-21，得到二氧化硅微球-ssDNA-21探针；
(3)将羧基化荧光编码纳米球(绿色，cat.no.6–3-1000，市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温反应15-30min,然后加入二氧化硅微球-ssDNA-21探针，室温下反应3h；反应结束后，采用离心分离进行纯化除去未反应的羧基化荧光编码纳米球，得到二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针。
图1a是本发明制备的进行miRNA-21的检测的红色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针的原理图解，图1b是探针的流式荧光强度表征，图1c是探针通过荧光显微镜进行荧光强度表征。由图1b，1c可以看出，荧光编码纳米球通过DNA成功偶联于二氧化硅微球表面。
(4)将绿色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针、待检miRNA按照体积比为1:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，25-60℃下反应0-120分钟，实现靶标回收及荧光循环衰减。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。并用流式进行微球荧光定量分析，实现miR-21的定量检测。
实施例2：
(1)将氨基化二氧化硅微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：4比例混合于磷酸缓冲液中，室温下反应15-30分钟，然后加入羧基化DNA-7d(5’-3’，ssDNA-7d：COOH-TTTAACTATGCAACC TACTACCTCTTTT-NH2)，室温下反应过夜；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的ssDNA-7d，得到二氧化硅微球-ssDNA-7d探针；
(3)将羧基化荧光编码纳米球(红色，cat.no.QDSCF10050，市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温反应15-30min,然后加入二氧化硅微球-ssDNA-7d探针，室温下反应3h；反应结束后，采用离心分离进行纯化除去未反应的羧基化荧光编码纳米球，得到二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针。
(3)将红色二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针、待检miRNA按照体积比为1:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，25-60℃下反应0-120分钟，实现靶标回收及荧光循环衰减。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。并用流式进行微球荧光定量分析，实现Let-7d的定量检测。
实施例3-7：实施例3-7与实施例1的二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针的制备方法相同，区别仅在于，反应温度不同。实施例3为对应25℃反应温度；实施例4对应37℃反应温度；实施例5对应45℃反应温度；实施例6对应55℃反应温度；实施例7对应60℃反应温度；如图2示，当反应温度为45℃时，获得荧光强度达到最大值。因此，45℃为最佳反应温度，用于后续实验。
实施例8-12：实施例8-13与实施例6的区别仅在于反应时间不同，实施例8对应反应时间为0min、实施例9对应反应时间为30min、实施例10对应反应时间为60min、实施例11对应反应时间为90min、实施例12对应反应时间为120min。由图3可知，当反应时间为120min时，获得荧光强度达到最大值(即实施例12)，且趋于平台趋势。因此，120min为最佳反应时间，用于后续实验。
实施例13：
(1)将绿色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针(实施例1制备得到)、红色二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针(实施例2制备得到)、空白样品按照体积比为1：1：2比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，45℃下反应120分钟，实现靶标回收及荧光循环衰减。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活，并用流式进行二氧化硅微球荧光定量分析。
(2)将绿色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针(实施例1制备得到)、红色二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针(实施例2制备得到)、miRNA-21样品、空白样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，45℃下反应120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活，并用流式进行二氧化硅微球荧光定量分析。
(3)将绿色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针(实施例1制备得到)、红色二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针(实施例2制备得到)、Let-7d样品、空白样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，25-60℃下反应0-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活，并用流式进行二氧化硅微球荧光定量分析。
(4)将绿色二氧化硅微球-ssDNA-21-荧光编码纳米球探针(实施例1制备得到)、红色二氧化硅微球-ssDNA-7d-荧光编码纳米球探针(实施例2制备得到)、miRNA-21样品、Let-7d样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，25-60℃下反应0-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活，并用流式进行二氧化硅微球荧光定量分析。
由图5可知，当只加入空白样品，未加入miRNA-21与Let-7d时，FL1、FL2两通道均未检出荧光信号，两种miRNA含量均未检出；当加入只miRNA-21时，只有检测miRNA-21含量的FL1通道荧光值达到1600，而检测Let-7d含量的FL2通道荧光值极低，说明可成功用于miRNA-21的检测；当加入只Let-7d时，只有检测Let-7d含量的FL2通道荧光值达到250，而检测miRNA-21含量的FL2通道荧光值极低，说明可成功用于Let-7d的检测；当同时加入miRNA-21与Let-7d时，两通道均检测出荧光，且与单独加入时荧光强度相差不大，说明可成功应用于miRNA-21与Let-7d的同时检测，图6示出同时检测的示意图。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)一步荧光循环衰减法：待检测miRNA与二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的DNA，导致二氧化硅微球表面荧光纳米球释放，并保持miRNA完整不被切割，进而引发靶标循环，实现荧光循环衰减及信号放大；
2)使用流式二氧化硅微球荧光定量检测。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，步骤1)中二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA的制备方法为：
1)二氧化硅微球-DNA探针的制备：将氨基化二氧化硅微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，然后加入羧基化DNA，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的DNA，得到二氧化硅微球-DNA探针；
2)将羧基化荧光编码纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温反应15-30min,然后加入二氧化硅微球-DNA探针，室温下反应3h；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的羧基化荧光编码纳米球得到二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针DNA。
3.根据权利要求2所述的诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，所述的羧基化DNA为ssDNA-21或者ssDNA-7d；ssDNA-21为COOH-TTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTT-NH2；ssDNA-7d为COOH-TTTAACTATGCAACCTACTACCTCTTTT-NH2。
4.根据权利要求1所述的非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，步骤1)的具体步骤为：将二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、待检miRNA按照体积比为1-3:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1-0.6U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及荧光信号衰减。
5.根据权利要求4所述的非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，反应温度为45℃，反应时间为120分钟。
6.根据权利要求4所述的非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，加入0.5U双链特异性核酸酶。
7.根据权利要求4所述的非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法，其特征在于，二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、待检miRNA的体积比为1:1。
8.一种权利要求1-7任一项所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于，包括二氧化硅微球-DNA-荧光编码纳米球探针、以及双链特异性核酸酶。
9.一种权利要求8所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于，用于检测miRNA-21、let-7d或者混和物。
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