CN105543374A - 黄曲霉毒素m1的快速检测方法 - Google Patents

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林雨欢
邓克勤
黄昊文
徐合意
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法。该方法包括如下步骤：（A）使黄曲霉毒素M1核酸适体（Apt）单链信号探针DNA（ssDNA）杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品反应，当待测样品中有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链与黄曲霉毒素M1反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA，此时体系中留下ssDNA；（D）在ssDNA诱导下，铜离子还原生成近红外荧光铜纳米簇；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素M1的含量。

Description

黄曲霉毒素M1的快速检测方法
技术领域
本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素污染源极广，无法完全消除黄曲霉毒素污染。哺乳动物摄入被黄曲霉毒素污染的饲料或食品后，在体内可被羟化而生成黄曲霉毒素M1。奶牛吃了被黄曲霉毒素污染的饲料，所产奶中就会有黄曲霉毒素M1，人们每天都会食用的牛奶，如果其中的黄曲霉毒素M1含量过高，就会造成对人体健康的危害。由于黄曲霉毒素M1具有强的致癌作用，世界卫生组织制定食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，美国联邦政府有关法律规定人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能300μg/kg。我国《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》发布的国家标准中规定食品中黄曲霉毒素M1在乳及乳制品中的限量为0.5μg/kg。欧盟国家规定原奶、热处理奶及加工奶产品中黄曲霉毒素M1限量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中黄曲霉毒素M1限量为0.025μg/kg。因此，建立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素M1的检测方法具有重要意义。
目前国内外研究主要有色谱法、化学发光法和酶联免疫法等。色谱法对操作技术要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生化试剂，而且这些生化试剂很容易失活等不足。文献MaterialsScienceandEngineeringC33(2013)2229–2234公布了一种基于黄曲霉毒素M1核酸适体的黄曲霉毒素M1电化学测定法，该法选择性和检测灵敏度均高，只是电极组装较为复杂，需专业人才才能完成。发明内容
本发明提供一种简单、快速、灵敏的高选择性黄曲霉毒素M1的快速检测方法。
本发明采用的技术方案：一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法，包括步骤：
（A）黄曲霉毒素M1核酸适体APT与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素M1反应释放出单链信号探针ssDNA；
（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；
（D）利用黄曲霉毒素M1核酸适体-黄曲霉毒素M1结合体不能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能诱导生成具有强荧光的近红外铜纳米簇，检测体系中荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。
所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子迅速还原成近红外荧光铜纳米簇的+4价硫无机化合物还原剂，例如亚硫酸氢钠。步骤（D）的检测例如包括依次先后向体系中加入铜离子溶液和维生素C溶液，反应后生成近红外荧光铜纳米簇。
所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。
所述的单链信号探针sSDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。
本发明的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交；当有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链与黄曲霉毒素M1反应释放出ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)，Apt-黄曲霉毒素M1和ssDNA。Apt-黄曲霉毒素M1不能诱导铜离子还原生成近红外荧光的铜纳米簇，对测定无干扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA。单链信号探针ssDNA不水解（水解速度非常慢），此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光的铜纳米簇的ssDNA，通过检测体系荧光强度，从而可以测定真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。
本发明另外提供了一种检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素M1核酸适体、可与黄曲霉毒素M1核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。
所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。
所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。
所述DNA扩增体系包括缓冲溶液，缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2和(NH4)2SO4组成，三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29DNA聚合酶。
所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。
所述的铜离子还原检测体系中的还原剂为维生素C。
本发明还提供了一种可用于检测黄曲霉毒素M1的黄曲霉毒素M1核酸适体，其碱基序列为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。
本发明的优点
根据本发明的检测方法和试剂盒，可以消除背景荧光的干扰，提高了黄曲霉毒素M1的检测灵敏度和精度。
附图说明
图1为ssDNA-Ag纳米簇荧光与黄曲霉毒素M1的浓度关系图。
具体实施方式
实施例1
一种检测黄曲霉毒素M1的试剂盒至少包括：黄曲霉毒素M1核酸适体、单链信号探针DNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶。核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。所述的铜离子还原检测体系中的还原剂为维生素C。所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
实施例2
一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法，具体操作过程如下：
将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交1小时，生成黄曲霉毒素M1核酸适体-信号探针杂交物（Apt-ssDNA）。
在37℃下，分别依次将浓度为0~50ng/mL的黄曲霉毒素M1添加到Apt-ssDNA溶液中，黄曲霉毒素M1与黄曲霉毒素M1核酸适体反应，生成核酸适体-黄曲霉毒素M1，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余（未反应的）AP-ssDNA和核酸适体-黄曲霉毒素M1等物质。
加入10μL缓冲溶液（缓冲溶液组成为50mMTris-HCl,10mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4,pH7.8），然后加入dNTP(10mM)18μL。再向体系中加入2μLPhi29DNA聚合酶(10u/μl),在37℃下反应15分钟，使得以黄曲霉毒素M1核酸适体-信号探针杂交序列（Ap-ssDNA）为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29DNA去活。
再向该反应体系中加入2μLExoIII核酸外切酶（20u/μL），在37℃下反应30分钟，使选择性地将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA，单链信号探针ssDNA不水解（水解速度非常慢）而保留下。
向反应液中加入25μL1mmol硝酸铜和180μL柠檬酸钠缓冲液（10mM，pH7.8）。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入150μL浓度为1mM的新制备的维生素C溶液。然后在45℃下反应5min。将溶液转移至微量比色皿，测定体系荧光强度，进行黄曲霉毒素M1的定量测定，结果如图1所示。
线性范围0.05–25ng/mL，检测限0.01ng/mL，回收率在94.5~110.6%。其它真菌毒素等生物小分子对黄曲霉毒素M1的检测无干扰。
<110>湖南科技大学
<120>黄曲霉毒素M1的快速检测方法
<160>2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>黄曲霉毒素M1核酸适体
<400>1
5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′
<210>2
<211>61
<212>DNA
<213>单链信号探针
<400>2
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’

Claims (9)

1.一种黄曲霉毒素M1的快速检测方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
（A）黄曲霉毒素M1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素M1反应释放出单链信号探针DNA；
（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，从而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；
（D）利用黄曲霉毒素M1核酸适体-黄曲霉毒素M1结合体不能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导铜离子还原生成强荧光的近红外铜纳米簇的原理，检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1的快速检测方法，其特征是，所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。
3.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素M1的快速检测方法，其特征是，所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。
4.权利要求1所述的黄曲霉毒素M1的快速检测方法，还包括检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素M1核酸适体、单链信号探针DNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述黄曲霉毒素M1核酸适体为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTGGAAAATCTCTA-3’。
7.根据权利要求4中所述的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
8.根据权利要求4中所述的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。
9.根据权利要求4中所述的试剂盒，其特征是，所述的铜离子还原检测体系中的还原剂为维生素C。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107764784A (zh) * 2017-09-01 2018-03-06 杨蕾 一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素b1的荧光方法
CN113234800A (zh) * 2021-05-13 2021-08-10 中山大学 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用
CN113304748A (zh) * 2020-03-04 2021-08-27 青岛大学 一种具有多种仿酶活性的铜纳米团簇及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102830113A (zh) * 2012-06-14 2012-12-19 青岛科技大学 目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术建立及赭曲霉素a的检测
CN104458684A (zh) * 2014-11-25 2015-03-25 浙江农林大学 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102830113A (zh) * 2012-06-14 2012-12-19 青岛科技大学 目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术建立及赭曲霉素a的检测
CN104458684A (zh) * 2014-11-25 2015-03-25 浙江农林大学 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANPING CAO等: ""Real-time detection of transcription factors using target-converted helicase-dependent amplification assay with zero-background signal"", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
JINGHUA CHEN等: ""A fluorescent aptasensor based on DNA-scaffolded silver-nanocluster for ochratoxin A detection"", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
卿志和: ""新型光学核酸探针的制备及其在生化分析中的应用研究"", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
陈宏主编: "《基因工程 第2版》", 31 August 2011, 中国农业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107764784A (zh) * 2017-09-01 2018-03-06 杨蕾 一种基于铜纳米簇检测黄曲霉毒素b1的荧光方法
CN113304748A (zh) * 2020-03-04 2021-08-27 青岛大学 一种具有多种仿酶活性的铜纳米团簇及其制备方法与应用
CN113304748B (zh) * 2020-03-04 2023-07-07 青岛大学 一种具有多种仿酶活性的铜纳米团簇及其制备方法与应用
CN113234800A (zh) * 2021-05-13 2021-08-10 中山大学 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用

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