CN113234800A

CN113234800A - 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN113234800A
Application number: CN202110522596.1A
Authority: CN
Inventors: 凌连生; 李婷婷; 黄文秀
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-05-13
Also published as: CN113234800B

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用，包括(1)制备纳米颗粒探针；(2)将检测样品与适配体混合，加入t‑DNA进行扩增，得到扩增产物；(3)将步骤(1)得到的纳米颗粒探针与步骤(2)得到的扩增产物混合，检测混合前后的纳米颗粒探针粒径变化情况。本发明中的N‑SDA和DLS检测方法操作简单、灵敏度高，检出限为1.3pmol/L，对AFM1检测具有特异性响应，不受其他毒素的干扰，在乳制品中也具有良好的适用性，为AFM1的分析检测提供了新的途径。

Description

一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的一类有毒的次级代谢产物，它们会对各种食物和动物饲料造成污染。由于其毒性和致癌特性，真菌毒素对人体已构成了严重的健康威胁。

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉产生的主要毒素之一，在黄曲霉毒素类中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强、影响最大的。当动物摄入受AFB1污染的饲料后，AFB1会在动物体内发生羟基化，从而代谢产生黄曲霉毒素M1(AFM1)。因此，AFM1主要存在于体内环境中，如动物的乳汁和血液中，由于基于这些动物来源的材料其在食品加工过程中具有很高的稳定性，因此可以存在各种乳制品或血液制品中。尽管AFM1的毒性低于AFB1，但它对肝脏具有毒害性并且具有致癌作用，因此也具有人体健康威胁性。

相关技术中，针对于AFM1或其他真菌毒素的分析检测主要包括比色法、荧光分析法和电化学方法，但这些方法都在一定程度上无法达到高灵敏度的技术要求，检出限也不能满足痕量检测的需求。DNA扩增技术是一种具有相对高灵敏度的检测技术，但其在AFM1或其他真菌毒素的分析领域中相对应用较少。

动态光散射是一种用于测量颗粒水动力直径的光学技术，多用于大分子的性能检测，如检测DNA、蛋白质等，但对于小分子化合物的检测应用较少。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种黄曲霉毒素M1的检测方法，该方法主要利用的是设计得到的DNA-AuNP探针。在样品中存在AFM1时，通过AFM1与适配体结合从而释放出与适配体杂交的互补链，该互补链与之后加入的模板DNA杂交，在聚合酶和dNTPs存在的情况下进行延伸，之后在DNA切割酶存在的情况下循环得到大量的单链DNA产物，该产物可与设计得到的DNA-AuNP探针杂交，从而导致金纳米颗粒发生聚集，最后通过测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对AFM1的高灵敏定量分析。

本发明的第一个方面，提供一种纳米颗粒探针，该纳米颗粒探针包括：

金属纳米颗粒；和

DNA片段，所述DNA片段通过巯基自组装在所述金属纳米颗粒表面；

其中，所述DNA片段的5’端或3’端连接有巯基。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒。

当然，可以根据实际使用需求，合理替换为其他金属纳米颗粒。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒。

本发明中的金纳米颗粒的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2mL新鲜配制的38.8mM柠檬酸钠溶液迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸HAuCl₄溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10分钟。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45微米的尼龙滤膜过滤，保存在4度冰箱中备用。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CCTTCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)；和/或

5’-TTTCTTTCTT-3’(SEQ ID NO.5)。

本发明中的DNA片段是基于单链DNA产物序列进行设计，使合成的纳米颗粒探针可以与单链DNA产物特异性结合。

本发明的第二个方面，提供一种黄曲霉毒素M1检测试剂盒。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述黄曲霉毒素M1检测试剂盒包括本发明第一个方面所述的纳米颗粒探针、适配体、t-DNA(模板链)和等温扩增反应试剂。

所述等温扩增反应试剂还包括：常规等温扩增反应的反应缓冲液、限制酶、聚合酶以及dNTP等。

在本发明的一些优选实施方式中，所述适配体的核苷酸序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’(SEQ ID NO.1)。

在本发明的一些优选实施方式中，所述t-DNA的核苷酸序列为5’-TTCTTTCTTTTTTCTCTTCCCCTCAGCTAGAGATAAATTT-3’(SEQ ID NO.3)。

本发明的第三个方面，提供一种黄曲霉毒素M1的检测方法，包括如下步骤：

(1)根据本发明第一个方面制备纳米颗粒探针；

(2)将检测样品与适配体混合，加入t-DNA进行扩增，得到扩增产物；

(3)将步骤(1)得到的纳米颗粒探针与步骤(2)得到的扩增产物混合，检测混合前后的纳米颗粒探针粒径变化情况；

若混合前后的纳米颗粒探针粒径无显著变化，则所述检测样品中不含黄曲霉毒素M1；

若混合后的纳米颗粒探针粒径具有统计学意义上的显著增大，则所述检测样品中含黄曲霉毒素M1。

基于切割酶的链替换等温核酸放大(Nicking Enzyme based StrandDisplacement Amplif ication，N-SDA)是等温核酸放大技术中的一种。该方法可以通过聚合酶和核酸内切酶的协同作用，成倍地合成寡聚脱氧核糖核苷酸。

金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNP)是一种最常用的纳米材料，其比表面积大、光学性质独特、生物相容性好。AuNP可随着分散/聚集状态的改变，其粒径大小也会随之变化，因此，可以将AuNP与SDA结合，通过换算，金纳米颗粒粒径大小可以转换为SDA产物的量。

本发明中的黄曲霉毒素M1的检测方法，其原理为：

如说明书附图1所示，当AFM1存在时，适配体(a-DNA)与AFM1发生结合反应使b-DNA被释放，导致b-DNA与模板DNA(t-DNA，待测样品DNA)杂交。在dNTPs和聚合酶存在下，b-DNA沿着t-DNA进行延伸。之后，双链DNA在2区域被Nicking核酸内切酶进一步切割，释放出单链DNA(p-DNA)。而在Nicking切割酶和聚合酶的存在下，N-SDA反应会继续周期进行，从而在这些过程内合成大量的p-DNA。这种p-DNA与DNA-AuNP探针同时杂交，可导致DNA-AuNP探针的聚集。通过测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对AFM1的高灵敏定量分析。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中的纳米颗粒探针包括：

金属纳米颗粒；和

其中，所述DNA片段的5’端或3’端连接有巯基；

在本发明的一些优选实施方式中，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒；

所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CCTTCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)；和/或

5’-TTTCTTTCTT-3’(SEQ ID NO.5)。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述适配体的核苷酸序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’(SEQ ID NO.1)。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述t-DNA的核苷酸序列为5’-TTCTTTCTTTTTTCTCTTCCCCTCAGCTAGAGATAAATTT-3’(SEQ ID NO.3)。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述扩增的扩增体系为：

1μM适配体	5μL
		1μM b-DNA	5μL
1μM t-DNA	5μL
		聚合酶	2.5U
Nb.BbvCI	3U
		dNTP	0.2mM

在本发明的一些优选实施方式中，所述dNTP来自1×NEB缓冲液。

扩增程序为：37℃反应3h，80℃培养20min终止反应。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的纳米颗粒探针在制备黄曲霉毒素M1检测制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

1)本发明中的纳米颗粒探针能够有效捕获率高，从而使后续反应的灵敏度得到有效提升。当AFM1存在时，其适配体互补链得到释放，从而引发N-SDA级联等温核酸放大，其产物(p-DNA)可以与纳米颗粒探针杂交，导致金纳米颗粒发生聚集，从而实现对AFM1的高灵敏定量分析。

2.本发明中的N-SDA和DLS检测方法操作简单、灵敏度高、特异性好，检出限为1.3pmol/L，适用于样品中微量或痕量AFM1的检测。

3.本发明中的N-SDA和DLS检测方法对AFM1检测具有特异性响应，不受其他毒素的干扰，在乳制品中也具有良好的适用性，为AFM1的分析检测提供了新的途径。

附图说明

图1为本发明实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法的原理示意图；

图2为采用动态光散射分析不同样品的粒径大小分布图，其中，A为未引发N-SDA的样品，B为引发N-SDA的样品；

图3为本发明实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法检测不同浓度(0～40nm)AFM1的粒径大小图；

图4为本发明实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法检测不同浓度(8.3pmol/L～1.0nmol/L)AFM1的标准曲线图；

图5为本发明实施例中的特异性检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实验材料

下述发明实施例中的金纳米颗粒的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2mL新鲜配制的38.8mM柠檬酸钠溶液迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸HAuCl₄溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10分钟。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45微米的尼龙滤膜过滤，保存在4度冰箱中备用。

下述发明实施例中的适配体的核苷酸序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’(SEQ ID NO.1)。该适配体由生物工程(上海)股份有限公司合成。当AFM1与该适配体结合后会释放分支链DNA(branched DNA，b-DNA)，经检测，释放的b-DNA核苷酸序列为：5’-AAATTTATCTCTAGC-3’(SEQ ID NO.2)。

下述发明实施例中的寡聚脱氧核糖核苷酸(t-DNA，模板链)的核苷酸序列为5’-TTCTTTCTTTTTTCTCTTCCCCTCAGCTAGAGATAAATTT-3’(SEQ ID NO.3)。该t-DNA由生物工程(上海)股份有限公司合成。

一种基于切割酶的链替换等温核酸放大(N-SDA)和动态光散射(DLS)检测AFM1的方法

本发明实施例中的一种N-SDA和DLS检测AFM1的方法主要通过测定金纳米颗粒(AuNP)的动态光散射信号(反映粒径大小)的变化，实现对AFM1的高灵敏定量分析。

具体步骤包括：

(1)制备DNA修饰的金纳米颗粒(DNA-AuNP)探针：

①制备巯基修饰的靶向DNA片段：

修饰的靶向DNA片段根据反应体系中的单链DNA产物序列进行设计，使合成的纳米颗粒探针可以与单链DNA产物特异性结合，从而引发金纳米颗粒的聚集。由生物工程(上海)股份有限公司合成。

本实施例中获得的巯基修饰的靶向DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CCTTCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)；和/或

5’-TTTCTTTCTT-3’(SEQ ID NO.5)。

其中，巯基(-SH)修饰于靶向DNA片段的5’端。

②取步骤①制备得到的巯基修饰的靶向DNA片段，溶于10mm醋酸缓冲溶液(60μL，pH 5.0)。然后，向溶液中添加磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)20mM，12μL培养1.5h。接着按200：1的摩尔比加入到预先制备的AuNPs溶液中，在室温下孵育16小时。然后在接下来的44小时内分多次加入NaCl进行盐老化，NaCl的最终浓度为0.1M。最后，将反应液以13800rpm的转速离心30分钟以除去游离的DNA(重复3次)，得到的油状沉淀物溶解在10mM PBS缓冲液(pH＝7.4，0.1M NaCl)中，保存在4度冰箱中备用。

(2)基于切割酶的链替换等温核酸放大：

首先，将a-DNA(1μM)和b-DNA(1μM)按1:1的比例孵育一段时间，然后加入检测样品。随后，将该溶液与t-DNA(1μM)、聚合酶(2.5U)、Nb.BbvCI(3U)、1×NEB缓冲液的dNTPs混合，并在37℃下培养3h。最后，在80℃下培养20min终止反应。

若检测样品中含有AFM1，则AFM1会与适配体反应结合，释放出b-DNA，在加入t-DNA进行等温扩增后，可以获得大量单链DNA产物(p-DNA)。

若检测样品中不含AFM1，则不会发生扩增。

(3)将步骤(1)得到的DNA-AuNP探针与步骤(2)等温扩增后得到的产物混合，若步骤(2)中含有p-DNA，则p-DNA会被DNA-AuNP探针上的巯基修饰的靶向DNA片段所捕获，从而使金纳米颗粒发生聚集(p-DNA大量结合在金纳米颗粒上)。

(4)DLS检测：

利用DLS技术检测金纳米颗粒在与DNA-AuNP探针结合前后的动态光散射信号，通过其粒径大小变化情况，分析待测样品中是否存在AFM1。

上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法的原理示意图如图1所示。

当待测样品中不含AFM1时，在基于切割酶的链替换等温核酸放大阶段并不会发生扩增，从而不会产生可以与DNA-AuNP探针结合的p-DNA，从而不会改变DNA-AuNP探针的整体大小。而当待测样品中含有AFM1时，AFM1会与适配体反应结合，释放出b-DNA，从而在基于切割酶的链替换等温核酸放大阶段扩增出p-DNA，而p-DNA会被DNA-AuNP探针上的巯基修饰的靶向DNA片段所捕获，从而将DNA-AuNP探针的整体大小变大。

如图2所示，当待测样品中含有和不含AFM1时，使用动态光散射分析得到的粒径大小存在显著差异。当AFM1不存在时，不能引发N-SDA反应，金纳米颗粒的粒径为38nm，与原始粒径大小并未显著发生。当AFM1存在时，引发N-SDA反应，金纳米颗粒的粒径增大到782nm。

N-SDA和DLS检测AFM1的方法定量检测情况

(1)灵敏度检测：

采用上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法，使用含有不同浓度的AFM1溶液(AFM1浓度分别为0.0083nM，0.017nM，0.05nM，0.13nM，0.17nM，0.33nM，0.67nM，0.83nM，1nM，2nM，2.5nM，5nM，10nM，20nM，40nM，60nM，80nM，100nM，150nM)作为待测样品，检测上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法定量检测准确性。

结果如图3和4所示。

图3为上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法对不同浓度下的AFM1溶液的检测情况，可以发现随着AFM1的增加，金纳米颗粒聚沉的程度愈明显，其粒径也逐渐增加。而基于实际检测中，检测样品中的AFM1通常为微量水平，因此，选取0.0083nmol/L至1.0nmol/L浓度范围绘制标准曲线(图4)，得到的标准曲线公式为：

D＝75+450C(C：nM)，R²＝0.9932。

根据图3和4，可以得到：上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法对于AFM1的痕量检测具有极高的灵敏度，AFM1浓度和金纳米颗粒的粒径在0.0083nmol/L到1.0nmol/L范围内呈良好的线性关系，上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法的检出限可以达到1.3pmol/L，具有极高的应用前景。

(2)特异性检测：

采用上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法，使用含有不同毒素成分的溶液作为样品，检测上述实施例中的N-SDA和DLS检测AFM1的方法的特异性。本实施例中分别选择了AFM1、AFB1、黄曲霉毒素B2(AFB2)、呕吐毒素(DON)、伏马毒素B1(FB1)、赭曲霉毒素(OTA)、T2毒素(T2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。

结果如图5所示。

通过检测使用含有不同毒素成分的溶液作为样品得到的金纳米颗粒的粒径大小，发现只有AFM1样品的粒径明显增大，而其他毒素样品的粒径则无明显变化，表明上述实施例中的N-SDA和DLS检测方法对AFM1具有特异性响应，表明该方法具有良好的特异性。

N-SDA和DLS检测AFM1的方法的实际检测效果

基于AFM1主要存在于奶制品及血液制品中，因此，本实施例以牛奶为样品，验证上述实施例中的N-SDA和DLS检测方法的实际效果。

本实施例采用加标回收法来验证N-SDA和DLS检测方法的准确性，具体实验步骤如下：

将牛奶样品在4℃下以10000rpm速度离心15min。离心后，收集上清液并分别加入不同浓度的AFM1(终浓度为0.05nmol/L、0.13nmol/L、0.16nmol/L、0.33nmol/L、0.66nmol/L)。采用上述N-SDA和DLS检测方法进行定量检测并计算回收率。

结果如表1所示。

表1牛奶样品中AFM1的加入回收实验

如表1所示，上述N-SDA和DLS检测方法的有效回收率在95.2～105.3％范围内相对标准偏差在1.4～4.2％范围内，该结果表明上述N-SDA和DLS检测方法在牛奶样品中具有良好的实用性，可用于牛奶样品中AFM1的检测。

同时与已报道的检测方法相比，本方法具有足够的优势。

表2与先前报道的牛奶中AFM1检测方法的比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actgctagag attttccaca t 21

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaatttatct ctagc 15

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttctttcttt tttctcttcc cctcagctag agataaattt 40

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccttctcttt 10

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttctttctt 10

Claims

1.一种纳米颗粒探针，其特征在于，所述纳米颗粒探针包括：

金属纳米颗粒；和

其中，所述DNA片段的5’端或3’端连接有巯基。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒探针，其特征在于，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的纳米颗粒探针，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CCTTCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)；和/或

5’-TTTCTTTCTT-3’(SEQ ID NO.5)。

4.一种黄曲霉毒素M1检测试剂盒，其特征在于，所述黄曲霉毒素M1检测试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的纳米颗粒探针、适配体、t-DNA和等温扩增反应试剂。

5.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素M1检测试剂盒，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’(SEQ ID NO.1)。

6.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素M1检测试剂盒，其特征在于，所述t-DNA的核苷酸序列为5’-TTCTTTCTTTTTTCTCTTCCCCTCAGCTAGAGATAAATTT-3’(SEQ ID NO.3)。

7.一种黄曲霉毒素M1的检测方法，包括如下步骤：

(1)将检测样品与适配体混合，加入t-DNA进行扩增，得到扩增产物；

(2)将权利要求1～3任一项所述的纳米颗粒探针与步骤(1)得到的扩增产物混合，检测混合前后的纳米颗粒探针粒径变化情况；

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述适配体的核苷酸序列为：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’(SEQ ID NO.1)；

所述t-DNA的核苷酸序列为5’-TTCTTTCTTTTTTCTCTTCCCCTCAGCTAGAGATAAATTT-3’(SEQID NO.3)。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩增的扩增体系及扩增程序为：

扩增程序为：37℃反应3h，80℃培养20min终止反应。

10.权利要求1～3任一项所述的纳米颗粒探针在制备黄曲霉毒素M1检测制剂中的应用。