CN101381771A - 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法 - Google Patents

产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101381771A
CN101381771A CNA2008101579016A CN200810157901A CN101381771A CN 101381771 A CN101381771 A CN 101381771A CN A2008101579016 A CNA2008101579016 A CN A2008101579016A CN 200810157901 A CN200810157901 A CN 200810157901A CN 101381771 A CN101381771 A CN 101381771A
Authority
CN
China
Prior art keywords
isothermal amplification
mediated isothermal
aflatoxin
fungi
loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2008101579016A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101381771B (zh
Inventor
雷质文
贺楠
李正义
祝素珍
房保海
唐静
贾俊涛
赵丽青
马维兴
张健
姜英辉
刘云国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority to CN2008101579016A priority Critical patent/CN101381771B/zh
Publication of CN101381771A publication Critical patent/CN101381771A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101381771B publication Critical patent/CN101381771B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－CGACAGTTGTTGGGGCCTGC－TCCAGGACATGTGCAGACT－3、下游内引物5－CAGACA GTGTGGCAGGCATCT－CCGTGTGGATAACGAAGTGC－3、上游外引物5－TCACGGCCTTCATCATCGA－3、下游外引物5－ACCAGGGGAGTTGAGATCC－3和甜菜碱；检测产黄曲霉毒素真菌的方法包括真菌DNA的提取、产黄曲霉毒素真菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

Description

产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)产生的次级代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物，其中B1是最危险的致癌物，经常在玉米、花生、棉花种子、一些干果中检测到。黄曲霉毒素主要污染粮油食品、动植物食品等，如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染，其中尤以花生和玉米污染最严重，家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素。黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关，黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。研究表明，黄曲霉毒素的细胞毒作用，是干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。
现有黄曲霉毒素的检测方法比较多，例如薄层层析法、液相色谱法、放射免疫分析方法、酶联免疫法、免疫层析法、普通PCR、荧光定量PCR等，但这些方法也有不足之处，如周期长、程序复杂、成本高。环介导等温扩增方法能较好的弥补这些不足，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测产黄曲霉毒素真菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法，其中包括的试剂如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：
其中包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；
上游内引物：
5-CGACAGTTGTTGGGGCCTGC-TCCAGGACATGTGCAGACT-3、
下游内引物：
5-CAGACAGTGTGGCAGGCATCT-CCGTGTGGATAACGAAGTGC-3、
上游外引物：5-TCACGGCCTTCATCATCGA-3、
下游外引物：5-ACCAGGGGAGTTGAGATCC-3、
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸(Tris—HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X—100(Triton X—100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22μL，其最佳组成为：2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2.0μL 10μmol/L上游内引物(FIP)、2.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、1.5μL 100mmol/LMgSO4、5μL 5M甜菜碱和6.6μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述方法检测产黄曲霉毒素真菌，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品或真菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)进行产黄曲霉毒素真菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3—5min，立即置于冰上1—3min；
B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65℃扩增反应45—90min；
C.将水浴调到80—85℃终止反应，3—5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产黄曲霉毒素真菌。
本发明是根据产黄曲霉毒素真菌的nor-1基因的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该基因序列为产黄曲霉毒素真菌各不同菌株型所共有，以保证检测不同来源的产黄曲霉毒素真菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作产黄曲霉毒素真菌的环介导等温扩增反应液：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2.0μL 10μmol/L上游内引物(FIP)、2.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、1.5μL 100mol/L MgSO4、5μL 5M甜菜碱和6.6μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物：
5-CGACAGTTGTTGGGGCCTGC-TCCAGGACATGTGCAGACT-3、
下游内引物：
5-CAGACAGTGTGGCAGGCATCT-CCGTGTGGATAACGAAGTGC-3、
上游外引物：5-TCACGGCCTTCATCATCGA-3、
下游外引物：5-ACCAGGGGAGTTGAGATCC-3
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种黄曲霉(Aspergillus flavus)，菌种来源中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC3.4408。
使用北京天根生物工程公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行黄曲霉的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μLLAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1小时；
C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品为黄曲霉。
实施例2
按下列配方制作阪崎肠杆菌的环介导等温扩增反应液：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP、2.0μL10μmol/L上游内引物(FIP)、2.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、1.5μL 100mmol/L MgSO4、5μL 5mol/L甜菜碱和6.6μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料DNAGreen。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种寄生曲霉(A.parasiticus)，菌种来源中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC3.6155。
使用北京天根生物工程公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行寄生曲霉的环介导等温扩增反应：
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1h；
C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，则待检样品也为寄生曲霉。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法
<160>4
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(39)
<400>1
CGACAGTTGTTGGGGCCTGC-TCCAGGACATGTGCAGACT 39
<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(41)
<400>2
CAGACAGTGTGGCAGGCATCT-CCGTGTGGATAACGAAGTGC 41
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(19)
<400>3
TCACGGCCTTCATCATCGA 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(19)
<400>4
ACCAGGGGAGTTGAGATCC 19

Claims (3)

1.环介导等温扩增检测产黄曲霉毒素真菌的试剂，其特征是该试剂包括(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液：
包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X—100；
其中上游内引物:
5-CGACAGTTGTTGGGGCCTGC-TCCAGGACATGTGCAGACT-3；
下游内引物:
5-CAGACAGTGTGGCAGGCATCT-CCGTGTGGATAACGAAGTGC-3；
上游外引物:5-TCACGGCCTTCATCATCGA-3；
下游外引物:5-ACCAGGGGAGTTGAGATCC-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.环介导等温扩增检测产黄曲霉毒素真菌的试剂，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。
3、利用权利要求1中所述的试剂进行等温快速检测产黄曲霉毒素真菌的方法，其特征是依次包括(1)-(3)下列步骤：
(1)待检样品或真菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；
(2)进行产黄曲霉毒素真菌的环介导等温扩增反应:
A.在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温95℃放置3—5min，立即置于冰上1—3min；
B.再在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温65℃扩增反应45—90min；
C.将温度调到80℃终止反应，3—5min后取出待检；
(3)显色检测:
在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产黄曲霉毒素真菌。
CN2008101579016A 2008-10-15 2008-10-15 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法 Expired - Fee Related CN101381771B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008101579016A CN101381771B (zh) 2008-10-15 2008-10-15 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008101579016A CN101381771B (zh) 2008-10-15 2008-10-15 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101381771A true CN101381771A (zh) 2009-03-11
CN101381771B CN101381771B (zh) 2011-06-22

Family

ID=40461822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008101579016A Expired - Fee Related CN101381771B (zh) 2008-10-15 2008-10-15 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101381771B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586455A (zh) * 2012-03-14 2012-07-18 万俊松 一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒
CN103451294A (zh) * 2013-09-04 2013-12-18 福建省农业科学院植物保护研究所 黄曲霉菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN103866014A (zh) * 2014-03-06 2014-06-18 中国人民解放军总医院 类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物和检测方法
CN110643684A (zh) * 2019-10-17 2020-01-03 江苏科技大学 一种黄曲霉毒素产毒基因nor-1的荧光传感器制备和检测方法
CN110982919A (zh) * 2019-11-13 2020-04-10 上海市农业科学院 一种环介导等温扩增法鉴定木霉属真菌的方法及引物
CN113234800A (zh) * 2021-05-13 2021-08-10 中山大学 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586455A (zh) * 2012-03-14 2012-07-18 万俊松 一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒
CN103451294A (zh) * 2013-09-04 2013-12-18 福建省农业科学院植物保护研究所 黄曲霉菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN103451294B (zh) * 2013-09-04 2015-05-20 福建省农业科学院植物保护研究所 黄曲霉菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN103866014A (zh) * 2014-03-06 2014-06-18 中国人民解放军总医院 类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物和检测方法
CN103866014B (zh) * 2014-03-06 2015-08-26 中国人民解放军总医院 类鼻疽伯克霍尔德菌环介导等温扩增的快速检测引物和检测方法
CN110643684A (zh) * 2019-10-17 2020-01-03 江苏科技大学 一种黄曲霉毒素产毒基因nor-1的荧光传感器制备和检测方法
CN110982919A (zh) * 2019-11-13 2020-04-10 上海市农业科学院 一种环介导等温扩增法鉴定木霉属真菌的方法及引物
CN113234800A (zh) * 2021-05-13 2021-08-10 中山大学 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用
CN113234800B (zh) * 2021-05-13 2023-01-10 中山大学 一种黄曲霉毒素m1的检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101381771B (zh) 2011-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101381771B (zh) 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法
Koskenniemi et al. Quantitative real-time PCR detection of toxic Nodularia cyanobacteria in the Baltic Sea
Zul et al. Effects of plant biomass, plant diversity, and water content on bacterial communities in soil lysimeters: implications for the determinants of bacterial diversity
Vaagt et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based method for rapid mushroom species identification
Pan et al. Impacts of inter-and intralaboratory variations on the reproducibility of microbial community analyses
Dai et al. A novel LAMP assay for the detection of Phytophthora cinnamomi utilizing a new target gene identified from genome sequences
CN102140512A (zh) 致病性嗜水气单胞菌的lamp检测试剂盒及检测方法
Rinta‐Kanto et al. Analysis of sulfur‐related transcription by Roseobacter communities using a taxon‐specific functional gene microarray
CN101381775A (zh) 白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法
CN101008037A (zh) 用环介导等温扩增方法检测副溶血弧菌的试剂盒及方法
CN101319249B (zh) 阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法
CN106755342A (zh) 基于颜色判定的环介导等温扩增（lamp）技术检测栗疫霉黑水病菌
CN101255460A (zh) 伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
CN101386885B (zh) 产霍乱毒素霍乱弧菌环介导等温扩增快速检测方法
CN105980577A (zh) 用于检测病原体和有益微生物的核酸和方法
CN112322768B (zh) 一种沙棘枝干枯萎病诊断及病原菌的快速rpa检测方法
CN101381774B (zh) 肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法
Yuan et al. Utility of a PCR-based method for rapid and specific detection of toxigenic Microcystis spp. in farm ponds
CN101020926A (zh) 用环介导等温扩增方法检测霍乱弧菌的试剂盒及方法
CN107287352A (zh) 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN102827936A (zh) 检测转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的组合物及其试剂盒
CN101255459A (zh) 空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
CN101381773B (zh) 产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法
Kuo et al. Identification of ingredient in mullet roe products by the real-time PCR method
CN101020927A (zh) 用环介导等温扩增方法检测创伤弧菌的试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110622

Termination date: 20111015