CN101255459A - 空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法 - Google Patents

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高宏伟
昃向君
陈颖
雷质文
林超
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Abstract

本发明涉及一种用环介导等温扩增技术的空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。该试剂盒内有环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－ACAGCTATACCACTTGAACCATTTAAAGTGAACCTGA TGTTTTACCT－3、下游内引物5－ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAAT CTCTTCTAAGCTTGCATCT－3、上游外引物5－TTCCAAATTATG ATGGTTCAGA－3、下游外引物5－TGGACCTTTAATAAACTGCATAA－3和甜菜碱；检测空肠大肠弯曲菌的方法包括细菌DNA的提取、空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

Description

空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。
背景技术
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一类呈逗点状或S形的革兰阴性杆菌，是常见的人畜共患病原菌，该菌广泛分布于自然界，可通过动物、食物、水、牛奶等传播。该菌可引起动物下痢和人的肠炎，多种动物携带此菌。该菌分布甚广，曾从牛、猫、狗、兔、猪等哺乳动物和离体的肠管和排泄物中检出。该病传播途径主要是消化道，空肠弯曲杆菌是条件病原菌，在气候寒冷、饲养管理不善、牛群抵抗力降低的情况可引起发病。感染不仅可以引起发烧、急性、自限性胃肠炎、格林-巴利综合征，还可以引起牛和绵羊流产，火鸡的肝炎和蓝冠病，童子鸡和雏鸡坏死性肝炎，雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病。可以通过动物、鸟和患病者的粪便进入环境中，包括饮用水，由于该菌对环境非常敏感，所以不可能在宿主外存活时间太长，但是在水中可以进入VNC状态。污染的水、生牛奶和禽肉是人类感染的最主要传染源。空肠弯曲杆菌主要引起人类的急性肠炎和食物中毒，并已取代沙门氏菌成为发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，被认为是人类主要食源性病原菌之一，由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态，所以传统的生化鉴定结果不够可靠，并且是一项费时而繁琐的工作。
现有空肠弯曲杆菌的检测方法主要有PCR、DNA杂交、疏水栅滤膜筛选和酶免疫。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测空肠弯曲杆菌的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：
其中包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.2μmol/L下游内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游外引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；
上游内引物：
5-ACAGCTATACCACTTGAACCATTTA-AAGTGAACCTGATGTTTTACCT-3、
下游内引物：
5-ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAA-TCTCTTCTAAGCTTGCATCT-3、
上游外引物：5-TTCCAAATTATGATGGTTCAGA-3、
下游外引物：5-TGGACCTTTAATAAACTGCATAA-3、
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管23μL的最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、1.0μL20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2M甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒检测空肠大肠弯曲菌的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)进行空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于水浴锅中恒温水浴上60-65℃放置45-90min；
D.将水浴调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是空肠大肠弯曲菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为空肠大肠弯曲菌。
本发明建立了空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据空肠大肠弯曲菌的gyrA基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为空肠大肠弯曲菌各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的空肠大肠弯曲菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于空肠大肠弯曲菌的检测，特别适于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。
其中所述的上游内引物：
5-ACAGCTATACCACTTGAACCATTTA-AAGTGAACCTGATGTTTTACCT-3、
下游内引物：
5-ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAA-TCTCTTCTAAGCTTGCATCT-3、
上游外引物：5-TTCCAAATTATGATGGTTCAGA-3、
下游外引物：5-TGGACCTTTAATAAACTGCATAA-3
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，菌种来源中国检科院食品安全微生物菌种保藏中心，编号IQCC13602。
使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于恒温水浴上65℃放置1小时；
D.将水浴调到80℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是空肠大肠弯曲菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为空肠大肠弯曲菌。
实施例2
按下例配方制作空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dAP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取
检测菌种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，菌种来源中国检科院食品安全微生物菌种保藏中心，编号IQCC13601。
使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于恒温水浴上65℃放置1h；
D.将水浴调到80℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是空肠大肠弯曲菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为空肠大肠弯曲菌。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
<160>4
<210>1
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(47)
<400>1
acagctatac cacttgaacc atttaaagtg aacctgatgt tttacct    47
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(45)
<400>2
acaaacatcc cgcctcatag tttaatctct tctaagcttg catct     45
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(22)
<400>3
ttccaaatta tgatggttca ga 22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(23)
<400>4
tggaccttta ataaactgca taa 23

Claims (3)

1.一种空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液：
包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；
其中上游内引物：
5-ACAGCTATACCACTTGAACCATTTA-AAGTGAACCTGATGTTTTACCT-3、
下游内引物：
5-ACAAACATCCCGCCTCATAGTTTAA-TCTCTTCTAAGCTTGCATCT-3、
上游外引物：5-TTCCAAATTATGATGGTTCAGA-3、
下游外引物：5-TGGACCTTTAATAAACTGCATAA-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的空肠大肠弯曲菌快速检测试剂盒，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
3.空肠大肠弯曲菌的快速检测方法，其特征是依次包括(1)-(3)下列步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)进行空肠大肠弯曲菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.再于恒温65℃放置45-90min；
D.将温度调到80℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测：
在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是空肠大肠弯曲菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或为空肠大肠弯曲菌。
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