CN110157780A - 一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法，涉及细菌耐药性检测技术领域。该引物组包括如下引物组合中的一种或多种：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9。采用该引物组通过多重PCR可以检测细菌的四环素耐药基因，通过检测其四环素耐药基因来检测细菌四环素耐药性。

Description

一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及细菌耐药性检测技术领域，具体而言，涉及一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
四环素类抗生素(tetracyclines)是一类广普抗生素，在禽畜养殖场中被大量使用，导致病原菌产生耐药性。国内外的大量研究结果表明，畜禽养殖环境及相关生鲜肉产品中的多种细菌(包括沙门氏菌、单增李斯特氏菌、弯曲杆菌等致病菌，以及大量非致病菌，涵盖革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)已对四环素类抗生素具备了很高的耐药性。
细菌之所以具有耐药性，从本质上看是因为携带各类耐药基因，且耐药基因可以在不同菌种间进行水平迁移，使得耐药性问题急剧扩散。耐药基因的检测技术主要包括普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR、实时荧光定量PCR和基因芯片等技术。耐药基因的检测工作量巨大，因为一方面，大量证据表明数量庞大的细菌可以是耐药基因的供体、受体和中间体；而另一方面，耐药基因种类繁多，比如目前已发现的四环素耐药基因就多达40多种。上述耐药基因的检测技术中，实时荧光定量PCR技术和基因芯片技术都能实现耐药基因的高通量的筛查，但均依赖较为昂贵的硬件设备，试剂和耗材的成本也较高，不易推广应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细菌耐药性检测的引物组，采用该引物组通过多重PCR可以检测细菌的四环素耐药基因，通过检测其四环素耐药基因来检测细菌四环素耐药性。
本发明的另一目的在于提供一种细菌耐药性检测试剂盒，采用该试剂盒通过多重PCR可以检测细菌的四环素耐药基因，通过检测其四环素耐药基因来检测细菌四环素耐药性。
本发明的另一目的在于提供一种细菌耐药性的检测方法，该检测方法通过多重PCR检测细菌的四环素耐药基因，通过检测其四环素耐药基因来检测细菌四环素耐药性。
本发明是这样实现的：
在整个细菌范围内进行耐药基因的筛查研究，现有试验大多基于单重或不多于三重的PCR技术展开，且涉及的四环素耐药基因种类不多，因此筛查效率较低，还易因耐药基因的漏检使得耐药菌的判定结果偏低，丢失大量耐药数据。如若能够开发多至五重的多重PCR技术，并涵盖大部分四环素耐药基因，则能大大提高细菌中四环素耐药基因的筛查效率和阳性率。
基于此，一方面，本发明提供了一种用于细菌耐药性检测的引物组，其包括如下引物组合中的一种或多种：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物；引物组合2包括： SEQ IDNO.11-20所示的引物；引物组合3包括：SEQ ID NO.21-30所示的引物；引物组合4包括：SEQID NO.31-40所示的引物；引物组合5包括：SEQ ID NO.41-50所示的引物；引物组合6包括：SEQ ID NO.51-60所示的引物；引物组合7包括：SEQ ID NO.61-70所示的引物；引物组合8包括：SEQ ID NO.71-80 所示的引物；引物组合9包括：SEQ ID NO.81-88所示的引物。
引物组合1中：
SEQ ID NO.1-2所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetA；SEQ ID NO.3-4 所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetD；SEQ ID NO.5-6所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetG；SEQ ID NO.7-8所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetS；SEQ ID NO.9-10所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetX；
引物组合2中：
SEQ ID NO.11-12所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetC；SEQ ID NO.13-14所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetU；SEQ ID NO.15-16所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetZ；SEQ ID NO.17-18所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet38；SEQID NO.19-20所示的引物对可以扩增四环素耐药基因 otrB；
引物组合3中：
SEQ ID NO.21-22所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetB(P)；SEQ IDNO.23-24所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetV；SEQ ID NO.25-26所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet30；SEQ ID NO.27-28所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet35；SEQ ID NO.29-30所示的引物对可以扩增四环素耐药基因 tet44；
引物组合4中：
SEQ ID NO.31-32所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetE；SEQ ID NO.33-34所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetH；SEQ ID NO.35-36所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetK；SEQ ID NO.37-38所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet43；SEQID NO.39-40所示的引物对可以扩增四环素耐药基因 otrC；
引物组合5中：
SEQ ID NO.41-42所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetO；SEQ ID NO.43-44所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetY；SEQ ID NO.45-46所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet31；SEQ ID NO.47-48所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet32；SEQID NO.49-50所示的引物对可以扩增四环素耐药基因 tet36；
引物组合6中：
SEQ ID NO.51-52所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetJ；SEQ ID NO.53-54所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetR；SEQ ID NO.55-56所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet40；EQ ID NO.57-58所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet42；SEQID NO.59-60所示的引物对可以扩增四环素耐药基因 tet45；
引物组合7中：
SEQ ID NO.61-62所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetA(p)；SEQ IDNO.63-64所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetW；SEQ ID NO.65-66所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet34；SEQ ID NO.67-68所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet41；SEQ ID NO.69-70所示的引物对可以扩增四环素耐药基因otrA；
引物组合8中：
SEQ ID NO.71-72所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetQ；SEQ ID NO.73-74所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet33；SEQ ID NO.75-76所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet37；SEQ ID NO.77-78所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tet39；SEQID NO.79-80所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tcr；
引物组合9中：
SEQ ID NO.81-82所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetB；SEQ ID NO.83-84所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetL；SEQ ID NO.85-86所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetM；SEQ ID NO.87-88所示的引物对可以扩增四环素耐药基因tetT。
该引物组可以对细菌44种四环素耐药基检测，包括：tetA、tetA(P)、tetB、 tetB(P)、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetR、 tetS、tetT、tetU、tetV、tetW、tetX、tetY、tetZ、tet30、tet31、tet32、tet33、tet34、 tet35、tet36、tet37、tet38、tet39、tet40、tet41、tet42、tet43、tet44、tet45、otrA、 otrB、otrC和tcr；每一组引物组合可独立地在同一反应体系中进行5重PCR，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点，弥补现有检测技术的不足，达到对细菌中四环素耐药基因及其四环素耐药性进行全面、快速、高效率检测筛查的目的。
另一方面，本发明提供了一种细菌耐药性检测试剂盒，其包括有上述的用于细菌耐药性检测的引物组。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，该细菌耐药性检测试剂盒还包括： Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR反应缓冲液。
该细菌耐药性检测试剂盒可以对细菌44种四环素耐药基因检测，包括：tetA、tetA(P)、tetB、tetB(P)、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetM、 tetO、tetQ、tetR、tetS、tetT、tetU、tetV、tetW、tetX、tetY、tetZ、tet30、tet31、 tet32、tet33、tet34、tet35、tet36、tet37、tet38、tet39、tet40、tet41、tet42、tet43、 tet44、tet45、otrA、otrB、otrC和tcr；每一组引物组合可独立地在同一反应体系中进行5重PCR，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点，弥补现有检测技术的不足，达到对细菌中四环素耐药基因及其四环素耐药性进行全面、快速、高效率检测筛查的目的。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，该细菌耐药性检测试剂盒还包括如下阳性对照液：阳性对照液1：为分别含有四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS 或tetX的质粒水溶液的混合物；阳性对照液2：为分别含有四环素耐药基因tetC、 tetU、tetZ、tet38或otrB的质粒水溶液的混合物；阳性对照液3：为分别含有四环素耐药基因tetB(P)、tetV、tet30、tet35或tet44的质粒水溶液的混合物；阳性对照液4：为分别含有四环素耐药基因tetE、tetH、tetK、tet43或otrC的质粒水溶液的混合物；阳性对照液5：为分别含有四环素耐药基因tetO、tetY、tet31、 tet32或tet36的质粒水溶液的混合物；阳性对照液6：为分别含有四环素耐药基因tetJ、tetR、tet40、tet42或tet45的质粒水溶液的混合物；阳性对照液7：为分别含有四环素耐药基因tetA(P)、tetW、tet34、tet41或otrA的质粒水溶液的混合物；阳性对照液8：为分别含有四环素耐药基因tetQ、tet33、tet37、tet39或tcr 的质粒水溶液的混合物；阳性对照液9：为分别含有四环素耐药基因tetB、tetL、 tetM或tetT的质粒水溶液的混合物。
另一方面，本发明提供了一种细菌耐药性的检测方法，其包括：使用如下引物组合中的任意一种引物组合进行PCR反应：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.11-20所示的引物；引物组合3包括：SEQ ID NO.21-30所示的引物；引物组合4包括：SEQ ID NO.31-40所示的引物；引物组合5包括：SEQ IDNO.41-50所示的引物；引物组合6包括：SEQ ID NO.51-60 所示的引物；引物组合7包括：SEQID NO.61-70所示的引物；引物组合8包括： SEQ ID NO.71-80所示的引物；引物组合9包括：SEQ ID NO.81-88所示的引物。
该检测方法可以对细菌44种四环素耐药基因检测，包括：tetA、tetA(P)、tetB、tetB(P)、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetR、tetS、tetT、tetU、tetV、tetW、tetX、tetY、tetZ、tet30、tet31、tet32、tet33、tet34、 tet35、tet36、tet37、tet38、tet39、tet40、tet41、tet42、tet43、tet44、tet45、otrA、 otrB、otrC和tcr；每一组引物组合可独立地在同一反应体系中进行5重PCR，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点，弥补现有检测技术的不足，达到对细菌中四环素耐药基因及其四环素耐药性进行全面、快速、高效率检测筛查的目的。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，所述PCR反应的体系中含有如下成分的一种或多种：待测样本的DNA模板、Taq酶、dNTPs和Mg2+。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，在所述PCR反应的体系中的Taq 酶浓度为0.025-0.15U/μL。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，所述PCR反应的退火温度为 53-58℃。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，当使用引物组合1进行所述PCR 反应时，在PCR反应的体系中，引物组合1包括5种引物对的浓度比为：1︰1 ︰2︰2︰2或1︰2︰2︰2︰2。
具体是指：引物对1(SEQ ID NO.1-2)、引物对5(SEQ ID NO.9-10)、引物对3(SEQID NO.5-6)、引物对2(SEQ ID NO.3-4)和引物对4(SEQ ID NO.7-8) 在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2或1︰2︰2︰2︰2。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，引物组合1中的每种引物在所述 PCR反应的体系中的浓度为0.1-0.2μmol/L。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，所述耐药性为四环素耐药性。
综上，本发明通过设计44种四环素耐药基因的特异性引物，并将对应的PCR 产物长度差异合适的引物对进行组合，从而实现基于多重PCR技术的细菌中多种四环素耐药基因的快速检测，对于每一个细菌样品，只需进行9组PCR反应，即可完成44种四环素耐药基因的筛查。与现有的单重PCR技术相比，检测效率提高约5倍；与现有的四环素耐药基因多重PCR筛查技术相比，涵盖的四环素耐药基因从3～11种提高至44种，且每组多重PCR反应几乎都达到了多重PCR 反应引物重述的上限即五重。本发明所述试剂盒具有操作简便、成本低廉、高效灵敏等优点，可用于各种细菌中四环素耐药基因的全面筛查检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中的不同稀释度DNA粗提液的单重PCR扩增结果。
图2为实验例1中的四环素耐药基因的五重PCR扩增结果。
图3为实验例2中的不同浓度比的引物对(引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4)进行多重PCR扩增结果。
图4为实验例3中的不同Taq酶浓度的多重PCR扩增结果。
图5为实验例4中的不同退火温度的多重PCR扩增结果。
图6为实验例5中的灵敏度检测结果。
图7为实验例6中的特异性检测结果。
图8为实验例7中使用实施例1的引物组对23株四环素耐药菌的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的用于细菌耐药性检测的引物组，包括：引物组合1。引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物。
SEQ ID NO.1-2所示的引物对1可以扩增四环素耐药基因tetA，片段大小 210bp左右；SEQ ID NO.3-4所示的引物对2可以扩增四环素耐药基因tetD，片段大小787bp左右；SEQID NO.5-6所示的引物对3可以扩增四环素耐药基因 tetG，片段大小623bp左右；SEQ IDNO.7-8所示的引物对4可以扩增四环素耐药基因tetS，片段大小210bp左右1050；SEQ IDNO.9-10所示的引物对5可以扩增四环素耐药基因tetX，片段大小468bp左右。
该引物组的5个引物对可以在同一PCR反应体系进行5重PCR，对四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS或tetX检测，通过检测样品是否具有四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS或tetX，进而可判断或筛查对四环素具有耐药性的细菌，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好等特点。
使用该引物组进行5重PCR检测的方法如下：
(1)配置PCR反应体系：
10×PCR反应缓冲液(购自Takara)：5μL；dNTPs(各2.5mmol/L)：4μ L；Taq酶(5U/μL)：1μL；MgCl2(25mmol/L)：4μL；引物：引物组合1全部加入在同一体系中，引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2；引物对1(浓度为10μmol/L)：0.5μL；引物对5(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对3(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对2(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对4(浓度为10μmol/L)：1μL。待测样品(可以是菌液或者是细菌基因组DNA等)：5μL；dd H2O补齐至50μL。
(2)PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
(3)电泳结束后，进行凝胶电泳，根据条带大小的位置或有无，判断待测样品是否具有四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS和tetX，根据该结果，进而可用于判断或辅助判断待测菌株是否具有四环素耐药性。
实施例2
本实施例提供的用于细菌耐药性检测的引物组，包括：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9。
引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物。
SEQ ID NO.1-2所示的引物对1可以扩增四环素耐药基因tetA；SEQ ID NO.3-4所示的引物对2可以扩增四环素耐药基因tetD；SEQ ID NO.5-6所示的引物对3可以扩增四环素耐药基因tetG；SEQ ID NO.7-8所示的引物对4可以扩增四环素耐药基因tetS；SEQ IDNO.9-10所示的引物对5可以扩增四环素耐药基因 tetX。
引物组合2包括：SEQ ID NO.11-20所示的引物。
SEQ ID NO.11-12所示的引物对6可以扩增四环素耐药基因tetC；SEQ ID NO.13-14所示的引物对7可以扩增四环素耐药基因tetU；SEQ ID NO.15-16所示的引物对8可以扩增四环素耐药基因tetZ；SEQ ID NO.17-18所示的引物对9可以扩增四环素耐药基因tet38；SEQ ID NO.19-20所示的引物对10可以扩增四环素耐药基因otrB。
引物组合3包括：SEQ ID NO.21-30所示的引物。
SEQ ID NO.21-22所示的引物对11可以扩增四环素耐药基因tetB(P)；SEQ IDNO.23-24所示的引物对12可以扩增四环素耐药基因tetV；SEQ ID NO.25-26 所示的引物对13可以扩增四环素耐药基因tet30；SEQ ID NO.27-28所示的引物对14可以扩增四环素耐药基因tet35；SEQ ID NO.29-30所示的引物对15可以扩增四环素耐药基因tet44。
引物组合4包括：SEQ ID NO.31-40所示的引物；
SEQ ID NO.31-32所示的引物对16可以扩增四环素耐药基因tetE；SEQ ID NO.33-34所示的引物对17可以扩增四环素耐药基因tetH；SEQ ID NO.35-36所示的引物对18可以扩增四环素耐药基因tetK；SEQ ID NO.37-38所示的引物对 19可以扩增四环素耐药基因tet43；SEQ ID NO.39-40所示的引物对20可以扩增四环素耐药基因otrC。
引物组合5包括：SEQ ID NO.41-50所示的引物；
SEQ ID NO.41-42所示的引物对21可以扩增四环素耐药基因tetO；SEQ ID NO.43-44所示的引物对22可以扩增四环素耐药基因tetY；SEQ ID NO.45-46所示的引物对23可以扩增四环素耐药基因tet31；SEQ ID NO.47-48所示的引物对 24可以扩增四环素耐药基因tet32；SEQ ID NO.49-50所示的引物对25可以扩增四环素耐药基因tet36。
引物组合6包括：SEQ ID NO.51-60所示的引物；
SEQ ID NO.51-52所示的引物对26可以扩增四环素耐药基因tetJ；SEQ ID NO.53-54所示的引物对27可以扩增四环素耐药基因tetR；SEQ ID NO.55-56所示的引物对28可以扩增四环素耐药基因tet40；EQ ID NO.57-58所示的引物对 29可以扩增四环素耐药基因tet42；SEQ ID NO.59-60所示的引物对30可以扩增四环素耐药基因tet45。
引物组合7包括：SEQ ID NO.61-70所示的引物；
SEQ ID NO.61-62所示的引物对31可以扩增四环素耐药基因tetA(p)；SEQ IDNO.63-64所示的引物对32可以扩增四环素耐药基因tetW；SEQ ID NO.65-66所示的引物对33可以扩增四环素耐药基因tet34；SEQ ID NO.67-68所示的引物对 34可以扩增四环素耐药基因tet41；SEQ ID NO.69-70所示的引物对35可以扩增四环素耐药基因otrA。
引物组合8包括：SEQ ID NO.71-80所示的引物；
SEQ ID NO.71-72所示的引物对36可以扩增四环素耐药基因tetQ；SEQ ID NO.73-74所示的引物对37可以扩增四环素耐药基因tet33；SEQ ID NO.75-76所示的引物对38可以扩增四环素耐药基因tet37；SEQ ID NO.77-78所示的引物对 39可以扩增四环素耐药基因tet39；SEQ ID NO.79-80所示的引物对40可以扩增四环素耐药基因tcr。
引物组合9包括：SEQ ID NO.81-88所示的引物。
SEQ ID NO.81-82所示的引物对41可以扩增四环素耐药基因tetB；SEQ ID NO.83-84所示的引物对42可以扩增四环素耐药基因tetL；SEQ ID NO.85-86所示的引物对43可以扩增四环素耐药基因tetM；SEQ ID NO.87-88所示的引物对 44可以扩增四环素耐药基因tetT。上述各引物组合扩增基因的PCR产物大小如下表：
采用本实施例的引物组进行多重PCR检测四环素耐药基因的方法：每个引物组合单独进行5重PCR，即9个5重PCR反应体系。使用引物组合2-9进行 PCR的反应体系和程序与实施例1中引物组合1的基本相同。
实验例1
材料、试剂和仪器
材料：具有四环素耐药表型的细菌菌株，由上海市农业科学院分离自市售冷鲜鸡肉表面及养鸡场环境。
试剂：DNA聚合酶(购于Takara)，dNTP混合液(包括dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，购于Takara)，MgCl2(购于Takara)，44对四环素耐药基因PCR引物 (由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，琼脂糖凝胶电泳试剂(购于北京全式金生物技术有限公司)，脑心浸液肉汤培养基(Brain heart infusion broth, BHI)和琼脂粉(购于Oxoid)，四环素(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)。
仪器：Bio-Rad T100型PCR仪，Bio-Rad Powerpac Universal型电泳仪， Bio-RadGelDoc XR+Imager型凝胶成像分析系统，北京六一生物科技有限公司 DYCP-31E型电泳槽，Eppendorf Centrifuge 5424 R型高速冷冻台式离心机， Eppendorf Research Plus型微量移液枪，德国公司。
待检细菌样品的基因组DNA模板制备：在含有16μg/mL四环素的BHI 固体培养基上，初步分离获得具有四环素耐药表型的细菌菌株，直接挑取单克隆菌斑作为PCR反应的模板；或挑取单克隆菌斑在液体BHI培养基进行预培养增菌，然后用商品化的细菌DNA抽提试剂盒提取细菌基因组，作为PCR反应的模板。
(1)单重PCR灵敏性试验
以5种四环素耐药基因片段阳性克隆的粗提DNA为模板，进行单重PCR 并用琼脂糖凝胶电泳观察结果，结合稀释菌液计数结果，确定5种耐药基因的单重PCR灵敏性。
用梯度稀释菌液的粗提DNA作为模板，对5种耐药基因进行单重PCR扩增(图1)。选择比目的条带可见的稀释梯度高1～2个梯度的稀释度，即tetA 10-4、 tetX 10-4、tetG 10-3、tetD 10-4、tetS 10-4，作为多重PCR中混合DNA的模板稀释度。稀释菌液的平板计数结果表明，tetA、tetX、tetG、tetD、tetS阳性克隆菌株菌悬液原始浓度为5.1×108，7.6×108，4.3×107，4.5×108，9.2×108CFU/mL，则再将各被选中的DNA模板稀释5.1，7.6，4.3，4.5，9.2倍，制成104CFU/mL 的菌液DNA粗提物，等比混合后获得用于开发多重PCR方法的DNA模板。
(2)多重PCR预试验：根据单重PCR的灵敏性，对5种耐药基因阳性克隆稀释菌液分别选择合适的稀释浓度下的粗提DNA模板，等比例混合后作为多重PCR的模板，进行多重PCR扩增反应。
(3)反应体系：混合DNA模板5μL，Taq酶0.25μL，每种基因的正向引物和反向引物各1.0μL，dNTP 4μL，MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液 5μL，最终用dd H2O补齐至50μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。以去离子水为模板作阴性对照。琼脂糖凝胶电泳观察结果。
在多重PCR体系中，随着检测基因位点的增多，即引物数量的增加，每条目的基因的扩增效率会受到影响，某种特异性条带优先进行PCR反应，而部分条带甚至无法获得扩增。在本研究中也出现了类似的情况，当多种DNA模板和引物混合反应后，部分在单重PCR中能够顺利扩增的条带不再呈现目的条带。采取阶梯增加引物的策略，调整新加入的引物浓度直至获得扩增，使得PCR体系从一重增加至五重(图2)。但用该体系和程序对实际细菌样品进行5种耐药基因的筛查时，发现部分基因无法扩增，因此需要优化多重PCR的反应体系及反应程序。
实验例2
比较不同引物浓度比的扩增结果。
采用实施例1的引物组，按表1设置不同引物浓度，进行多重PCR。
表1多重PCR体系引物浓度的优化
反应体系为：阳性对照液(含有四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS或 tetX的质粒水溶液的混合物)1μL，Taq酶0.5μL，引物体积参照上表1，dNTPs 4μL，MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液5μL，最终用dd H2O补齐至50μ L；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
结果见图3，图3中：
M：2K Maker；1-5：引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4 的引物浓度比分别为1︰1︰1︰1︰2、1︰1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2︰2、1︰2︰ 2︰2︰2、1︰2︰2︰2︰4；6～10：1-5各自对应阴性对照。
根据图3结果可以看出，当引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4的分别为0.1，0.1，0.2，0.2，0.2μmol/L(即5对引物的单条引物添加量分别为0.5，0.5，1.0，1.0，1.0μL，浓度比为1︰1︰2︰2︰2，图3，泳道3) 时，5个目的基因(tetA、tetX、tetG、tetD和tetS)的扩增条带亮度相近，均能得到比较好的扩增且无非特异性条带。
实验例3
比较不同Taq酶浓度的扩增结果。
采用实施例1的引物组，多重PCR反应体系中分别添加0.25(1.25U)，0.50 (2.5U)，1.00(5U)，1.50μL(7.5U)Taq酶，比较不同Taq酶浓度的扩增效果。
反应体系为：阳性对照液(含有四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS或tetX的质粒水溶液的混合物)1μL；Taq酶0.25/0.5/1.0/1.5μL；引物组合1 全部加入在同一体系(引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2；引物对1(浓度为10μmol/L)：0.5μL；引物对5(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对3(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对2(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对4(浓度为10μmol/L)：1μL；)；dNTPs 4μL，MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液5μL，最终用dd H2O补齐至50μ L；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min。
结果见图4，图4中：M：2K Maker；1-4：Taq酶添加量分别为0.25，0.50， 1.00，1.50μL，对应在体系中的浓度为：0.025U/μL、0.05U/μL、0.1U/μL、 0.15U/μL；5-8：1-4各自的阴性对照。
从图4可以看出，当多重PCR体系中的Taq酶添加量为1μL(即Taq酶的终浓度为0.1U/μL)时，5条目的条带最为清晰(图4，泳道3)。
实验例4
比较不同退火温度的扩增结果。
采用实施例1的引物组，设置不同的退火温度53，55，57和58℃，进行多重PCR反应，比较不同退火温度的扩增结果。
反应体系为：同实验例3；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s， 53/55/57/58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
结果见图5，图5中：M：2K Maker；1-4：退火温度分别为53℃，55℃， 57℃，58℃；5-8：1-4各自的阴性对照。
图5结果表明，当退火温度高至58℃时(图5)，部分条带不再能够扩增， 55℃可作为多重PCR的较佳退火温度。
实验例5
验证实施例1的引物组和检测方法的灵敏度
将含104CFU/g混合菌液(含有耐药基因tetA的菌、含有耐药基因tetD的菌、含有耐药基因tetG的菌、含有耐药基因tetS的菌和含有耐药基因tetX的菌的混合物，各种菌为104CFU/g)的粗提DNA模板稀释成10.00％，1.00％，0.10％，作为模板，然后分别进行扩增。
反应体系为：不同稀释度的DNA模板5μL；引物组合1全部加入在同一体系(引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2；引物对1(浓度为10μmol/L)：0.5μL；引物对5(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对3(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对2(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对4(浓度为10μmol/L)：1μL；)；dNTPs 4μL， MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液5μL，最终用dd H2O补齐至50μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环；72℃延伸10min。
结果表明，当混合DNA模板被稀释到0.10％时，已检测不到tetS基因，而 1.00％的稀释模板仍能扩增出所有5条目的条带(图6，图6中：M：2K Maker； 1-4：模板稀释梯度分别为10-3，10-2，10-1，100；5-8：1-4各自的阴性对照。)。该结果说明实施例1的引物组和检测方法的的灵敏度为102CFU/g，具有较高的灵敏度。
实验例6
验证实施例1的引物组和检测方法的特异性
以13种耐药基因的阳性克隆菌株粗提DNA为模板，用优化的多重PCR体系进行扩增，考察体系的特异性。
反应体系为：待测DNA模板溶液5μL，Taq酶1.0μL，引物组合1全部加入在同一体系(引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2；引物对1(浓度为10μmol/L)：0.5μL；引物对5(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对3(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对2(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对4(浓度为10μmol/L)：1μL；)；dNTPs 4μL，MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液5μL，最终用dd H2O补齐至50μ L；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min。
结果表明，该实施例1的引物组和检测方法可以检测5种目的耐药基因，对不含目的耐药基因的样品无法扩增出条带(图7，图7中：M：2K Maker；1-16：分别以tetA、tetA+tetD、tetA+tetG、tetS、tetX、sul1、sul2、tetE、tetM、tetT、 tetO、tetR、tetA+tetX、tetA+tetS、tetA+sul1、tetA+tetX+tetS的阳性克隆菌为模板进行PCR扩增的样品；-：阴性对照)。该结果说明实施例1的引物组和检测方法具有较好的特异性。
实验例7
从市售冷鲜鸡肉表面及养鸡场环境中分离出的23株具有四环素耐药表型的细菌，鉴定种属后用单重PCR筛查tetA、tetD、tetG、tetS和tetX五种四环素耐药基因的存在情况，并将PCR产物阳性条带切胶回收后测序验证，进一部确认对应的四环素耐药基因存在情况。然后用实施例1的引物组合和检测方法进行耐药基因的多重PCR检测。
反应体系为：混合待测DNA模板溶液5μL，Taq酶1.0μL，引物组合1 全部加入在同一体系(引物对1、引物对5、引物对3、引物对2和引物对4在同一体系中的浓度比为1︰1︰2︰2︰2；引物对1(浓度为10μmol/L)：0.5μL；引物对5(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对3(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对2(浓度为10μmol/L)：1μL；引物对4(浓度为10μmol/L)：1μL；)；dNTPs 4μL，MgCl2 4μL，10×PCR反应缓冲液5μL，最终用dd H2O补齐至50μ L；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min。
结果表明，多重PCR试剂盒的四环素耐药基因检测结果与普通单重PCR检测结果完全一致(表2，图8，图8中：M：2K Maker；1～23.表2中对应的四环素耐药菌菌株，-：阴性对照)。
表2用于验证实施例1的引物组合和检测方法实用性的23株禽源四环素菌
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种用于细菌耐药性检测的引物组、试剂盒和检测方法
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctacatcct gcttgccttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catagatcgc cgtgaagagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaccattac ggcattctgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccggatac accatccatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agcaggtcgc tggacactat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgcggtgttc cactgaaaac 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaacgccaga gaggtatt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacctccatt tggacctcac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caataattgg tggtggaccc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcttacctt ggacatcccg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttgagagcc ttcaacccag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atggtcgtca tctacctgcc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aacagcgggt taagtgtgca a 21
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atggtatcat tcagttttcc gacaat 26
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccttctcgac caggtcgg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acccacagcg tgtccgtc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctaaagggga ccagaagact 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaaactaatc cgacaatact ca 22
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cctgaaccta ccgcacga 18
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacatcacgg agaacagaac c 21
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agtggtgcaa atactgaaaa agttgt 26
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tttgttcctt cgttttggac aga 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggacgacaag cacgaacat 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcacagggac gggaactc 18
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cctgccactt gtaaccgtct 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggtcagcacc tgccctatt 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atcatcggtg gtatcttgg 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gctcttcgtt taggtcgtgt 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gataagggaa caacaaggg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tccactctaa agacgcaaa 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aaataggcca caaccgtcag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aaaccacatc ctccatacgc 20
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tttgggtcat cttaccagca ttaa 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ttgcgcatta tcatcgacag a 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acaaggagta ggatctgctg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aggatagcca tggctacaag 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctacgacggc aaggaacaga 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ccgagggact cacaaagga 19
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tggcacgagg tccgca 16
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctccacgcac tgtttgtcc 19
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aacttaggca ttctggctca c 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tcccactgtt ccatatcgtc a 21
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gttgctgctt ggaatggg 18
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aggcttgctg cgacgag 17
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aacaggagcc gtagcagc 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
agcaccgatt agccaaag 18
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
caacattaac ggaaagttta ttgtatacca 30
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttgacgctcc aaattcattg tatc 24
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
cgacactcct ggacacat 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
cttcaaagta agcatctaac g 21
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tttgccattt gcgtcctc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggttgtccca ttcctccc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tcaccctttc tcggtcctt 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctgggcttta ctggcactt 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gttccctggc ggtttcta 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cggctgacag tccctttt 18
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ctgctgggca tccgactt 18
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gtggctgacc attgcgtaga 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gctgagccat ccactcattt 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tttcctcttg agcgtttatg c 21
<210> 61
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
agttgcagat gtgtatagtc gtaaactatc tatt 34
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
tgctacaagt acgaaaacaa aactagaa 28
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ggacaacgag gacggacac 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
acagcaaagc ggaaacaac 19
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
attcattatc acttgggacg 20
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
caatcagttt cgctttcg 18
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ccctgatgag cgtcgtcc 18
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gcgttgatgc tattcctgtt t 21
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
atcaggttcg gtttggcg 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
atggactcgt tgcggttg 18
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
ttatacttcc tccggcatcg 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
atcggttcga gaatgtccac 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
cgaagttgga atctccctgt c 21
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
ccgtcggcgt tgatgtaa 18
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
acggtattcc agttcagca 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
ggagcagtct catctttcg 19
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
caacggctga ttatctccta 20
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
atcgcaacct attccacat 19
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gcaagccgct ctaactgg 18
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
cgggaaggtg aactggaatc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
ttggttaggg gcaagttttg 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gtaatgggcc aataacaccg 20
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
ttggatcgat agtagcc 17
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gtaaccagcc aactaatgac 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gtggacaaag gtacaacgag 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
cggtaaagtt cgtcacacac 20
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
aaggtttatt atataaaagt g 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
aggtgtatct atgatattta c 21

Claims (10)

1.一种用于细菌耐药性检测的引物组，其特征在于，其包括如下引物组合中的一种或多种：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.11-20所示的引物；
引物组合3包括：SEQ ID NO.21-30所示的引物；
引物组合4包括：SEQ ID NO.31-40所示的引物；
引物组合5包括：SEQ ID NO.41-50所示的引物；
引物组合6包括：SEQ ID NO.51-60所示的引物；
引物组合7包括：SEQ ID NO.61-70所示的引物；
引物组合8包括：SEQ ID NO.71-80所示的引物；
引物组合9包括：SEQ ID NO.81-88所示的引物。
2.一种细菌耐药性检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的细菌耐药性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR反应缓冲液。
4.一种细菌耐药性的检测方法，其特征在于，其包括：使用如下引物组合中的任意一种引物组合进行PCR反应：引物组合1、引物组合2、引物组合3、引物组合4、引物组合5、引物组合6、引物组合7、引物组合8和引物组合9；
其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1-10所示的引物；
引物组合2包括：SEQ ID NO.11-20所示的引物；
引物组合3包括：SEQ ID NO.21-30所示的引物；
引物组合4包括：SEQ ID NO.31-40所示的引物；
引物组合5包括：SEQ ID NO.41-50所示的引物；
引物组合6包括：SEQ ID NO.51-60所示的引物；
引物组合7包括：SEQ ID NO.61-70所示的引物；
引物组合8包括：SEQ ID NO.71-80所示的引物；
引物组合9包括：SEQ ID NO.81-88所示的引物。
5.根据权利要求4所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，所述PCR反应的体系中含有如下成分的一种或多种：待测样本的DNA模板、Taq酶、dNTPs和Mg2+。
6.根据权利要求5所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，在所述PCR反应的体系中的Taq酶浓度为0.025-0.15U/μL。
7.根据权利要求5所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，所述PCR反应的退火温度为53-58℃。
8.根据权利要求5所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，当使用引物组合1进行所述PCR反应时，在PCR反应的体系中，引物组合1包括5种引物对的浓度比为：1︰1︰2︰2︰2或1︰2︰2︰2︰2。
9.根据权利要求5所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，引物组合1中的每种引物在所述PCR反应的体系中的浓度为0.1-0.2μmol/L。
10.根据权利要求4-9任一项所述的细菌耐药性的检测方法，其特征在于，所述耐药性为四环素耐药性。
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