CN112877409A - 用于检测抗生素耐药基因的rpa试剂、装置及其检测方法 - Google Patents

用于检测抗生素耐药基因的rpa试剂、装置及其检测方法 Download PDF

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CN112877409A CN202110137618.2A CN202110137618A CN112877409A CN 112877409 A CN112877409 A CN 112877409A CN 202110137618 A CN202110137618 A CN 202110137618A CN 112877409 A CN112877409 A CN 112877409A
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Abstract

本发明提供了用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂、装置及其检测方法。用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，所述抗生素耐药基因为blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR，所述试剂包括：用于检测blaNDM耐药基因的试剂A、用于检测blaKPC耐药基因的试剂B、用于检测mcr耐药基因的试剂C；还包括：用于检测tetL耐药基因的试剂D和用于检测tetR耐药基因的试剂E中的任意一种。本发明提供的试剂、装置和检测方法，采用常温扩增方式进行抗生素耐药基因的扩增和检测，能够完全脱离大型仪器设备的依赖，实现便携式小型化和移动化，符合环境样本检测中快速检测的需要。

Description

用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂、装置及其检测方法
技术领域
本发明涉及抗生素耐药基因检测领域，具体涉及用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂、装置及其检测方法。
背景技术
随着抗生素使用的普及，携带多种抗生素耐药基因(antibiotic resistancegenes,ARG) 的临床微生物已经屡见不鲜。抗生素耐药基因ARGs的广泛传播必然导致泛耐药菌在水体、土壤，空气，动植物中泛滥，控制抗生素耐药形势需要各方的共同关注和行动。与临床形势相比，环境中的耐药微生物研究起步晚，研究规模和深度不足。耐药微生物或抗生素耐药基因的增涨和传播是非常迅速的，据报道耐药微生物的生物量在潮湿环境中，在2h后即可达到指数级增长，而抗生素耐药基因的水平传播也是以小时计的。由此可见，依托于传统的微生物培养和梯度稀释药敏检测，费时费力的同时也不能应对环境中耐药微生物的扩散和抗生素耐药基因的传播。
常规的监测过程中，直接有效的检测耐药基因的方式高度依赖PCR等大型仪器设备，不同的样品进行实验室核酸检测的要求也有差异。常规监测环境中耐药微生物基因类型，往往需要符合核酸扩增要求的环境分子检验实验室配合进行，该配置的环境检测实验室极少。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)被称为可替代PCR的核酸检测技术。RPA技术以T4噬菌体的核酸复制机制为基本原理，模仿细胞内的核酸复制机制的一种新兴恒温核酸扩增技术。
现有的RPA技术也存在很多应用难点。产品中以LFD-RPA及EXO-RPA为主要检测模式，但是RPA产品仍依赖于实验室操作，对于扩增反应要求非常高，且依赖于恒温扩增仪等必备仪器。现场检测对扩增体系的要求需要体系制剂尽可能的脱离仪器依赖，目前，RPA扩增反应尚不能适应不同的检测样品，受到扩增环境的影响较大，未达到现场检测的要求。
发明内容
针对现有的抗生素耐药基因现场环境检测的局限性，无法满足快速高通量和准确有效的快速应急分析需求，本发明首先建立了对应抗生素耐药基因的重组酶聚合酶扩增技术平台，建立了blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR抗生素耐药基因的检测方法，blaNDM采用exo-RPA常温检测扩增，其余基因采用nfo-RPA常温扩增进行检测，分别设计上下游引物及exo和nfo探针，并设计了一种用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂、简易装置及其检测方法。
本发明的第一目的在于，提供了一种用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，所述抗生素耐药基因为blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR，所述试剂包括：用于检测blaNDM耐药基因的试剂A、用于检测blaKPC耐药基因的试剂B、用于检测mcr耐药基因的试剂C；还包括：用于检测tetL耐药基因的试剂D和用于检测tetR耐药基因的试剂E中的任意一种。
blaNDM基因为产金属β内酰胺酶NDM的抗生素耐药基因，相关引物探针依照序列blaNDM-1(KX999121.1)，blaNDM-2(KU510393.1)，blaNDM-3(JQ734687.1)，blaNDM-4(KP772213.1)，blaNDM-5(KP772211.1)，blaNDM-6(NG049338.1)，blaNDM-7(JX262694.1) 等22种不同基因型的保守序列为模板进行设计(委托上海生物工程公司合成)，引物长度控制在30～35bp，探针为45～52bp的exo型荧光探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，距离探针5’端超过30bp，距离探针3’端超过15bp，THF相隔1～3个bp的位置5’端使用FAM荧光基团修饰的脱氧胸腺嘧啶取代脱氧胸腺嘧啶，3’端使用BHQ粹灭基团修饰的脱氧胸腺嘧啶取代脱氧胸腺嘧啶，从而使得探针能被有DNA损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。同时设计该基因的nfo扩增体系，引物长度在 30～35bp，探针为45～52bp的nfo型荧光探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，距离探针5’端超过30bp，距离探针3’端超过15bp，5’末端采用FAM基团标记，3’末端使用C3封闭基团标记，使得探针能够被nfo酶识别并切割修复。
优选地，所述试剂A包括引物对和探针，具体包括试剂A1和试剂A2中的任意一种；
所述试剂A1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
探针：序列如SEQ ID NO:3所示；
所述试剂A2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
探针：序列如SEQ ID NO:6所示；
blaKPC基因为产碳青霉烯酶KPC的抗生素耐药基因，引物探针参照序列blaKPC-1(AF297554.1)，blaKPC-2(EF062508.1)，blaKPC-3(AB557734.1)，blaKPC-4(EU447304.1)，blaKPC-5(NG_049259.1)，blaKPC-6(EU555534.1)等共计17种基因型的相同保守序列进行设计(委托上海生物工程公司合成)。下游引物的5’端使用生物素基团标记，探针为 48～55bp的nfo型探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，5’末端采用FAM基团标记，3’末端使用C3封闭基团标记。
所述试剂B包括引物对和探针，具体包括试剂B1和试剂B2中的任意一种；
所述试剂B1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
探针：序列如SEQ ID NO:9所示；
所述试剂B2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
探针：序列如SEQ ID NO:12所示；
mcr基因为产多粘菌素酶MCR的相关基因，其引物探针依照序列mcr-1(KY013597.1)，mcr-2(MF176239.1)，mcr-3(NG_056184.1)，mcr-4(MK016505.1) 等10种不同基因型的保守序列进行设计(委托上海生物工程公司合成)，引物及探针方案与blaKPC相同。
所述试剂C包括引物对和探针，具体包括试剂C1和试剂C2中的任意一种；
所述试剂C1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
探针：序列如SEQ ID NO:15所示；
所述试剂C2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
探针：序列如SEQ ID NO:18所示。
tetLR基因为产替加环素酶TET的相关基因，其引物探针依照序列tetL(JQ280448.2) 和tetR(J01830.1)基因序列进行设计(委托上海生物工程公司合成)，引物及探针方案与blaKPC相同。
优选地，所述试剂D包括引物对和探针，具体包括试剂D1和试剂D2中的任意一种；
所述试剂D1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
探针：序列如SEQ ID NO:21所示；
所述试剂D2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:23所示；
探针：序列如SEQ ID NO:24所示；
所述试剂E包括引物对和探针，具体包括试剂E1和试剂E2中的任意一种；
所述试剂E1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:25所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:26所示；
探针：序列如SEQ ID NO:27所示；
所述试剂E2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:28所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:29所示；
探针：序列如SEQ ID NO:30所示。
本发明的第二目的在于，提供了上述用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂在抗生素耐药基因环境样本检测中的应用。
本发明的第三目的在于，提供了一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，简易装置内包括上述的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂。
优选地，还包括：透明单侧粘性的玻璃纤维膜、封闭液体的PVC封闭膜、含微流控液体管路的检测片、以及不透光的背膜；荧光报告试剂为Alexa Fluor488标记的羊抗兔FAM抗体悬浊液，抗体使用5％BSA的PBS缓冲液按1:200进行稀释，阳性对照使用Cy5标记的羊抗兔地高辛抗体，阴性对照无任何荧光报告基团。
优选地，所述检测片是由聚二甲基硅氧烷经过硅片模具一体浇筑而成，所述PVC封闭膜内侧进行硅氧烷疏水处理；所述微流控微管的流动相液体为含2.5％表面活性剂Span-80的硅油，分散相为含RPA试剂的扩增液体。
优选地，还包括：核酸提取用滤纸，所述核酸提取用滤纸使用10％醋酸钠浸泡后干燥，过滤滤纸片剪裁折叠后放置于F处，核酸提取试剂为含0.1％氢氧化钠的磁珠纯水悬液。
所述简易装置中，荧光反应报告区能特异性的显示阳性和阴性检测结果。随着重组酶聚合酶扩增(RPA)对各ARGs样本核酸的扩增，反应物将各自携带应对的报告基团。由于RPA探针的5'端用FAM标记，下游引物的5'端用生物素标记，因此当RPA扩增结果为阳性时，RPA产物可与Alexa Fluor488标记的小鼠抗FAM单克隆抗体结合，继续扩散后又与检测线上包被的亲和素发生结合，因此在检测线(T线)上会出现特异性的荧光条带；而AlexaFluor488标记的鼠抗地高辛单克隆抗体会与质控线上包被的羊抗鼠抗体结合，在质控线(C线)也会出现荧光条带。当RPA扩增结果为阴性时，探针会被抗 FAM抗体所结合，但未发生扩增，FAM基团连接的核酸片段不携带biotin基团，无法与T线亲和素结合，因此在检测线(T线)上不出现荧光条带；同时Alexa Fluor488标记的小鼠抗FAM单克隆抗体会与羊抗鼠抗体结合，因此在质控线(C线)上会出现条带。
所述简易装置中，阳性对照反应区使用KPC酶全长基因为模板的质粒作为阳性对照物，对应的引物和探针体系为阳性反应物，使用地高辛对探针进行5’末端标记，使用 Cy5标记的抗地高辛抗体进行荧光报告。当反应顺利进行后，阳性对照区扩增形成的产物5’末端标记了地高辛基团，结合了Cy5标记的抗地高辛抗体后，在T检测线显示出红色荧光，C线显示亦为红色荧光。
所述简易装置中，阴性对照反应区只使用了去离子和RPA扩增试剂进行试剂对照实验，T线无荧光报告而C线有红色荧光报告证明本次检测可靠。
RPA扩增与常规的PCR扩增反应具有显著差异，其引物探针设计需要脱离PCR扩增体系的研究方案，遵照RPA扩增引物和探针设计原则进行实验。引物长度控制在30-35 bp；避免5’端长的G序列；尽可能3’端用G、C序列，探针长度控制在46-52bp；在THF左右分别修饰FAM荧光基团和粹灭基团；在3’端添加C端封闭阻止延伸。
本发明的第四目的在于，提供了一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置在抗生素耐药基因环境样本检测中的应用。
本发明的第五目的在于，一提供了种用于检测抗生素耐药基因的检测方法，应用于上述的简易装置中，其特征在于，步骤包括如下：
S1.核酸提取过程：样本孔中加入样本悬液200μl，同时在对照孔加入双蒸水100μl；逆时针旋转90度，微流控流动相硅油与样本混合进入裂解区，裂解5min；顺时针旋转 90度，混合液滴进入酸中合仓，中和反应5min；本检测片即可对采集的环境核酸样本进行碱裂解和酸中和，简易方式提取核酸；
S2.核酸纯化过程：将测试片，放置于37～42℃恒温设备中，将装置顺时针旋转90度，中和液滴自动进入过滤区进行过滤；
S3.RPA常温扩增：随后将装置逆时针旋转90度，混合液体经微流控方式自动进液至RPA扩增区，立刻进行常温核酸扩增20min，
S4.结果判别：随后将装置顺时针旋转90度，对产物进行荧光报告，可视化判别检测样本中是否存在抗生素耐药基因；
有效性判别方法：当阳性孔T和C线发生荧光反应报阳性，阴性孔为T线为阴性而C线为阳性时，表示本次检测结果可靠。根据对应样本孔的荧光反应直接判别是否含有4类抗生素耐药基因。样本检测结果判别方法：
当抗生素耐药基因对应的检测窗口T线为阳性，而C线为阳性，阳性对照为阳性，阴性对照组为阴性时，判别该样本含对应抗生素耐药基因片段。
当样本检测窗口T线无荧光，而C为阳性，阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，判断该样本不含对应抗生素耐药基因片段。
当对照组区域出现错误结果，请按照下述方法重新进行试验。
对照试验组判别方法：
当样本检测窗口的C线无荧光，提示检测区试剂过期，抗FAM抗体失效需要重新试验。
当阳性对照检测窗口的T线无荧光，提示检测片RPA试剂过期或污染，需要重新试验。
当阴性对照检测窗口的T线出现荧光反应，提示检测片被核酸污染，请更换并进行重新试验。
本发明技术方案，具有如下优点：
采用常温扩增方式进行抗生素耐药基因的扩增和检测，能够完全脱离大型仪器设备的依赖，实现便携式小型化和移动化，符合环境样本检测中快速检测的需要。
RPA扩增有别于其他核酸检测，因为超长引物和探针的复杂性，其设计难度极高，很难选择到高度保守的序列，其次，常温扩增过程中，无法有效规避非特异性扩增，因此扩增结合区域的特异性要求远远高于常规扩增(如PCR)，最后RPA扩增体系的敏感性和稳定性也较弱与其他扩增方法。本发明对扩增体系进行了严格的筛选和测试。 RPA扩增成功的关键是相应抗生素耐药基因靶基因保守区的选择，引物和探针的敏感性、重复性和特异性，因此所设计引物探针是本发明是否有效的决定性因素。本发明涉及的多个引物探针体系均经过了实验验证和优化。
本发明提供的简易装置是全封闭式的一体化芯片模块，加入样本悬液后，只需要按照要求进行转动和常温孵育即可实现扩增和判读的目标，使用方便，便于携带，薄片式设计，能进行多个样本同时检测，检测结果可视化。
本发明提供的简易装置，液体进液流动无需外力，通过微流控的方式主动进液，只需要按照说明流程旋转检测片即可达到核酸提取，DNA纯化，RPA扩增和荧光结果判读的目的。本发明是首次将微流控技术与抗生素耐药基因的RPA扩增结合起来。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一个实施例的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置中检测片的剖面图及配置方法流程图；
图2是本发明一个实施例的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置操作标准化流程图；
图3是本发明一个实施例的不同的RPA扩增体系模板梯度稀释实验；
其中，A1-A4：实验组RPND1～4；P0：未稀释；P1：10倍稀释；P2:100倍； P3：1000倍；P4：10000倍；P5：100000倍；
图4是本发明一个实施例中RPA扩增体系特异性实验；
图5是本发明一个实施例中RPND1扩增体系RPA扩增重复性实验；
图6是本发明一个实施例中blaNDM基因nfo扩增结果；
其中，每个实验组自左向右模板浓度依次递减，blaNDM基因的原始拷贝数为 1.764×109Copys/mL，初始浓度为40ng/mL；
图7是本发明一个实施例中blaKPC基因nfo扩增结果；
其中，每个实验组自左向右模板浓度依次递减，blaKPC基因的原始拷贝数为 1.803×109CopysCopys/mL，初始浓度为40ng/mL；
图8是本发明一个实施例中mcr基因nfo扩增结果；
其中，每个实验组自左向右模板浓度依次递减，mcr基因的原始拷贝数为 1.922×109CopysCopys/mL，初始浓度为40ng/mL；
图9是本发明一个实施例中tetL基因nfo扩增结果；
其中，每个实验组自左向右模板浓度依次递减，tetL基因的原始拷贝数为 1.271×109CopysCopys/mL，初始浓度为40ng/mL；
图10是本发明一个实施例中tetR基因nfo扩增结果；
其中，每个实验组自左向右模板浓度依次递减，tetR基因的原始拷贝数为 1.061×109CopysCopys/mL，初始浓度为40ng/mL；
图11是本发明一个实例中各组扩增重复性结果。
具体实施方式
以下结合附图进行说明。
实施例1：用于检测抗生素耐药基因的上下游引物及exo和nfo探针的设计
一种用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，所述抗生素耐药基因为blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR，所述试剂包括：用于检测blaNDM耐药基因的试剂A、用于检测blaKPC耐药基因的试剂B、用于检测mcr耐药基因的试剂C；还包括：用于检测tetL耐药基因的试剂D和用于检测tetR耐药基因的试剂E中的任意一种。
blaNDM基因为产金属β内酰胺酶NDM的抗生素耐药基因，相关引物探针依照序列blaNDM-1(KX999121.1)，blaNDM-2(KU510393.1)，blaNDM-3(JQ734687.1)，blaNDM-4(KP772213.1)，blaNDM-5(KP772211.1)，blaNDM-6(NG_049338.1)，blaNDM-7(JX262694.1) 等22种不同基因型的保守序列为模板进行设计，引物长度控制在30～35bp，探针为 45～52bp的exo型荧光探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，距离探针5’端超过 30bp，距离探针3’端超过15bp，THF相隔1～3个bp的位置5’端使用FAM荧光基团修饰的脱氧胸腺嘧啶取代脱氧胸腺嘧啶，3’端使用BHQ粹灭基团修饰的脱氧胸腺嘧啶取代脱氧胸腺嘧啶，从而使得探针能被有DNA损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。同时设计该基因的nfo扩增体系，引物长度在30～35bp，探针为45～52bp的nfo 型荧光探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，距离探针5’端超过30bp，距离探针 3’端超过15bp，5’末端采用FAM基团标记，3’末端使用C3封闭基团标记，是的探针能够被nfo酶识别并切割修复。
优选地，所述试剂A包括引物对和探针，具体包括试剂A1和试剂A2中的任意一种；
所述试剂A1包括：
上游引物：CTTATGCCAATGCGTTGTCGAACCAGCTTGCCC(SEQ ID NO:1)；
下游引物：Biotin-CCCAACGGTGATATTGTCACTGGTGTGGCC(序列如SEQ ID NO:2)；
探针：5`6-FAM-CAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTG
/idSp/GTCGAACCAGCAACCGCG-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
CAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTGGGTCGAACCAGCAACCGCGCCC (SEQ ID NO:3)；
所述试剂A2包括：
上游引物：CATTAGCCGCTGCATTGATGCTGAGCGGGTGCATGCCC(SEQ ID NO:4)；
下游引物：Biotin-CCCTGACGATCAAACCGTTGGAAGCGACTGCCC(序列如SEQ ID NO:5)；
探针：5`6-FAM-AGCTCGCACCGAATGTCTGGCAGCACACTTCC
/idSp/ATCTCGACATGCCG-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
AGCTCGCACCGAATGTCTGGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGG(SEQ ID NO:6)；
blaKPC基因为产碳青霉烯酶KPC的抗生素耐药基因，引物探针参照序列blaKPC-1(AF297554.1)，blaKPC-2(EF062508.1)，blaKPC-3(AB557734.1)，blaKPC-4(EU447304.1)，blaKPC-5(NG_049259.1)，blaKPC-6(EU555534.1)等共计17种基因型的相同保守序列进行设计。下游引物的5’端使用生物素基团标记，探针为48～55bp的nfo型探针，四氢呋喃基团THF取代腺苷酸位点，5’末端采用FAM基团标记，3’末端使用C3封闭基团标记。
所述试剂B包括引物对和探针，具体包括试剂B1和试剂B2中的任意一种；
所述试剂B1包括：
上游引物：TGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAAC(SEQ ID NO:7)；
下游引物：Biotin-AAGCCCTTGAATGAGCTGCACAGTGGGAAGCG(序列如SEQ ID NO:8)；
探针：5`6-FAM-GACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGA
/idSp/ACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTA-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
GACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGT AAGTTA(SEQID NO:9)；
所述试剂B2包括：
上游引物：AGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCT(SEQ ID NO:10)；
下游引物：Biotin-TCATGCCTGTTGTCAGATATTTTTCCGAGATG(序列如SEQ ID NO:11)；
探针：5`6-FAM-TGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGC
/idSp/GGACACACCCATCCGTTACGGCA-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
TGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCCGTTAC GGCA(SEQ IDNO:12)；
mcr基因为产多粘菌素酶MCR的相关基因，其引物探针依照序列mcr-1(KY013597.1)，mcr-2(MF176239.1)，mcr-3(NG_056184.1)，mcr-4(MK016505.1) 等10种不同基因型的保守序列进行设计，引物及探针方案与blaKPC相同。
所述试剂C包括引物对和探针，具体包括试剂C1和试剂C2中的任意一种；
所述试剂C1包括：
上游引物：CTAAAGCCTGTGTTGATTTTGCTATTAATCATGGG(SEQ ID NO:13)；
下游引物：Biotin-CCCAATCGGCGCATCAAACCCTTGCCCCAA(序列如SEQ ID NO:14)；
探针：5`6-FAM-CGGTCTATGATACGACCATGCTCCAAAATGC
/idSp/CTACAGACCGACCAAGCCGAG-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
CGGTCTATGATACGACCATGCTCCAAAATGCCCTACAGACCGACCAAGCCGAG (SEQ ID NO:15)；
所述试剂C2包括：
上游引物：AGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCG(SEQ ID NO:16)；
下游引物：Biotin-TGGTCACGCCATCGATCTTGGCAAGCTGTGG(SEQ ID NO:17)；
探针：5`6-FAM-CGTCGTCGGTGAGACGGCACGCGCCGATCA
TGTCAGCTTCAATGGCTATGA-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
CGTCGTCGGTGAGACGGCACGCGCCGATCATGTCAGCTTCAATGGCTATGA(SEQ ID NO:18)。
tetLR基因为产替加环素酶TET的相关基因，其引物探针依照序列tetL(JQ280448.2) 和tetR(J01830.1)基因序列进行设计，引物及探针方案与blaKPC相同。
优选地，所述试剂D包括引物对和探针，具体包括试剂D1和试剂D2中的任意一种；
所述试剂D1包括：
上游引物：TTAAAAGGTTACTCCTATTTGGGATTATAATA(SEQ ID NO:19)；
下游引物：Biotin-TATGGAGCCAATAAGACCAAACGCTTTACC(序列如SEQ ID NO:20)；
探针：5`6-FAM-CTGGCTCGATTTATTCAAGGAGCTGGTGCAGC
/idSp/GCATTTCCAGCACTCGTG-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
CTGGCTCGATTTATTCAAGGAGCTGGTGCAGCTGCATTTCCAGCACTCGTG(SEQ ID NO:21)；
所述试剂D2包括：
上游引物：TTATTGGCTCCATAGTAGCTATGGGAGAAG(SEQ ID NO:22)；
下游引物：Biotin-AGTATAATTCCTTTGATATCAAAATGACCTT(序列如SEQ ID NO:23)；
探针：5`6-FAM-TTCTACTCATTCCTATGATAACAATTATCACTGT
/idSp/CCGTTTCTTATGAAATTATTAA-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
TTCTACTCATTCCTATGATAACAATTATCACTGTTCCGTTTCTTATGAAATTATTAA (SEQ ID NO:24)；
所述试剂E包括引物对和探针，具体包括试剂E1和试剂E2中的任意一种；
所述试剂E1包括：
上游引物：GCTTGCACTTTATGCGTTAATGCAGGTTATCT(SEQ ID NO:25)；
下游引物：Biotin-CAAACGGCCTAAATACAGCATCCAAAGCGCACT(序列如SEQ ID NO:26)；
探针：5`6-FAM-TCTGACCGATTTGGTCGGCGCCCAGTGCTGTTG
/idSp/TGTCATTAATAGGCGCATCGCTG-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
TCTGACCGATTTGGTCGGCGCCCAGTGCTGTTGTTGTCATTAATAGGCGCATCGCTG (SEQ ID NO:27)；
所述试剂E2包括：
上游引物：CATGAGCAAGGTGCTTTACAGGGATTATTG(SEQ ID NO:28)；
下游引物：Biotin-CTAAACCAATAATCCAAATCCAGCCATCCCA(序列如SEQ ID NO:29)；
探针：5`6-FAM-GCAACCGGTGTTATTGGCCCATTACTGTTTAC
/idSp/GTTATTTATAATCATTCAC-3`C3-Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列：
GCAACCGGTGTTATTGGCCCATTACTGTTTACTGTTATTTATAATCATTCAC(SEQ ID NO:30)。
其中，/idsp/：四氢呋喃修饰；5`6-FAM：5`端FAM荧光基团；3`C3-Spacer：3`端封闭基团；Biotin-反向引物5`端生物素标记基团
实施例2：Exo扩增体系的验证
扩增反应体系和扩增条件：实验组RPND1和RPND2使用Exo-1探针，实验组 RPND3和RPND4使用Exo-2探针，具体见表1。exo扩增反应采用PCR仪进行监控，扩增程序为：设置等温模式，40℃预扩增1.0min，40℃扩增31sec共40个循环。
扩增体系敏感性试验：将携带抗生素耐药基因的质粒DNA母液标记为P0，分别稀释10(P1)、100(P2)、1000(P3)、10000(P4)和100000(P5)倍，最终制备成梯度稀释模板2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和20copys/mL，分别进行RPA扩增实验，该方法分析RPA扩增体系对模板DNA的检出限。其结果见图3。
扩增体系特异性试验：将不同耐药表型的沙门菌、铜绿假单胞菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、副溶血性弧菌和溶血性链球菌分别进行RPA体系的扩增试验，扩增结果与阳性质粒实验组进行对比，评估RPA扩增体系的特异性。其结果见图4。
扩增体系重复性试验：选择敏感性较高的实验组，分别进行阳性的RPA重复扩增实验，分别进行重复扩增10次，通过分析结果阳性率评估RPA扩增的重复性。其结果见图5。
表1 Exo扩增体系的探针和引物对
Figure BDA0002927617940000131
注：/i6FAMdT/：FAM荧光基团修饰的脱氧胸腺嘧啶；/iBHQ1dT/：BHQ粹灭基团修饰的脱氧胸腺嘧啶；/idsp/：四氢呋喃修饰。
由图3可知，将扩增体系引物和探针进行梯度稀释后经RPA扩增检测，4组扩增体系均在N0组呈现出较好的扩增曲线，各扩增体系在N1组仍显示较微弱扩增信号，N2 组后扩增结果呈阴性。DNA模板浓度梯度的RPA扩增结果所示，50～2.0×102copys/mL 依然出现阳性扩增结果。
由图4可知，本实验设计的4组引物和探针扩增体系中有3组呈现出了良好的敏感性和特异性。其检出限达到200个DNA模板拷贝，与PCR相关产品相当。blaNDM基因的RPA扩增也具有极好的特异性，未出现交叉反应，能够准确的在样品中检测出微量的blaNDM基因。
由图5可知，RPA扩增反应能够在35～45℃进行反应，可见其对扩增设备要求很低。此外，RPA反应能够在2～7min内出现阳性反应，可见其在快速检测领域具有很好的应用价值。选择扩增反应较灵敏的RPN1实验组进行RPA扩增反应重复性验证，其重复性较好。
实施例3：Nfo扩增体系验证
扩增反应体系和扩增条件：分别采用实施例1所述的引物对和探针对含blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR基因的质粒序列进行模拟扩增试验。扩增反应采用PCR仪进行，扩增程序设置等温模式，40℃预扩增1.0min，40℃扩增31sec共40个循环。随后吸取 5μl扩增产物加至95μl的PBST中制备成反应稀释液，插入商业化试剂盒含抗FAM抗体的侧向流试纸条，在5min内进行判读。
扩增体系敏感性试验：将携带抗生素耐药基因的质粒DNA母液标记为1，分别稀释10、100、1000、104、105、106、107、108和109倍，最终制备成梯度稀释反应模板，分别进行RPA扩增实验，该方法分析RPA扩增体系对模板DNA的检出限。其结果见表2所示。
扩增体系特异性试验：将不同耐药表型的肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌分别进行RPA体系的扩增试验，扩增结果与阳性质粒实验组进行对比，评估RPA扩增体系的特异性。其结果见图6-10。
扩增体系重复性试验：选择表2中敏感性较高的扩增体系，分别进行阳性的RPA 重复扩增实验，分别进行重复扩增10次，通过分析结果阳性率评估RPA扩增的重复性。
表2不同扩增体系nfo扩增试验检出限结果
Figure BDA0002927617940000141
以blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR质粒为试验模板，以不同耐药表型的病原菌为特异性对照，各组扩增体系也未见交叉反应。如图11所示，blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR质粒模板进行的重复性验证结果中，体系均呈现较好的重复性，阳性率均达到100％。样本的RPA扩增的停留时间随着模板浓度的升高而显著下降，可见较高的抗生素耐药基因拷贝数，能显著缩短阳性反应时间。
各反应扩增产物，使用Alexa Fluor488标记抗FAM抗体进行荧光放大，均获得较好的效果。其中大部分扩增体系能在扩增15min后检出样本中仅含100copys/mL以内的靶基因序列。阳性对照组荧光反应效果强烈，能满足对照实验要求，而双蒸水试剂实验组则无法报告荧光，满足阴性对照实验组的要求。
实施例4：用于检测抗生素耐药基因的简易装置
一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，简易装置内包括实施例1的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂。
优选地，还包括：透明单侧粘性的玻璃纤维膜、封闭液体的PVC封闭膜、含微流控液体管路的检测片、以及不透光的背膜；荧光报告试剂为Alexa Fluor488标记的羊抗兔FAM抗体悬浊液，抗体使用5％BSA的PBS缓冲液按1:200进行稀释，阳性对照使用Cy5标记的羊抗兔地高辛抗体，阴性对照无任何荧光报告基团。
优选地，所述检测片是由聚二甲基硅氧烷经过硅片模具一体浇筑而成，所述PVC封闭膜内侧进行硅氧烷疏水处理；所述微流控微管的流动相液体为含2.5％表面活性剂Span-80的硅油，分散相为含RPA试剂的扩增液体。
优选地，还包括：核酸提取用滤纸，所述核酸提取用滤纸使用10％醋酸钠浸泡后干燥，过滤滤纸片剪裁折叠后放置于F处，核酸提取试剂为含0.1％氢氧化钠的磁珠纯水悬液。
所述简易装置中，荧光反应报告区能特异性的显示阳性和阴性检测结果。随着重组酶聚合酶扩增(RPA)对各ARGs样本核酸的扩增，反应物将各自携带应对的报告基团。由于RPA探针的5'端用FAM标记，下游引物的5'端用生物素标记，因此当RPA扩增结果为阳性时，RPA产物可与Alexa Fluor488标记的小鼠抗FAM单克隆抗体结合，继续扩散后又与检测线上包被的亲和素发生结合，因此在检测线(T线)上会出现特异性的荧光条带；而AlexaFluor488标记的鼠抗地高辛单克隆抗体会与质控线上包被的羊抗鼠抗体结合，在质控线(C线)也会出现荧光条带。当RPA扩增结果为阴性时，探针会被抗 FAM抗体所结合，但未发生扩增，FAM基团连接的核酸片段不携带biotin基团，无法与T线亲和素结合，因此在检测线(T线)上不出现荧光条带；同时Alexa Fluor488标记的小鼠抗FAM单克隆抗体会与羊抗鼠抗体结合，因此在质控线(C线)上会出现条带。
所述简易装置中，阳性对照反应区使用KPC全长基因为模板的质粒作为阳性对照物，对应的引物和探针体系为阳性反应物，使用地高辛对探针进行5’末端标记，使用 Cy5标记的抗地高辛抗体进行荧光报告。当反应顺利进行后，阳性对照区扩增形成的产物5’末端标记了地高辛基团，结合了Cy5标记的抗地高辛抗体后，在T检测线显示出红色荧光，C线显示亦为红色荧光。
所述简易装置中，阴性对照反应区只使用了去离子和RPA扩增试剂进行试剂对照实验，T线无荧光报告而C线有红色荧光报告证明本次检测可靠。
RPA扩增与常规的PCR扩增反应具有显著差异，其引物探针设计需要脱离PCR扩增体系的研究方案，遵照RPA扩增引物和探针设计原则进行实验。引物长度控制在30-35 bp；避免5’端长的G序列；尽可能3’端用G、C序列，探针长度控制在46-52bp；在 THF左右分别修饰FAM荧光基团和粹灭基团；在3’端添加C端封闭阻止延伸。
如图1所示，所述简易可视化RPA扩增检测装置，其制备方法如下：
①制备底层黑色不透光PVC底板，依照(10cm×18cm×1.5mm)进行切割，边缘抛光备用。将硅片依照(9.8cm×17.7cm×2mm)进行切割，随后浸没在浓硫酸中，放在120 度烤箱内加热烘烤30min，随后冷却至室温后用大量水重洗清除硫酸，再用酒精清洗表面，最后使用去离子水冲洗3～5遍，随后使用氮气吹干，放置在烤箱中加热烘干去除水分。
②将雕刻好的模板压在硅片上，使用激光切割硅片，制备成含孔和管道的检测模具。将聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)单体与交联剂按照10:1的比例进行混合，倒入硅片模具中，抽真空后静置2h，放入80度烘箱中加热平衡10h。
③将固化完好的PDMS片从模具硅片上剥离后进行打孔和切割，以便满足实验要求。不透光背板和PVC膜朝向检测片一侧均需要进行硅氧烷疏水处理。随后将背板与 PDMS检测片进行氧等离子键合，完成芯片管路的单侧封闭。
④在流动相槽口内注入2.5％表面活性剂Span-80的硅油，使用与背板一样的黏合方法，将PVC膜与PDMS检测片离子键合黏连实现芯片整体封闭。随后将透明保护胶膜贴在PVC膜外侧，保护好加样孔及对照孔，简易装置安装完成。
上述简易装置，其使用方法如下：
样本种类：环境污水，动植物样本，垃圾样，表面拭子样本等。
采样要求：无菌操作下进行样本采集工作。将样本进行适当稀释，制备成悬浊液或半透明液体态，固体样本需要进行悬浊液制备，粘稠和颗粒物较多样本可能影响本检测方法的可靠性，进行适当研磨或稀释处理。样本的pH值需要维持在6.5～7.5范围内，过酸或过碱将显著影响本检测方法可靠性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Figure BDA0002927617940000171
Figure BDA0002927617940000181
Figure BDA0002927617940000191
Figure BDA0002927617940000201
Figure BDA0002927617940000211
Figure BDA0002927617940000221
Figure BDA0002927617940000231
Figure BDA0002927617940000241
Figure BDA0002927617940000251

Claims (10)

1.用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，其特征在于，所述抗生素耐药基因为blaNDM、blaKPC、mcr、tetLR，所述试剂包括：用于检测blaNDM耐药基因的试剂A、用于检测blaKPC耐药基因的试剂B、用于检测mcr耐药基因的试剂C；还包括：用于检测tetL耐药基因的试剂D和用于检测tetR耐药基因的试剂E中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，其特征在于，所述试剂A包括引物对和探针，具体包括试剂A1和试剂A2中的任意一种；
所述试剂A1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
探针：序列如SEQ ID NO:3所示；
所述试剂A2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
探针：序列如SEQ ID NO:6所示；
所述试剂B包括引物对和探针，具体包括试剂B1和试剂B2中的任意一种；
所述试剂B1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
探针：序列如SEQ ID NO:9所示；
所述试剂B2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
探针：序列如SEQ ID NO:12所示；
所述试剂C包括引物对和探针，具体包括试剂C1和试剂C2中的任意一种；
所述试剂C1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:13所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:14所示；
探针：序列如SEQ ID NO:15所示；
所述试剂C2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:16所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:17所示；
探针：序列如SEQ ID NO:18所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂，其特征在于，所述试剂D包括引物对和探针，具体包括试剂D1和试剂D2中的任意一种；
所述试剂D1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
探针：序列如SEQ ID NO:21所示；
所述试剂D2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:23所示；
探针：序列如SEQ ID NO:24所示；
所述试剂E包括引物对和探针，具体包括试剂E1和试剂E2中的任意一种；
所述试剂E1包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:25所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:26所示；
探针：序列如SEQ ID NO:27所示；
所述试剂E2包括：
上游引物：序列如SEQ ID NO:28所示；
下游引物：序列如SEQ ID NO:29所示；
探针：序列如SEQ ID NO:30所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂在抗生素耐药基因环境样本检测中的应用。
5.一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的用于检测抗生素耐药基因的RPA试剂。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，其特征在于，还包括：透明单侧粘性的玻璃纤维膜、封闭液体的PVC封闭膜、含微流控液体管路的检测片、以及不透光的背膜；荧光报告试剂为Alexa Fluor488标记的羊抗兔FAM抗体悬浊液，抗体使用5％BSA的PBS缓冲液按1:200进行稀释，阳性对照使用Cy5标记的羊抗兔地高辛抗体，阴性对照无任何荧光报告基团。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，其特征在于，所述含微流控液体管路的检测片是由聚二甲基硅氧烷经过硅片模具一体浇筑而成，所述PVC封闭膜内侧进行硅氧烷疏水处理；微流控微管的流动相液体为含2.5％表面活性剂Span-80的硅油，分散相为含RPA试剂的扩增液体。
8.根据权利要求6所述的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置，其特征在于，还包括：核酸提取用滤纸，所述滤纸使用10％醋酸钠浸泡后干燥，核酸提取试剂为含0.1％氢氧化钠的磁珠纯水悬液。
9.权利要求5-8任意一项所述的一种用于检测抗生素耐药基因的简易装置在抗生素耐药基因环境样本检测中的应用。
10.一种用于检测抗生素耐药基因的检测方法，应用于权利要求5-9任意一项所述的装置中，其特征在于，步骤包括如下：
S1.核酸提取过程：样本孔中加入样本悬液200μl，同时在对照孔加入双蒸水100μl；逆时针旋转90度，微流控流动相硅油与样本混合进入裂解区，裂解5min；顺时针旋转90度，混合液滴进入酸中合仓，中和反应5min；本检测片即可对采集的环境核酸样本进行碱裂解和酸中和，简易方式提取核酸；
S2.核酸纯化过程：将测试片，放置于37～42℃恒温设备中，将装置顺时针旋转90度，中和液滴自动进入过滤区进行过滤；
S3.RPA常温扩增：随后将装置逆时针旋转90度，混合液体经微流控方式自动进液至RPA扩增区，立刻进行常温核酸扩增20min，
S4.结果判别：随后将装置顺时针旋转90度，对产物进行荧光报告，可视化判别检测样本中是否存在抗生素耐药基因；
结果判别的方法：实验阴性对照组无荧光，阳性对照组有荧光，表示检测有效，根据对应样本孔的荧光反应直接判别是否含有4类抗生素耐药基因。
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