CN113897447A

CN113897447A - 耐药基因mcr-1的RAA检测引物和探针

Info

Publication number: CN113897447A
Application number: CN202111385986.5A
Authority: CN
Inventors: 车勇良; 周伦江; 王隆柏; 陈如敬; 吴学敏; 陈秋勇
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2022-01-07

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种耐药基因mcr‑1的RAA检测引物和探针。所述RAA检测引物的序列如SEQ ID NO.1‑2或SEQ ID NO.3‑4所示。所述RAA检测探针的序列如SEQ ID NO.5所示。本发明提供的RAA检测引物和探针具有灵敏度高、特异型好的特点，有利于临床对细菌mcr‑1耐药基因的检测监控，具有较大的应用价值。

Description

耐药基因mcr-1的RAA检测引物和探针

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物和探针。

背景技术

抗生素是抵抗人类和动物细菌感染最重要的药物。然而，由于抗生素被大量不合理使用，导致了耐药细菌的大量产生，给全球公共卫生和食品安全带来了巨大威胁。多黏菌素（polymyxin）作为人类抵抗革兰阴性菌感染的“最后一道防线”，因其使用频率的增加，也相继出现了大量的耐药细菌。因此，mcr-1作为一种多黏菌素耐药基因，一经发现，就引起了全世界的广泛关注。随之，为了更好地检测mcr-1基因，已建立了多种检测方法，其中包括普通PCR方法、荧光定量PCR方法等。

重组酶介导检测方法（recombinase-aid assay，RAA）是近几年前创建的一种新的检测病原方法，它是通过设计一对RAA特异性引物，引物长度在30 bp左右，在源于细菌或真菌的重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白的共同作用下，完成目的片段的RAA扩增，并结合特异性荧光标记或金颗粒标记探针，通过荧光定量显示仪或金标试纸进行结果判断。该方法具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、恒温扩增、不需要昂贵仪器、结果判断方法多样等多种优势。

因此，本研究以多黏菌素耐药基因mcr-1为研究对象，设计了特异性引物和荧光标记探针，为多黏菌素耐药基因的流行病学调查和耐药分子机制研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物和探针。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物，所述引物序列为：

mcr-F1：5’-TTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATC-3’，

mcr-R1：5’- ATGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTA-3’。

上述一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物，所述引物序列还可以为：

mcr-F2：5’-TTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCA-3’，

mcr-R2：5’- TGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTAG-3’。

一种耐药基因mcr-1的RAA检测探针，所述探针序列为：

5’-GCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTC(FAM-dT)(dSpacer)(BHQ1-dT)GGCGCGATGCTACTG (C3 Spacer) -3’。

上述一种RAA检测引物在制备mcr-1基因RAA荧光法检测试剂盒中的应用。

上述一种RAA检测探针在制备mcr-1基因RAA荧光法检测试剂盒中的应用。

本发明的显著优点在于：本研究以多黏菌素耐药基因mcr-1为研究对象，设计了特异性引物和荧光标记探针，实现了多黏菌素耐药基因mcr-1的快速检测，且特异性好、敏感性强。

附图说明

图1为mcr-1基因阳性质粒的鉴定结果。其中，泳道M为DNA Marker 2000，泳道1-2为mcr-1基因阳性质粒。

图2为mcr-1基因的基础RAA扩增结果。其中，泳道M为DNA Marker 2000，泳道1为mcr-F1(R1)引物，泳道2为mcr-F2(R2)引物。

图3为RAA检测引物组（探针）的敏感性试验。其中，曲线1为阳性对照，曲线2为10⁴copies/μL，曲线3为10³copies/μL，曲线4为10²copies/μL，曲线5为10¹copies/μL，曲线6为阴性对照。

图4为RAA检测引物组（探针）的特异性试验。其中，曲线1为mcr-1基因阳性大肠杆菌，曲线2为阳性对照，曲线3为mcr-1基因阴性沙门氏菌，曲线4为mcr-1基因阴性志贺氏菌，曲线5为mcr-1基因阴性克雷伯氏菌，曲线6为mcr-1基因阴性摩根摩氏菌，曲线7为阴性对照。

图5为实际样品检测试验。其中，曲线1为实际样品1 ，曲线2为阳性对照，曲线3为实际样品2 ，曲线4为实际样品3 ，曲线5为实际样品4 ，曲线6为阴性对照。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

以下实施例中所涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，例如：

生物材料

多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌、mcr-1阴性沙门氏菌、mcr-1阴性志贺氏菌、mcr-1阴性克雷伯氏菌、mcr-1阴性摩根摩氏菌以及实际样品1-4均为常规筛选方法筛选出的菌株，仅用于说明本发明技术方案。

主要仪器与试剂

PCR仪购自Eppendorf公司，荧光定量PCR仪（RTQ-960 Pro型）购自艾康生物技术有限公司，细菌DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PCR试剂均购自北京全式金生物技术有限公司，RAA基础扩增试剂盒和RAA荧光检测试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司。

实施例1 RAA检测引物对和探针的设计

根据GenBank中多黏菌素耐药基因mcr-1的保守片段序列（GenBank AccessionNO. KX886345.1）设计用于对mcr-1基因进行RAA检测的PCR引物对及探针，用以定性、定量检测待测样品中的mcr-1基因。

设计获得的引物对序列如下：

上游引物mcr-F1（SEQ ID NO.1）：5’-TTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATC-3’，

下游引物mcr-R1（SEQ ID NO.2）：5’-ATGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTA-3’；

上游引物mcr-F2（SEQ ID NO.3）：5’-TTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCA-3’，

下游引物mcr-R2（SEQ ID NO.4）：5’-TGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTAG-3’。

设计获得的探针序列如下：

mcr-RAP（SEQ ID NO.5）：

此外，根据已公开的文献（Zhang J, Chen L, Wang J, et al. Moleculardetection of colistin resistance genes (mcr-1 to mcr-5) in human vaginalswabs[J]. BMC Res Notes, 2018, 11(1): 143-143.）合成一对PCR引物，其序列如下：

上游引物mcr1-F（SEQ ID NO.6）：5’-AGTCCGTTTGTTCTTGTGGC-3’，

下游引物mcr1-R（SEQ ID NO.7）：5’-AGATCCTTGGTCTCGGCTTG -3’。

实施例2 细菌基因组DNA提取

将多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌、mcr-1阴性沙门氏菌、mcr-1阴性志贺氏菌、mcr-1阴性克雷伯氏菌和mcr-1阴性摩根摩氏菌分别用LB液体培养基培养至对数生长期（菌悬液OD₆₀₀=0.6），将菌悬液在3000r/min的条件下离心，收集菌体沉淀，采用细菌DNA提取试剂盒提取各细菌基因组DNA。所有操作均按照试剂盒说明书进行。

实施例3 mcr-1基因阳性质粒的制备

利用特异性引物（mcr1-F和mcr1-R）对多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 40 S，58℃ 40 S，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR扩增体系为：2×PCR Mix 12.5 µL，上游引物（20 µmol/L）0.5 µL，下游引物（20 µmol/L） 0.5 µL，DNA模板2 µL，加ddH₂O补足反应体系总体积至50 µL。回收PCR片段，与克隆质粒pMD18-T进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性鉴定后扩大培养并提取阳性质粒送至福州尚亚生物科技有限公司进行序列测定。将所测序列与GenBank中的mcr-1序列（GenBank Accession NO. KX886345.1）进行同源性比较，同源性达99%，进一步确认其是多黏菌素耐药基因mcr-1。 mcr-1基因阳性质粒的鉴定结果如图1所示。

实施例4 RAA检测引物对用于RAA基础扩增

以实施例2获得的多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌基因组DNA为模板，利用特异性引物对mcr-F1/mcr-R1和mcr-F2/mcr-R2分别对多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌的基因组DNA进行PCR扩增。按照RAA基础试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL：A buffer 37.5 μL，上游引物（10 µmol/L） 4.0 μL，下游引物（10 µmol/L）4.0 μL，DNA模板2.0 μL，B buffer 2.5 μL。其中，A buffer和B buffer均由试剂盒配套提供。在荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR反应条件为：39℃反应40 s；39℃反应30 s，40个循环。使用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增后的RAA产物，电泳检测。结果如图2所示，使用引物mcr-F1/mcr-R1和引物mcr-F2/mcr-R2的扩增结果基本一致，都可以扩增出156 bp的目的片段。

实施例5 RAA检测引物对（探针）用于RAA荧光扩增

（1）RAA引物组（探针）的敏感度试验

将实施例3获得的mcr-1阳性质粒进行稀释以进行敏感度验证，使其终浓度分别为10¹copies/μL、10²copies/μL、10³copies/μL、10⁴copies/μL，并将其作为模板进行RAA反应，确定该方法的最低检测浓度，即为mcr-1荧光RAA方法的检测限。以RAA荧光试剂盒提供的阳性对照为阳性对照，以RAA荧光试剂盒提供的阴性对照为阴性对照。

按照RAA荧光试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL：A buffer36.9 μL，mcr-F2（10 µmol/L） 4.0 μL，mcr-R2（10 µmol/L）4.0 μL，mcr-RAP（10 µmol/L）0.6 μL，模板2.0 μL，B buffer 2.5 μL。其中，A buffer和B buffer均由试剂盒配套提供。在荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR反应条件为：39℃反应40 s；39℃反应30 s，40个循环，收集荧光。

结果如图3所示，检测限值为10²copies/μL。

（2）RPA引物组（探针）的特异性试验

分别以实施例2获得的多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌基因组DNA、mcr-1阴性沙门氏菌DNA、mcr-1阴性志贺氏菌DNA、mcr-1阴性克雷伯氏菌DNA和mcr-1阴性摩根摩氏菌DNA作为模板进行RAA反应，通过荧光信号判定引物对（探针）的特异性。以RAA荧光试剂盒提供的阳性对照为阳性对照，以RAA荧光试剂盒提供的阴性对照为阴性对照。

按照RAA荧光试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL：A buffer36.9 μL，mcr-F2（10 µmol/L） 4.0 μL，mcr-R2 （10 µmol/L）4.0 μL，mcr-RAP（10 µmol/L）0.6 μL，DNA模板2.0 μL，B buffer 2.5 μL。其中，A buffer和B buffer均由试剂盒配套提供。在荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR反应条件为：39℃反应40 s；39℃反应30 s，40个循环，收集荧光。

结果如图4所示，仅在多黏菌素耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌基因组DNA中检测出mcr-1基因，其他4种DNA样品未被检测出mcr-1基因。

实施例6 实际样品检测

利用已经经过检测的mcr-1基因阳性菌株和mcr-1基因阴性菌株（菌株信息见下表）为实际样品检测对象，采用DNA提取试剂盒，提取其基因组DNA，采用本发明的引物对、探针对提取的DNA进行RAA检测。以RAA荧光试剂盒提供的阳性对照为阳性对照，以RAA荧光试剂盒提供的阴性对照为阴性对照。

按照RAA荧光试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL：A buffer36.9 μL，mcr-F2（10 µmol/L）4.0 μL，mcr-R2（10 µmol/L） 4.0 μL，探针（10 µmol/L）0.6 μL，DNA模板2.0 μL，B buffer 2.5 μL。其中，A buffer和B buffer均由试剂盒配套提供。在荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR反应条件为：39℃反应40 s；39℃反应30 s，40个循环，收集荧光。

结果如图5所示，样品1-2和阳性对照均有荧光信号产生，样品3-4和阴性对照均无荧光信号产生，证明本发明的引物对、探针对实际样本的检测结果与其他方法检测结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 耐药基因mcr-1的RAA检测引物和探针

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttttgataaa atcagccaaa cctatcccat c 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgattaata gcaaaatcaa cacaggcttt a 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttttgataa aatcagccaa acctatccca 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgattaatag caaaatcaac acaggcttta g 31

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctttgtgct gacgatcgct gtcgtgctcg gcgcgatgct actg 44

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agtccgtttg ttcttgtggc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agatccttgg tctcggcttg 20

Claims

1.一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物，其特征在于：所述引物序列为：

mcr-F1：5’-TTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCATC-3’，

mcr-R1：5’- ATGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTA-3’。

2.根据权利要求1所述的一种耐药基因mcr-1的RAA检测引物，其特征在于：所述引物序列还可以为：

mcr-F2：5’-TTTTTGATAAAATCAGCCAAACCTATCCCA-3’，

mcr-R2：5’- TGATTAATAGCAAAATCAACACAGGCTTTAG-3’。

3.一种耐药基因mcr-1的RAA检测探针，其特征在于：所述探针序列为：

5’-GCTTTGTGCTGACGATCGCTGTCGTGCTC(FAM-dT)(dSpacer)(BHQ1-dT)GGCGCGATGCTACTG(C3 Spacer) -3’。

4.如权利要求1所述的RAA检测引物在制备mcr-1基因RAA荧光法检测试剂盒中的应用。

5.如权利要求3所述的RAA检测探针在制备mcr-1基因RAA荧光法检测试剂盒中的应用。