CN103667426B - 转基因玉米Bt11液相芯片检测方法 - Google Patents

转基因玉米Bt11液相芯片检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种转基因玉米Bt11液相芯片检测方法，根据转基因玉米Bt11中外源基因3’端与玉米基因组DNA连接区的序列，设计出可快速检测转基因玉米Bt11的特异性引物对和探针（如Seq？ID？No.1-3所示），并在此基础上建立了液相芯片检测方法，可快速、准确地检测出转基因玉米Bt11品系。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对边境口岸的物种监测具有重要意义。

Description

转基因玉米Bt11液相芯片检测方法
技术领域
本发明涉及转基因玉米Bt11的检测，具体地说，涉及一种转基因玉米Bt11液相芯片检测方法。
背景技术
转基因玉米Bt11为兼具抗虫害及耐除草剂两种特性的品系，其转入的抗虫基因为Bt系列毒蛋白基因的Cry1Ab抗虫基因，转入的耐草丁膦除草剂基因是草丁膦乙酰转移酶基因，在我国已批准进口用作加工原料，是转基因玉米中的代表性品系。目前，一些国家要求检测进口产品中是否含有转基因成分，有的还要求查明来自哪个转基因品系，该品系是否获准进入本国，例如，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织要求对其进行标识。因此，针对性的检测转基因玉米品系就显得非常重要。目前，在基因水平上检测转基因作物的技术已有很多，如PCR、基因芯片（Microarrays）和Real-time PCR等。这些检测方法已经在日常检测工作中广泛应用。但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要建立更加特异和灵敏的高通量检测方法。
Luminex液相芯片检测技术是一种全新的快速高通量检测技术，也是唯一被美国食品与药物管理局（FDA）批准用于临床诊断的新型生物芯片产品。该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体，具有独特的优点：检测需要样本少；相对于固相芯片，反应在液态体系中进行，大大缩短检测时间；关键是可灵活检测上百种分子，满足高通量检测需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型、准确、特异性强，灵敏度高的转基因玉米Bt11液相芯片检测方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测转基因玉米Bt11的引物对和探针，所述引物对为：
正向引物Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，
反向引物Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3’；
所述探针为Bt11Probe：
NH2-C12-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3’。
本发明还提供一种含有上述引物对和探针的用于检测转基因玉米Bt11的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
更优选地，所述试剂盒还包括阳性验证探针：Biotin-5’-CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA-3’。
本发明进一步提供一种转基因玉米Bt11液相芯片检测方法，包括以下步骤：1）提取待测玉米的总DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，以上述Bt11F和Bt11R为引物，进行PCR扩增反应；同时以水为模板设置空白对照；3）将PCR产物与包被有探针Bt11Probe的微球混合孵育，反应结束后，置于液相芯片检测仪上进行分析。若检测的中位荧光值（MFI）大于空白对照的中位荧光值3倍以上，则判定该待测玉米为转基因玉米Bt11品系。
PCR反应体系以50μL计为：
PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。
前述的检测方法，步骤3）中所述微球为羧基化荧光磁性微球。
前述的检测方法，步骤3）中混合孵育的条件为：95℃5min，58℃15min。
本发明根据转基因玉米Bt11中外源基因3’端与玉米基因组DNA连接区的序列，设计出可快速检测转基因玉米Bt11的特异性引物对和探针，并在此基础上建立了液相芯片检测方法，可快速、准确地检测出转基因玉米Bt11品系。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对边境口岸的物种监测具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中利用引物Bt11F和Bt11R进行PCR扩增的结果；其中，M为DNAMarker，1-10分别为：1、Bt 176玉米基因组；2、Bt11玉米基因组；3、NK603玉米基因组；4、MON810玉米基因组；5、非转基因玉米基因组；6、转基因大豆GTS40-3-2基因组；7、非转基因大豆基因组；8、转基因棉花基因组；9、非转基因棉花基因组；10、空白对照。
图2为本发明实施例2中Bt11探针偶联54号微球的效率验证结果。
图3为本发明实施例2中液相芯片检测体系的特异性检测结果。
图4为本发明实施例2中液相芯片检测体系的灵敏度检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的操 作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1用于检测转基因玉米Bt11的PCR引物对和探针的合成
根据转基因玉米Bt11中外源基因3’端与玉米基因组DNA连接区的序列，设计引物。
1.1引物、探针的设计与合成
引物设计原则：(1)首先应该选择在核酸序列保守区域内设计特异性较高的引物；(2)一般引物长度为18-25个碱基，上下游引物的长度差别最好不超过5个碱基；(3)引物G+C含量尽可能在40％~60％之间，上下游引物之间的GC含量差值不应太大，一般不超过5；(4)引物自身不能有连续4个碱基的互补，但引物之间最好不能有超过连续4个碱基的互补；(5)3’端不可修饰并且自由能值不能过高，引物3’端碱基组成对Taq酶效率影响较大，一般应该在5’端进行修饰，如可能的话每条引物的3’端碱基应为G或C，因3’末端为A的错配率比为G/C高；（6）尽量避免引物二聚体和发卡结构的出现，能值不应超过4.5kcal/mol；（7）上下游引物的Tm值差值不应超过5℃；（8）为了使得液相芯片的杂交效率提高，引物的目的扩增片段最好为100-300bp之间；（9）下游引物5’端进行生物素标记（5′Biotin）目的是与链霉亲和素化的藻红蛋白反应；（10）带标记的单链扩增片段必须与偶联微球的捕获探针互补。
捕获探针设计原则：(1)首先探针应符合特异性强、灵敏度高的特点，液相芯片的探针长度最好为18bp~24bp左右，20bp的探针为最佳；(2)G+C含量应在40％~60％之内，且最好避免同一碱基连续重复不超过4个，否则容易出现非特异性杂交反应；(3)探针内部不应出现互补序列区域，即不应出现远远大于4的碱基反向互补配对序列，因为极易形成探针内部发卡结构，影响杂交；(4)各探针的Tm值最好保持一致，值相差越小越好，最小Tm值与最大Tm值的差值最好不要超过5℃；(5)最为重要的是：探针与其它已知的各种基因序列进行同源 性的比较，与非靶基因序列蛋白同源性不应超过70％的同源性或不应有连续8个以上碱基序列相同的情况；（6）探针必须有一定的空间与目的片段杂交，且有氨基与羧基化的荧光微球偶联，所以须在5’端进行氨基修饰的C12手臂的标记（5′Aminolinker C12）；（7）同时针对每条探针设计方向互补探针(验证探针)，且5′进行生物素标记，用于验证偶联的效率。
确定受检的转基因玉米品系，利用其在各类标准（农标、行标和国标）的引物在NCBI中BLAST搜索基因的同源序列，通过阅读匹配度为100％的每个序列的Definition来确认整体序列，然后再根据Featu res所描述的分段序列所对应的基因名称，最终找出每个转基因玉米品系的外源基因与玉米基因组之间的连接点。根据连接区域序列，利用Primer Premier 5.0，DNAMAN，DNAStar，Primer Express 3.0等软件设计并筛选了1对特异性引物、1条特异性探针和1条验证探针。下游引物和验证探针5’端进行生物素标记，捕获探针5’端进行氨基修饰的C12手臂的标记，并由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如表1所示。
表1转基因玉米Bt11液相芯片引物和探针序列
1.2引物、探针的稀释
(1)引物、捕获探针和互补探针的工作浓度分别为10μM（0.01nmol/μL）、100μM、1000μM。
（2）先根据引物和探针合成单上的质量数(nmol数)﹑分子量等计算出100μM需加水的体积(μL)。同时根据验证探针合成单上的质量 数(nmol数)﹑分子量等计算出1000μM需加水的体积(μL)。
(3)然后加入相应的水量，涡旋震荡均匀，高速离心10min，即为所需要浓度，经稀释后的捕获探针和验证探针于-20℃保存备用。
(4)然后将已稀释成100μM浓度的引物进行再次稀释，引物最终稀释成10μM浓度，-20℃保存备用。
实施例2转基因玉米Bt11液相芯片检测技术
1实验方法
1.1植物基因组DNA的提取及浓度测定
参考QIAGEN植物DNA提取试剂盒说明书，采用改进的方法，提取转基因植物产品全基因组DNA，具体方法步骤如下：
（1）首先将转基因植物产品研磨成粉末，称取50mg放入1.5mL离心管中。
（2）加入360μL缓冲液AP1和40μL蛋白酶K（20mg/mL），利用涡旋仪彻底涡旋混匀。
（3）56℃孵育1-3小时，期间轻柔地涡旋2-3次。在样品中加入4μL的RNA酶溶液(100mg/mL)，彻底混匀。室温（15-25℃）孵育5min。
（4）加入130μL缓冲液AP2，混匀，冰育5min，20000×g(14000rpm)离心5min。
（5）将试剂盒中的QIAshredderTM离心柱安装在2mL的收集管上，将上述操作的上清液转移至QIAshredderTM离心柱中，最大转速20000×g（14000rpm）离心2min。
（6）将上清转移到新的2mL的收集管中，尽量不要吸取沉淀。
（7）加入上清液1.5倍体积的Buffer AP3，混匀。
（8）将离心柱安装在新的2mL的收集管上，加入650μL的上述混匀液，≥6000×g(≥8000rpm)离心1min，弃去滤液，最后将剩下的混匀液重复此操作，弃去收集管。
（9）将离心柱安装在新的2mL的收集管上（试剂盒中），加入500 μL缓冲液AW，≥6000×g(≥8000rpm)离心1min，弃去滤液。
（10）重复操作9。
（11）将离心柱安装放置于原来的2mL的收集管上，20000×g（14000rpm）离心2min，使离心柱上的膜完全干燥，弃去滤液和收集管。
（12）将离心柱安装在新的1.5mL的离心管上，加入80μL的ddH2O至DNeasy膜上，室温孵育5min，≥6000×g(8000rpm)离心1min，洗脱DNA。
（13）为增加DNA得率，重复步骤（12）。
（14）提取的玉米基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白分析仪（ND-1000）进行质量评价，以检测基因组DNA提纯和纯化的结果是否达到纯度要求。根据琼脂糖凝胶电泳中条带亮度判断DNA的量。而微量核酸蛋白分析仪是根据测A260/A280和A260/A230比值来判断DNA的质量，根据DNA浓度来进行核酸定量。最后分装为20μL/份，-20℃保存备用。
1.2单重PCR扩增
用特异性引物分别对4种转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、转基因棉花和非转基因大豆、非转基因棉花、基因组DNA进行单重PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，2.5mM dNTP4μL，上下游引物各1μL（10μM），DNA模板1μL（100ng/μL），5U/μLEx Taq酶0.5μL，补ddH2O至50μL。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。PCR反应结束后，取5μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3PCR产物的回收纯化
（1）将PCR产物分别进行2％的琼脂糖凝胶电泳；
（2）在紫外灯照射下，从琼脂糖凝胶上快速切下所需的目的片 段，置于1.5mL Eppendorf管中，并称切下的胶块重量；
（3）胶重为0.3g时，加入300μL的结合缓冲液（XP2）（如胶重超过300mg，分管进行），于55-60℃加热混匀直至胶充分融化；
（4）将溶胶液转入试剂盒HiBind DNA柱中，室温下，10000×g离心1min，弃滤液，将剩余的溶胶液重复此操作；
（5）向HiBind DNA柱中加入300μL结合缓冲液（XP2），10000×g离心1min，弃滤液；
（6）向HiBind DNA柱中加入700μL SPW洗涤缓冲液，室温静置2min，10000×g离心1min，弃滤液；
（7）重复步骤6，弃滤液；
（8）≥13000×g离心2min，将液体离心甩干；
（9）将HiBind DNA柱转移至一新的1.5mL Eppendorf管中，在离心柱的膜中央加入30μL ddH2O或洗脱缓冲液，室温静置2min，13000×g离心1min，洗脱DNA。滤液即为回收的DNA片段，用微量核酸蛋白分析仪NanoDrop1000进行核酸浓度测定，4℃保存备用。
1.4目的基因克隆与阳性质粒的构建、测序
（1）连接
将1.3中的胶回收产物与pMD19-T载体进行连接反应。连接体系为：pMD19T载体1μL，胶回收产物4μL，含T4DNA连接酶的溶液5μL，总体系为10μL，16℃水浴连接过夜。
（2）转化
A、无菌条件下，取50μL DH5α感受态细胞于1.5mL Eppendorf管中，冰浴中融解5min，轻轻混匀，加入10μL连接产物温和混匀后于冰浴中放置30min；
B、42℃水浴，热激90s，立即移至冰上冰浴3-5min。
C、加入700μL预热至37℃的LB培养液（不含氨苄青霉素），37℃温和振荡培养（200r/min）1h，使感受态细胞恢复抗药性。
D、室温5000×g离心3min，弃600μL上清。
E、将剩余的培养液和细胞沉淀（约200μL）混匀，均匀涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)、40μL X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，20mg/mL)，7μL IPTG(异丙基硫代-B-D半乳糖苷，200mg/mL)的LB琼脂平板上。
F、正置LB琼脂平板30min后，倒置平板于37℃培养箱培养12~16h，置平皿于4℃使蓝色充分显现，进行蓝白斑筛选，挑白色菌落进行摇菌。
(3)提取质粒及测序
A.从LB平板无菌挑取白色单克隆，至5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃（200r/min）培养12-16h。
B.吸取1.5-5mL菌液于EP管中，10000×g室温离心1min，弃去上清。
C.加250μL含RNase A的溶液Ⅰ重悬菌液，涡旋震荡混匀。
D.加250μL溶液Ⅱ，轻柔混匀至液体澄清透明，室温静置2min。
E.加350μL溶液Ⅲ，立即涡旋混匀，直到出现均匀的白色絮状物。
F.≥13000×g室温离心10min。
G.将上清小心转移至装有离心柱的2mL收集管中，10000×g室温离心1min，弃滤液。
H.加入500μL缓冲液HB，10000×g室温离心1min，弃滤液。
I.加700μL DNA洗涤缓冲液，10000×g室温离心1min。
J.重复上述步骤。
K.13000×g室温离心2min，目的是将HiBind Miniprep Column离心柱甩干。
L.将甩干的柱子置于一新的1.5mL EP管中，加50μL ddH2O或洗脱缓冲液，56℃孵育10min，13000×g离心2min，收集DNA溶液。
M.为提高洗脱效率，重复步骤L。
N.滤液即为回收的DNA片段，用微量核酸蛋白分析仪NanoDrop1000进行核酸浓度测定，4℃保存备用。
O.取10μL，浓度约100ng/μL的已提取质粒，送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行序列测定。
1.5探针与微球的偶联
（1）取2支于4℃保存的新鲜EDC粉末恢复至室温（大概需要30-60min）。
（2）取浓度为1.25×107个/mL的磁性微球（即羧基化荧光磁性微球，购自伯乐上海生命科学研究发展有限公司）于涡旋仪上以最高转速悬浮混匀，然后在超声清洗仪上超声微球30s。
（3）取400μL微球至Eppendorf管中，14000rpm离心2min，弃上清。
（4）加入80μL 0.1M MES pH4.5重悬微球，漩涡振荡20s，充分混匀。
（5）加入2μL稀释好的0.1nmol/μL的捕获探针于重悬微球中，震荡以混匀。
（6）每个交联反应中加入15μL新鲜配制的EDC（10mg/mL），迅速涡旋混匀，室温中避光放置30min。
（7）每个交联反应中再次加入15μL新鲜配制的EDC（10mg/mL），迅速涡旋混匀，室温中避光放置30min。
（8）向微球中加入1mL 0.02％的Tween-20，14000rpm离心2min，弃去上清。
（9）向微球中加入1mL 0.1％的SDS重悬微球，14000rpm离心2min，弃去上清后加入100μL TE缓冲液(pH 8.0)，涡旋震荡混匀微球。
（10）将1μL微球与水进行1:100倍稀释，彻底涡旋，取10μL于血球计数器上计数，计算微球的最终浓度。
（11）将偶联好的微球转移到棕色管中，4℃保存备用。
1.6探针偶联效率的验证
（1）首先准备新鲜稀释验证探针，从1nmol/μL的储存浓度稀释成最后浓度为10fmol/μL，置于冰上备用。
（2）取出已经偶联探针的微球，震荡混匀，超声处理30s。
（3）制备混合的微球工作液，用1.5×TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/μL（每个反应共需要33μL混合微球工作液）。
（4）在标准的PCR管中，加入33μL微球的混合液。
（5）按下表2加入相应的生物素标记的验证探针和TE缓冲液，做3个复孔：
表2探针和TE缓冲液的加入量
（6）用移液枪反复吹吸充分混匀。
（7）将PCR管于PCR仪中，95℃变性5min，58℃杂交15min。
（8）新鲜配制报告缓冲液（SA-PE）：用1×TMAC杂交液将链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）配制成2μg/mL（每孔约需100μL报告缓冲液）。
（9）将PCR仪中的反应液转移至预热的96孔ELISA板中，每孔加入100μL报告缓冲液，用移液枪反复吹吸至混匀各反应孔。
（10）用膜盖上ELISA板，于杂交温度58℃孵育10min。
（11）在预先调整到杂交温度的Bio-Plex液相芯片检测仪上分析50μL样品。根据中位荧光强度值（MFI）来判断探针与微球的偶联效率。
1.7不对称PCR体系的建立及优化
根据有关不对称PCR反应特点的报道，在实验中对上下游引物浓度比例、dNTP浓度、酶量、退火温度等条件进行反复优化。由于下游引物进行了Biotin（生物素）标记，因此不对称PCR产物为生物素标记物，便于与报告缓冲液（SA-PE）反应。
1.8液相芯片检测仪的使用和结果判定标准
操作依照伯乐公司推荐的Bio-Plex 200液相芯片检测仪器的参照说明书进行。当每种磁性荧光编码微球的个数≧100个且背景空白荧光强度值＜500，表示实验是成立的，可以进行结果判定。液相芯片定性比值结果(Luminex qualitative ratio result，LQRR)等于样品的校正后的荧光强度中位值(Median florescence intensity，MFI)与空白对照MFI的平均值(MFIB)的比值，即LQRR=MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，判定为阳性样本；如果2≤LQRR≥3，则判定为可疑；如果LQRR<2，则判定为阴性。
1.9杂交及检测
（1）取偶联好探针的微球，涡旋超声约20s重悬微球。
（2）配制混合微球工作液：用1.5×TMAC杂交缓冲液将各组微球稀释至150个/μL，（每个反应管需要33μL），再次震荡涡旋、超声处理微球20s以混匀工作液。
（3）向每个反应管、空白对照管及阳性对照管中分别加入33μL混合的微球工作液。向空白对照管中加入17μL的TE缓冲液(pH 8.0)；向反应管中加入2-5μL已生物素化的PCR扩增产物，并用TE缓冲液补齐使得总加入量为17μL；向阳性对照管中加入与探针序列互补的，且5，端已生物素化标记的验证探针2μL（浓度为0.01μmol/L），再加入15μL TE缓冲液（pH 8.0），然后用移液枪充分混匀每孔。
（4）将上述各管置于PCR仪中，95℃变性5min，使PCR产物变性，58℃杂交15min。
（5）在进行第（4）步时，同时配制新鲜的报告缓冲液（SA-PE）：用1×TMAC杂交液将原浓度为1mg/mL的SA-PE配成2μg/mL。
（6）将PCR仪中的反应液转移至预热的96孔ELISA板中，每孔加入100μL报告缓冲液，用移液枪反复吹吸至混匀各反应孔。
（7）用膜盖上ELISA板，于杂交温度58℃孵育10min。
（8）在预先调整到杂交温度的Bio-Plex液相芯片检测仪上分析50μL样品。根据中位荧光强度值（MFI）来判断杂交效率。
1.10液相芯片杂交条件的优化
由于本实施例中所用的6.5μm的磁性荧光编码微球直接进口购买，且仪器的操作说明、捕获探针与微球的偶联、结果判读都是参照Bio-Plex公司的规定进行，需要改进的空间并不大。因此本实施例中将液相芯片检测体系建立的重点放在各种条件的优化上。探针杂交的最佳条件就是既能保证杂交的特异性，又能在适当的速率下形成稳定的杂交体。通过查阅文献，本实施例分别对下列条件进行了优化。
1.10.1不对称PCR反应中，上下游引物比例的优化
不对称PCR反应中，按照不同的上下游比例（1:1，1:2，1:4，1:6，1:8，1:10）进行PCR反应，然后用液相芯片仪进行杂交检测，进而确定适合液相芯片杂交的最佳比例。
1.10.2杂交反应体系中PCR产物体积的优化
体系中PCR产物的体积对杂交效率有明显的影响，最佳的PCR产物体积量是用最少的PCR产物达到最佳的杂交效率，很好的区分阴阳性。过多或过少都会产生不良的结果。本实施例中，分别以5个不同的探针为研究对象，对体系中PCR产物的体积进行优化，其他条件完全相同。选定0.265μL、0.531μL、1.062μL、2.125μL、4.25μL、8.5μL和17μL等7个稀释梯度为研究对象，考察体系中不同体积的PCR产物下液相芯片的检测效果。
1.10.3杂交温度的优化
温度对杂交效果有明显的影响，选择最适当的杂交温度可以增强特异性杂交，降低非特异性杂交的荧光强度。本实施例中，分别以5个不同的探针为研究对象，根据探针的Tm值，选定50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃等6个温度梯度为研究对象，其他条件完全相同，考察不同杂交温度下液相芯片的检测效果，以确定最佳的杂交温度。
1.10.4杂交时间的优化
为达到杂交效果好，杂交时间短的目的，在反应体系完全相同的条件下，本实施例中对杂交时间进行了优化，将杂交温度设为58℃，分别杂交10min、15min、20min、25min、30min和35min，对5种PCR产物进行检测，以考察不同杂交时间下液相芯片的检测效果，确定最佳的杂交时间。
1.11目标基因液相芯片检测体系的建立
在1.9操作的基础上，采用优化好的上下游引物比例、最佳的PCR产物体积、杂交温度以及杂交时间，最终确立整个液相芯片检测体系。
1.12重复性实验
提取转基因玉米Bt11（100％）的基因组DNA，并将其稀释到100ng/μL备用。用建立的PCR反应体系对目的基因进行PCR扩增，然后在完全相同的条件下，用所建立的液相芯片体系进行三次检测，计算变异系数（CV），用以验证该方法的重复性。
1.13特异性实验
在相同条件下，将转基因玉米Bt176、转基因玉米Bt11、转基因玉米NK603、转基因玉米MON810、非转基因玉米、非转基因大豆、转基因大豆（Glycime max）GTS40-3-2、转基因棉花和非转基因棉花的基因组样品按照2.9进行PCR，然后对扩增产物进行xMAP悬浮芯片检测，以判断整个体系对非目标转基因玉米有无检测信号，检验该方法的特异性程度。
1.14敏感性实验
由于转基因玉米标准品量少，本实施例中用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit分别提取70mg的转基因玉米Bt11(100％)与非转基因玉米的基因组DNA，并用紫外分光光度计测定浓度和纯度，最终用分子生物级水将基因组DNA分别稀释到50ng/μL备用。将转基因玉米Bt11的DNA与非转基因玉米的DNA以不同比例稀释，从而得出转基因玉米DNA/非转基因玉米DNA的百分比为100％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％，以此为模板进行PCR扩增，扩增结果分别用凝胶电泳和悬浮芯片杂交分析，确定该方法的灵敏度。
2实验结果
2.1特异性引物的PCR检测结果
提取的植物基因组DNA经微量核酸蛋白分析仪测定，结果显示A260/A280均在1.8-2.0之间，表明用QIAGEN植物DNA提取试剂盒进行基因组DNA提纯和纯化的结果达到纯度要求。
特异性引物扩增结果显示，仅在转基因玉米Bt11中能扩增出207bp的目的片段，片段大小与预期结果一致（图1）。而在转基因玉米Bt176、NK603、MON810、转基因大豆GTS40-3-2、非转基因大豆、转基因棉花和非转基因棉花中都没有上述目的片段的存在，通过用特异性的引物进行扩增，可以初步确定为转基因玉米Bt11品系。
将提取的质粒送北京诺赛基因组测序中心进行测序，用DNAMAN软件将测序结果与NCBI序列比对，结果证实序列相似性度基本达100％。
2.2色标微球上探针偶联效率的验证
用与探针反向互补并经生物素标记的验证探针作为阳性对照（PC），0fmol~200fmol系列稀释后与偶联微球的捕获探针杂交，检测偶联的效率，结果见图2。结果显示针对目的基因的PC和捕获探针均 具有较高的杂交信号，且荧光信号随着验证探针浓度的升高逐渐上升，表明微球与探针偶联成功。
2.3重复性试验
提取转基因玉米Bt11（100％）的基因组DNA，并将其稀释到100ng/μL备用。用建立的PCR反应体系对目的基因进行PCR扩增，然后在完全相同的条件下，用所建立的液相芯片体系进行三次检测，用以验证该方法的重复性，检测结果见表3。结果显示，目的基因检测的变异系数均在10％以内，表明该方法具有良好的可重复性。
表3液相芯片检测体系的重复性验证
2.4特异性试验
悬浮芯片检测方法的特异性是建立在引物特异性与探针特异性的基础上。分别以9种转基因作物基因组DNA为模板，用所设计引物进行不对称PCR扩增，反应后进xMAP液相芯片检测，用以验证本方法的检测特异性。结果如图3所示。结果表明，用特异性的引物扩增都能扩增出阳性的目的条带，表明引物特异性好。对转基因玉米Bt11的xMAP液相芯片检测结果均为阳性，而对于非目的品系的扩增产物的检测值均为阴性。由此说明建立的液相芯片检测方法特异性很好，方法成立。
2.5灵敏度试验
将100％的转基因玉米Bt11与非转基因玉米的DNA以不同比例稀释，从而得出转基因玉米DNA／非转基因玉米DNA的百分比为100％、 5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％，以此为模板进行PCR扩增，扩增结果分别用凝胶电泳和悬浮芯片杂交分析，确定该方法的灵敏度。液相芯片检测结果（图4）显示，随着转基因玉米DNA的稀释比例增加，中位荧光强度（MFI）逐渐减弱，但显示仍为阳性，该方法检测Bt11品系转基因玉米时，检测灵敏度可达0.01％，与路兴波等（路兴波,武海斌,王敏,等.转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制.作物学报,2009,35（8）:1432-1438）报道的固相芯片检测转基因玉米品系基本一致，但是整个实验时间短，2h即可完成。而常用的PCR检测灵敏度只能达到0.1％。因此，液相芯片在转基因作物检测方面有很大的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种转基因玉米Bt11液相芯片检测方法，其特征在于，检测过程中使用如下用于检测转基因玉米Bt11的引物对和探针，
所述引物对为：
正向引物Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，
反向引物Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3；’
所述探针为：NH2-C12-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3’。
2.一种试剂盒，其特征在于，包含如下用于检测转基因玉米Bt11的引物对和探针，
所述引物对为：
正向引物Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，
反向引物Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3’；
所述探针为：NH2-C12-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3’；
所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种；还包括标准阳性模板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性验证探针：Biotin-5’-CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA-3’。
4.一种转基因玉米Bt11液相芯片检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测玉米的总DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，Bt11F和Bt11R为引物，进行PCR扩增反应；
3)将PCR产物与包被有探针的微球混合孵育，反应结束后，置于液相芯片检测仪上进行分析；
所述引物序列为：
Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，
Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3’；
所述探针为：NH2-C12-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，PCR反应体系以50μL计为：
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中所述微球为羧基化荧光磁性微球。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中混合孵育的条件为：95℃5min，58℃15min。
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