CN104561366A - 利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法 - Google Patents

利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法 Download PDF

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Abstract

利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法，本发明使用单列流体通道包含反应孔腔数目不少于20、通道不少于3列的微流体芯片进行检测，每一列流体通道的反应孔腔中分别预先包埋SEQ ID No.1～60的20组特异性引物探针组合物。本发明将TaqMan Array Card微流体芯片检测技术应用于转基因玉米品系高通量筛查检测。在一次PCR扩增过程中，同时完成2个玉米内源基因以及18个外源重组品系的筛查检测，检测灵敏度可达1％。与单重检测方法相比，在一次PCR扩增反应中检测内源基因和外源基因，可有效保证因为实验操作失误可能引起的误差；可实现多样品，多基因靶点的高通量筛查检测。

Description

利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及含转基因成分玉米的高通量筛查方法。
背景技术
玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。
目前，转基因玉米成分检测方法主要为TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐，污染环境、灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是单通道TaqMan实时荧光PCR法检测成本较高，步骤繁琐，不适合于转基因产品的多品系筛查检测，尤其对于业务量大的检测部门。因此，继续开发新的技术来解决这一问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单快捷、灵敏准确同时又省时省力的针对多种转基因玉米进行高通量筛查的方法。
本发明首先提供一种利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法，所述方法使用单列流体通道包含反应孔腔数目不少于20、通道不少于3列的微流体芯片进行检测，每一列流体通道的反应孔腔中分别预先包埋下述特异性引物探针组合物：
(1)针对转基因玉米TC 1507的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.1]:FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-MGB
上游引物[SEQ ID No.2]:AGTAGTCTTCGGCCAGAATGG
下游引物[SEQ ID No.3]:TCAAATATCTTTGCCAAGATCAAGCG
(2)针对转基因玉米NK 603的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.4]:FAM-ACGCGACACACTTCCACTC-MGB
上游引物[SEQ ID No.5]:ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA
下游引物[SEQ ID No.6]:AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT
(3)针对转基因玉米MON 87640的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.7]:FAM-ATTTTCAAAGCGTTAGACGGC-MGB
上游引物[SEQ ID No.8]:CTCTCACGTTGAAGGAAAATGGATTG
下游引物[SEQ ID No.9]:TCGCGATCCTCCTCAAAGAC
(4)针对转基因玉米MON 863的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.10]:FAM-CATCCGAACAAGTAGGGTCA-MGB
上游引物[SEQ ID No.11]:AGTAGGATCGGAAAGCTTGGTACA
下游引物[SEQ ID No.12]:TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT
(5)针对转基因玉米MON 810的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.13]:FAM-ATCCTTTGCCATTGCCCAGC-MGB
上游引物[SEQ ID No.14]:TCGAAGGACGAAGGACTCTAAC
下游引物[SEQ ID No.15]:GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT
(6)针对转基因玉米MIR 162的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.16]:FAM-CCGGGTCTAGACAATTCAGTACA-MGB
上游引物[SEQ ID No.17]:GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG
下游引物[SEQ ID No.18]:TGCCTTATCTGTTGCCTTCAGA
(7)针对转基因玉米MIR 604的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.19]:FAM-AAACGACAATCTGATCATGAGC-MGB
上游引物[SEQ ID No.21]:GCGCACGCAATTCAACAG
下游引物[SEQ ID No.21]:GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT
(8)针对转基因玉米LY 038的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.22]:FAM-ATCCGAGCGGAGTTTAT-MGB
上游引物[SEQ ID No.23]:TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT
下游引物[SEQ ID No.24]:GCTGCAGGAATTCGATATCAAGCT
(9)针对转基因玉米GA21的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.25]:FAM-ATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGG-MGB
上游引物[SEQ ID No.26]:GCTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA
下游引物[SEQ ID No.27]:TGGCTCGCGATCCTCCT
(10)针对转基因玉米DAS 40278-9的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.28]:FAM-TAGCTAACCTTCATTGTATTCCG-MGB
上游引物[SEQ ID No.29]:CAGCACGAACCATTGAGTTACAATCA
下游引物[SEQ ID No.30]:TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTGC
(11)针对转基因玉米Bt176的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.31]:FAM-CCAGATCGGCCGACACC-MGB
上游引物[SEQ ID No.32]:GCCGTGAACGAGCTGTT
下游引物[SEQ ID No.33]:GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA
(12)针对转基因玉米Bt11的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.34]:FAM-TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-MGB
上游引物[SEQ ID No.35]:TGTGTGGCCATTTATCATCGACT
下游引物[SEQ ID No.36]:CGCTCAGTGGAACGAAAACTC
(13)针对转基因玉米98140的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.37]:FAM-CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATA-MGB
上游引物[SEQ ID No.38]:GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT
下游引物[SEQ ID No.39]:GATTGTCGTTTCCCGCCTTC
(14)针对转基因玉米59122的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.40]:FAM-ACTGAAGGCGGGAAAC-MGB
上游引物[SEQ ID No.41]:GGATAAGCAAGTAAAAGCGCTCA
下游引物[SEQ ID No.42]:CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAGA
(15)针对转基因玉米3272的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.43]:FAM-CTGCTGACTGCTGACGC-MGB
上游引物[SEQ ID No.44]:TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGGC
下游引物[SEQ ID No.45]:CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAA
(16)针对转基因玉米MON 88017的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.46]:FAM-TCCCGCCTTCAGTTTAAACAGAGTCGGGT-TAMRA
上游引物[SEQ ID No.47]:GAGCAGGACCTGCAGAAGCT
下游引物[SEQ ID No.48]:TCCGGAGTTGACCATCCA
(17)针对转基因玉米T25的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.49]:FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA
上游引物[SEQ ID No.50]:ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC
下游引物[SEQ ID No.51]:GACATGATACTCCTTCCACCG
(18)针对转基因玉米MON 89034的特异性引物探针组：
探针[SEQ ID No.52]:FAM-CATCCCCGGAAATTATGTT-MGB
上游引物[SEQ ID No.53]:CGTTCTCCATATTGACCATCATACTCATT
下游引物[SEQ ID No.54]:GCCGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTA
(19)玉米内源基因hmg：
探针[SEQ ID No.55]:FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-MGB
上游引物[SEQ ID No.56]:TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA
下游引物[SEQ ID No.67]:GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT
(20)玉米内源基因Adh1：
探针[SEQ ID No.58]:VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA
上游引物[SEQ ID No.59]:CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC
下游引物[SEQ ID No.60]:CCACTCCGAGACCCTCAGTC
作为优选的方式，本发明的检测方法中，所述的微流体芯片是包埋了特异性引物探针组合物的384孔TaqMan微流体芯片。TaqMan微流体芯片是一种384孔板结构的实时荧光定量PCR反应板。注塑而成的384孔板上分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1uL的微孔。在本发明的技术方案中，每个微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的TaqMan探针。本发明中所用的所有探针都含荧光标记，FAM或VIC。
本方法中所涉及的微流体芯片可同时检测8个样品，可设置为7个样品和一个阴性对照样品，或者6个样品和一个阴性对照样品和一个阳性对照样品；优选后者。
进一步具体的优选方式中，本发明所述的利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法包括如下步骤：
(1)将特异性引物探针组合物预先包埋于384孔TaqMan微流体芯片的反应孔腔中；
(2)提取待测玉米样品的DNA，制备待检DNA样品，同时设阳性对照和阴性对照各1组；
(3)将待检DNA样品加入微流体芯片加样孔，离心分配反应液后，封闭反应腔室，并按照如下条件反应：50℃2min；95℃10min；95℃15sec,60℃1min,40个循环；
(4)反应结束后，对比阳性对照和阴性对照判读结果。
使用本发明所述的方法，TaqMan微流体芯片检测技术应用于转基因玉米品系筛查检测，在一次PCR扩增过程中，同时完成包括2个玉米内源基因(hmg和adh基因)，以及TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25及LY 038等18个外源重组品系的筛查检测。与单重检测方法相比，在一次PCR扩增反应中检测内源基因和外源基因，可有效保证因为实验操作失误可能引起的误差；可实现多样品，多基因靶点的高通量筛查检测。并且检测用时短，5分钟可以完成上样，无需复杂的微量液体移动装置，操作简便，省时省力；标准化程度高，消除系统误差，利于检测结果的多向比较。
附图说明
本发明附图1幅，为实施例1的转基因玉米高通量筛查微流体芯片结构示意图。
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明的内容进一步说明，但不应理解为对本发明任何形式的限制。如无特殊说明，本发明中所述的主要材料来源包括：
T25、MON88017、MON87640、MON89034、MIR162转基因标准物质购买自American Oil Chemists’Society(AOCS,Urbana,USA)。
TC1507、NK603、MON863、MON810、GA21、DAS40278-9、BT176、BT11、98140、59122、3272、MIR604及LY 038转基因标准物质购买自Sigma公司(SigmaAldrich，中国)。
16种转基因玉米阳性样品收集自日常检验中获得的阳性样品。
实施例1.
(1)微流体芯片设计
微流体芯片Array Cards，TAC(AppliedThermoFisher Scientific Inc.,Foster City,CA)是一种384孔板结构的实时荧光定量PCR反应板。注塑而成的384孔板上分16列，每两列共享一个加样通道，每通道包含48个体积为1uL的空腔。微孔预先包埋上针对检测靶标而设计的DNA引物对和对应的探针(如表1)。实验中所用的所有探针都含荧光标记，FAM或VIC。本发明设计为同时检测6个样品和一个阴性对照样品和一个阳性对照样品。
此外，芯片中还包括针对玉米内源基因hmgA和adh1的检测引物探针组。
表1：微流体芯片的特异性引物和探针序列
将上述表1的特异性引物和探针序列包埋至384孔微流体芯片的微孔内，在芯片上的排布方式如附图1所示。
(2)样品基因组DNA提取
将待测的实验材料放入液氮中研磨。采用TaKaRa公司的DNA extraction kit ofgenetically modified organism(GMO)detection Ver 2.0(No.D9093；TaKaRa,Dalian,China)试剂盒进行基因组DNA的提取。提取的基因组DNA溶于100μL Tris-EDTA(TE)溶液中。纯化后的DNA样品用紫外分光光度计(ND-1000；Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)测定浓度。
(3)样品检测
将步骤(2)所制备的80ng样品基因组DNA、2ⅹEvironmental MasterMix2.050μl和超纯水混合为100μl预混液后，将该溶液直接加入步骤(1)所制备的微流体芯片的加样孔中。将微流体芯片放入AppliedArray Card专用的离心适配器中，在331g(参照SorvallTMLegendTMT(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham,MA)的吊桶式转头75006445，约1200rpm)下离心两次，每次1分钟，使PCR反应液均匀地分配到384个PCR反应腔中。把待封口的芯片按照指定朝向放入封口器，将芯片上各反应腔体的通路封闭，形成384个彼此独立的反应室。
然后在下述条件下进行反应：
50℃2min；95℃10min；95℃15sec,60℃1min,40个循环。
(4)判定检测结果
待测样品外源基因检测Ct值大于或等于40，内源基因检测Ct值小于或等于28，设置的对照结果正常者，则可判定该样品未检出目标转基因玉米品系；
待测样品外源基因检测Ct值小于或等于35，内源基因检测Ct值小于或等于28，设置的对照结果正常者，则可判定该样品检出目标转基因玉米品系；
待测样品外源基因检测Ct值在35～40之间，应适当增加模板量，重做TaqMan微流体芯片实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出目标转基因玉米品系；再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，可判定该样品未检出目标转基因玉米品系。
实施例2.微流体芯片检测特异性与灵敏度试验
(1)特异性测试
采用T25、MON88017、MON87640、MON89034、MIR162、TC1507、NK603、MON863、MON810、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MIR604、LY038等18种转基因标准品进行品系间交叉反应试验，验证引物和探针的特异性。同时也采用非转基因玉米样品进行特异性的验证。
特异性试验中，反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec,60℃1min,40个循环。
(2)灵敏度试验
采用一系列不同浓度的T25、MON88017、MON87640、MON89034、MIR162、TC1507、NK603、MON863、MON810、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MIR604、LY038等18种转基因标准品进行灵敏度试验，确定TAC流体芯片最低检测浓度。
(3)测试结果
试验结果显示，18种转基因标准品检测灵敏度能够达到1％，其中13种检测灵敏度能够达到检出0.1％含量的转基因成分。结果如表2所示。
其中，灵敏度检测结果列“灵敏度1％/灵敏度0.1％”的“x”标记表示该品系检测达到该灵敏度要求。特异性检测结果列“x”表示无假性结果，有很好的特异性。
表2：微流体芯片检测特异性与灵敏度测试结果
序号 品系 灵敏度1％ 灵敏度0.1％ Not react w/NON-GMO
1 3272 ⅹ ⅹ
2 59122 ⅹ ⅹ ⅹ
3 98140 ⅹ ⅹ ⅹ
4 BT11 ⅹ ⅹ
5 Bt176 ⅹ ⅹ
6 DAS-40278-9 ⅹ ⅹ ⅹ
7 GA21 ⅹ ⅹ ⅹ
8 MIR162 ⅹ ⅹ ⅹ
9 MIR604 ⅹ ⅹ ⅹ
10 MON810 ⅹ ⅹ ⅹ
11 MON863 ⅹ ⅹ
12 MON87460 ⅹ ⅹ ⅹ
13 MON88017 ⅹ ⅹ ⅹ
14 MON89034 ⅹ ⅹ ⅹ
15 NK603 ⅹ ⅹ
16 T25 ⅹ ⅹ ⅹ
17 TC1507 ⅹ ⅹ ⅹ
18 LY 038 ⅹ ⅹ
本试验中，采用2个玉米内源基因(adh1基因和hmg基因)作为DNA提取和扩增效果的控制参照。玉米内源基因(adh1基因和hmg基因)的扩增情况可以反映出DNA提取效率和其中玉米组分基因片段的状态。
实施例3.实际样品检测试验
采用实施例1所建立的方法对玉米粉、玉米粒、膨化玉米粉、玉米酒糟粕等16种样品进行玉米品系的筛查检测。
同时采用转基因检测的实时荧光PCR方法(SN/T1196—2012)对结果进行验证。所有单一的实时荧光PCR反应均在AB7900HT实时荧光PCR仪上进行。每个反应包括：Universal PCR Master Mix(2×)12.5μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，探针(5μmol/L)1μL，DNA模板(40ng/μL～50ng/μL)2μL，ROX DyeII 0.5μL，补ddH2O至25μL。实时荧光PCR的反应参数为：预变性95℃30s；95℃5s,60℃34s，40个循环。
检测结果如表3所示：可见，TAC流体芯片方法的检测结果与实时荧光PCR方法的结果完全吻合。结果如表3所示。
表3.16种玉米样品TAC微流体芯片检测与实时荧光PCR结果比对
品系 微流体芯片法 Real-time PCR 符合率
hmgA 16/16 16/16 100
Adh1 16/16 16/16 100
TC1507 12/16 12/16 100
NK603 10/16 10/16 100
MON87460 0/16 0/16 100
MON863 0/16 0/16 100
MON810 10/16 10/16 100
MIR162 0/16 0/16 100
LY038 0/16 0/16 100
GA21 4/16 4/16 100
DAS40278 0/16 0/16 100
Bt176 0/16 0/16 100
Bt11 9/16 9/16 100
98140 0/16 0/16 100
59122 9/16 9/16 100
3272 0/16 0/16 100
MON89034 7/16 7/16 100
MIR604 9/16 9/16 100
MON88017 13/16 13/16 100
T25 0/16 0/16 100

Claims (3)

1.利用微流体芯片高通量检测转基因玉米的方法，其特征在于，使用单列流体通道包含反应孔腔数目不少于20、通道不少于3列的微流体芯片进行检测，每一列流体通道的反应孔腔中分别预先包埋下述特异性引物探针组合物：
(1)针对转基因玉米TC 1507的特异性引物探针组：
探针：FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-MGB
上游引物：AGTAGTCTTCGGCCAGAATGG
下游引物：TCAAATATCTTTGCCAAGATCAAGCG
(2)针对转基因玉米NK 603的特异性引物探针组：
探针：FAM-ACGCGACACACTTCCACTC-MGB
上游引物：ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA
下游引物：AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT
(3)针对转基因玉米MON 87640的特异性引物探针组：
探针：FAM-ATTTTCAAAGCGTTAGACGGC-MGB
上游引物：CTCTCACGTTGAAGGAAAATGGATTG
下游引物：TCGCGATCCTCCTCAAAGAC
(4)针对转基因玉米MON 863的特异性引物探针组：
探针：FAM-CATCCGAACAAGTAGGGTCA-MGB
上游引物：AGTAGGATCGGAAAGCTTGGTACA
下游引物：TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT
(5)针对转基因玉米MON 810的特异性引物探针组：
探针：FAM-ATCCTTTGCCATTGCCCAGC-MGB
上游引物：TCGAAGGACGAAGGACTCTAAC
下游引物：GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT
(6)针对转基因玉米MIR 162的特异性引物探针组：
探针：FAM-CCGGGTCTAGACAATTCAGTACA-MGB
上游引物：GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAG
下游引物：TGCCTTATCTGTTGCCTTCAGA
(7)针对转基因玉米MIR 604的特异性引物探针组：
探针：FAM-AAACGACAATCTGATCATGAGC-MGB
上游引物：GCGCACGCAATTCAACAG
下游引物：GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT
(8)针对转基因玉米LY 038的特异性引物探针组：
探针：FAM-ATCCGAGCGGAGTTTAT-MGB
上游引物：TGGGTTCAGTCTGCGAATGTT
下游引物：GCTGCAGGAATTCGATATCAAGCT
(9)针对转基因玉米GA21的特异性引物探针组：
探针：FAM-ATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGG-MGB
上游引物：GCTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA
下游引物：TGGCTCGCGATCCTCCT
(10)针对转基因玉米DAS 40278-9的特异性引物探针组：
探针：FAM-TAGCTAACCTTCATTGTATTCCG-MGB
上游引物：CAGCACGAACCATTGAGTTACAATCA
下游引物：TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTGC
(11)针对转基因玉米Bt176的特异性引物探针组：
探针：FAM-CCAGATCGGCCGACACC-MGB
上游引物：GCCGTGAACGAGCTGTT
下游引物：GGGAAGAAGCCTACATGTTTTCTAA
(12)针对转基因玉米Bt11的特异性引物探针组：
探针：FAM-TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-MGB
上游引物：TGTGTGGCCATTTATCATCGACT
下游引物：CGCTCAGTGGAACGAAAACTC
(13)针对转基因玉米98140的特异性引物探针组：
探针：FAM-CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATA-MGB
上游引物：GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT
下游引物：GATTGTCGTTTCCCGCCTTC
(14)针对转基因玉米59122的特异性引物探针组：
探针：FAM-ACTGAAGGCGGGAAAC-MGB
上游引物：GGATAAGCAAGTAAAAGCGCTCA
下游引物：CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAGA
(15)针对转基因玉米3272的特异性引物探针组：
探针：FAM-CTGCTGACTGCTGACGC-MGB
上游引物：TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGGC
下游引物：CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAA
(16)针对转基因玉米MON 88017的特异性引物探针组：
探针：FAM-TCCCGCCTTCAGTTTAAACAGAGTCGGGT-TAMRA
上游引物：GAGCAGGACCTGCAGAAGCT
下游引物：TCCGGAGTTGACCATCCA
(17)针对转基因玉米T25的特异性引物探针组：
探针：FAM-TCATTGAGTCGTTCCGCCATTGTCG-TAMRA
上游引物：ACAAGCGTGTCGTGCTCCAC2 -->
下游引物：GACATGATACTCCTTCCACCG
(18)针对转基因玉米MON 89034的特异性引物探针组：
探针：FAM-CATCCCCGGAAATTATGTT-MGB
上游引物：CGTTCTCCATATTGACCATCATACTCATT
下游引物：GCCGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTA
(19)玉米内源基因hmg：
探针：FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-MGB
上游引物：TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA
下游引物：GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT
(20)玉米内源基因Adh1：
探针：VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA
上游引物：CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC
下游引物：CCACTCCGAGACCCTCAGTC。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微流体芯片是包埋了特异性引物探针组合物的384孔TaqMan微流体芯片。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将特异性引物探针组合物预先包埋于384孔TaqMan微流体芯片的反应孔腔中；
(2)提取待测玉米样品的DNA，制备待检DNA样品，同时设阳性对照和阴性对照各1组；
(3)将待检DNA样品加入微流体芯片加样孔，离心分配反应液后，封闭反应腔室，并按照如下条件反应：50℃2min；95℃10min；95℃15sec,60℃1min,40个循环；
(4)反应结束后，对比阳性对照和阴性对照判读结果。
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