CN110643693A

CN110643693A - RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN110643693A
Application number: CN201910960374.0A
Authority: CN
Inventors: 袁静; 李少丽; 赵汉青; 冯燕玲; 薛冠华; 闫超; 崔晶花
Original assignee: Capital Institute of Pediatrics
Current assignee: Capital Institute of Pediatrics
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2020-01-03

Abstract

本发明公开了一种RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明公开了用于对Mcr进行RAA检测的专用引物、探针，以及试剂盒和检测方法；具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点，只需在37～42℃条件下反应5～20min便可分析结果；对未来检测Mcr传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

Description

RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

碳青霉烯耐药肠杆菌科感染已在全球范围内蔓延，使得包括粘菌素在内的多粘菌素成为“最后的治疗手段”。然而，在过去的十年里，世界上对多粘菌素的耐药率不断增加，这可能部分是由于它在人类和兽医学中的不合理使用。在人类和环境中，可转移的多粘菌素抗性基因Mcr的传播促进了多粘菌素抗性的传播。粘菌素耐药性的出现增加了无法治疗的感染的可能性。截止目前，已经在亚洲、非洲、欧洲、美洲、拉丁美洲等超过48个国家和地区相继发现携带有Mcr耐药基因的菌株。这些菌株不仅来自于人和动物，还有从食物和环境中分离到的菌株。多粘菌素耐药性的广泛存在，构成了一种全球性威胁，对人类的健康和发展构成灾难性风险，因此迫切需要开展强有力的Mcr耐药性监测和控制。

目前对Mcr基因进行检测的方法主要有PCR联合测序法、real-time PCR法、LAMP法、侧向流动免疫测定法(LFIA)、宏基因组测序或全基因组测序法、质谱法等。但是这些方法费时、费力或者需要昂贵的设备和具有高度技术专长的人员。然而，对现场进行长期监测，以预测MCR未来的流行和传播，或对现场怀疑有生物恐怖行为的样本进行调查，都需要一种简单、快速和有效的诊断方法。

因此，提供一种RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法，检测快速、灵敏、操作简便。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

RAA荧光法检测Mcr的引物，所述引物序列如下：

Mcr-F：5’-CGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGC-3’；SEQ ID NO.2；

Mcr-R：5’-CTTACGCATATCAGGCTTGGTTGCTTGTACCGC-3’；SEQ ID NO.3。

进一步，RAA荧光法检测Mcr的探针，其特征在于，所述探针序列如下：

5’-GCCAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCAG(FAM-dt)(THF)(BHQ-dt)TGAGTATAAAAAAGC-3’-block(在3’端阻断延伸)。

进一步，一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物Mcr-F和Mcr-R，以及上述探针。

进一步，所述引物Mcr-F和Mcr-R的终浓度分别为0.42pM/μL，所述探针的终浓度分别为0.24pM/μL。

进一步，所述试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。

RAA基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是F00001(商品货号)的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。

进一步，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为450mM，pH7.6的Tris-HCl缓冲液；浓度为260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000。

反应缓冲液在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了更方便检测，可以预先将探针和引物包含在反应缓冲液中，反应缓冲液可包括：使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer(pH7.6)；260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000，终浓度为0.24pM/μL的探针，和终浓度为0.42pM/μL的Mcr-F和Mcr-R，余量为作为溶剂的水。

进一步，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

进一步，所述阳性质控品为含Mcr-1基因的大肠杆菌DNA，使用浓度为1.0×10⁴Copies/μl；也可以选择高于此浓度的任意一个浓度作为阳性质控品；所述阴性质控品为不含Mcr基因的大肠杆菌DNA的RAA扩增体系(如双蒸水)。

进一步，一种RAA荧光法检测Mcr的方法，在37～42℃条件下反应5～20min。

本发明的重组酶介导等温核酸扩增(RAA)是一种新的等温扩增和检测方法，其使用指定的引物、探针和特定模板混合，并利用特异性酶和蛋白质，可以实现在等温(37-42℃)条件下30min以内完成等温扩增检测病原菌，具有高灵敏度、高特异性和极高效率。RAA的酶混合物包括单链DNA结合蛋白(SSB)、重组酶UvsX和DNA聚合酶，其中重组酶UvsX是从大肠杆菌中提取的。RAA利用UvsX对模板DNA和SSB退火引物，形成D-环结构，用DNA聚合酶保持扩增和延伸的模板DNA的单链状态。RAA分析可以使用荧光探针系统实时检测DNA扩增子，其扩增子的检测依赖于使用具有DT荧光团两侧的内部碱基模拟物(四氢呋喃，THF)和相应的DT淬灭基团的寡核苷酸探针。只有当探针与其互补的靶序列结合时，THF位置才被核酸外切酶III识别和切割，从而分离荧光团和淬灭剂并积累荧光信号。

本发明基于以上原理，经过探索，提供一种特异性和灵敏度较高的RAA荧光检测Mcr的专用探针和专用引物，并提供一种检测快速、灵敏、操作简便的RAA荧光检测试剂盒和检测方法。提供的方法不需要专门的或昂贵的设备，而且只需要简单和廉价的水浴或加热块，因此更适合于现场应用，特别是在贫困地区。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法，检测快速、灵敏、操作简便，对未来检测Mcr基因具有非常重要的意义；本发明具有以下有益效果：

(1)本发明解决了现有技术Mcr检测方法中费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题；本发明采用RAA技术，克服了以上缺点，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点，只需在37～42℃(较佳为39℃)下反应5～20min便可分析结果；对未来检测MCR传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

(2)本发明利用RAA技术能够快速检测Mcr，尤其可用于检测DNA含量较低的样品，对检测材料质量要求低；操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选；并且可用于基层医疗卫生单位筛查和检测MCR，指导临床诊疗和预后，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明RAA荧光检测Mcr的灵敏度结果；

其中1、2、3、4、5、6、7分别代表1.0×10⁸copies/mL、1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10²copies/mL的含Mcr大肠杆菌基因组；8是ddH₂O；

图2附图为本发明RAA荧光检测Mcr的特异度结果；

其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分别代表Mcr阳性的大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假嗜单胞菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌、幽门螺旋杆菌、李斯特菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌和ddH₂O。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

根据Mcr基因特异性的保守靶序列(GenBank Accession NO.KP347127)设计用于对Mcr基因进行RAA检测的引物，用以定性、定量检测人、畜或其它待测样品中的Mcr基因。Mcr基因特异性的保守靶序列如下所示：

CGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGCATAAGCCGCTGCGTAGCTATGTCAATCCGATCATGCCAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCAGTATTGAGTATAAAAAAGCCAGTGCGCCAAAAGATACCATTTATCACGCCAAAGACGCGGTACAAGCAACCAAGCCTGATATGCGTAAG；SEQ ID NO.1。

设计获得的引物序列如下：

Mcr-F：5’-CGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGC-3’；SEQ ID NO.2；

Mcr-R：5’-CTTACGCATATCAGGCTTGGTTGCTTGTACCGC-3’；SEQ ID NO.3。

采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ)修饰探针；修饰后的探针为：

5’-GCCAATCTACTCGGTGGGTAAGCTTGCCAG(FAM-dt)(THF)(BHQ-dt)TGAGTATAAAAAAGC-3’-block。

荧光报告基团FAM修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团BHQ修饰在探针序列离5’端碱基数33bp的位置上，其中离5’端碱基数32bp的位置上的碱基用四氢呋喃残基替换。

实施例2含Mcr基因大肠杆菌基因组DNA提取

用QIAamp DNA mini Kit提取细菌基因组DNA，具体提取方法包括以下步骤：

(1)取菌液400μl放入1.5ml离心管中，8000g离心1分钟，去上清，留沉淀，用移液器加入180μl ATL和20μl Proteinase K，立即涡旋振荡，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体，56℃孵育30min；

(2)向(1)中1.5ml离心管中加入200μl buffer AL，立即涡旋振荡15s；

(3)在70℃孵育10min；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

(4)加入200μl无水乙醇，涡旋15sec充分混匀；然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；

(5)将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spin column中，将离心柱放入2ml收集管中；盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min；

(6)将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)；丢弃含有液体的收集管；小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp Mini spin column中。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。

(7)将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)；丢弃含有液体的收集管；小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp Mini spin column中；盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min；将离心管取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)；丢弃含有液体的收集管；

(8)推荐：将QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃含有液体的收集管；全速离心1min；尽可能的去除buffer AW2，buffer AW2残留可能会对后续实验造成影响；

(9)将QIAamp Mini spin column置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃含有液体的收集管；小心在QIAamp Mini spin column中加入200μl Buffer AE或蒸馏水；室温下静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min；

(10)重复步骤(9)；收集的液体即为含Mcr大肠杆菌的基因组DNA；将收集管盖好，保存于-20℃备用。

实施例3 RAA荧光检测Mcr的灵敏度试验

灵敏度采用以下检测方法进行：

(1)根据实施例2的提取方法提取待测样品的DNA；

将5uL 10⁵IU/μL含Mcr大肠杆菌基因组DNA制成不同梯度的的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁸copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品2，含有1.0×10⁷copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品3，含有1.0×10⁶copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品4，含有1.0×10⁵copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品5，含有1.0×10⁴copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品6，含有1.0×10³copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

工作标准品7，含有1.0×10²copies/μl含Mcr大肠杆菌基因组；

(2)反应体系配制：取49μL反应缓冲液加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司提供F00001，每管2μg冻干粉)中，使其充分溶解并混均；再加入已提取的1μL待测样品DNA为模板，总体积为50μL；其中所述反应缓冲液包含使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer(pH7.6)；260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000，终浓度为0.24pM/μL的探针，和终浓度分别为0.42pM/μL的上游引物和下游引物，余量为作为溶剂的水。

(3)将上述反应体系放入提前开机预热至39℃的配套仪器B6100(江苏奇天基因生物科技有限公司提供)中，长按3sec进行恒温震荡混匀；

(4)放入提前开机预热至39℃的FAM荧光检测仪器(江苏奇天基因生物科技有限公司提供的QT-RAA-F1620荧光检测仪)中进行实时RAA荧光反应；所述实时RAA荧光法反应条件为：反应温度37-42℃，优选39℃，反应时间5～20min，优选10min。

(5)检测结果如图1所示。结果显示：工作标准品1、2、3、4、5、6、7均有Mcr基因组扩增；8为同时设立的阴性对照，模板为ddH₂O，为一条平直线，没有NDM基因扩增。

实施例4 RAA荧光检测Mcr的特异度试验

特异度采用以下检测方法进行：

(1)根据实施例2所述的方法提取待测样品(含Mcr基因的大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假嗜单胞菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌、幽门螺旋杆菌、李斯特菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌)DNA。

(2)在每个反应体系中，取49μL反应缓冲液(同实施例3的反应缓冲液)加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司提供F00001，每管2μg冻干粉)中，使其充分溶解并混均；再加入已提取的1μl待测样品DNA为模板，总体积为50μL。

(4)放入提前开机预热至39℃的FAM荧光检测仪器(江苏奇天基因生物科技有限公司提供的QT-RAA-F1620荧光检测仪)中进行实时RAA荧光法反应；所述实时RAA荧光法反应条件为：反应温度37-42℃，优选39℃，反应时间5～20min，优选10min。

(5)检测结果如图2所示。结果显示最快2min内即开始有扩增，10min内含Mcr基因的大肠杆菌标准工作品有荧光信号，其余均没有荧光信号，特异度很好。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 首都儿科研究所

<120> RAA荧光法检测Mcr的引物、探针、试剂盒和检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 188

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cgttcagcag tcattatgcc agtttctttc gcgtgcataa gccgctgcgt agctatgtca 60

atccgatcat gccaatctac tcggtgggta agcttgccag tattgagtat aaaaaagcca 120

gtgcgccaaa agataccatt tatcacgcca aagacgcggt acaagcaacc aagcctgata 180

tgcgtaag 188

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cgttcagcag tcattatgcc agtttctttc gcgtgc 36

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cttacgcata tcaggcttgg ttgcttgtac cgc 33

Claims

1.RAA荧光法检测Mcr的引物，其特征在于，所述引物序列如下：

Mcr-F：5’-CGTTCAGCAGTCATTATGCCAGTTTCTTTCGCGTGC-3’；SEQ ID NO.2；

Mcr-R：5’-CTTACGCATATCAGGCTTGGTTGCTTGTACCGC-3’；SEQ ID NO.3。

2.RAA荧光法检测Mcr的探针，其特征在于，所述探针序列如下：

3.一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。

4.根据权利要求3所述的一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述引物Mcr-F和Mcr-R的终浓度分别为0.42pM/μL，所述探针的终浓度分别为0.24pM/μL。

5.根据权利要求3所述的一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。

6.根据权利要求5所述的一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为450mM，pH 7.6的Tris-HCl缓冲液；浓度为260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000。

7.根据权利要求5所述的一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

8.根据权利要求7所述的一种McrRAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含Mcr-1基因的大肠杆菌DNA，使用浓度为1.0×10⁴Copies/μl；所述阴性质控品为不含Mcr基因的大肠杆菌DNA的RAA扩增体系。

9.一种RAA荧光法检测Mcr的方法，其特征在于，在37～42℃条件下反应5～20min。