CN106834506A - 一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr‑1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr‑1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包括一对外引物、一对内引物和一对环引物,采用以上六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在60~65℃对DNA样品进行扩增,加入显色剂即可观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、检测简便、适合现场检测等优点,适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测,具体涉及一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
多粘菌素属于阳离子多肽抗生素家族,有A、B、C、D、E五种,抗菌谱相互类似而范围宽广,通常被认为是对抗耐多药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线,临床上常用的是多粘菌素B(polymyxin B)和多粘菌素E(colistin,黏菌素)。
近年来,发现了一个新的基因mcr-1,可使细菌对多粘菌素产生高度耐药性,其广泛存在于取自中国南方的猪和患者的肠杆菌科细菌中,包括具有流行可能性的菌株。已知,mcr-1基因产物属于磷酸乙醇胺转移酶家族,能够催化磷脂酰乙醇胺转移到脂质A的第四个磷酸基团上,使得脂质A的结构发生改变,从而降低了多粘菌素E与脂多糖的亲和力,介导多粘菌素耐药。mcr-1基因以质粒为载体存在于细菌中,能够以水平基因转移的方式在不同菌株中进行遗传物质的交换,这意味着mcr-1基因介导的耐药性可以在细菌中相互传播。
各项研究表明,截止至2016年底,mcr-1基因已经在不少于16个国家中被发现,包括东南亚、柬埔寨和马来西亚的7个国家,9个欧洲国家。特别注意的是,质粒传播的mcr-1基因至少存在于3个肠道菌种中(大肠杆菌、沙门氏菌和克雷伯氏肺炎菌),宿主包括至少三种家禽和家畜(鸡、猪和牛),从而引发了公众对于其全球传播和扩散的担忧。因此,mcr-1基因的检测对于监控耐药细菌的爆发,指导患者感染用药具有重要作用。
对于mcr-1基因的检测,传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值,但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用,因而研发一种简便、快速的细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的检测方法具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组;
本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒;
本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组,其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物,其核苷酸序列分别如下所示:
内引物1:5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’;
内引物2:5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’;
外引物1:5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’;
外引物2:5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’;
环引物1:5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’;
环引物2:5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’。
一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所示的LAMP引物组。
作为上述试剂盒的优选,LAMP引物组中,内引物、外引物、环引物的摩尔比为:(6~8):(1~2):(3~4)。
作为上述试剂盒的改进,还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。
作为上述试剂盒配方的优选,DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
作为上述试剂盒配方的优选,LAMP反应液含有:10 mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSO4水溶液、5 mM 甜菜碱,四者的体积比为(6~8):(4~5):(2~3):(8~10)。
作为上述试剂盒配方的优选,显色剂为SYBR GREENⅠ。
作为上述试剂盒配方的优选,阳性对照为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的质粒,阴性对照为DEPC水。
一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法,包括如下步骤:
(1)提取待检样品DNA;
(2)利用LAMP引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应;
(3)结果判断:反应结束后,在反应管中加入1~2µL显色剂,混匀后即可观察反应液的颜色:若呈现绿色,判定为阳性,若呈现橙色,判定为阴性;
上述方法所用的引物与试剂如权利要求1~8任一项所述;
上述方法用于非疾病的诊断与治疗。
作为上述方法的优选,等温基因扩增反应的25μL反应体系含有:内引物各8 pmol/µL,外引物各1 pmol/µL,环引物各4 pmol/µL,反应液 12.5µL,DNA聚合酶8U,待检DNA 1~100 ng,用灭菌去离子水补齐到25µL;等温基因扩增反应的条件为:60~65℃反应55~65min。
本发明的有益效果是:
本发明针对细菌多粘菌素耐药基因mcr-1特异性设计了6条引物,与目的基因的6个区域结合,具有较高的特异性,能准确识别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1。
本发明的试剂盒方便快捷,加入显色剂后即可观察结果,能在较短的时间内鉴别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1,不需要昂贵的仪器设备,灵敏度高,特异性好,适合现场检测。
附图说明
图1:本发明对阴性样品和阳性样品的显色检测结果,图中,1:不含mcr-1基因的细菌粗提DNA(阴性样品);2:细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因mcr-1样本(阳性样品);
图2:采用实施例2方法的检测灵敏度结果,图中,1为DEPC水,2~11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒,浓度依次为1.0×10-0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL;
图3:采用常规PCR方法的检测灵敏度结果,图中,1为DEPC水,2~11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒,浓度依次为1.0×10-0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL,M为DNA Marker,条带至上而下为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp;
图4:实施例4的特异性验证结果,图中,1:DEPC水,2:CTX-M-1,3:PME-1,4:SME-1,5:CMY-2,6:KPC-1,7:IMP-9,8:VIM-2,9:TEM,10:CTX-M-9,11:mcr-1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1、快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒的建立
快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒,包括以下成分:(1)LAMP检测引物组;(2)DNA聚合酶;(3)LAMP反应液;(4)显色剂;(5)阳性对照和阴性对照。
(1)LAMP检测引物组
根据细菌多粘菌素耐药基因mcr-1(GenBank登录号为:KX886345.1),针对其6个区域,进行LAMP引物设计,经过大量的引物特异性实验,优选出特异性好的的LAMP检测引物组,包括一对内引物、一对外引物和一对环引物,其核苷酸序列分别如下所示:
内引物1:5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’(SEQ ID NO:1);
内引物2:5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’(SEQ ID NO:2);
外引物1:5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’(SEQ ID NO:3);
外引物2:5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’(SEQ ID NO:4);
环引物1:5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’(SEQ ID NO:5);
环引物2:5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’(SEQ ID NO:6)。
(2)DNA聚合酶:Bst DNA聚合酶。
(3)LAMP反应液:含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM甜菜碱,四者的体积比为8:5:3:10。
(4)显示剂:SYBR GREEN Ⅰ。
(5)阳性对照:含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的pMD19-T质粒;利用常规的质粒构建方法将基因mcr-1片段插入pMD19-T质粒中得到。
(6)阴性对照:DEPC水。
实施例2、快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法
利用实施例1的试剂盒快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1,具体步骤如下:
(1)提取待检样品DNA:
采用水煮法提取细菌基因组DNA。
(2)利用LAMP检测引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应:
等温基因扩增反应的25μL体系为:内引物1、2终浓度各为8 pmol/µL,外引物1、2终浓度各为1 pmol/µL,环引物1、2终浓度各为4 pmol/µL,反应液 12.5µL,DNA聚合酶8U,待检样品DNA 50 ng,用灭菌去离子水补齐到25µL,然后加入20µL的密封液;
等温基因扩增程序为:63℃反应60min。
(3)结果判断:
反应结束后,在反应管中加入1~2µL显色剂,混匀后即可观察反应液的颜色:若呈现绿色,判定为阳性,若呈现橙色,判定为阴性。
上述检测方法对阳性样品和阴性样品的检测结果如图1所示,1号为不含mcr-1基因的细菌粗提DNA,即阴性样品,呈现橙色,2号为细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因mcr-1样本,即阳性样品,呈现绿色。
实施例3、灵敏度实验
取阳性对照品(即构建好的含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的pMD19-T质粒),测定其浓度并计算拷贝数,按照10倍的浓度梯度稀释,选取1.0×100~1.0×109拷贝/μL的浓度作为样品进行实验;分别用实施例2的检测方法和常规PCR方法进行检测。
常规PCR检测方法所用的引物序列如下所示:
MCR-1-F:CGGTCAGTCCGTTTGTTC (SEQ ID NO:7);
MCR-1-R:CTTGGTCGGTCTGTAGGG (SEQ ID NO:8)。
采用实施例2检测方法的检测结果如图2所示:其对mcr-1基因的最低检出限为:1.0×104拷贝/μL。
采用常规PCR方法的检测结果如图3所示:其对mcr-1基因的最低检出限为:最低检出限为:1.0×106拷贝/μL。
实施例4 特异性实验
利用实施例2的方法分别对经鉴定不含mcr-1基因但含其他耐药基因的9株临床分离株DNA进行检测,所述的其他耐药基因分别为CTX-M-1、PME-1、SME-1、CMY-2、KPC-1、IMP-9、 VIM-2、TEM、CTX-M-9,以DEPC水为阴性对照,以含mcr-1基因的临床分离株DNA为阳性对照。
检测结果如图4所示:仅细菌多粘菌素耐药基因mcr-1管为绿色,其余管为橙色;说明表明,本发明的检测试剂盒特异性高,能准确地将mcr-1及非mcr-1区分开来。
以上实施例表明,本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点,且不需要昂贵的仪器设备,肉眼显色观察即可,适合现场检测。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例,对于本领域技术人员来说,在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进,都应被视为本发明的一部分。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方
法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgatgggat aggtttggct gtgttgccgt tttcttgac 39
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgctgacgat cgctgtcggc acatagcgat acgatgat 38
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgatgcagca tacttctgtg 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccgtgcca taagtgtc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaggtaagat tggcggtcg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctactgatca ccacgctgtt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggtcagtcc gtttgttc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cttggtcggt ctgtaggg 18
Claims (10)
1.一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组,其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物,其核苷酸序列分别如下所示:
内引物1:5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’;
内引物2:5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’;
外引物1:5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’;
外引物2:5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’;
环引物1:5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’;
环引物2:5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’。
2.一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所示的LAMP引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:LAMP引物组中,内引物、外引物、环引物的摩尔比为:(6~8):(1~2):(3~4)。
4.根据权利要求2所示的试剂盒,其特征在于:还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:LAMP反应液含有:10 mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSO4水溶液、5 mM 甜菜碱,四者的体积比为(6~8):(4~5):(2~3):(8~10)。
7.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:显色剂为SYBR GREENⅠ。
8.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,阳性对照为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的质粒,阴性对照为DEPC水。
9.一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法,包括如下步骤:
(1)提取待检样品DNA;
(2)利用LAMP引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应;
(3)结果判断:反应结束后,在反应管中加入1~2µL显色剂,混匀后即可观察反应液的颜色:若呈现绿色,判定为阳性,若呈现橙色,判定为阴性;
上述方法所用的引物与试剂如权利要求1~8任一项所述;
上述方法用于非疾病的诊断与治疗。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:等温基因扩增反应的25μL反应体系含有:内引物各8 pmol/µL,外引物各1 pmol/µL,环引物各4 pmol/µL,反应液 12.5µL,DNA聚合酶8U,待检DNA 1~100 ng,用灭菌去离子水补齐到25µL;等温基因扩增反应的条件为:60~65℃反应55~65min。
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