CN101255460A - 伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法 - Google Patents

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高宏伟
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Abstract

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体说是一种伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。该试剂盒内包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；环介导等温扩增反应液中含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－TTACGTCACCAACGAC ACGGGACGTATTGGGCAATGACTGG－3、下游内引物5－CGGTAAATACCATCCCCACGGCT AACGCAGCGAGAATGGC－3、上游外引物5－GTCGCGTACTTTACGCCAT－3、下游外引物5－ACCCTGACCATCCACCAG－3和甜菜碱；检测伤寒沙门氏菌的方法包括细菌DNA的提取、伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

Description

伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法。
背景技术
伤寒沙门氏(Salmonella enterica)是一类大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞的革兰氏阴性杆菌，是病原性肠道细菌的一个属，包括肠伤寒杆菌，一般有鞭毛，无荚膜，多数有菌毛，在形态上和生理上都极似大肠杆菌，1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌分布很广，广泛在于自然界中，常可在各种动物，如猪、牛、羊、马、等家畜及鸡、鸭、鹅、等家禽，飞鸟、鼠类等野生动物的肠道中发现。鸡是沙门氏菌最大的储存储主，鸡群暴发死亡率高达80％，也存在于蛋类、蛋粉及其它食物中(牛肉、猪肉、鱼肉、香肠、火腿等)。伤寒沙门氏菌，甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等只对人类致病，而马流产沙门氏菌，雏沙门氏菌只对马和鸡致病。可引起如下类型的疾病：(1)肠热症(2)食物中毒(3)慢性肠炎(4)败血症。人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，作出了不懈的努力，现有检测方法主要有：1、同位素标记，该方法使用同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，经大约48h的增菌步骤后，其检测敏感性高，但所需时间较长，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测伤寒沙门氏菌的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种伤寒沙门氏菌的快速检测试剂盒的制备和检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，而且内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：
其中包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.2μmol/L下游内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游外引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；
上游内引物：
5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、
下游内引物：
5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、
上游外引物：5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、
下游外引物：5-ACCCTGACCATCCACCAG-3，
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液中每管23μL的最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL2M甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒检测伤寒沙门氏菌的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品或细菌DNA的提取：
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA，其DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。
(2)进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于恒温65℃放置45-90min；
D.将水浴调到8℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为伤寒沙门氏菌。
本发明建立了伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据伤寒沙门氏菌的gyrA基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为伤寒沙门氏菌各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的伤寒沙门氏菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于伤寒沙门氏菌的检测，特别适用于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)配制LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/LMgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。
其中所述的上游内引物：
5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、
下游内引物：5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、
上游外引物：5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、
下游外引物：5-ACCCTGACCATCCACCAG-3；
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取：
检测菌种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，菌种来源中国检科院食品安全微生物菌种保藏中心，编号IQCC10503.2。
使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。
(2)进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于恒温65℃放置1小时；
D.将水浴调到80℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL上述显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为伤寒沙门氏菌。
实施例2
按下列配方制作伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)配制LAMP反应液：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
按照以下(1)-(3)程序进行检测：
(1)样品DNA的提取：
检测菌种甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi-A)，菌种来源中国检科院食品安全微生物菌种保藏中心，编号IQCC10518。
使用北京天根生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1.7，浓度达到22ng/μL。
(2)进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液中的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.于恒温水浴上63℃放置1h；
D.将水浴调到90℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或者为伤寒沙门氏菌。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒的制备和检测方法
<160>4
<210>1
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(41)
<400>1
ttacgtcacc aaccacacgg gacgtat tgg gcaatgactg g 41
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(40)
<400>2
cggtaaatac catccccacg gctaacgcag cgagaatggc 40
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(19)
<400>3
gtcgcgtact ttacgccat 19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)...(18)
<400>4
accctgacca tccaccag 18

Claims (3)

1.一种伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液：
包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；
其中上游内引物；
5-TTACGTCACCAACGACACGGG-ACGTATTGGGCAATGACTGG-3、
下游内引物；
5-CGGTAAATACCATCCCCACGGC-TAACGCAGCGAGAATGGC-3、
上游外引物：5-GTCGCGTACTTTACGCCAT-3、
下游外引物：5-ACCCTGACCATCCACCAG-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；
(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的伤寒沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征是上述dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
3.伤寒沙门氏菌的快速检测方法，其特征是依次包括下列(1)-(3)步骤：
(1)待检样品或细菌DNA的提取
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；
(2)进行伤寒沙门氏菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入1μL待检样品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶；
C.再于金属浴中恒温60-65℃放置45-90min；
D.将浴中温度调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测：
在每个反应管中加入1μL上述的显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是伤寒沙门氏菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有或为伤寒沙门氏菌。
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