CN105586400A - 亚利桑那菌lamp法检测用的引物和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明亚利桑那菌LAMP法检测用的引物和检测方法涉及用分子生物学方法，以LAMP法对亚利桑那菌DNA的检测。本发明引物进行LAMP法检测，对亚利桑那菌浓度为108？CFU/mL、107？CFU/mL、106？CFU/mL的被检测液体样品，多次重复为试险有白色浑浊为阳性；对选用的六种干扰菌浓度为108？CFU/mL的被检测液体样品和灭菌去离子水对照，多次重复为试险无白色浑浊为阴性。说明使用本发明的引物进行LAMP法检测亚利桑那菌特异性高，可以作为检测亚利桑那菌的方法。

Description

亚利桑那菌LAMP法检测用的引物和检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学中用LAMP法对亚利桑那菌DNA的检测。
技术背景
目前食品中对亚利桑那菌的检测工作仍然沿用传统的两种细菌学鉴定方法。
第一种分离纯化鉴定方法的缺点：按最新的亚利桑那菌检测上述国家标准GB4789.4-2010中采用的传统的分离纯化鉴定方法，阳性样品检测周期至少需6天以上；且步骤繁琐，需经过5个步骤才能检测出样品是否含有目标菌；使用平板琼脂分离纯化细菌时，需要依靠经验选取可疑菌落，人为因素影响检测结果，还极易造成漏检。
第二种抗原抗体反应方法的缺点：目前沙门氏菌分型仍然采用传统的抗原和生化标准，将沙门氏菌分为四个亚属, 亚利桑那菌是沙门氏菌的第Ⅲ亚属，近3000种血清型，血清数量太大，如要在基层检测实验室配备大量价格昂贵的鉴定血清难以实现，因此在实际检测工作中基本失去价值。传统的亚利桑那菌检测方法早已不能满足现代食品安全检测工作的需要，必须开发快速、简便、高通量、高特异性、高灵敏度的检测方法，来丰富和完善食品中致病菌的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用扩增DNA的LAMP法，检测亚利桑那菌的引物，并且还提供用这种引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测的方法，既提供一种比传统细菌学鉴定亚利桑那菌更具有费用低、灵敏度高、操作简便的LAMP法检测亚利桑那菌的方法。
本发明所说的亚利桑那菌是：亚利桑那菌Salmonella arizonae。
用本发明的引物的作用是，使用分子生物学LAMP检测方法，在样品中检测出亚利桑那菌DNA。
用本发明设计的LAMP引物与引物是同一个概念。
本发明的LAMP技术也是LAMP法的含义，也就是环介导等温扩增法（loop-mediatedisothermal amplification，）简称LAMP技术或LAMP法或LAMP检测法。
本发明的引物设计和应用概述：首先对以往文献进行梳理，分析了沙门氏菌属,包括亚利桑那菌spvA基因、16SrRNA、ORF的部分基因序列，最终确定spvA基因作为模版检测基因。最终确定spvA基因作为模版检测基因的参考文献是：
第一参考文章名称为：Toward a population genetic analysis of Salmonella:Genetic diversity and relationships among strains of serotypes S.choleraesuis, S. derby, S. dublin, S. enteritidis, S. heidelberg, S.infantis, S. newport, and S. typhimuriu
第一参考文章作者为：PILAR BELTRAN*t, JAMES M. MUSSER*, REINER HELMUTHt,JOHN J. FARMER iii§, WAYNE M. FRERICHS¶, I. KAYE WACHSMUTH§, KATHLEEN FERRIS¶, ALMA C. MCWHORTER§, JOY G. WELLS§, ALEJANDRO CRAVIOTOt, AND ROBERT K.SELANDER*
第一参考文章期刊名和时间为：Proc. Nati. Acad. Sci. USA
Vol. 85, pp. 7753-7757, October 1988
Medical Sciences
第二参考文章名称为：Salmonella Virulence Plasmid: Modular Acquisition ofthe spv Virulence Region by an F-Plasmid in Salmonella enterica Subspecies Iand Insertion Into the Chromosome of Subspecies II, IIIa, IV and VII Isolates
第二参考文章作者为：E. Fidelma Boyd and Daniel L. Hartl
第二参考文章期刊名和时间为：Copyright Ó 1998 by the Genetics Society ofAmerica。
在GENBANK数据库中，对亚利桑那菌spvA这段基因序列进行检索比对，发现亚利桑那菌与同属中的其它沙门氏菌仅有39个碱基序列差异，为亚利桑那菌保守且特异的DNA序列，因此确定这39个碱基序列
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAAT
能够作为LAMP法检测亚利桑那菌的被检特异DNA序列。然后用这个选定的被检特异DNA序列为基础，进行设计用于LAMP法检测亚利桑那菌的检测用的引物，然后并合成这种检测用的引物，再把这种检测用的引物用LAMP法检测亚利桑那菌。
本发明的引物设计原理如下：
（1）选取spvA基因作为靶基因序列：因spvA基因在沙门氏菌属中高度保守，可作为检测沙门氏菌属靶基因序列。
（2）获取靶基因序列：按当前生物基因组数据的获取通用方法，即通过美国国立生物技术信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information，)管理的GENEBANK数据库进行查询，所获序列都是对全世界公开的，研究人员都可以无偿获取使用的亚利桑那菌spvA基因作为靶基因序列。所以，本发明选用GENEBANK数据库中的亚利桑那菌spvA基因DNA作为本发明的靶基因序列。
（3）选靶基因中的特异性DNA片段：我们选取GENEBANK数据库中的亚利桑那菌spvA基因DNA 序列中保守性最高的、LAMP法检测效果最好的一段DNA作为引物的基础DNA来设计LAMP法检测用的检测用的引物，在GENBANK中对这段基因序列进行检索比对，发现亚利桑那菌与同属中的其它沙门氏菌仅有39个碱基片段差异，为亚利桑那菌保守且特异性DNA片段，既39个碱基片段如下：
CCGACCCTGCAGCTGGTTAATGACATTCTGGAGAATAAT。
（4）设计LAMP引物：用上述（3）中的39个碱基片段为依据，用现有引物设计技术，设计出本发明的LAMP法检测用的引物，即本发明的4个单独引物组成的引物组序列如下：
引物F3： AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3： TACGGCAGCAGGGTCG；
引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；
引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
设计本发明的4个单独引物既引物组的规则：
按LAMP反应原理，每次LAMP反应需4个单独引物同时反应，这4个单独引物作为一个引物组，即每组LAMP引物为4个单独引物，本发明的引物组中4个单独引物代号是：B3，F3，BIP，FIP。
设计引物时，B3，F3，BIP，FIP引物5’和3’最开始的一个碱基保证在5个物种中都是保守的；引物中5’dG 和 3’dG 尽量小于-4.00。
用本发明的LAMP引物，进行LAMP法检测样品中亚利桑那菌、其它干扰菌和灭菌去离子水对照的检测方法如下：
步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种DNA：225ml缓冲蛋白胨水(BPW，Buffered PeptoneWater) 中添加亚利桑那菌标准菌种CMCC47001，培养18-24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB 4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得含有亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL、107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL四种梯度稀释液，然后将这四种梯度稀释液分别取1ml，采用水煮模板法或CTAB/NaCl 法或QIAGEN公司试剂盒方法中的某一种方法，分别提取这四种梯度稀释液中的亚利桑那菌标准菌DNA；
得到，
第一种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第二种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第三种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第四种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA。
步骤2、制备含干扰菌标准菌种DNA：在六个225ml缓冲蛋白胨水(BPW，BufferedPeptone Water) 中，分别添加鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌这六种干扰菌，和一个灭菌去离子水对照，分别培养18-24小时后，用灭菌生理盐水分别对每个缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得这六种干扰菌浓度为108 CFU/mL的干扰菌稀释液，和一个灭菌去离子水对照液，然后将这六种干扰菌稀释液和一个灭菌去离子水对照液分别取1ml，采用水煮模板法或CTAB/NaCl 法或QIAGEN公司试剂盒方法试剂盒方法中与步骤1相同的那一种方法，分别提取这六种干扰菌稀释液中的干扰菌标准菌DNA；
得到，
第五种干扰菌液：含鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌标准菌DNA；
第六种干扰菌液：含肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL的肠炎沙门氏菌标准菌DNA；
第七种干扰菌液：含大肠杆菌O157浓度为108 CFU/mL的大肠杆菌O157标准菌DNA；
第八种干扰菌液：含福氏志贺氏菌浓度为108 CFU/mL的福氏志贺氏菌准菌DNA；
第九种干扰菌液：含单增李斯特菌浓度为108 CFU/mL的单增李斯特菌标准菌DNA；
第十种干扰菌液：含金黄色葡萄球菌浓度为108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准菌DNA；
第十一种灭菌去离子水对照液：不含任何菌。
步骤3、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒
选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为：Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂盒，该DNA扩增试剂盒组成为：
（1）2 × 反应缓冲液（RM），
（2）Bst DNA 聚合酶（Bst DNA Polymerase），
（3）去离子水（DW），
（4）引物溶液 DNA（PM DNA），
（5）阳性对照 DNA（PC DNA）。
步骤4、用本发明的引物对步骤1和2的十一种液体分别进行LAMP法检测DNA
4.1. 配制LAMP法检测液：在生物安全柜中冰上操作，向十一个 Loopamp®“朗报®”反应试管中分别加入下述各原料：
加入12.5μL 的2 × 反应缓冲液（RM），
加入6.5μL去离子水（DW），
加入0.5μL 的引物F3，
加入0.5μL的 引物B3，
加入0.5μL 的引物FIP，
加入0.5μL 的引物BIP，
加入1.0μL的 Bst DNA 聚合酶；
得到装有LAMP法检测液各原料的十一个反应试管；
所述的引物为：
引物F3： AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3： TACGGCAGCAGGGTCG；
引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；
引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
4.2. 配制含有被检测物的十一个反应试管：
向4.1步骤中的十一个反应试管分别加入
3.0μL第一种试验菌液，
3.0μL第二种试验菌液，
3.0μL第三种试验菌液，
3.0μL第四种试验菌液，
3.0μL第五种干扰菌液，
3.0μL第六种干扰菌液，
3.0μL第七种干扰菌液，
3.0μL第八种干扰菌液，
3.0μL第九种干扰菌液，
3.0μL第十种干扰菌液，
3.0μL第十一种灭菌去离子水对照液；
获得
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL；
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌O157浓度为108CFU/mL；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108CFU/mL；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108CFU/mL；
反应试管11；第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌。
4.3. 对十一个反应试管进行反应处理
对十一个反应试管分别进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟14000rpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡；然后分别放入63℃恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再分别放入95℃恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA 聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应。
4.4. 观察反应结果：
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL，20次重复试险，有16次白色浑浊为阳性；另4次无白色浑浊为阴性。
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌O157浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管11；第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌，20次重复试险无白色浑浊为阴性。
结论：对含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL、107 CFU/mL、106 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，能多次重复的检测到亚利桑那菌，这些检测亚利桑那菌的试验具有可重复性，具有可靠性。
对含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，检测亚利桑那菌的试验不具有完全可重复性，不具有可靠性。
用本发明的引物进行LAMP法检测，对浓度为108 CFU/mL为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照液都分别是为阴性。说明本发明的引物能区分出鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照，可以推论本发明的引物能区分出沙门氏菌属的其它菌，能区分出肠杆菌科的其它细菌，能区分出革兰氏阳性杆菌的其它细菌，能区分出无任何菌的灭菌去离子水对照。
所以，说明使用本发明的引物进行LAMP法检测亚利桑那菌特异性高，可以作为检测亚利桑那菌的方法。
本发明的干扰菌，既常见食品致病菌种类及选择原则：
与亚利桑那菌亲缘关系最近的常见食品致病菌：因亚利桑那菌属沙门氏菌属，选择鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌两种沙门氏菌属细菌作为干扰菌。
与亚利桑那菌亲缘关系较近的常见食品致病菌：因亚利桑那菌属肠杆菌科沙门氏菌属细菌，选择大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌两种肠杆菌科细菌作为干扰菌。
与亚利桑那菌亲缘关系较远的常见食品致病菌：因亚利桑那菌属革兰氏阴性杆菌，选择革兰氏阳性杆菌单增李斯特菌、革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌作为干扰菌。
本发明的优点：
本发明的创造性在于具有高度的特异性：用本发明所设计的检测用的引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测，其检测的灵敏度达到106CFU/ml，既在每毫升液体中，含有106CFU单位量的亚利桑那菌，都能产生阳性反应。而用了六种干扰菌液，分别以108CFU/ml单位量的浓度用本发明的引物对分别对其进行LAMP法检测，都产生阴性反应，并且空白对照也产生阴性反应。说明：本发明的引物对对亚利桑那菌进行LAMP法检测具有高度的特异性。
本发明的创造性在于具有可重复性：用本发明所设计的检测用的引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测，含有亚利桑那菌的浓度为108CFU/ml，107CFU/ml，106CFU/ml，105CFU/ml，分别进行了20次重复试验，浓度为108CFU/ml，107CFU/ml，106CFU/ml，每次都能产生阳性反应。浓度为105CFU/ml有16次产生阳性反应，只有4次产生阴性反应。说明当亚利桑那菌的浓度等于或大于106CFU/ml时，对亚利桑那菌的检测结果具有可重复性，具有可靠性。而传统的分离纯化鉴定方法使用平板琼脂分离纯化细菌时，人为因素影响检测结果，根本不能用灵敏度、精确度进行评价；传统的抗原抗体反应方法要在3000种血清型中去人为选准抗体更是人为因素影响检测结果，并且还受3000种血清型的质量、数量和经济条件影响。
分子生物学技术已经广泛应用于大量食品致病菌的检测，经查阅大量文献发现，利用分子生物学检测亚利桑那致病菌鲜有报道，特别是LAMP基因检测技术以其快速、简便、现场、高通量、高特异性、高灵敏度的优势，可实现对亚利桑那致病菌的快速筛查，将会大大减轻检测者的工作量，提高检测效率和准确度。
使用LAMP法检测亚利桑那菌，相对国标方法，步骤简化；检测周期缩短到2天左右；无人工主观筛选可疑菌落步骤，提高特异性和灵敏度；采用基于DNA的分子生物学检测技术，灵敏度达到106CFU/ml；无需配备价格昂贵的检测试剂；因步骤简化，仪器代替人工操作，检测通量大大提高。
由于现在对亚利桑那菌分子生物学检测报道较少，我们首先采取生物信息学方法获取亚利桑那菌特异的基因序列。针对这些基因序列设计相应的LAMP的引物，开发相应LAMP技术检测亚利桑那菌技术方法。
具体实施例
实施例1、用本发明的LAMP引物，进行LAMP法检测样品中亚利桑那菌、其它干扰菌和灭菌去离子水对照的检测方法如下：
设计并委托有关单位制备LAMP引物，即本发明的4个单独引物组成的引物组序列如下：
引物F3： AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3： TACGGCAGCAGGGTCG；
引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；
引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种DNA：225ml缓冲蛋白胨水(BPW，Buffered PeptoneWater) 中添加亚利桑那菌标准菌种CMCC47001，培养18-24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB 4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得含有亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL、107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL四种梯度稀释液，然后将这四种梯度稀释液分别取1ml，采用水煮模板法分别提取这四种梯度稀释液中的亚利桑那菌标准菌DNA；
得到，
第一种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第二种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第三种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
第四种试验菌液：含亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA。
步骤2、制备含干扰菌标准菌种DNA：在六个225ml缓冲蛋白胨水(BPW，BufferedPeptone Water) 中，分别添加鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌这六种干扰菌，和一个灭菌去离子水对照，分别培养18-24小时后，用灭菌生理盐水分别对每个缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得这六种干扰菌浓度为108 CFU/mL的干扰菌稀释液，和一个灭菌去离子水对照液，然后将这六种干扰菌稀释液和一个灭菌去离子水对照液分别取1ml，采用水煮模板法分别提取这六种干扰菌稀释液中的干扰菌标准菌DNA；
得到，
第五种干扰菌液：含鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌标准菌DNA；
第六种干扰菌液：含肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL的肠炎沙门氏菌标准菌DNA；
第七种干扰菌液：含大肠杆菌O157浓度为108 CFU/mL的大肠杆菌O157标准菌DNA；
第八种干扰菌液：含福氏志贺氏菌浓度为108 CFU/mL的福氏志贺氏菌准菌DNA；
第九种干扰菌液：含单增李斯特菌浓度为108 CFU/mL的单增李斯特菌标准菌DNA；
第十种干扰菌液：含金黄色葡萄球菌浓度为108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准菌DNA；
第十一种灭菌去离子水对照液：不含任何菌。
步骤3、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒
选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为：Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂盒，该DNA扩增试剂盒组成为：
（1）2 × 反应缓冲液（RM），
（2）Bst DNA 聚合酶（Bst DNA Polymerase），
（3）去离子水（DW），
（4）引物溶液 DNA（PM DNA），
（5）阳性对照 DNA（PC DNA）。
步骤4、用本发明的引物对步骤1和2的十一种液体分别进行LAMP法检测DNA
4.1. 配制LAMP法检测液：在生物安全柜中冰上操作，向十一个 Loopamp®“朗报®”反应试管中分别加入下述各原料：
加入12.5μL 的2 × 反应缓冲液（RM），
加入6.5μL去离子水（DW），
加入0.5μL 的引物F3，
加入0.5μL的 引物B3，
加入0.5μL 的引物FIP，
加入0.5μL 的引物BIP，
加入1.0μL的 Bst DNA 聚合酶；
得到装有LAMP法检测液各原料的十一个反应试管。
4.2. 配制含有被检测物的十一个反应试管：
向4.1步骤中的十一个反应试管分别加入
3.0μL第一种试验菌液，
3.0μL第二种试验菌液，
3.0μL第三种试验菌液，
3.0μL第四种试验菌液，
3.0μL第五种干扰菌液，
3.0μL第六种干扰菌液，
3.0μL第七种干扰菌液，
3.0μL第八种干扰菌液，
3.0μL第九种干扰菌液，
3.0μL第十种干扰菌液，
3.0μL第十一种灭菌去离子水对照液；
获得
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL；
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌O157浓度为108 CFU/mL；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108 CFU/mL；
反应试管11；第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌。
4.3. 对十一个反应试管进行反应处理
对十一个反应试管分别进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟14000rpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡；然后分别放入63℃恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再分别放入95℃恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA 聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应。
4.4. 观察反应结果：
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为107 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL，20次重复试险，有16次白色浑浊为阳性；另4次无白色浑浊为阴性。
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌O157浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管11；第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌，20次重复试险无白色浑浊为阴性。
结论：对含原有的亚利桑那菌浓度为108 CFU/mL、107 CFU/mL、106 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，能多次重复的检测到亚利桑那菌，这些检测亚利桑那菌的试验具有可重复性，具有可靠性。
对含原有的亚利桑那菌浓度为105 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，检测亚利桑那菌的试验不具有完全可重复性，不具有可靠性。
用本发明的引物进行LAMP法检测，对浓度为108 CFU/mL为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照液都分别是为阴性。说明本发明的引物能区分出鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照，可以推论本发明的引物能区分出沙门氏菌属的其它菌，能区分出肠杆菌科的其它细菌，能区分出革兰氏阳性杆菌的其它细菌，能区分出无任何菌的灭菌去离子水对照。
所以，说明使用本发明的引物进行LAMP法检测亚利桑那菌特异性高，可以作为检测亚利桑那菌的方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 亚利桑那菌LAMP法检测用的引物和检测方法
<130> 2015
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgaccctgc agctggttaa tgacattctg gagaataat 39
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcagttccg ccgtcg 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggcagca gggtcg 16
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggtatttgc tggttaatgg agggacaggc agagcg 36
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctggttaat gacattctgg agcgtttcat ccaccgact 39

Claims (2)

1.亚利桑那菌LAMP法检测用的引物，由4个单独引物组成，这4个单独引物是引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP，这4个单独引物的序列如下：
引物F3： AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3： TACGGCAGCAGGGTCG；
引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；
引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
2.用权利要求1的亚利桑那菌LAMP法检测用的引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测的方法，包括以下步骤：
步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种DNA：225ml缓冲蛋白胨水(BPW，Buffered PeptoneWater) 中添加亚利桑那菌标准菌种，培养18-24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB 4789.2-2010方法对进行细菌计数，制得含有亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL的稀释液，然后将该稀释液取1.0ml，提取稀释液中的亚利桑那菌标准菌DNA；得到，含亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；
步骤2、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒
选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为：Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂盒，该DNA扩增试剂盒组成为：
（1）2 × 反应缓冲液（RM），
（2）Bst DNA 聚合酶（Bst DNA Polymerase），
（3）去离子水（DW），
（4）引物溶液 DNA（PM DNA），
（5）阳性对照 DNA（PC DNA）；
步骤3、用本发明的引物进行LAMP法检测DNA
（3.1）、配制LAMP法检测液：在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp朗报反应试管中加入下述各原料：
加入12.5μL 的2 × 反应缓冲液（RM），
加入6.5μL去离子水（DW），
加入0.5μL 的引物F3，
加入0.5μL的 引物B3，
加入0.5μL 的引物FIP，
加入0.5μL 的引物BIP，
加入1.0μL的 Bst DNA 聚合酶；
得到装有LAMP法检测液各原料的反应试管；
所述的引物为：
引物F3： AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3： TACGGCAGCAGGGTCG；
引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；
引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT；
（3.2）、配制含有被检测物的反应试管：
向3.1步骤中的反应试管加入3.0μL步骤1获得的含亚利桑那菌浓度为106 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA液体；
（3.3）、对反应试管进行反应处理
对反应试管进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟14000rpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡；然后放入63℃恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再放入95℃恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA 聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应；
（3.4）、观察反应结果：反应试管有白色浑浊为阳性。
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袁发浒等: "肠炎沙门氏菌的LAMP检测方法的建立", 《中国酿造》 *
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