CN106591483A - 一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，以铜绿假单胞菌特有的ETA保守序列为靶基因序列，设计一套LAMP特异性引物，对纺织品样品增菌后产物进行LAMP扩增，扩增后的产物形成白色沉淀，通过对比观察可判定结果，或通过浊度仪观察结果，样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性，样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。对判定为阳性样品增菌液接种平板分离，挑取平板上典型或可疑菌落，利用MALDI‑TOF‑MS技术鉴定快速鉴定出结果。本方法操作简单，快速、高效、特异性强，灵敏度高，结果观察方便、直观。

Description

一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法
技术领域
本发明涉及一种铜绿假单胞菌的检测方法，具体涉及一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌，是一种高致死率、溶血性、抗药性强的革兰氏阴性杆菌，在分类上属假单胞菌科中的假单胞菌属，此菌属种类多达200种以上，在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。本菌最主要的生长条件是潮湿环境，其它条件要求不高。纺织品极易吸潮，具备铜绿假单胞菌生长的所有因素，能够提供其繁殖的理想环境，包括合适的pH，温度及水营养，也能提供其繁殖所需的大表面积。因此纺织品中一旦污染铜绿假单胞菌，该菌会顽强地吸附在纤维上，一般的清洗、曝晒是消灭不了的。
铜绿假单胞菌可暂时寄生于皮肤，因此接触性体表感染率相当高，能引起人中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，亦可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸，甚至通过血流导致败血症，可引起病人死亡。
铜绿假单胞菌检测有多种方法，常见的主要有传统标准方法、全自动微生物分析系统分析法、分子生物学方法(常规PCR法、多重PCR法、PCR-DHPLC法、Real-time PCR法、基因芯片技术)、免疫学方法(免疫磁性分离法、荧光激活细胞分离法、酶联免疫吸附法)、蛋白多肽检测方法等。传统检测方法程序繁琐、周期长、灵敏度低。免疫学方法制备抗体较困难、不能同时检测多种成分，对实验人员技巧性要求高，易出现交叉污染。分子生物学方法具有高灵敏度、准确、快速等优点，但需要专门仪器设备，易污染，对检验人员要求较高。目前纺织品领域铜绿假单胞菌的检测都采用的传统培养法定性检测，在方法检测程序上也都大致相同，增菌→分离→镜检和其它验证试验，需要4d～6d。
铜绿假单胞菌是条件致病菌，在环境中广泛存在多种变体。铜绿假单胞菌可产生许多致病因子或毒力因子，包括弹性酶、碱性蛋白酶、LasA蛋白酶、溶血素、绿脓素，绿脓素是铜绿假单胞菌分泌的重要毒力因子之一。铜绿假单胞菌附着生长状态产绿脓素远远高于浮游生长状态下产绿脓素量，常常浮游生长状态下绿脓素产生不明显，因此对样品一次增菌后，仅凭是否产生绿脓素来判定铜绿假单胞菌是否生长不够严谨，不能快速得出结果，对一次增菌液进行DNA提取，初步筛选更科学合理些。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，达到 了高效、准确、省时省力的效果。具体技术方案如下：
一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品增菌
用无菌的方式取样、增菌培养，得增菌液；
步骤二：LAMP试验
2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；
2.2)LAMP扩增反应
2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管。扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混合混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；
表1 反应体系
2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照
每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；
空白对照：以水代替DNA模板；
阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；
2.2.3)加样
将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL；盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec；
2.2.4)上机反应
将步骤2.2.3)离心后的反应管置于水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min；
2.2.5)初步观察结果
2.2.5.1)可视化观察结果
反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察；先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；
2.2.5.2)浊度仪结果
反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效；样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性；
步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定
3.1)分离
取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h；铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素；挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果；
3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认
3.2.1)配制标准品和基质
配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；
标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial TestStandard，BTS)，加入标准溶剂50μL；使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末；室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用；
基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂，振荡混匀，直到形成澄清溶液；
3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定
挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干；将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果；
步骤四 结果报告
根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果；初步结果为阴性，可直接报 告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。
优选的，所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤(一)中取样、增菌培养为无菌方法打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，在电子天平上准确称取剪下的样品25g，剪碎后加入到盛有225mL SCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀；将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养24h±2h。
优选的，所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，步骤2.1)中DNA模板的制备：取1mLSCDLP增菌液放入1.5mL灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；加入1mL灭菌双蒸水混匀，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，高速冷冻离心机内10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，可-20℃存放备用。
优选的，所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，步骤2.2.5.1)中：如果沉淀现象不明显，在反应管中加入1000×SYBR Green I染料2μL，轻轻混匀，立即观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性；空白对照、阴性对照、阳性对照成立，才能判定样品的检测结果，样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化都判定为阳性结果。
优选的，一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤3.2.1)中配制基质的浓度不大于10mg/mL。
本发明中用到的设备和材料如下：
1 设备和材料
1.1 常规微生物检测用的基本设备与材料。
1.2 无菌剪刀、镊子。
1.3 电子天平：0.01g。
1.4 无菌均质袋。
1.5 拍击式均质器：400mL。
1.6 恒温培养箱：36℃±1℃。
1.7 接种环。
1.8 载玻片。
1.9 微量移液器：量程1μL～20μL；量程200μL～1000μL。
1.10 灭菌Eppendorf离心管：1.5mL。
1.11 PCR薄壁反应管：200μL。
1.12 高速离心机：2000r/min～13000r/min。
1.13 水浴锅：63℃±1℃。
1.14 LAMP实时浊度仪。
1.15 MALDI BioTyper自动鉴定仪。
2 培养基和试剂
2.1 SCDLP液体培养基。
2.2 假单胞菌CN选择性培养基。
2.3 灭菌双蒸水。
2.4 10×LAMP扩增缓冲液：含200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、100mmol/L硫酸铵、500mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1％Tween20。
2.5 引物：根据铜绿假单胞菌的ETA基因保守序列，设计一套LAMP特异性引物。
外引物F3：5'-TCTTCGGGCAGCTCCG-3'
外引物B3：5'-TGGAGGTTGGCCGAACTC-3'
内引物FIP：5'-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3'
内引物BIP：5'-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCCCCGAAACCG-3'
环引物LoopF：5'-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3'
环引物LoopB：5'-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3'
2.6 100mmol/L MgSO4。
2.7 10mmol/L dNTP(2'-脱氧核苷酸-5'-三磷酸)混合物：包含四种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，每种核苷酸浓度10mmol/L。
2.8 Bst DNA聚合酶：8U/μL。
2.9 显色液：SYBR Green I染料，1000×。
2.10 甲酸。
2.11 乙腈。
2.12 乙酸。
2.13 三氟乙酸。
2.14 标准品Bacterial Test Standard(BTS)。
2.15 基质HCCAportioned。
3 质控菌株：绿脓杆菌ATCC10145、绿脓杆菌ATCC27853、门多萨假单胞菌CGMCC1.1768、荧光假单胞菌CGMCC1.1823、恶臭假单胞菌CGMCC1.1839、产氮假单胞菌CGMCC1.1792、伦敦沙门氏菌CMCC50106、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单增李斯特菌CMCC54002、阪崎 肠杆菌IQCC10403、副溶血性弧菌CICC 21617、大肠杆菌CMCC44102、大肠杆菌O157NCTC12900。
4 方法检测程序见图4。
绿脓杆菌外毒素A(ETA)是铜绿假单胞菌最具毒性的胞外产物，在铜绿假单胞菌种内广泛分布，且ETA基因在铜绿假单胞菌中高度保守。本方法基于LAMP技术和MALDI-TOF-MS技术的特点，以铜绿假单胞菌特有的ETA保守序列为靶基因序列，针对靶基因的6个独立区域设计2对特异内外引物，利用DNA聚合酶启动循环链置换反应，在等温条件下对铜绿假单胞菌一次增菌后的增菌液提取的DNA模板，63℃左右40min条件下可特异、高效、快速地完成核酸扩增。扩增结果通过对比观察判定，或通过浊度仪观察，扩增浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；扩增浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。对判定为阳性样品增菌液接种选择性平板分离，挑取平板上典型或可疑菌落，利用MALDI-TOF-MS技术鉴定快速鉴定出结果。
本发明提供的快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，与现有技术相比具有以下有益效果：
1.本方法采用的环介导等温扩增技术(LAMP)技术利用链置换DNA聚合酶在等温条件下进行反应，40min内可完成核酸扩增反应，扩增结果通过可视化对比观察判定，或通过浊度曲线判定。检测过程不需要昂贵的仪器设备，反应过程不需要模板的热变性、长时间的温度循环，扩增产物不需要繁琐的电泳过程，结果直观，快速灵敏，特异性强，检测成本低，适合即时、现场初筛，如果现场初筛为阳性，即可有目的的抽样送检实验室，检验监管中不但反应速度快，针对性强，而且节约时间，不仅适用于卫生防疫及卫生监督部门，还适用于企业及家庭卫生的检测；
2.本方法采用的MALDI-TOF-MS技术主要基于各种细菌本身的蛋白质组成和分子量，利用MALDI BioTyper仪器测定细菌特有的蛋白质谱指纹图谱，并与已知数据库细菌的质谱图进行比较，从而对未知细菌进行鉴定。该技术可检测的分子量范围很大，仪器操作简单，扫描速度快，具有灵敏度高、特异性强及重复性大等特点，该方法高度自动化，减少实验误差，其结果明确、唯一，不需要其他附加实验，靶板可重复使用，节约检测成本；
3.本方法结合两种技术特点，使一种致病菌的鉴定简单的分为3步：LAMP技术初筛→细菌分离→MALDI-TOF-MS技术鉴定，本方法操作简单、快速、高效，特异性强，灵敏度高，结果观察方便、直观，适宜基层推广应用；
4.本方法大大缩短了检测时间，传统的铜绿假单胞菌检测方法得到阴性检测结果需要2d～5d，阳性检测结果需要4d～6d，本方法阴性检测结果只需1d，阳性检测结果只需2d。
附图说明
图1为1～8号、9～14号、15～20号、21～25号、29～33号、34～38号、39～42号样品LAMP扩增曲线图；
图2为1～8号、9～14号、15～20号、21～25号、29～33号、34～38号、39～42号样品LAMP扩增吸光度图；
图3为部分铜绿假单胞菌及其对照MALDI BioTyper鉴定图谱；
图4为方法检测程序。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例，并配合附图进行详细描述。
实施例1
一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品增菌
无菌方法打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，在电子天平上准确称取剪下的样品25g，剪碎后加入到盛有225mL SCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀。将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养24h±2h。
步骤二：LAMP试验
2.1)DNA模板的制备：取1mLSCDLP增菌液放入1.5mL灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；加入1mL灭菌双蒸水混匀，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，高速冷冻离心机内10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，可-20℃存放备用。
2.2)LAMP扩增反应
2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管。扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，颠倒混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL。
表1 反应体系
2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照
每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照。
空白对照：以水代替DNA模板。
阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
2.2.3)加样
将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL。盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec。
2.2.4)上机反应
将反应管置水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min。
2.2.5)初步观察结果
2.2.5.1)可视化观察结果
反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察。先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；
2.2.5.2)浊度仪结果
反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效。样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。
步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定
3.1)分离
取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果。
3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认
3.2.1)配制标准品和基质
配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸。
标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial TestStandard，BTS)，加入标准溶剂50μL。使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末。室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用。
基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂(终浓度10mg/mL)，振荡混匀，直到形成澄清溶液。
3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定
挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干。将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果。
步骤四 结果报告
根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果。初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。
实施例2
一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品增菌
无菌方法打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，在电子天平上准确称取剪下的样品25g，剪碎后加入到盛有225mL SCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀。将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养24h±2h。
步骤二：LAMP试验
2.1)DNA模板的制备：取1mL SCDLP增菌液放入1.5mL灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；加入1mL灭菌双蒸水混匀，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，高速冷冻离心机内10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，可-20℃存放备用。
2.2)LAMP扩增反应：
2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性 对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管。扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，颠倒混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL。
表1 反应体系
2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照
每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。
空白对照：以水代替DNA模板。
阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
2.2.3)加样
将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL。盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec。
2.2.4)上机反应
将反应管置水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min。
2.2.5)初步观察结果
2.2.5.1)可视化观察结果
反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察。先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果沉淀现象不明显，在反应管中加入1000×SYBRGreen I染料2μL，轻轻混匀，立即观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。空白对照、阴性对照、阳性对照成立，才能判定样品的检测结果，样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化都判定为阳性结果。
2.2.5.2)浊度仪结果
反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效。 样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。
步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定
3.1)分离
取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果。
3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认
3.2.1)配制标准品和基质
配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸。
标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial TestStandard，BTS)，加入标准溶剂50μL。使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末。室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用。
基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂(终浓度10mg/mL)，振荡混匀，直到形成澄清溶液。
3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定
挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干。将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果。
步骤四 结果报告
根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果。初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。
实施例3
一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品增菌
无菌方法打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，在电子天平上准确称取剪下的样 品25g，剪碎后加入到盛有225mL SCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀。将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养24h±2h。
步骤二：LAMP试验
2.1)DNA模板的制备：取1mLSCDLP增菌液放入1.5mL灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；加入1mL灭菌双蒸水混匀，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，高速冷冻离心机内10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，可-20℃存放备用。
2.2)LAMP扩增反应：
2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管。扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，颠倒混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL。
表1 反应体系
2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照
每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照。
空白对照：以水代替DNA模板。
阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板。
2.2.3)加样
将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL。盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec。
2.2.4)上机反应
将反应管置水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min。
2.2.5)初步观察结果
2.2.5.1)可视化观察结果
反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察。先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果沉淀现象不明显，在反应管中加入1000×SYBRGreen I染料2μL，轻轻混匀，立即观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。空白对照、阴性对照、阳性对照成立，才能判定样品的检测结果，样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化都判定为阳性结果。
2.2.5.2)浊度仪结果
反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效。样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。
步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定
3.1)分离
取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果。
3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认
3.2.1)配制标准品和基质
配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸。
标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial TestStandard，BTS)，加入标准溶剂50μL。使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末。室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用。
基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂(终浓度5mg/mL)，振荡混匀，直到形成澄清溶液。
3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定
挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干。将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果。
步骤四 结果报告
根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果。初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。
方法稳定性测试：
1)准备样品
1.1)样品收集
收集不同纤维组成的样品和不同用途的样品共28份，包括：各种颜色新棉布5份，新棉麻布1份，丝织品1份，毛线衣服料1份，棉线2份，涤纶布1份，混纺平布1份，粗棉布1份，油布1份，帆布1份，府绸布1份，牛仔布1份，灯芯绒布1份，雪纺布1份，绸缎布1份，锦纶布1份，纺绸布2份，天鹅绒布2份，真丝料子2份，经水漂洗后晾干每一份样品装入一个无菌采样袋中做高压灭菌处理。分别编号1、2、3、4、……、28，各编号内样品种类随机。另收集14个传统方法检测阳性的样品，包括：宾馆用毛巾2个，医院床单5个，医院枕套2个，医院用被套1个，护士服1套，旅馆被罩1个，旅馆毛巾2个，火车卧铺床单1个，分别编号29、22、23、24、……、42。
1.2)样品制作
取质控标准菌株绿脓杆菌ATCC10145、绿脓杆菌ATCC27853、门多萨假单胞菌CGMCC1.1768、荧光假单胞菌CGMCC1.1823、恶臭假单胞菌CGMCC1.1839、产氮假单胞菌CGMCC1.1792、伦敦沙门氏菌CMCC50106、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单增李斯特菌CMCC54002、阪崎肠杆菌IQCC10403、副溶血性弧菌CICC 21617、大肠杆菌CMCC44102、大肠杆菌O157NCTC12900，分别接种300mL营养肉汤中复活，培养后的肉汤各取10mL进行混合，将混合菌液接种平板，经平板计数，铜绿假单胞菌的原始菌液浓度为4.3×109CFU/ml，10倍倍比稀释后，选取高浓度菌液(4.3×105CFU/mL)人工污染1～10号样品隔夜放置，取低浓度菌液(4.3CFU/mL)人工污染11～25号样品隔夜放置。
2)测试
同时对1～42号样品按照新建方法进行检测。图1为1～42号样品LAMP扩增曲线图；图2为1～42号样品LAMP扩增吸光度图；对LAMP检测阳性结果分离出单个菌落，利用MALDI-TOF-MS技术鉴定，图3为部分铜绿假单胞菌及其对照MALDI BioTyper鉴定图谱，最终1～10号、11～25号、29～42号样品全部检出铜绿假单胞菌，与预期结果一致，具体结果见 表2。
表2 42个样品检测情况
由表2可以看出，人工添加无论是高浓度水平(4.3×105CFU/mL)还是低浓度水平(4.3CFU/mL)，LAMP都能预期检出，而经过选择性增菌后，MALDI-TOF-MS鉴定准确率 也达到100％，利用该方法大大缩短了检测时间，阴性检测结果只需1天，阳性检测结果只需2天。本方法使用LAMP技术和MALDI-TOF-MS科学结合，既简易、经济，又具有高通量特点，适合即时、现场检测，如果现场检测为阳性，即可有目的地抽样送检实验室，检验监管中不但反应速度快、针对性强，而且节约时间。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品增菌
用无菌的方式取样、增菌培养，得增菌液；
步骤二：LAMP试验
2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；
2.2)LAMP扩增反应
2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管；扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混合混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；
表1 反应体系
2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照
每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；
空白对照：以水代替DNA模板；
阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；
2.2.3)加样
将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL；盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec；
2.2.4)上机反应
将步骤2.2.3)离心后的反应管置于水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min；
2.2.5)初步观察结果
2.2.5.1)可视化观察结果
反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察；先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如结果为阳性或可疑，继续进行步骤三的鉴定；
2.2.5.2)浊度仪结果
反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效；样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性；
步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定
3.1)分离
取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h；铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素；挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果；
3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认
3.2.1)配制标准品和基质
配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；
标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial Test Standard，BTS)，加入标准溶剂50μL；使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末；室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用；
基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂，振荡混匀，直到形成澄清溶液；
3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定
挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干；将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDIBiotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果；
步骤四：结果报告
根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果；初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤(一)中取样、增菌培养为无菌方法打开送检纺织品样品，用无菌剪刀均匀剪样，在电子天平上准确称取剪下的样品25g，剪碎后加入到盛有225mL SCDLP液体培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，充分混匀；将制备好的样品放入36℃±1℃恒温培养箱中，增菌培养24h±2h。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤2.1)中DNA模板的制备：取1mLSCDLP增菌液放入1.5mL灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；加入1mL灭菌双蒸水混匀，高速冷冻离心机内10000r/min离心5min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，高速冷冻离心机内10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，可-20℃存放备用。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤2.2.5.1)中：如果沉淀现象不明显，在反应管中加入1000×SYBR Green I染料2μL，轻轻混匀，立即观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性；空白对照、阴性对照、阳性对照成立，才能判定样品的检测结果，样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化都判定为阳性结果。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：步骤3.2.1)中配制基质的浓度不大于10mg/mL。
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