CN102272597A

CN102272597A - 分析物检测试验

Info

Publication number: CN102272597A
Application number: CN200980153782XA
Authority: CN
Inventors: K·F·伯特; E·努希杰; P·马尔瓦尼
Original assignee: University of Melbourne; Genera Biosystems Ltd
Current assignee: University of Melbourne; Genera Biosystems Ltd
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-11-20
Also published as: BRPI0921591A2; CA2744331C; NZ597114A; AU2009317878B2; CA2744331A1; NZ592953A; EP2368115A4; JP5588454B2; MX2011005366A; ES2545232T3; AU2009317878A1; JP2012509070A; EP2368115A1; US8617824B2; CN102272597B; US20110256528A1; EP2368115B1; WO2010057264A1

Abstract

快速且灵敏的分析物检测试验是基于荧光标记的微球体颗粒的回音壁模式。将分析物(如核酸)的配体锚定颗粒。荧光标记可以包含荧光团或量子点。在后一种情况中，颗粒可以包含蜜胺甲醛。试验可以用于检测含水样品中的分析物。

Description

分析物检测试验

申请数据

本申请与2008年11月21日提交的发明名称为“分析物检测试验”的澳大利亚临时专利申请No.2008906057相关并要求其优先权，在此将其全部内容引入作为参考。

技术领域

本发明涉及分析物检测的领域。更特别地，本发明涉及使用基于回音壁模式(WGM)的试验进行生物传感并且快速而灵敏地检测分析物。

背景技术

本说明书中作者参考的出版物的书目详细内容在描述的结尾处集中按字母顺序给出。

本说明书中对任何现有技术的参考不是并且不应当认为是该现有技术形成任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

单片共振器中的环路光学模式称为“回音壁模式”(WGM)或“形态依赖性共振”(MDR)。这样的模式或共振是通过来自共振器边界的全内反射支持的封闭光轨迹(直立光波)。通过球形电介质腔表面内的近-全内反射限制特定发射剖面的直立光波时，产生了WGM(Moller等，Applied Physics Letters 83(13)：2686-2688，2003)。

WGM技术详细描述于国际专利申请No.WO2005/116615中，在此将其引入作为参考。WGM技术部分是基于荧光团能够产生与众不同的WGM特征的现象预测的。将荧光团结合至量子点上，通过扩散使量子点进入微粒中或可以在其制备过程中掺入。荧光团的类型不受限制，并且可以是例如有机染料、基于稀土的生光团、各种形态和组成的半导体纳米晶体、磷光体或照亮时发射光的其他材料。然后将这种荧光团或其混合物结合微球体颗粒。当目标分析物与固定于微球体颗粒上的结合伴侣相互作用时，WGM特征产生变化，因此能够检测结合事件。

WGM只允许从颗粒中发射出来的特定波长的光。这种现象的结果是来自例如荧光团的常见宽发射(10-100nm宽)条带受到限制并显示为一系列有效地对应于颗粒内光的直立模式图型的锐锋形。WGM特征对微球体颗粒表面的变化非常敏感，并且当微球体颗粒与其环境中的分析物或分子相互作用时，WGM特征发生变化。

不同来源样品中的稀有分析物的检测需要灵敏、通用且实际的检测方法。需要设计提高WGM的灵敏度、通用性和实用性的方法，用于分析物的检测。

发明内容

本发明提供了一种基于回音壁模式(WGM)检测试验的灵敏方法和试剂，特别是，用于检测样品中的分析物。

特别地，本发明的目的是描述一种方法，通过该方法，利用WGM对环境的敏感性，可以常规地检测任何介质(液体或气体)中的未标记分析物。关于液体和气体，包括水溶液和生物缓冲液以及空气。

本发明的方法和试剂一部分是基于意想不到的确定：具有荧光团的微球体涂层本身，与使用离散的量子点相反，增强了基于WGM的检测的灵敏度。在另一部分中，颗粒(如，在其表面上具有功能化的化学基团的颗粒)的选择提高了量子点或直接荧光团涂层发生时的灵敏度。在另一部分中，选择相对于在其中进行试验的介质而具有较高折射率的颗粒。在一个实施方案中，微球体颗粒具有高于1.40的折射率。

因此，本发明的一个方面提供了介质中分析物检测的方法，该方法包括将覆盖荧光团的微球体和多个配体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件。

在另一个方面中，本发明提供了介质中分析物检测的方法，该方法包括将微球体和多个配体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件，其中微球体具有高于包含覆盖荧光团的分析物的介质的折射率。在一个实施方案中，微球体颗粒具有高于1.40的折射率。

本发明的另一个方面提供了检测分析物和配体之间的结合事件的方法，其包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

本发明的另一个方面包括，用于检测介质中的分析物的方法，包括步骤：

(i)将多个分析物的配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒，其中如果微球体颗粒是蜜胺甲醛，则其可以与荧光团偶联或包含量子点；

(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；

(ii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和

(iii)将微球体颗粒接受回音壁模式(WGM)检测工具，以检测结合事件。

在特定的实施方案中，通过化学部分，如使用叠氮化物、炔、胺、醛、硫酸盐或硫醇、羧基、羧酸盐和/或羟基，将微球体颗粒官能化。在一个方面中，微球体颗粒是胺-醛颗粒，如但不限于，蜜胺颗粒或蜜胺甲醛颗粒。

因此，本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的官能化微球体颗粒；(ii)将官能化的微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将官能化的微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

在特定的实施方案中，本发明提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的胺-醛微球体颗粒；(ii)将胺-醛微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将胺-醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将胺-醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

在最特别的实施方案中，胺-醛颗粒是蜜胺甲醛颗粒。

因此，本发明提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将蜜胺甲醛微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将蜜胺甲醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将蜜胺甲醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

当颗粒是蜜胺甲醛时，颗粒还可以包含量子点。因此，本发明的另一个方面是提供用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群包含荧光团覆盖的量子点的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群具有高于包含分析物的介质的折射率的微球体颗粒，微球体颗粒编码荧光团；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

本发明的再另一个方面提供了检测分析物的方法，该方法包括将至少一群微球体颗粒接触推定包含分析物的样品，其中微球体颗粒群内的每个颗粒包含应答红外线激励发射可见光辐射的荧光团和分析物的固定化推定结合伴侣，其中每个颗粒群具有限定的WGM特征，其中分析物与固定化结合伴侣的结合导致至少一群微球体颗粒的WGM特征发生变化，这表示了分析物的存在。

在一个实施方案中，分析物或其各自的配体包含选自核酸；蛋白；肽；抗体；脂质；碳水化合物；和任何小分子或化学个体的分子，包括细胞(例如，癌细胞)、细菌和病毒。

在特定的实施方案中，与微球体颗粒锚定的配体是核酸分子，待检测的分析物是互补核酸分子。

在另一个实施方案中，核酸配体或分析物是包含单链DNA序列的DNA分子。

本发明的另一个方面提供了一种方法的用途，该方法包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受试验制备中的WGM检测工具，以检测分析物和配体之间的结合事件。

在进一步的实施方案中，微球体可以是循环利用的。此外，试验可以在任何介质中进行，如空气或其他气体，或在液相中，如水溶液、生物缓冲液或复合的生物流体。

在另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其包含荧光团偶联的微球体颗粒和多个用于与其锚定的配体，用于通过WGM检测工具来检测配体和分析物之间的结合事件。

在特定的实施方案中，试剂盒包含荧光团偶联的微球体颗粒，多个配体已经与其结合。当颗粒是蜜胺甲醛时，荧光团可以覆盖在有机染料或量子点上。

在进一步的方面中，本发明提供了包含WGM检测工具的生物传感器，其中生物传感器是包含粉末来源、光源、样品操纵室和分光光度计的自给装置。

核苷酸和氨基酸序列通过序列识别号(SEQ ID NO)来表示。SEQ ID NO用数字对应于序列识别号<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。表1中提供了序列识别号的概括。在权利要求之后提供了序列表。

表1中提供了贯穿本说明书中所用的序列识别号的概括。

表1

序列识别号的概括

附图说明

一些图包含颜色表现或实体。在需要时，彩色照片可以获自专利权所有人或合适的专利局。如果获自专利局，可能需要费用。

图1是WGM DNA生物传感的图示，证明了结合后一致且可测量的转移。已经在含有pH缓冲剂和电解质的水溶液中进行了这些测量。将珠子或微球体颗粒接触核酸分析物(其与锚定珠子表面的核酸分析物-结合伴侣互补)后，对珠子9、10、11和12观察到了WGM特征的可证明转移(各自为A、B、C和D)。每个珠子的直径为5.6μm。

图2是WGM检测工具和装置的图示。

图3是用6.3μW、50.2μW、214.5μW和1,160.5μW的入射光产生的WGM光谱的图示(各自为A、B、C和D)。光源具有532nm的波长，并且曝光时间为200ms。

图4是用入射光(532nm，50μW)照射微球体颗粒10、60、200和1,000ms后产生的WGM特征的图示(各自为A、B、C和D)。可见度逐渐降低至5秒曝光时间(E)。

图5是固定于玻璃盖玻片表面上的本发明的微球体颗粒的像片。

图6是显示用硫醇基团官能化的硅石颗粒的简化化学反应步骤的图示。通过共价结合，实现了荧光标记的丙烯酰-单链寡核苷酸片段的偶联。该过程导致非常节约成本的传播WGM的荧光微球体的装备。

图7是显示了作为记录的试验阶段函数的来自单个微球体的四个主要WGM峰的峰位置曲线的图示。该曲线清楚地证明了四个主要的峰在杂交过程中的红移，在变性过程中的蓝色转移和重新暴露于目标时再次的红移。

图8是显示了颗粒合成和WGM杂交试验的概括的图示。部分A)表示70个碱基enl寡核苷酸修饰的7.50μm SiO₂微球体的关键特征。TMR＝染料标记四甲基若丹明；部分B)将颗粒试验平板制备颗粒固定于杂交底物上，接着获取发射信号(预处理)；部分C)用DNA探针或对照溶液处理试验平板，接着是底物洗涤和最终的发射信号获取；部分D)最终步骤涉及来自单个颗粒的前/后-发射信号的分析，将来自所获得光谱的峰位置进行比较，以确定处理溶液的作用。

图9是显示了典型的WGM发射信号输出和单个颗粒光谱的图示。使用两套WGM特征装置，从激发的7.50μm寡修饰的硅石颗粒在空气中捕获的典型发射信号，A)与Ocean Optics光谱仪连接(±0.9nm)和B)Triax光谱仪(±0.05nm)；C)单个颗粒光谱学的概念，示意图显示了两个颗粒，标记的微球体A和B，各自来自相同样品，两个颗粒同样是化学修饰的。注意到获自单个颗粒的发射信号显然是独一无二的。

图10是显示了来自基于浓度的cDNA杂交试验中所用的传感器选择的单个微球体光谱移动数据的图示。A)在四个参照波长下相对所示cDNA浓度的杂交前(绿线实心方块)和杂交后(红线实心星形)作出曲线的峰位置。在选定的颗粒中在所有的杂交后WGM信号中注意到可观察的移动。当用cDNA浓度10^-7至10^-14M杂交70个碱基寡核苷酸修饰的颗粒时，在得到的模式特性中注意到可重复的红色移动，而在对照组中，没有明显的连续的峰移动；B)作为cDNA浓度函数的移动(Δλ)。关于λ_max峰置换的误差计算为±0.44nm；C)峰位置分析在暴露于非标记的互补DNA的10^-18M浓缩样本前和后的相同enl靶颗粒。结果表明在暴露于阿托摩尔(attomole)浓缩的非标记DNA探针溶液后每个荧光团的峰红色移动。

图11是用于使用标记的单链寡核苷酸片段官能化原料蜜胺甲醛(MF)颗粒的反应化学的图示。注意到反应仅使用缓冲液在室温下以单个步骤完成。片段与颗粒表面上的-NH基团共价结合。

图12是显示通过80W水银灯和420-490nm滤块获得的颗粒激发的图示。在空气和水中从7.50μm 30个碱基(TMR)寡-修饰的微球体捕获发射信号。A)硅石；B)蜜胺。将微球体浸入单滴Milli-Q中，并通过光谱分析，在空气中进行扫描之前，将水蒸发掉。注意到在激发的蜜胺颗粒实例中，在加入水后，仍然可以观察到WGM发射信号。在寡核苷酸官能化之前，从单个7.52μm MF颗粒获取基线光谱，通过2s积分使用TRIAX 550光谱仪(±0.05nm)；C)空气；D)溶液(Mill-QH₂O)。

图13是显示发射信号测量的图示，使用获自几种复合材料的试验平板来进行测量；通过80W水银灯和420-490nm滤块获得颗粒激发。A)硅石栅格的试验平板；B)基于聚合物的96孔细胞培养物平板；C)聚碳酸酯384细胞孔平板；D)384孔光度微量滴定平板。

图14是显示寡核苷酸(TMR)官能化7.52μm MF颗粒的热稳定性分析。在90℃的恒定加热下，将颗粒浸入Milli-Q、缓冲液或MES(pH5.4)中的溶液中，超过3hr的时间段。使用80W水银灯和420-490nm滤块，从每个测试颗粒收集WGM。注意到在MES中加热的选定颗粒相对于选定的PBS处理的(黑色光谱)和Milli-Q处理的(灰色光谱)寡-修饰的MF颗粒，呈现出明显的WGM发射信号减弱(点线光谱)。

图15是显示了热循环杂交结合试验的图示。使用连接共焦/TRIAX设备的热调节镜台，形成了两步温度梯度(37℃-72℃)。目标DNA(T_m＝71.2℃)与连接颗粒的rs10434目标片段互补。使用Milli-Q H₂O(对照)和目标DNA，在单个微球体上完成了杂交循环。在每个温度梯度下捕获荧光信号，并观察Δλ。A)对照杂交循环一；B)对照杂交循环二；C)目标探针杂交循环一；D)目标探针杂交循环二。在最大循环温度(72℃)时所有荧光峰蓝移[只有目标DNA时]存在时和阶段温度小于目标探针T_m时红移。

图16(A)和(B)是图示，其显示(A)蜜胺珠子WGM实线：实线是在空气中获得的单个蜜胺甲醛珠子的WGM。以点线显示了含水介质中获得的光谱；(B)硅石珠子WGM：实线是在空气中获得的单个硅石珠子的WGM。以点线显示了含水介质中获得的光谱。水中的获取产生了非常微弱的荧光，并且没有WGM。

图17是抗体WGM免疫试验的图示。将用FITC标记的人α-IgM抗体官能化的单个7.52μm MF颗粒固定于单个微孔中。整个试验在室温下进行。通过Ar+激光来激发未处理的颗粒，以获得参照信号，然后用Milli-Q处理，接着用未标记的人IgM。相对于未处理的WGM，代表性的峰-组表示了IgM处理后形成的几个纳米的典型红移。在添加30min后，注意到最小的移动。通过Triax550/CCD共焦装置获取了光谱(光谱分辨率±0.05nm)。

具体实施方式

在整个说明书中，除非文中需要另外指出，词语“包含(comprise)”，或其变形，如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，将理解为表示包括所述的要素或整体，或要素或整体的组，而且不排除任何其他要素或整体，或要素或整体的组。

如本发明说明书中所用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另外清楚地指出。因此，例如，关于“一种配体(a ligand)”包括单种配体，以及两种或多种配体；关于“一种分析物(an analyte)”包括单种分析物，以及两种或多种分析物；关于“该荧光团”包括单种荧光团，以及两种或多种荧光团；关于“本发明”包括本发明的单个或多个方面；等等。

本发明提供了多个与荧光团覆盖的微球体颗粒连接的分析物-结合伴侣或配体。当照亮这些颗粒时，发射出“基线”回音壁模式(WGM)光谱或特征。每个微球体颗粒群具有独特的WGM基线信号。通过分析物与微球体颗粒表面上的分析物-结合伴侣或配体的结合来改变这种基线特征，引起WGM光谱的可检测移动。

本发明的微球体颗粒包含用荧光团覆盖的微球体，其在照亮时，发射出荧光。在微球体内捕获发射的光，并在球内共振，形成称为回音壁模式或“WGM”的离散波长的光谱。与使用离散的量子点相对，用荧光团覆盖微球体颗粒增强了基于WGM的检测的灵敏度。本发明扩展至用荧光团覆盖的微球体颗粒(即，没有使用量子点)或结合使用量子点和蜜胺甲醛颗粒。还在微球体颗粒相对于包含分析物的介质具有较高折射率的基础上来选择微球体颗粒。在一个实施方案中，微球体颗粒具有高于1.40的折射率。

如在此所用的，术语“量子点”或“QD”理解为包括本领域已知的诸如半导体纳米颗粒、纳米晶体、量子点或Q颗粒这样的颗粒。

术语“微球体颗粒”和“微球体”在此可以互换使用，并包括任何同质或相反材料的球形颗粒，其可以基于荧光团产生一个或多个WGM特征。如本领域技术人员将清楚的，几乎所有同质或相反的任何材料可以用于微球体颗粒。在此考虑的微球体颗粒还可以包含超过一种物质，并且同样可以包含外壳、合金或有机和/或无机物质的混合物。如果微球体颗粒包含基本上均质的具有各向同性折射率并且还是非吸收性的材料(除了荧光团以外，其将在以下进一步描述)，对于通过本发明的方法所产生数据的定量将是有利的。

本发明的微球体颗粒包含选自以下列表的材料：蜜胺或其化学衍生物，如蜜胺甲醛；硅石；乳胶；氧化钛；二氧化锡；氧化钇；氧化铝；其他二价金属氧化物；钙钛矿和其他压电金属氧化物；PLGA；蔗糖；琼脂糖；和其他聚合物。

在特定的实施方案中，通过化学部分将微球体颗粒官能化，如使用胺、醛、硫酸酯或硫醇、羧基、羧化酶和/或羟基。在一个方面中，微球体颗粒是胺-醛颗粒，如但不限于蜜胺甲醛(MF)颗粒。对于待结合的丙烯酰修饰的目标寡核苷酸和蛋白质，MF颗粒提供了强有力的偶联基质。在暴露于高pH溶液和极端温度后，共价键保持完整，因为可以在处理后获取高质量的WGM。

蜜胺是氨腈的三聚物，并且也称为：1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺；2，4，6-三氨基-s-三嗪；三聚氰酰胺；三聚氰胺或氰尿酰胺。在特定的实施方案中，蜜胺是蜜胺甲醛。

本发明还扩展至磁性颗粒在WGM试验中的用途。这样的颗粒可以存在于非常精确的固定位置中。磁性促进的颗粒固定使得可以进行离散单颗粒试验并减少制造定制固定基质的需要。

在特定的实施方案中，选择支持溶液中的WGM的高折射率颗粒，如硅胶、氧化锆或氧化钛。或者，用较高折射率的材料做成微球体的壳，这提供了有用的理想传感器平台。这些颗粒在吸收层内含有高阶径向模，并且作为结果，应当能够获取高Q WGM光谱，其含有高阶模。

使用半导体纳米晶体(例如，CdSe、CdTe、CdS)提供了另一种强荧光替换物。通过将单层纳米晶体吸附至同质微球体，接着稳定高折射率外壳来产生支持溶液中WGM的荧光稳定颗粒。以下提供了可购得的高折射率材料和颗粒的列表。

术语荧光团是常规的并且不限于有机染料，而且包括具有照明时发射明确波长光特性的任何化学物、分子或材料。这包括但不限于：有机染料、有机金属复合物、量子点(包括纳米棒、纳米丝和其他形态学的、覆盖和未覆盖的QD、合金及其混合物)、稀土离子或其混合物、上变频器以及红外线发射荧光团，这在吸收样品中是有利的。还可以结合其他材料，如缺陷荧光材料，如含有氮的钻石诱导的缺陷或空白。

可以通过连接微球体表面的荧光团来产生WGM，也可以在将荧光团包埋或分布在微球体内时产生。荧光团的分布影响不同模式的WGM的强度，但对于本发明的目的，在微球体表面上或在微球体内的荧光团之间没有形成区别。

本发明一部分是基于以下的确定：WGM检测工具不需要用量子点覆盖微球体。

因此，本发明的一个方面提供了介质中的分析物检测方法，该方法包括将用荧光团和多个配体覆盖的微球体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件。

在另一个方面中，本发明提供了介质中的分析物检测方法，该方法包括将微球体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件，其中微球体具有高于介质的折射率，所述介质包含用荧光团覆盖的分析物和多个配体。

本发明的另一个方面提供了检测介质中分析物的方法，包括步骤：

(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；

关于“覆盖的”或“偶联的”，应当理解为指的是在没有量子点或其功能性等价物的帮助下，微球体颗粒表面上的荧光团的结合。

如在此所用的，术语“荧光团”指的是呈现出荧光特性的任何分子。对于在此的目的，术语“荧光”可以定义为分子吸收特定波长的光和再发射较长波长的光的特性。波长变化涉及过程中发生的能量损耗。术语“荧光团”可以包括各种荧光团，如化学荧光团和染料。

可以选择荧光团以在任何波长发射，在该波长下可以容易地分辨WGM特征。这取决于发射波长与颗粒半径的比。如果球半径是任意的，因此可以从紫外线(约350nm至约3nm的波长范围)、可见光(约350nm至约800nm的波长范围)、近红外线([NIR])(约800nm至约1500nm的波长范围)和/或红外线([IR])(约1500nm至约10μm的波长范围)范围中合适地选择发射。然而，由于容易检测，在一个特别优选的实施方案中，荧光团在可见波长范围中是可检测的。

在一个特定的实施方案中，荧光团应答红外线激发而发射可见光辐射。在此也将这样的荧光团称为“上变频器”。

因此，本发明的另一个方面提供了检测分析物的方法，该方法包括将至少一群微球体颗粒接触推定包含分析物的样品，其中微球体颗粒群内的每个颗粒包含荧光团(其应答红外线激发而发射可见光辐射)和固定的推定的分析物的结合伴侣(其中每个颗粒群具有限定的WGM特征)，其中分析物与固定的结合伴侣的结合导致了与基线WGM特征相比时至少一群微球体颗粒的WGM特征的变化，这表示了分析物的存在。

在特定的实施方案中，通过化学部分，如使用胺、硫醇和/或醛基、硫酸酯、羧酸酯、羟基、axide和/或炔，将微球体颗粒官能化。此外，基于胺-醛的颗粒，如蜜胺甲醛，提供了用于待结合的丙烯酰修饰的目标寡核苷酸和蛋白的有用基质。

因此，本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团-偶联的官能化微球体颗粒；(ii)将官能化的微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将官能化的微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

在最特别的实施方案中，胺-醛颗粒是蜜胺甲醛。因此，本发明提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤；(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将蜜胺甲醛微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将蜜胺甲醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将蜜胺甲醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

当颗粒是蜜胺甲醛时，还可以使用量子点。

因此，本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群包含荧光团覆盖的量子点的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群具有比包含分析物的介质更高折射率的微球体颗粒；该微球体颗粒编码荧光团。(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。

对荧光团唯一的限制是发射应当导致空腔谐振模发射，并且本发明的荧光团特别地排除量子点。

存在许多本领域中可获得的可以用作根据本发明的荧光团的荧光染料。荧光染料或其他荧光团的重要特性是荧光团的激发波长，这决定了其的使用潜能；其必须与光源可获得的波长相适。然而，许多不同的荧光染料和其他荧光团将是本领域技术人员熟知的，并且荧光标记的选择决不限制本发明。

可以用于微球体颗粒标记的方便“荧光团”包括使用选自以下的光源可以激发的任何荧光标记：

(i)氩离子激光器-包括蓝色的488nm线，其适用于荧光在绿色至红色区的许多染料和荧光染料的激发。发射波长范围(特别是458nm、488nm、496nm、515nm)的可调氩激光器也可以获得。

(ii)二极管激光器-具有635nm的发射波长。现在可获得的其他二极管激光器在532nm下运行。该波长最理想地激发碘化丙啶(PI)。发射大约476nm光的蓝色二极管激光器也是可获得的。可以方便地将这些二极管激光器用于激发微球体颗粒内的WGM。

(iii)HeNe气体激光器-用红色633nm线运行。这样的激光器可以方便地用于激发微球体颗粒内的WGM。

(iv)发光二极管(LED)

(v)HeCd激光器-在325nm运行。这样的激光器可以方便地用于激发微球体颗粒内的WGM。

(vi)100W水银弧光灯-用于激发UV染料(如，Hoechst和DAPI)的最有效光源。

(vii)Xe弧光灯和石英卤素灯-可以用作激发WGM的工具，并因此利用颗粒作为传感器。

在本发明的特定实施方案中，荧光素标记选自：Alexa荧光素染料；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；Cy染料，特别是Cy3、Cy5和Cy5.5；6-FAM(荧光素)；荧光素dT；六氯荧光素(HEX)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)；Oregon绿色染料，包括488-X和514；若丹明染料，包括若丹明绿，若丹明红和ROX；羧基四甲基若丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；和Texas红。

两种染色技术，内部染色和外部染色(表面标记)，通常用于荧光标记微球体颗粒。这两种技术产生了具有独特特性的颗粒，各自对于不同的应用是有益的。内部染色产生非常稳定的颗粒，典型地具有狭窄的荧光发射。这些颗粒通常呈现出对光褪色更高的抵抗性。因为荧光团是在颗粒的内部，表面基团可用于将配体(蛋白、抗体、核酸等)与珠子的表面偶联。为此，典型地将内部标记的颗粒用于分析物检测和免疫试验应用中。表面标记涉及荧光团与微球体颗粒表面的偶联。因为荧光团在颗粒的表面上，它们能够与它们的环境相互作用，正如染色细胞上的荧光团那样。该结果是颗粒标准：在各种不同的条件下，如存在污染物或pH变化，呈现出与染色的细胞样品相同的激发和发射特性。表面标记颗粒的“环境应答性”性质使其理想地适用于模拟生物样品。外部标记的颗粒常常用作各种利用荧光检测的应用中的对照和标准品。然而，本发明考虑了颗粒经由任何方式与荧光标记的结合。

如在此所用的，术语“荧光团”应当理解为还包括多重荧光团和荧光团的混合物。认为在微球体颗粒上使用所有这些荧光团在在此所述的方法和试剂的范围内。

根据本发明，已经显示出任何特定荧光团的发射取决于微球体颗粒中荧光团的分布，荧光团的类型和荧光团的浓度。然而，本发明的方法仍然是可实践的，与荧光团是否在微球体颗粒的表面，作为微球体颗粒内的外壳是否存在，是否位于微球体颗粒的核心或存在于超过一个的所述位置无关。

应当注意到本发明的方法不是基于猝灭来自荧光团的发射。然而，本发明的方法部分基于作为分析物与固定于微球体颗粒表面的结合伴侣的相互作用或结合的结果，荧光团的WGM特征的调节(即，变化)。

WGM，当涉及电磁辐射时，是入射光与折射率高于其周围介质的颗粒相互作用时可以建立的电磁共振。对于给定的粒径，在特定的光共振波长下，产生WGM，并且特别地，WGM的性质可以随着含有WGM的颗粒的大小以及颗粒和周围介质的折射率而改变。此外，颗粒的大小还可以影响其中建立的WGM。当入射光在颗粒表面经历全内反射时建立WGM。

可以在两种非吸收介质的界面产生全内反射(TIR)。在较高折射率的介质中传播的光束以高于临界角的入射角遇到较低折射率介质的界面时，在界面上反射全部的光并且传播回高折射率介质。如本领域技术人员显而易见的，在3-维介质中，光可以在较高折射率的颗粒内反射多次。在WGM中，光在颗粒周围附近集中，并可以指定模数和模阶。模数，n，提供了颗粒周围的波长数，模阶，l，提供了依赖于颗粒内电磁场的半径中最大的数量。

如在此所限定的，包埋于颗粒上的荧光团发射体，展示出限定的WGM特征。这些模式使得只有特定波长的光从颗粒中发射出来。这种现象的结果是荧光团通常相对宽的发射光谱(例如，荧光团典型地发射10-100nm宽带)变得受到限制并显示为一系列有效对应于颗粒内的光直立模式的尖“峰”。作为本发明的微球体颗粒中的WGM建立的结果，产生了这一系列的峰，在此称为“回音壁模式特征”或“WGM特征”。

WGM特征对包埋的荧光团的位置及其浓度和相对于彼此的立体构型非常敏感。颗粒大小和折射率是决定WGM特征中看到的发射波长的2个最重要的参数。

提出了WGM特征中一个或多个峰的位置和规模可能受到微球体颗粒与样品或外部环境中的分子相互作用或结合的强烈影响。

在一个实例中，分子与微球体颗粒的缔合或结合改变了微球体颗粒的有效折射率，改变了通过微球体颗粒产生的WGM特征。

本领域已知的多种方法适用于将荧光团与微球体的表面偶联。为了分子(包括荧光团或任何生物或化学分子)的疏水性吸附或共价连接，可以将微球体表面优化或官能化。本发明没有延伸至和特意排除使用量子点来标记微球体。

可以通过加入多种官能团将微球体的表面官能化，官能团包括；叠氮化物、炔烃、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、环氧化物、甲基丙烯酸酯、丙烯酰、胺、醛、硫酸酯或硫醇；羧基；羧酸酯；羟基；等。

在一个实施方案中，核酸分子与硅石微球体的硫覆盖的表面共价结合。使用用3-巯基丙基三甲氧基硅烷的硅烷化，接着彻底洗涤来形成这种表面。用5’硫醇或丙烯基团来制造核酸分子，例如，DNA寡核苷酸，并将其与表面上的游离硫结合。

决没有将本发明的配体限于任何一种并且包括选自以下的配体：核酸；抗体；肽；多肽；碳水化合物；脂质；糖蛋白；脂蛋白；脂肽；脂多糖；小的有机分子和小的无机分子。用抗原或抗体覆盖时，将颗粒用于“免疫-WGM”试验或“基于免疫的WGM”试验中。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物，正义和反义链，并且可以化学或生化修饰或可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员容易获知的。这样的修饰包括，例如，天然存在的核苷酸的一个或多个的标记、甲基化、用类似物(如，吗啉环)的取代，核苷酸间修饰，如不带电荷的连接(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)、带电的连接(例如，硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连接(例如，α-异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸的通过氢键和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。这样的分子是本领域已知的，并且包括，例如，其中肽连接替代分子主链中磷酸酯连接的那些。

术语“抗体”指的是免疫球蛋白家族的蛋白，其能够与抗原结合、相互作用或其他缔合。因此，抗体是抗原结合分子。在此所用的术语“抗原”以其最宽的意思来表示能够与抗体的抗原结合位点反应或结合抗体的抗原结合位点的物质。对于本发明，抗原还包括抗体的独特型。

在此所用的术语“免疫球蛋白”指的是由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。已知的免疫球蛋白分子包括κ、λ、α、γ(IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)、δ、ε和μ恒定区，轻链(κ和l)，以及繁多的免疫球蛋白可变区。一种形式的免疫球蛋白组成抗体的基础结构单位。该形式是四聚体，并且由两个相同的免疫球蛋白链对组成，每个对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区一起负责与抗原的结合，并且恒定区负责抗体效应物功能。除了抗体以外，免疫球蛋白可以以各种其他形式存在，包括，例如，Fv、Fab、Fab’和(Fab’)₂和嵌合抗体，并且在此所用的术语“抗体”包括所有这些变体。此外，来自其他动物(例如，鸟类、哺乳动物、鱼、两栖类和爬行类)的免疫球蛋白具有相似功能，但命名不同，将这些也认为是“抗体”。

在一个实施方案中，分析物-结合配体是包含单链DNA突出物的DNA分子，并且待检测的分析物是能够与配体杂交的核酸分子。杂交发生时，可检测到WGM特征的移动。相反地，在互补核酸序列之间不存在杂交时，没有发生WGM特征的移动。

在特定的实施方案中，分析物-结合伴侣或配体是通过以下方法制备的DNA：(i)用产生单链DNA突出物的酶消化双链DNA，例如，限制性内切核酸酶；和(ii)用核酸外切酶消化。所得到的消化DNA包含特别能够与互补单链核酸杂交的单链DNA。

如在此所用的“限制性内切核酸酶”意思是水解DNA分子内特定序列处的核苷酸的核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型和III型限制性核酸内切酶。

表2列出了产生4个碱基的5’-突出物的I型和II型限制性核酸内切酶的子集。

表2

I型和II型限制性内切酶4个碱基的5’-突出物

酶	突出物长度	序列
			BamHI	4	GATC
EcoRI	4	AATT
			HinDIII	4	AGCT
AflII	4	TTAA
			AgeI	4	CCGG
ApaLI	4	TGCA
			ApoI	4	AATT
BanI	4	可变
			BclI	4	GATC
BglII	4	GATC
			BsaI	4	可变
BsaJI	4	可变
			BsaWI	4	GGCC
BseYI	4	CCAG
			BsiWI	4	GTAC
酶	突出物长度	序列
			BsmAI	4	可变
BsmBI	4	可变
			BsmFI	4	可变
BsoBI	4	可变
			BspEI	4	CCGG
BshHI	4	CATG
			BspMI	4	可变
BsrFI	4	CCGG
			BsrGI	4	GTAC
BssHII	4	CGCG
			BssKI	4	CCNG
BssSI	4	TCGT
			BstEII	4	GTNA
BstYI	4	GATC
			BtgI	4	可变
DpnII	4	GATC
			EaeI	4	GGCC
KasI	4	GCGC
			MboI	4	GATC
MfeI	4	AATT
			MluI	4	CGCG
NcoI	4	CATG
			NgoMIV	4	CCGG
NheI	4	CTAG
			NotI	4	GGCC
PaeR7I	4	TCGA
			PspGI	4	可变
SalI	4	TCGA
			Sau3AI	4	GATC
SexAI	4	可变
			SfcI	4	可变
酶	突出物长度	序列
			SgrAI	4	CCGG
SpeI	4	CTAG
			StyI	4	可变
TliI	4	TCGA
			Tsp45I	4	可变
Tsp509I	4	AATT
			XbaI	4	CTAG
XhoI	4	TCGA
			XmaI	4	CCGG

表3列出了产生3’-突出物(最常见的长度为四个碱基)的I型和II型限制性内切酶的子集。

表3

I型和II型限制性内切酶3’-突出物，大部分4个碱基

酶	突出物长度	序列
			AatII	4	ACGT
ApaI	4	CCGG
			BanII	4	可变
Bme1580I	4	可变
			BsiHKAI	4	可变
Bsp1286I	4	可变
			BstXI	4	可变
FseI	4	GGCC
			HaeII	4	CGCG
Hpy99	4	可变
			KpnI	4	GTAC
NlaIII	4	GTAC
			NsiI	4	ACGT
酶	突出物长度	序列
			NspI	4	GTAC
PstI	4	TGCA
			SacI	4	TCGA
SphI	4	GTAC
			TspRI	8	可变

如在此所用的“外切核酸酶”意思是从DNA链的末端水解核苷酸的核酸酶。适用于制备分析物-结合配体和/或待检测的分析物的外切核酸酶的一个实例是拉姆达(λ)外切核酸酶。拉姆达外切核酸酶是双链DNA外切核酸酶，其以5’-至3’-方向降解双链DNA。拉姆达外切核酸酶需要DNA的5’-端是双链的并且是磷酸化的。拉姆达外切核酸酶消化可以优先用于降解双链DNA的特定链，以产生单链DNA分析物-结合配体和待分析的分析物。

在特定的实施方案中，用源自病原物(如病毒、细菌、酵母或寄生物)的核酸覆盖本发明的微球体颗粒。结合事件的检测表明样品中互补核酸的存在，并因此表示样品中和/或样品的来源中物质的存在。

如在此所用的“互补”指的是寡聚化合物的两个核碱基之间的精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸(寡聚化合物)特定位置的核碱基能够与目标核酸的特性位置的核碱基进行氢键合，所述目标核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，则寡核苷酸和目标核酸之间的氢键合的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置由彼此可以氢键合的核碱基占据时，寡核苷酸和更多的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。因此，“特异性可杂交”和“互补”是用于表示足够量的核碱基中足够程度的精确配对或互补性的术语，使得在寡核苷酸和目标核酸之间产生稳定和特异性的结合。

本发明对于测试单个样品中多种分析物的存在特别有用。

不需要知道待检测分析物的特性，也不需要用例如荧光或放射性标记来标记分析物或配体。

由于WGM检测工具的灵敏度，本发明对于检测以低浓度存在于样品中的稀有分析物是有用的。例如，在特定的实施方案中，本发明对于微量元素或污染物的检测是有用的，如食品或药品中的过敏原、热原和微生物或化学污染物；环境和工业样品中的污染物质或有毒物；爆炸物；生物恐怖剂；等。如在此所用的，术语“稀有”表示不常出现或罕见的或数量相对少或浓度相对低。

本发明对于之前未知能结合特定配体的分析物的鉴定也是有用的。例如，在本发明的特定实施方案中，用酶或受体分子覆盖微球体颗粒，其中催化位点或推定的配体-结合位点的构造是完整的。结合这些颗粒的分析物表示了酶活性或受体-配体结合的推定激动剂或拮抗剂。换句话说，本发明对于药物鉴定和设计是有用的。

合理药物设计允许产生目标生物活性多肽的结构类似物或与其相互作用的小分子(例如，激动剂、拮抗剂、抑制剂或增强剂)，以形成药物，例如其为活性更大的或稳定形式的多肽，或例如其增强或干扰体内多肽功能。参见，例如，Hodgson(Bio/Technology 9：19-12，1991)。在一种方法中，首先通过x-射线结晶学，通过计算机建模或最典型的通过这些方法的组合来确定目标蛋白的三维结构。还可以通过基于同源蛋白结构的建模来获得关于多肽结构的有用信息。合适药物设计的实例是HIV蛋白酶抑制剂的研发(Erickson等，Science 249：527-533，1990)。此外，可以通过丙氨酸扫描来分析目标分子(Wells，Methods Enzymol，202：2699-2705，1991)。在这种技术中，氨基酸残基被丙氨酸替换，并且测定其对肽活性的作用。以这种方式分析肽的每个氨基酸残基，以测定肽的重要区域。

在另一个实施方案中，本发明对于与特定的病理状况和疾病相关的基因或其编码蛋白的检测是有用的。例如，在特定的实施方案中，用已知在人癌肿中表达的特定配体或配体文库来覆盖本发明的微球体颗粒，或相反，用已知与该癌症相关的一种或多种抗原的特异性抗体或抗体文库来覆盖本发明的微球体颗粒。因此，结合事件的检测表示样品中存在已知与癌症相关的分析物。

由于其灵敏度，本发明的WGM检测工具特别提供了用于癌症早期检测的方法。

在进一步的实施方案中，待检测的配体或分析物包含单核苷酸多态性(SNP)或特定的翻译后修饰。

本发明的方法对于例如医药、兽医科学、农业、法医学、生物技术、食品技术、运动科学、营养科学、制造、药物设计和研发、生物防御、爆炸性物质的检测、杀虫剂、肥料和毒素领域中的数个应用是有用的。

此外，本发明的方法对于病理状况或疾病的诊断、天然样品中未知细菌或病毒或其他微生物的鉴定是有用的，病理状况或疾病包括遗传病、癌症、自体免疫失调、过敏、传染病、心脏病、神经病、蛋白质折叠错误病(proteopathy)和代谢疾病、病毒和细菌病和污染。

再进一步，本发明的方法对于组织分型、血液分型、遗传测试、药物测试、血液分析物的分析、醇测试、怀孕测试等特别有用。

本发明的方法对于筛选生物样品中分析物的存在特别有用。“生物样品”理解为源自生物来源的样品，如环境样品、生物体提取物、植物或动物提取物、血清、尿液、分泌液、精液、血浆、土壤样品、河流或密封样品、外星样品，其它来源等。

本发明的另一个方面提供了一种生物传感器。如在此所用的“生物传感器”意思是用于检测生化或化学物质的含量(包括非常小的量)或变化的传感器设备，其中记录分子间的结合事件，并翻译成数据。

如在此所用的“生物传感”意思是多种程序中的任何一种，其使用生物分子探针，通过将生化相互作用翻译成可定量的物理信号来测量生物分子、生物结构、微生物的存在或浓度等。

本发明的生物传感的应用决不受到限制并且包括：环境应用，例如，杀虫剂和河水污染物的检测；例如在反生物恐怖活动中空气传播的细菌或其孢子的遥测；病原体的检测；测定生物矫正之前和之后有毒物质的水平；有机磷酸盐的检测；生化分析物的常规分析测量；食品中药物残余物的检测，如抗生素和生长促进剂；药物发现和新化合物的生物活性的评价。

特别地，基于WGM检测系统，本发明提供了光学传感器。在特定的实施方案中，生物传感器是紧凑的并且是易携带的。本发明的生物传感器提供了一种用于分析物的快速和灵敏检测的工具。

在一个实施方案中，生物传感器特别适用于研究和分析实验室以及田间的方便使用。WGM检测装置本身适于设施独立、小型化和便于携带。重要地，这种适应性使得可以在工作台上或田间进行快速且方便的分析物检测，而不需要体积大的和昂贵的组件。

在本发明的特定实施方案中，WGM检测装置不需要大体积的电源或光源，也不需要昂贵的分光光度计或光学透镜。例如，一些实施方案提供了60X显微镜物镜，并且使用了非冷却的具有0.5nm缝隙宽度的分光光度计。在一些实施方案中，WGM检测装置是生物传感器。

根据本发明的方法，约10μW至约2000μW的电源足以产生WGM光谱数据。

在一个实施方案中，将本发明的荧光团偶联的微球体颗粒暴露于光约20-2000毫秒。根据本发明，532nM波长的光特别适于产生WGM光谱。

在特定的方面中，通过“焙固”于固体支持物基质(例如，玻璃)来固定本发明的微球体颗粒。固体支持物包含红外线、可见光和紫外线光谱中的光可以通过其穿行的材料。

在一个实施方案中，在高于40℃的温度下持续超过10分钟的时间将微球体干燥至玻璃表面。

系统的关键需求是可以自动比较光谱并可以定量结合前后之间的差异。通过使用时间模式光谱的对数变换实现了此。

本发明还提供了用于通过WGM工具检测分析物的试剂盒。这样的试剂盒包含荧光团偶联的微球体颗粒，与其连接多个分析物-结合配体。在一个实施方案中，将微球体颗粒固定于玻璃表面上。可以设计多个待锚定于微球体颗粒的配体，以检测特定阵列的分析物。例如，在特定的实施方案中，测试环境样品中一种或多种公众健康重要的人病原的存在，例如，嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、结合杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。在一个实施方案中，用源自各种不同病原体的核酸文库覆盖微球体。用于锚定微球体颗粒的配体的组合没有限制。

当微球体颗粒是蜜胺甲醛时，试剂盒还可以含有量子点。

如在此所用的“环境样品”意思是从环境来源收集的任何材料的样本，环境来源如空气、水或土壤。如在此所用的“环境来源”涉及天然环境、人造环境或外星球环境。其他样品包括食物样品。因此，WGM试验对于食品工业、环境水测试、农业生产、生物恐怖测试和药物测试是有用的。

颗粒还可以循环，用于持续使用和高通量筛选。

WGM的变化表示分析物的存在。还可以从特定微球体的相对强度、线宽和WGM峰波长的变化收集更多的信息。

通过以下的非限制性实施例来进一步描述本发明。

实施例1

微球体颗粒(QSand-商标)与多个DNA配体的偶联证明了结合分析物时的WGM一致移动

荧光团偶联的微球体颗粒(Qsand[商标：硅石颗粒])与多个DNA配体的偶联证明了特异性分析物结合后的可测量且一致的差异。将直径为4.87、5.6、6.8或7.5μm的微球体颗粒与多个22-mer DNA分子偶联，该分子在核苷酸位置1具有TMR标记物。在与互补的22-mer杂交之前和之后获取了WGM(图1)。

实施例2

用于生物传感的WGM装置的优化

测定各种参数，以确定WGM检测系统是否适于小型化、设施独立和便于携带。

图2提供了WGM检测系统的图示。首先，改变光源的功率以测定其对WGM分辨率的作用。6.3、50.2、214.5或1160.5μW的光源(532nm，200毫秒)入射功率足以分辨WGM(图3B)。可以使用标准的低成本激光器(照明插座)获得这种功率。

改变激发时间，以测定其对WGM的作用。在入射光(50μW，532nm)暴露10、60、200和1000毫秒后测定WGM。测定了短如200ms的暴露时间足以分辨WGM(图4C)，降至5秒暴露时间具有可见性(图4E)。

显示了暴露于50微瓦功率光200毫秒对于高质量的WGM是足够的。

实施例3

WGM生物传感器原型

原型WGM生物传感器用来建立导致分析物与微球体颗粒结合之前和之后的充分分辨的WGM光谱的说明书。装置大约为30x15x15cm和2-5kg，并且是完全设施独立的，包含电源、光源、样品操作室和分光光度计。

实施例4

微球体颗粒固定

将微球体颗粒(QSand[商标：硅石颗粒])以随意的构型固定于玻璃显微镜载玻片的表面(图5)。含有固定的QSand(商标)颗粒的盖玻片能够与分光光度计的缝隙直接偶联。

实施例5

使用单个荧光微球体中的回音壁模式用于未标记寡核苷酸目标检测的单颗粒平台的研发和表征

在该实施例中，证明了基于生物传感系统的廉价、高灵敏度、回音壁模式(WGM)的研发。该系统包括用荧光团官能化的硅石微球体和单链寡核苷酸的密集单层。互补链的吸附引起微球体发射光谱中的光谱移动，这可以使用常规光学显微镜和CCD检测仪来记录。

材料

7.50μm SiO₂微球体获自Microparticles GmbH，柏林，德国。5.06μm和6.80μm硅石颗粒获自(Bangs Laboratiries，Inc，USA)。光刻网格盖玻片(18x18mm)购自Bellco Glass，Vineland，NJ，USA。(3-巯丙基)三甲氧基硅烷(MPS，95％)；四乙基原硅酸盐(TEOS，98％)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW 40,000)，氢氧化铵(水中29.1％wt％NH₃)；(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)水合物(MES)，醋酸钠(NaOAc)，过磷酸铵(＞98％)和二甲亚砜(＞99.9％)获自Sigma-Aldrich。分析级硝酸、乙醇、甲醇和2-丙醇获自Merck，维多利亚州，澳大利亚。琥珀酰亚胺酯染料标记四甲基若丹明(TMR)、Bodipy 630/650和Alexa 647购自Olecular Probes，Eugene，USA。全部使用Milli-Q级(R＞18MΩcm)水。内部设计丙烯酰修饰的寡核苷酸并由Integrated DNA Technologies，Coralville，USA来构建。收集干的寡核苷酸构建体并在使用前用超纯的Milli-Q H₂O重悬浮至200μM。

表征仪表

Ocean optics装置

在Nikon Eclipse TE2000-S显微镜上进行了实验。使用通过420-490nm滤块的80W Nikon水银灯获得微球体荧光的激发。在空气中使用QE6500 Ocean Optics分光光度计捕获来自激发微球体的回音壁模式发射信号。使用相应的Spectra Suite软件捕获所有数据。典型地，在1-2秒内收集WGM光谱，使用800ms级分时间时具有±0.9nm的光谱分辨率。测量通过滤块的激发光是恒定的35.52mW辐射功率。通过Nikon Plan Fluor油浸100X物镜使颗粒成像，使用1.30mm工作距离。光谱分辨率(±0.9nm)限定了可以测量荧光峰波长的精确度。可以常规地观察到WGM应答曲线中的峰移在0.1nm至高达几nm之间。由制造商所述的光学分辨率表示0.14nm-7.7nm的峰FWHM可以被常规地检测到。

利用在575nm、585nm、605nm观察到的QE6500峰时，由于在这些波长的低噪音信号和单个峰的锐度，通常用作参照峰。

共焦显微镜检查

在一些情况中，将连接Lympus共焦显微镜的氮冷却TRIAX550分光光度计(Horiba Jovin Yvon，USA)用于收集具有±0.05nm的光谱分辨率的光谱。来自两种仪表的结果在实验误差内是相同的。结合Ocean Optics装置使用了TRIAX 500光谱仪(其提高了灵敏度(校准的光谱分辨率±0.05nm)和扫描范围(0-1500nm)能力)，以提供有效的平台来证实和监控WGM移动，特别是检测非常低浓度的DNA样品时。

在Jobin Yvon Fluorolog-3荧光计上记录稳态发射光谱。所用的显微镜装置和扫描条件的更详细的描述记载于实施例6中。

扫描电子显微镜(SEM)

还是用Philips XL-30场发射SEM收集了微球体的图像。为此，用Milli-Q H₂O洗涤微球体并直接固定于12mm圆形硅石基质上，然后将其装载于SEM立柱上。使用Edwards S150B喷射涂层仪，将样品喷射覆盖3-5nm的金。

寡核苷酸片段设计和构建

为了本研究的唯一目的，随机设计以下的单链目标物和互补寡核苷酸序列并命名；因此，已知基因序列的同源性是一致的并应当忽视。从integrated DNAtechnologies，Coralville，Iowa，USA合成并定购设计的序列。将寡核苷酸维持于超纯Milli-Q H₂O中的200μM工作储液中。

以下提供了该实施例中所用的寡核苷酸序列和简化名称。修饰“iAm”提供了DNA片段上的游离内部胺基(例如，用于连接荧光团)，其实质上是具有附加的游离-NH基团的T核苷酸碱基。

enl(T)

5′-/Acrd//iAm/AT GGA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAG GAC AGC TAT GGACTG CTT CTA CAC AGT CTC CTG TAC CTG GGC A-3′(SEQ ID NO：1)

α-enl(T)

5′-CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG TCC ATA GCT-3′(SEQ ID NO：2)

40个碱基α-enl(T)

5′-GT CCT CCC CTT CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG TCC ATA GCT-3′(SEQ ID NO：3)

20个碱基α-enl(T)

5′-CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG-3′(SEQ ID NO：4)

10个碱基α-enl(T)

5′-CAG GAG AC/iAm/G-3′(SEQ ID NO：5)

对照(随机非特异性目标序列)

(T)

5′-/Acrd//iAm/TTA GGC CTA TGG ACA CGT GCG CAT GAT TTG CCT ATT CCGAAT CCG CAG GAT GGG CCT TAC A-3′(SEQ ID NO：6)

序列/Acrd/表示连接寡核苷酸序列的5’丙烯酰基团(Acrydite-商标，IntegratedDNA Technologies，USA)和/iAm/表示修饰的T核苷酸碱基的位置，其具有游离的内部胺基，用于荧光团连接(Integrated DNA Technologies，USA)。

方法

微球体表面官能化

使用标准文献程序(Battersby等，Chemical Communications 14：1435-1441，2002；Corrie等，Langmuir 22(6)：2731-2737，2006；Miller等，ChemicalCommunications 38：4783-4785，2005；Johnston等，Chemical Communications7：848-850，2005；Verhaegh和Vanblaaderen，Langmuir 10(5)：1427-1438，1994)，用硫醇基团将本研究中所用的硅石微球体官能化。通过在1800rpm离心2min，将5mL等份的原料微球体在20mL Milli-Q H₂O中洗涤。将沉淀重悬浮于20mL 1.5M硝酸中，接着温和地倒置在电动转轮上30min；将该过程重复三次。然后用20mL等份的2-丙醇洗涤微球体，并在恒定的搅拌下在80℃下在2-丙醇(20mL)中回流，同时在4hr的时间段中每30min给予(100μL)0.5％v/v的纯MPS，以用硫醇基团将颗粒官能化。将官能化的球体在1800rpm下用2-丙醇洗涤并重悬浮于10mL新鲜2-丙醇中。将该微球体浆液分成等份，并在8000rpm下沉淀5s，并在干燥器中在氮下干燥230min。最后，将它们搅拌并加热固化，以确保完全的2-丙醇蒸发(90℃)，在加热块上持续30min。将所有官能化的微球体在4℃和氮下干燥保存。以上的程序导致硅石表面可再生的、密集的官能化，并且进一步确保存储后微球体的定量再胶溶。

表面分层的掺杂纳米晶体的微球体合成

使用了CdSeZns纳米晶体核心/外壳，其发射橙色光，具有最大发射593nm；FWHM 32nm。从10μM储液中取出等份。将MPS官能化的硅石珠子与CdSeZns纳米晶体核心外壳纳米晶体以1∶2.5的比例混合，手摇，然后置于转子上，在最小rpm下持续15min-1hr。钝化后，使用2-丙醇来乳化两个相，并将胶状悬浮液在800rpm旋转沉淀5秒钟；然后丢弃上清液并进行了几次CHCl₃洗涤，以除去游离或未吸附的纳米晶体。需要微球体上60个PVP分子/nm²的表面积来覆盖CdSeZns钝化的微球体，将PVP在搅拌下在9∶1CHCl₃∶2-丙醇的反应溶剂中1hr。将钝化沉淀物重悬浮于反应混合物中，并快速涡旋，并使反应过夜进行。PVP分子上的吡咯烷酮环内的极性酰胺基团最可能促进通过共价键化学吸附至纳米晶体表面。此外，由于分子的两性特征，涂层给予微球体稳定性(在水中的疏水性和稳定性)，并使分子吸附至许多表面上。这提高了颗粒与最终的硅石外壳涂层的亲和性，而没有使用偶联剂。将后一天反应的颗粒在2-丙醇中洗涤几次(8000rpm；5s)并在4℃下维持于新鲜2-丙醇中。将微球体在TEOS的1∶200溶液中加帽，反应中每1mL PVP加帽的颗粒和1∶200TEOS体积使用1mL 4.2％(在H₂O中)NH₃溶液(100μL/0.005g PVP加帽的微球体)。在搅拌下加入TEOS，并使反应过夜，接着在2-丙醇中洗涤几次。将所有微球体保持悬浮于2-丙醇中，并维持于4℃下。

寡核苷酸碱基特异性标记

为了染料标记接受了5’丙烯酰enl和对照寡核苷酸序列的游离内部胺基，将15μL 200μM储备寡核苷酸在eppendorf管中与3.5μL TMR琥珀酰亚胺酯-荧光团和4.5μL 1M NaHCO₃溶液混合。将溶液在黑暗中(为了最小化染料的光褪色)在室温下孵育2hr，不时地混合。为了洗涤和沉淀标记的寡核苷酸，用58μL Milli-Q H₂O，10μL NaOAc和200μL乙醇的混合物处理制剂，将其直接加入反应中然后将溶液保存在-20℃的冰箱中30min。然后将样品在13,800rpm下离心20min，并除去上清液。重复这些步骤，直至样品上清液没有过量的荧光团。最后，将标记的寡核苷酸稀释于使用100μL超纯Milli-Q H₂O的200μM工作储液中，并储存于-20℃的冰箱中。

丙烯酰寡核苷酸与微球体的偶联

使用标准程序(Hermanson，Bioconjugative Techniques，Sand Diego：AcademicPress Incorporated，785，1996)，用enl和对照目标5’丙烯酰修饰的寡核苷酸来衍生硫醇官能化的微球体，标准程序如下：在eppendorf管中，称重0.002g官能化的MPS微球体，然后用100μL的甲醇通过微离心(8000rpm，5s)来饱和，丢弃上清液。将沉淀重悬浮于新鲜的0.5M MES(pH5.4)中，接着加入15μL的200μM丙烯酰-修饰的TMR标记的寡-序列(enl或对照)和100μL新鲜的10％w/v的过硫酸铵(w/v)。将反应涡旋，然后在电动转轮上温和地混合1小时。用磷酸盐缓冲盐水(缓冲液)[ph9.0]洗涤偶联的微球体，并在微离心(8000rpm，5s)中沉淀，以除去上清液。将所有寡-偶联的微球体制剂重悬浮于1mL缓冲液中(2g球体/升)，并储存于4℃。图6中说明了用于常规制造荧光寡核苷酸修饰的硅石颗粒的方法，该修饰的硅石颗粒产生该实施例中呈现的和之后在实施例6中呈现的WGM。将这些颗粒用于证明将WGM用于DNA特异性识别平台中时，其强有力且高度灵敏的检测能力。

将微球体固定于网格矩阵平板的方法

对于每个试验平板，用1mL份的Milli-Q H₂O(8000rpm，5s)将10μL等份(20μg微球体/试验)的enl或对照微球体在eppendorf管中分开洗涤3-4次。将洗过的微球体重悬浮于120μL的Milli-Q H₂O中，并涡旋，点在单独的网格硅石平板上。然后将每个颗粒装载的矩阵放于加热块/板上(90℃)，以固定颗粒，并完全蒸发掉任何过量的水。在加热过程中，通过将涡旋混合器连接加热板来温和地涡旋矩阵平板，以确保胶体的彻底分散。

杂交循环条件

如在聚合酶链式反应(PCR)制备中(Rychlid等，Nucl.Acids Res.18(21)：6409-6412，1990)，对于所有杂交反应循环，使用两步温度梯度。一旦加入cDNA，将矩阵平板置于90℃的加热块上，持续10s-5min的时间。此后，在5分钟内将矩阵冷却至室温，以确保足够的时间，使得cDNA探针退火至目标寡核苷酸上。

单颗粒cDNA杂交试验

用PBS(1∶40)稀释200μM储备cDNA溶液的样品，并将样品涡旋。将120μL等份施加于每个矩阵平板(足以完全浸没网格矩阵区域)。然后每个装载颗粒的矩阵经历90s单杂交循环。对于对照试剂矩阵，用120μL对照溶液：Milli-Q H₂O接着缓冲液(PBS)、非特异性DNA和cDNA(如上)处理每个网格，并且对于每个处理平板，运行90s的杂交循环。使所有矩阵在RT下静置5min，然后用100μL部分的Milli-Q H₂O温和洗涤，以除去任何溶液相(未反应的)DNA。除非另外指出，通过在加热块(90℃)上蒸发除去所有试验中cDNA处理后的过量水。然后在空气中捕获来自处理过的球体的荧光激发和发射信号测量。

cDNA变性试验

如上进行杂交，然后通过将杂交样品在90℃加热块上加热30s来实现变性。通过用Milli-Q H₂O的几次100μL洗涤来立即除去缓冲液。将变性步骤重复三次，接着蒸发过量的液体，并且最终测量来自选定颗粒的发射。

颗粒表征研究

颗粒制造

该实施例的最初目标涉及使用CdSe核心外壳(发射体)的硅石微球体(＜10μm)的表面官能化，使得能够通过紫外线(UV)照射来形成WGM信号(Gomez等，Small 1(2)：238-241，2005)。然后用几个有机稳定层将NC颗粒加帽，并且打算最终的功能层使用选定的生物分子。非常不幸地，实验中所用的纳米晶体的稳定性受到损害；在进行使用生物分子的任何可能的偶联之前，渐进性的处理导致一致的光降解和可辨别的WGM峰丢失。明显的光致发光丢失可能是由于纳米晶体层的解吸附/分解。暴露于PVP和TEOS加帽相中使用的反应溶剂时，纳米晶体的光稳定性明显受损。接下来的研究描述了可替换的方法，其涉及用染料标记的、单链、寡聚片段对硫醇官能化颗粒表面直接表面官能化微球体。可替换的方法形成了以下实施例的基础。

单颗粒杂交试验

每个单官能化微球体呈现出独特的WGM指纹。因此，在暴露于测试溶液之前和之后在相同的颗粒上进行生物实验是必需的。为了实现这，将颗粒固定于网格硅石矩阵上，并且收集enl-目标和对照试验网格的详细微球体图谱。根据测量的其他发射信号，将每个微球体编号；然后使用相应的扫描编号将特定的位置绘制出图谱，扫描编号标注在表示单个蚀刻网格的示意图上。使用网格矩阵，在暴露于各种测试溶液和对照后，可以将相同的微球体常规地重新定位。然而，微球体的折射率非常低，并且由于低折射率反差，难以从浸没于溶液中的微球体获得高质量WGM光谱。这是基础性的问题并且是预想不到的。硅胶和水之间的折射率不匹配不足以支持WGM。因此，设计了实验方案，使得可以在空气中收集所有光谱。

用120μL剂量的目标互补α-enl处理矩阵平板。最初的杂交步骤涉及置于90℃加热块上的矩阵网格；通过缓慢加热溶液，将目标溶液中存在的任何寡聚的或聚集的DNA肽化，以促进与珠子上的探针DNA的杂交。当探针寡核苷酸与有效地将目标-探针序列栓系并固定于球体表面的微球体表面偶联时，形成了丙烯酰/巯基键，并且没有受到随后90℃加热的影响。将矩阵在RT冷却5min，使得有足够的时间使α-enl cDNA探针退火至enl目标微球体。然后将网格洗涤，并且通过在加热块上蒸发来除去所有多余的水。用α-enl探针处理后，将相同的单个颗粒重新定位，并在空气中收集第二套光谱。通过荧光测量分析用于标记enl和对照寡核苷酸目标序列的染料标记TMR的荧光光谱。染料的发射范围证明了预期的微球体发射信号的范围，这应当通过选定荧光团的激发范围来限定。WGM发射信号落入TMR染料的激发范围内。WGM光谱显示出清晰的红移，尽管每个峰移不相等。对于所示的样品，与预杂交发射信号相比，在波长575(1.1nm)、585(1.5nm)、595(1.1nm)和605(1.1nm)测量cDNAα-enl杂交后观察到的峰值位移都朝向较长的波长，即，杂交导致WGM光谱中主要峰的红移。

非特异性结合、对照试剂和缓冲剂作用

然后建立对照试验来研究对照试剂对回音壁模式信号的作用。用Milli-Q H₂O、非特异性DNA序列和最后的cDNA探针处理单个试验平板。对于每个阶段的处理，运行90s的杂交循环，在每个阶段后，将选定球体重新定位并收集荧光光谱。将选定的微球体暴露于Milli-Q和非特异性DNA处理时，没有观察到一致的峰移。然而，将微球体暴露于cDNA(α-enl)时，观察到了一致的红移。Milli-Q H₂O处理后得到的蓝移的诱因仍然不清楚，然而，与暴露于互补目标DNA相比，关键结果是所记录的非特异性DNA和对照试剂处理后没有相关性。这不是噪音关注的信号，因为单颗粒形式的实验适应此，因此在该阶段，结果仅仅表明蓝移是随机的非特异性结果。

WGM试验的循环

该方面涉及测试试验是否可逆，即，DNA的变性是否将导致蓝移至原始位置以及在相同微球体上第二次进行的杂交反应是否还将引起红移。这将使得我们能够证实光谱移动是由于生物分子识别引起的，而不仅仅是DNA的非特异性结合。此外，通过重复的吸附-解吸附循环来循环的能力使得可以设计统计学上更可靠的试验，其中可以将几个循环中的峰移平均。将cDNA与探针微球体杂交后，在稀释缓冲液中在90℃下退火，以尝试并使DNA变性，并引起目标序列的解吸附。

记录光谱，并且移动显示于图7中，与第二次杂交循环的结果一起。如可以看到的，稀释缓冲液中延长的退火导致所有四个主要峰的蓝移，并且第二次杂交导致红移，表明试验循环可以重复，尽管所观察到的移动与完全的可逆性不一致。图7是来自选定的重新定位的球体的杂交试验的每个阶段的峰位置的简单表示。

实施例6

使用单个荧光微球体中的回音壁模式进行无标记寡聚目标物的阿托摩尔检测

在该实施例中，确定了试验可以进行的灵敏度、限制和速度。

实施例5显示了用单链寡核苷酸片段官能化的单个硅胶，并且可以描述cDNA目标探针的10个核苷酸碱基之间的差异。在该实施例中，结果证明了基于WGM的系统能够在室温(RT)下、在低于皮可摩尔浓度下，并且就在几分钟内使用几微升的样品快速、目标特异性地检测互补DNA片段。结果表明以常规为基础可以进行未标记DNA片段的阿托摩尔检测。

实验部分

以下列出了详细描述颗粒合成和杂交试验方法的简图(图8)。所用的DNA片段按照实施例5来使用，与回音壁模式表征装置一起。

仪器和表征方法

在连接Triax 550分光光度计和CCD-3000v外部检测仪(Jobin Yvon，USA)的FV-500 Olympus Fluoview激光扫描显微镜IX71(Olumpus，USA)上收集空气中较高分辨率的光谱。通过Olympus UPlanSApo油浸100XO物镜使颗粒成像，使用0.13mm的工作距离。应当在5s-2min内(根据波长扫描范围)收集光谱，具有0.05nm的光谱分辨率。使用液氮冷却的(137K)CCD相机收集样品光致发光和光谱。通过Melles Griot X2多线Ar+激光器(Melles Griot，USA)激发颗粒，典型地在350μW的激发功率。典型地通过550nm截留滤块，使用2s积分时间，用600nm的波长中心点收集发射信号。

方法

“真实的”试验环境是其中在实施例5中所述的各种反应条件下，将官能化颗粒暴露于各种对照试剂、特异性和非特异性的未标记分析物和杂交缓冲液的环境。目前市场上的竞争性检测平台应当能够常规地检测低于皮克摩尔浓度的分析物。该实施例研究了WGM试验是否可以在室温下进行并测定了实施例5中呈现的系统检测极限。除非另外指出，该实施例中进行的试验与实施例5中所述的相同。

灵敏度互补探针杂交试验

对于以下的杂交试验，用200μM储备α-enl cDNA溶液进行了连续稀释，以形成cDNA浓度为10^-15M至10^-7M的目标溶液。将每个样品彻底涡旋并将120μL每个探针溶液的等份试样用于单独的enl目标矩阵。然后将每个装载颗粒的矩阵置于90℃加热块上，并且将杂交反应运行90s。使样品在室温静置5min，并用100μL份的Milli-Q H₂O温和地洗涤。处理后，用Milli-Q H₂O洗涤矩阵平板，以稀释盐水反应缓冲液，并且确保蒸发掉过量反应物时，试验平板上的盐晶体沉积最小化。然后收集颗粒并测量相关的“杂交后”发射信号。

室温杂交动力学试验

使用固定的enl-目标传感器进行了五个试验。如上所述，记录相应的颗粒图谱，并通过荧光显微镜和激发收集WGM光谱。已知在RT下进行了试验，在使用前，将缓冲液中准备的探针处理(2.50x10^-8Mα-enl)在90℃下加热10min，以确保α-enlDNA片段是单链的。然后用120μL等份的在缓冲液中制得的单链2.50x10^-8Mα-enl溶液处理每个制得的矩阵平板。然后将矩阵在RT下运行10s、30s、60s、180s或300s的单个杂交循环。使处理后的矩阵平板在RT下静置5min，用Milli-Q H₂O洗涤，并干燥。然后收回传感器，并测量了相关发射信号。

灵敏度和室温杂交研究

单颗粒WGM试验

使用两个表征装置，从用TMR标记的70个碱基-寡核苷酸片段官能化的7.50μm硅石颗粒获取回音壁模式信号。第一个是连接ocean optics CCD(±0.9nm)检测仪的TE2000-S Nikon荧光显微镜(图8A)，并且使用连接TRIAX分光光度计(±0.05nm)的Olympus Fluoview激光扫描显微镜IX71(Olympus，USA)获得了较高分辨率的光谱，图8B。所研发的识别平台的关键特征是用于颗粒评分的“单颗粒”方法。以下的示意图(图8C)说明了对于选定形式的基本原因，以及为什么在基于WGM的系统是关键的。从示意图获取的关键点是在检测平台中使用WGM的光学特性，不能成功地进行平均来自整体结果的光谱，因为该实施例显示了两个相同修饰的颗粒，来自具有独特发射信号的相同样品。最后，单个颗粒作为其“自身参考”，因此单个颗粒可以看作单个实验。这个参数形成了所研发杂交试验中的基础分析变量。

灵敏度

制备cDNA探针储液的初始连续稀释(缓冲液)，其具有10^-7M至10^-15M的浓度范围。在cDNA处理暴露之前和之后，捕获了来自选择的单个微球体的发射信号。作为cDNA浓度的函数，分析了接近575、585、595和605nm波长处的发射峰波长或模式位置(图9A)。图9B呈现了作为cDNA浓度函数的发射光谱的峰移(Δλ)之间的相关性。对于实质上所有的WGM发射峰，暴露后在发射光谱中存在明显的红移，这与(Milli-Q处理)对照试验相反，其形成不一致方向的峰值位移。对于试验目的，足以指出实际上所有模式在DNA吸附时呈现出红移。此外，在高于熔化温度的温度下，DNA变性时，是可逆的。已知对于大部分试验，Δλ移动仅为1-4nm，使用具有±0.05nm光谱分辨率的Triax 550分光光度计，进行了模式移动的更详细研究。图9C呈现了cDNA暴露之前和之后，来自相同enl目标颗粒的典型WGM光谱。

重要的是识别由于每个单独的微球体具有其自身WGM信号，检测仅仅是基于使用相同的单独微球体观察到的或未观察到的移动。多个微球体的结果的平均是不可能的。目前，对于使用任何单独微球体的阳性检测观察到的实际移动，对于所用的微球体，通常为1-2nm，并且对照小于此。因此，尽管检测水平非常低，每个实验仅仅可以与相同颗粒的行为相关。如图9A中所示的数据，其中显示了来自不同微球体的结果，对于每个颗粒绝对移动的差异是没有意义的。检测的标准是对于给定的暴露于试剂，是否可以通过任何单个颗粒来检测一致的光谱移动。

讨论

该研究中通常所用的CCD装置的光谱分辨率可能限制WGM传感器的灵敏度。灵敏度关键取决于所用检测仪的光谱分辨率。Ocean Optics检测仪具有0.9nm的分辨率，并且由于低的光谱分辨率，WGM发射峰是衰减的。因此，不存在可以从振型收集的信息。无论如何，这些简单的光谱仪使得可以廉价地进行试验，并可以在田间常规地进行。

从120μL剂量体积，用低于皮可摩尔cDNA浓度处理的70个碱基寡修饰的颗粒，常规地观察到杂交诱导的红移。微球体WGM模式的适当观察和表征需要Benchtop、LN2冷却的CCD和光栅单色仪，但对于试验目的，这样的高分辨率不是预先需要。在最低的DNA浓度下，可以从杂交后的颗粒观察到小的、随机的蓝移。这些表示WGM发射可能受到小扰动(如，由于温度波动和电解质浓度引起的溶液折射率微小变化)的影响。这确定了对于含水介质中的这些生物试验可能的最终实践灵敏度极限。因此，只取四个或更多峰的一致红移来表示阳性检测事件。

在此还证明了可以在室温下成功地使用系统，其通过暴露cDNA10秒的微球体发射信号中谐振模移动来表示目标检测。这将与当微球体环境的温度跳动来变性任何非特异性结合的探针并能够使DNA有效退火至微球体时发生的盐沉积和结晶、pH变化、干燥和污染相关的问题最小化。以上提及的改进对于用于DNA分析的基于WGM的生物检测平台的整体发展是重要的。

实施例7

使用单个蜜胺微球体中的回音壁模式的单个核苷酸多态性目标的基于溶液的无标记检测

基于硅石的WGM平台的缺陷在于不能完全在溶液中使用。在该实施例中，通过设计偶联试验方案和高灵敏的基于回音壁模式(WGM)溶液的基因型测定系统来减少与目前的WGM系统相关的限制。该系统包含均匀的、高度交联的用荧光团和单层的单链寡核苷酸官能化的蜜胺甲醛微球体

使用微球体-孔系统，可以完全在溶液中完成试验。WGM无标记系统可以以低于皮尔摩尔灵敏度评价多肽扩增的DNA目标。水中检测的频率偏移可以用于监控双链杂交后复合物在升高温度下的变性。通过两步温度梯度控制，还证明了基于聚合物的光学开关能力的传感器，因为WGM移动可以常规地逆转和重新激活。

为此，各种粒径(300nm-12μm)的生物相容性蜜胺复合颗粒是可购得的。材料高于聚甲基丙烯酰胺(n_r 1.48)、硅石和大部分其他玻璃材料(n_r 1.47-1.50)的高折射率(n_r 1.68)给予了明显的优势。使用Mie理论的计算表明，MF颗粒和外部水介质(n_r 1.33)之间提高的折射率错配应当提高WGM的品质系数。重要地，错配足够大，使得能够可以在溶液中进行简化的试验。

该实施例检测了用于寡聚目标物检测的单颗粒的、无标记WGM“湿-试验”的开发。颗粒在空气中具有与相同大小的硅石微球体的那些相似的Q因数。使用发光WGM信号，试验可以常规地在溶液中在微-孔平板bench-top形式中检测低于皮可摩尔水平的未标记寡核苷酸片段。所呈现的发现显示了高度交联的蜜胺甲醛(MF)微球体(＜10μm)中的荧光WGM信号阳性区分了在特定的基因座携带不同核苷酸的三个单独的基因组DNA(gDNA)的未标记PCR扩增片段之间的单核苷酸多态性(SNP)。

实验部分

材料

7.52μm蜜胺甲醛树脂(C₅H₈N₆O)_n[MF]微球体获自Microparticles GmbH，柏林，德国。384孔聚碳酸酯微量滴定平板、96孔细胞培养平板和384孔光学微量滴定平板购自NUNC，布鲁塞尔，比利时。琥珀酰亚胺酯染料标记Bodipy 630/650源自Molecular Probes Eugene，USA。所有其他试剂，缓冲液和复合微球体源自之前记载的供应商。所用的所有仪器和WGM表征方法与实施例5和6中所述的相同。

仪器

将显微镜PE100-NI系统倒置peltier台用于热循环杂交研究。该系统包括血滴比色法(diaphot)范围的倒置镜，具有为Nikon TE200/300显微镜表定制的XY表。用PE100-I加热/冷却peltier台控制台温范围(-5至99℃)。将台连接水循环泵，以调控台温。使用小的改变，还将以上的装置装载于IX71 Olympus显微镜上。

人SNP目标DNA序列(T)

rs10434目标(与颗粒偶联)5′-/5Acrd//iAm/TC GCC GGG ACA TCT GCC AGTGG[T]CTC CTG-3′(SEQ ID NO：7)

(T)

α-rs10434 A(补体)5′CAG GAG[A]CCAC/iAm/GGCAGATGT CCC GGC GAA-3′(SEQ ID NO：8)

(T)

α-rs10434 B(错配)5′CAG GAG[C]CC AC/iAm/GGC AGATGT CCC GGC GAA-3′(SEQ ID NO：9)

*括号表示核苷酸碱基错配

按照实施例5中所述的来标记以上所列的DNA片段，除了另外所述的(Nuhiji和Mulvaney，Small 3(8)：1408-1414，2007)。

rs10434 SNP区域。

5’-TGG AAG ATT CAG GAG CCT GGG CGG CCT TCG CTT ACT CTC ACC TGCTTC TGA GTT GCC CAG GAG[A/G]CC ACT GGC AGA TGT CCC GGC GAAGAG AAG AGA CA-3’(SEQ ID NO：10)

由国际糖尿病研究院(墨尔本，澳大利亚)提供了含有rs10434 SNP标记的单独的1[A/A]；单独的2[A/G]；单独的3[G/G]的gDNA的PCR扩增区域。使用MassARRAY系统(Sequenom，San Diego，CA)，按照之前所述的(Peyrefitte等，Mechanisms of Development 104(1-2)：99-104，2001)，进行了基因型确定。简而言之，使用SpectroDESIGNER设计了用于rs10434的PCR引物，以扩增围绕变体位点的97bp片段。使用5μL总反应体积中的2.5ng基因组DNA，2.5mmol/L MgCl₂，标准浓度的其他PCR试剂和0.1单位HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen，德国)进行了反应。按照制造商的说明，使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)，通过电泳分离了片段。

正向引物：

****ACGTTGGATGATGTGTCTCTTCTCTTCGCC(SEQ ID NO：11)

反向引物：

****ACGTTGGATGCCTTCGCTTACTCTCACCTG(SEQ ID NO：12)

方法

丙烯酰介导的寡核苷酸片段与微球体的偶联

将原料蜜胺颗粒在Milli-Q中洗涤几次(8000rpm，5s)，并干燥储存，在4℃和氮下干燥。将洗涤的MF颗粒(2mg)在eppendorf管中称重。密胺颗粒的天然表面化学性质(Gao等，Macromolecular Materials and Engineering 286(6)：355-361，2001)提供了强有力的偶联表面，以固定单链寡核苷酸片段。通过使用用5’丙烯酸(丙烯酰)基团修饰的片段，在单个室温反应中进行了颗粒官能化(Sharmin等，progress in Organic Coatings 50(1)：47-54，2001)。将颗粒重悬浮于新鲜PBS中，接着加入15μL 200μM丙烯酰TMR标记的寡核苷酸。将反应涡旋并在电动转轮上温和地混合1hr。用缓冲液洗涤偶联的微球体，并在微离心机中沉淀(8000rpm，5s)，以除去上清液。将所有寡偶联的微球体制剂重悬浮于1mL缓冲液中(2g球体/升)，并存储于4℃。图10中呈现了偶联方法的示意图。

单颗粒显微镜加热台研究

i)微球体稀释

最初将微球体连续四次稀释，通过取1μL储备微球体(2mg/1mL)并重悬浮于1mL的Milli-Q(稀释液1)中并涡旋。然后将250μL的稀释液重悬浮于1mL的Milli-Q H₂O中并涡旋。用新的稀释液将该过程重复三次。来自稀释液3或4的1μL等份试样典型地含有1个颗粒/μL。

ii)单个微球体固定

将1μL等份的稀释液3用于单个微孔的底部，并且监控小滴内的微球体数量。当确定一个颗粒数时，在加入49μL体积的pH7.0的新鲜缓冲液后，记录颗粒发射光谱。在重力的作用下，将蜜胺颗粒固定于单个微孔的底部。

iii)仅有对照缓冲液和rs10434目标探针试验

将加热台温度提高至37℃，并使其平衡2min，然后捕获单个光谱。然后将5μLMilli-Q或2μM目标探针溶液加入孔中。将台温提高至72℃，并保持2min，接着获取光谱。最后，将台温降至37℃或室温。

使用来自PCR扩增的对照基因组DNA样品的DNA片段的rs10434杂交试验

i)杂交目标探针处理

将2μL所需的目标DNA探针(10ng/μL)溶液直接加入含有单个rs10434-MF目标颗粒的孔中。在90℃下进行了5min杂交循环，接着是室温下的10min冷却循环。在每个循环后获取发射信号扫描(x3)。对于单独的1、2和3DNA样品重复了杂交处理。在溶液中捕获所有发射信号，并且没有采用任何洗涤或反应缓冲液的更换。

除非另外指出，目标探针暴露处理后扫描所有试验，同时微球体保持浸没在杂交缓冲液中。在溶液中捕获了来自处理球体的荧光激发和发射信号测量，典型地使用网格硅石平板和384孔光学平板时，使用500ms-2s积分时间。将平板储存于4℃，并且按照需要，将微球体成功地用于进一步的杂交试验中。

颗粒研发和表征研究

在溶液中传播WGM

设计并构建用于官能化微球体的寡核苷酸片段，以模拟横跨人基因组的rs10434 SNP区域的30个碱基链。序列与染色体6上的片段是同源的。序列分析表明该片段编码血管内皮生长因子受体(VEGF)[Awata等，Biochemical andBiophysical Research Communications 333(3)：679-685，2005；Errera等，Diabetes Care30(2)：275-279，2007；Joussen等，Ophtalmologe 100(5)：363-370，2003；Sowers和Epstein，Hypertension 26(6)：869-879，1995；Uhlmann等，Experimental and ClinicalEndocrinology & Diabetes 114(6)：275-294，2006]。全部rs10434 SNP区域的深入BLAST研究揭示了两个匹配；序列与5’侧上的866bp(血管内皮生长因子异构体e前体，位置：6p12)和3’侧上的215111bp(假定的蛋白LOC221416，位置：6p21.1)具有同源性。在该区域中具有倾向性的个体对糖尿病视网膜病、糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病(也称为2型糖尿病(NIDDM或T2D))、成年期糖尿病(MOD)和胰岛素抗性具有提高的易感性。糖尿病病人经历的高血糖症引起异常血管细胞功能，特别是在疾病后期的内皮中。这些个体通常经历微循环和大循环的渐进性退化，这最后导致器官损伤(Laselva等，Acta Diabetologica 30(4)：190-200，1993；Ciulla等，Acta Ophthalmologica Scandinavica 80(5)：468-477，2002)。研究证明了选定的SNP区域可以潜在地用作T2D和相关疾病的标记。在此呈现的发现证明了优化WGM平台作为有效的诊断工具来常规评价已知的人疾病相关SNP目标的有效性。

寡修饰的MF颗粒具有7.52微米的直径并且与5’丙烯酰修饰的TMR标记的目标寡核苷酸直接生物偶联。存在颗粒的荧光激发，其通过蓝色多线Ar+激光器在350μW激发功率，通过550nmλ阻挡滤片。荧光强度特征证明了丙烯酰DNA片段和颗粒表面上的天然-NH基团之间的偶联是强有力的(Krajnc和Toplak，Reactive& Functional Polymers 52(1)：11-18，2002)。

硅石vs.蜜胺

使用之前的硅石复合微球体研究，所有测量值应在空气中获取。这需要蒸发过量的反应液，以提高来自单个颗粒的信号发射。该部分的主要目标是发展优化的基于单颗粒WGM溶液的杂交试验。在空气和水中从固定的单MF(n_r 1.68)和硅石颗粒来系统地测量发射信号。最初，在空气中捕获代表性的发射信号，然后将单滴Milli-Q H₂O(R＞18MΩcm)添加至每个固定平板上，以完全浸没颗粒。重复过程几次后，从水中和空气中重新定位的球体获取回音壁模式信号。图11证明了所示处理后的典型输出。对于硅石微球体，每次水处理导致发射信号峰的消散并且捕获的信号类似含水介质中游离TMR的信号[Nuhiji和Mulvaney，2007，上文](蓝色和红色光谱)。然而，蒸发Milli-Q后，特有的WGM发射特征重新产生了图11A(黑色、绿色和水蓝色光谱)。将蜜胺颗粒暴露于Milli-Q时，发生了与模式强度降低相关的模式变宽和丢失；然而，几个明确的峰仍然可以重复地收集(图12B，红色和蓝色光谱)。因为MF颗粒是该研究的主要焦点，从这点上，在图11的图C)和D)中还提供了基线光谱。

微孔平板试验

支持溶液中WGM的MF颗粒能力形成了下一个研究，其是用来选择有助于在溶液中常规获取相对高-Q WMG的杂交基质。以微滴定平板形式呈现颗粒移动了一个步骤，使得更接近直接的高通量自动化试验。该分析是基于WGM信号质量，该信号收集自寡修饰的同时固定于微孔和试验平板基质上的MF颗粒。将修饰的MF颗粒固定于硅石网格矩阵平板上，在单个孔内，384孔聚碳酸酯细胞平板，384孔光学平板和96孔聚合物细胞培养平板。从浸没于标准杂交缓冲液的选定颗粒收集发射信号。图12说明了使用每个选定基质获得的代表性发射特征。由于基质的小工作宽度，预期硅石网格矩阵将从选定的MF颗粒产生高信号输出(图12A)。然而，对于高通量形式，基于孔的系统是所需的方向。使用基于普通塑料的96孔培养平板进行了第一个微平板系统分析(图12B)。收集的发射信号表示由几个宽的低强度峰组成的WGM特征。这仅仅是由于每个孔的底部的大宽度和塑料具有高散射特性的事实。此外，使用较低物镜放大倍数(x40)使得较大的工作距离降低了整体信号。然而，材料的透明度使得颗粒的成像和定位变得容易。使用透镜，通过交替换位来控制较大的工作距离，因为工作距离的增加与信号丢失的提高直接相关。接着，分析384孔CC3-商标聚苯乙烯/聚合物底平板，其模拟使用无菌的非生物涂层的聚-D-赖氨酸。涂层是带正电荷的，并且促进弱粘附细胞的附着，并且在我们的情况中，将帮助负电荷的寡/DNA覆盖的7.52微米MF颗粒的固定，每个孔具有较小的总工作体积(基于聚合物的平板：底部宽度100μm；孔面积，0.05cm²/孔，具有总工作体积，120μL/孔)。此外，平底孔几何学和可见的透明度使得易于进入平板和使用显微镜X/Y定向工作台来操纵。图12C显示了来自MF颗粒的典型发射信号的实例。呈现了一系列可识别的狭窄的、高强度荧光峰。还使用了384光学平板，其具有和聚合物平板相同的工作维度和体积。然而，底部宽度较窄(50μm)，并且孔底部不带有正电荷。如图13A和C中所示的，WGM特征内注意到九个截然不同的发射峰。通过384孔光学级别平板获取的颗粒光谱表示与组A-C中的光谱相比，每个可鉴定模式的强度得到提高(图12D)。图4中呈现的WGM输出中标注的每个λ_max的双重作用仅仅是溶液中获取的WGM信号的作用。

加热作用

因此建立了在工作试验中以微孔形式呈现MF颗粒的优势。然而，在DNA杂交反应过程中，微球体可以暴露于＞90℃的外部反应条件。在温和条件下(＜37℃)反应时，用丙烯酰寡核苷酸片段的颗粒官能化保持完整。然而，过度的热应力怎样影响偶联仍然是未知的。使用384孔光学微平板，研发了加热研究来确定化学键在升高温度下的回弹力。将单个MF颗粒固定于微孔中，然后浸入缓冲液、MES(pH5.4)或Milli-Q H₂O(对照)中。从选定的颗粒测量了参照光致发光(PL)信号，将平板加热至标准杂交试验温度(90℃)。将温度维持三个小时，在该时间过程中，将选定的颗粒重新定位并且常规地收集发射信号。图14呈现了在3小时热暴露后，从选定的颗粒获取的标准化WGM光谱。在3hr时间段中，在浸没于MES的颗粒中注意到最大的作用(黑色虚线)，其与浸没于杂交缓冲液中的颗粒相比(黑色实线)，呈现出PL信号的明显丢失。在仅维持于Milli-Q中的对照颗粒中观察到热处理后最强的信号(灰色实线)。样品之间的发射信号水平有改变。然而，在3hr加热后，从每个颗粒仍然获得了具有几个可识别峰的清晰WGM特征。

进行的表征实验证明了该实施例中所述的颗粒可以支持溶液中的WGM。接着，使用Linkam PE100-NI热控制显微镜台来研究基于微孔溶液的杂交试验中的“实时”WGM信号波动。使用镜台-装置展开了试验，以测定微球体周围的局部介质高于或低于杂交互补探针T_m的热变化是否可以循环地检测到。构建的标记为α-rs10434A的30b目标探针(T_m＝71.2℃)与栓系于MF颗粒的片段互补。将单个7.52μm MF-rs10434目标颗粒通过两步梯度(37℃-72℃)进行循环。加入5μL Milli-Q后，完成了最初的杂交反应。在每个梯度温度，在2s积分时间下，通过几个循环获取的光谱表示WGM峰没有一致的移动，图15A-B。使用相同的颗粒，加入目标探针DNA(5μL的2μM储液)重复实验条件。最初的杂交循环后，获取的发射信号数据显示出在72℃下暴露于α-rs10434 A片段导致主要WGM峰的蓝移，和台温降至37℃，相同峰产生红移(图15C)。重复的杂交循环导致局部平板温度低于目标探针T_m时，一致地观察到WGM峰的红移，将温度提高至高于目标探针T_m时，观察到WGM峰的蓝移，图15D-E。

人基因组目标试验

使用获自三个个体对照(健康个体)的对照gDNA，使用横跨rs10434 SNP区域的引物扩增了大约20个碱基的DNA片段。使用Sequenom MassARRAY基因型测定平台测定了以上个体的基因型。每个个体具有不同的基因型。在该基因座，个体1对于A等位基因是纯合的(A/A)，个体2是杂合的(A/G)，个体3对于G等位基因是纯合的(G/G)。在此的目标是测定是否可以使用WGM系统从PCR扩增样品中检测到单个碱基对差异。将rs10434 DNA变体的A等位基因特异性的单个rs10434-MF颗粒固定于微平板孔中；然后将颗粒在分开的杂交反应中暴露于3个不同的分析物。加入2μL DNA样品后(个体1-3)，在90℃下持续5min，完成每个杂交。在反应温度梯度降至室温后，在每个杂交反应后，分别收集发射信号。测定了每次处理后相对于参照信号(黑色光谱)获取的WGM信号。相对于未处理的WGM特征分析了峰位置，并记录了Δλ。所获得的光谱显示了作为关于给定参照波长的峰移函数的峰波长位置。暴露于个体1样品后(黑色实心方块)，形成了所有主要荧光回音壁模式的正向红移。然后用个体2 DNA样品处理相同颗粒。暴露后获取的WGM信号表示了所有荧光峰的红移(与未处理信号相比)。然而，相对于用个体1样品处理后的波长峰位置，用杂合个体2样品的处理导致了荧光模式的蓝移。最后用来自个体3的DNA的处理(绿色实心三角)则导致了另一个WGM蓝移，相对于用来自个体1的扩增DNA处理后获取的模式信号。这些观察到的非常小的蓝移是引入来自个体2和3的错配DNA探针的结果。这些探针非特异性地结合，并且作为结果，降低了来自个体1的错配DNA可用的结合位点数量。

目标辨别

为了证实修饰的微球体可以在工作试验中常规地辨别单个碱基错配，构建了两个实验室合成的目标DNA探针，使用游离内部胺，用于染料分子连接。设计第一个目标(α-rs10434A)来模拟[A]rs10434等位基因变体，用TMR将片段进行荧光标记。可替换的分析物含有单个碱基错配并且用Bodipy 630/650鉴定。将单个未标记的rs10434目标MF颗粒固定于384光学平板的三个微孔中。在目标探针暴露于基线之前，在溶液(缓冲液)中从选定的颗粒中获取发射信号。在单独的杂交循环中用α-rs10434 A和α-rs10434 B目标探针完成了两个单独的试验。结果显示了α-rs10434 A目标探针的杂交。用显示球形荧光颗粒的相同颗粒获取的荧光强度图像扫描来证实锐利的荧光WGM发射信号的获取。从暴露于含有单个错配的α-rs10434 B的颗粒获取了弱荧光WGM信号，然而，荧光强度图像扫描显示出没有可检测的荧光。如果颗粒最初暴露于α-rs10434 A目标片段，单个颗粒暴露于两个目标探针导致α-rs10434 B处理后所有主要荧光回音壁模式峰的蓝移。

连续体积稀释中的单个颗粒研究还证明了这些寡官能化聚合物颗粒可以检测阿托摩尔水平的分析物DNA。这样的检测体积强调了有效使用小反应体积来完成整个单颗粒杂交试验。此外，这证明了颗粒可以常规地检测低于皮尔摩尔浓度的目标探针DNA。

讨论

在此呈现的结果清楚地证明了可以在溶液中检测DNA的互补链与寡核苷酸修饰的MF颗粒的非共价结合。可以使用荧光回音壁模式的波长移动来常规地检测未标记互补DNA片段在各种反应条件下的吸附和解吸附。

MF颗粒的天然表面有助于丙烯酰修饰的寡核苷酸片段的密集单层的偶联。偶联基本上是蜜胺分子与丙烯酸的共价连接。在升高的温度下(90℃)暴露于高pH溶液时，寡核苷酸修饰的颗粒具有高回弹力，因为从延长暴露后的颗粒可以收集高质量的WGM信号。数据证明FITC标记的人α-IgM抗体还可以有效地结合未修饰的MF颗粒。这些颗粒然后可以用于抗体-抗原结合试验中。

单链(变性的)构造的DNA具有较高的折射率(Parthasarathy等，Applied PhysicsLetters 87(11)：113901-3，2005)。天然形式的DNA的折射率与典型的有机聚合物的相似(Samoc等，Chemical Physics Letters 431(1-3)：132-134，2006)。天然双链DNA作为绝缘材料存在，并且可替换地，其变性形式变成半导体，具有几百毫电子伏特的带隙(Rakitin等，Physical Review Letters 86(16)：3670，2001)。因此，通过降低或提高与微球体直径提高直接相关的微球体表面的相对折射率来控制该实施例中所述的WGM移动(杂交后)(Niu和Saraf，Smart Materials and Structures11(5)：778-782，2002)。这些参数怎样特异性地影响WGM尚需解释，然而，相反，使用两种复合颗粒，特征性的移动是常规地可重复。

这些单颗粒研究证明了在杂交试验过程中，获自rs10434修饰颗粒的WGM信号中的Δλ移动可以用于分辨实验室合成的探针DNA中的单碱基变化。颗粒存在于微平板形式中时，使用PCR扩增的gDNA在自动化系统中证实了一致的峰移，PCR扩增的gDNA含有预期含有目标单核苷酸变化的区域。该实施例中所述的MF rs10434-目标颗粒可以在糖尿病相关rs10434 SNP的各种等位基因之间分辨栓系丙烯酰寡核苷酸的第一个核苷酸碱基的荧光位置(大约离开胶体表面5-10nm)有助于激发的光在空气和水介质中的常规全内反射。

在微孔形式试验中在溶液中激发WGM的能力完全避免了使用实施例5和6中所述系统遇到的问题。利用微孔形式的系统减少了完成试验的运行时间，因为颗粒快速定位，并且不需要洗涤步骤。最后，这种形式能够常规在溶液中的相同颗粒上进行整个试验，其还提供了组织化系统，用于重新使用用于进一步测试的传感器。

此外，该实施例中所述的系统没有使用光纤偶联方法来激发WGM，这明显简化了试验。可以常规地检测阿托摩尔体积的目标DNA探针溶液。在MF微球体中观察到的循环可逆的WGM移动重要地表明了颗粒可以循环。当局部温度高于和低于目标探针的T_m波动时，WGM峰移显示出是可逆的；因此，光谱红移特定地是由于互补DNA杂交引起的。DNA片段具有单碱基错配时，目标探针的结合亲和性明显降低。如果相同的颗粒最初暴露于互补目标，非特异性结合(尽管发现可以忽略)可能引起颗粒WGM光谱中的小蓝移。在单孔单颗粒杂交反应中，比较的WGM发射光谱表明特定的目标探针具有高得多的结合亲和性，与含有单碱基错配的片段相对。

这些发现表明用标记的(30个碱基)寡核苷酸片段修饰的高折射率密胺颗粒在溶液中常规地发射WGM。在溶液中激发颗粒时，激发信号光致发光强度降低，并且荧光模式变宽。然而，仍然可以常规地鉴定出一系列确定的WGM共振峰。

实施例8

用于单荧光硅石和蜜胺寡核苷酸修饰的微球体中的回音壁模式激发的最佳条件

该实施例记录了研发一系列优化参数来常规地激发荧光胶体中的高质量回音壁模式(WGM)。全部使用了实施例5至7中呈现的目标特异性寡核苷酸修饰的(TSOM)硅石和蜜胺微球体(7.50-7.52μm)[Microparticles Germany GmbH]。

实验部分

材料

用于颗粒合成、固定策略和WGM表征的材料和方法与实施例5至7中所述的相同。

回音壁模式激发参数研究

偶联位置作用

使用共焦装置，设计了角度分辨分光镜技术来表征作为改变激光激发位置结果的WGM发射。按照之前所述的(实施例5至7)，用TSOM硅石和MF颗粒制备玻璃矩阵盖玻片。将所用的共焦系统用于改变颗粒圆周周围的激发位置，使用获取的颗粒透射图像作为参照。在350μW辐射功率下，通过多线Ar+激光器激发选定的颗粒。在2s积分时间下收集发射光谱。对于在此的所有共焦工作，将Ar+激光器用于颗粒激发。相对于0°(参照)坐标，在围绕微球体外周边界以45°增量在360°旋转中改变激发位置。在共焦装置上激发颗粒的WGM时，通常利用0°激发位置，这形成了常规获取的高质量WGM。然而，在360°的选定位置的激发还导致收集了强WGM光谱。对于选定实施例的光谱设定的分析证明了对于选定的激发位置观察到没有可检测的峰移(在Triax550光谱仪±0.05nm的光谱分辨率内)。在一些情况中，可能产生了峰值失真。在给定波长下获取的每个WGM光谱中一致地观察到了失真。

然后在相同条件下在空气中扫描选定的MF颗粒。WGM光谱设定的分析证明了相对于0°光谱，观察到了可检测的峰移(CCD±0.05nm的光谱分辨率)。在选定的实施例中观察到了蓝移，然而，不太可能是颗粒折射率改变而引起所观察到的移动。这些作用可能是由于激发位置的移动而产生的，但更可能是达到CCD的阈值极限的结果。实施例7中证明了通过固定于溶液中的TSOM-MF颗粒的光的全内反射。然后在选定的辐射位置激发浸没于溶液中的单个MF颗粒。扫描范围内(相对于0°扫描)的所有荧光峰一致红移。结果表明与空气结果比较，相对于0°扫描的峰值位移明显较大。这种提高的峰变化可能是由于水的高光散射特性引起的。注意到峰位置变化最高在位置180°、270°和315°(高达0.89nm)。这些结果表明应当将固定的激发位置用于TSOM颗粒中的WGM激发。

重复激发研究

跟踪研究涉及由TSOM颗粒通过单个位置重复激发引起的作用的分析，并且作为结果，观察WGM信号的相对退化。在单颗粒杂交试验过程中，将单个激发点(0°)用于所有WGM光谱。已经证明了使用固定激发位置的重要性。重要地，这将提高峰值变化。

常规地，在工作试验过程中，将单个TSOM-微球体激发(扫描)大约2-5次。重要的是在该时间过程中，微球体WGM信号保持稳定，使得几次处理后可以获取一组WGM光谱。因此，该实验的目的是测定与该论题中所述的TSOM颗粒相关的荧光信号退化水平。

空气WGM退化研究

将颗粒固定于盖玻片矩阵上，然后将基质装载于共焦显微镜上。在空气中通过0°激发位置(积分时间2s)激发选定的硅石和MF微球体。在2s积分时间下，从选定的硅石微球体获取光谱组。在一系列扫描后的荧光强度中，WGM光强度(PI)明显降低。在扫描1中识别十个不同的峰，在扫描20中，识别9-10个峰。

然后将单个TSOM MF颗粒暴露于相同的实验参数。扫描1至扫描20中识别的峰数目仍然是一致的(大约16个)。Q-因数降低七倍，并且峰位置变化是可忽略的。

水WGM退化研究

接下来的步骤是在溶液中(Milli-Q H₂O)重复激发单个TSOM MF颗粒。在位置0°以激光照射单个颗粒，并且在2s积分时间下捕获一组光谱。与空气测量相比，在选定扫描范围(八个)内，识别的峰数目降低。然而，在扫描完成后(扫描1-20)，峰数目保持未改变。在扫描1和20之间分别观察到Q-因数降低六倍。

从最终WGM扫描收集的定比光谱由8-16个可识别峰组成。这些结果证明通过固定激发位置(0°)重复激光照射后(350μW辐射功率)，可以从相同的颗粒常规地收集WGM特征(＞20)。此外，由TMR染料标记的光降解和水中的颗粒固定引起的峰变宽没有导致任何明显的峰值变化。因此，强调了工作试验中颗粒的回弹力特性。

CCD分辨率

如在早先的实施例中所证明的，光谱仪的灵敏度在工作试验过程中的WGM测量中具有重要作用。光谱仪测定可以从激发的颗粒获取的光谱信息的量和WGM检测平台的灵敏度极限。在该实施例中，比较了显微镜装置和CCD检测仪的灵敏度。

首先在空气中激发硅石颗粒(位置0°)，并且在2s的积分时间下用Triax 500光谱仪(光谱分辨率±0.05nm)收集光谱。然后通过水银灯(激发输出功率35.52mW)从相同的颗粒获取光谱。在2s积分时间下，利用QE6500 Ocean Optics系统(光谱分辨率±0.9nm)来获取光谱。从使用QE6500光谱仪获取的光谱观察到几个主要的峰明显变宽。此外，通过Triax 550获取的光谱表明几个峰(λ_max：577.54，588.47nm，594.35nm和599.95nm)不存在于QE6500光谱中。计算FWHM中的变化(λ_maxPI＝1.00)各自为0.38nm(Triax)和0.98(QE6500)。然后在空气中使用单个TSOM MF颗粒进行了相同测量。通过Triax 550获取的光谱表明将QE6500用于WGM获取时几个峰结果的丢失(λ_max：578.81nm，584.65nm，588.07nm，597.73nm和608.08nm)。Triax(0.72nm)和QE6500(1.27nm)的FWHM值进一步表明了光谱质量的差异。

接着，通过荧光激发固定于溶液中的单个MF颗粒，并且获取其光谱。结果表明在水中获取的光谱显示出每次代表性的扫描后，发射峰没有丢失。Triax捕获的发射光谱表明0.81nm(λ_max，其中PI＝1.00)的FWHM，而来自QE6500光谱的为1.15nm。峰变宽的程度比空气中对MF和硅石颗粒测量的低得多。

这些数据组证明了使用高功率CCD时可以获取具有更多数量的光谱峰的高质量WGM。所获取的WGM剖析图还含有更多光谱信息。然而，在溶液中进行测量时，这些光谱仪之间的可变性明显提高(大约0.24nm)。

光谱仪之间的WGM峰移仅仅是由于光谱仪的不同灵敏度引起的。例如，仪器的光谱分辨率限定了其中可以作为“真实”λ_max来测量峰位置的精确性。因此，与TRIAX系统(±0.05nm)相比，Ocean Optical系统(±0.9nm)对于每个观察到的WGM峰的“真实λ_max”就不太精确。因此，基于这些条件，预期WGM应答曲线之间将存在可变性。

漂白时间

在通过固定偶联位置的恒定激发下测定了微球体的漂白阈值。使用共焦表征装置测量了漂白特征。通过激发点0°，使用350μW的输出能量，在488nm(Ar+)的连续波长下，在空气中激光照射单个颗粒。在100X物镜的后面(NA＝1.4)测量所有漂白特征，并成像。作为随着时间(s)的函数[200s]观察了漂白的速率。对于来自硅石(n＝100)和MF(n＝100)TSOM颗粒的100个颗粒，收集了选定颗粒的荧光漂白特征。从每个扫描集合平均漂白特征。使用三个指数匹配来匹配平均的数据。对于硅石颗粒的平均漂白时间曲线，表明了在0.23s内的恒定激发过程中，60％的荧光消散。在2.51s后，则进一步有31％的颗粒荧光信号漂白。最后，在26.40s后，剩余9％的颗粒荧光漂白。对于给定的硅石样品，大部分的颗粒荧光在大约3.30s后消散。比较而言，TSOM-MF颗粒显示出更强。数据表明50％的颗粒荧光信号在31.10s以后降解。使用相同的3个指数匹配模型，在6.28s后，最大百分比的荧光信号光降解，这与硅石TSOM颗粒相比，是明显的提高。

将相当高的激光器功率用于颗粒激发(350μW)。然而，结果表明在恒定激发过程中在26.40s(硅石)和31.10s(MF)后仍然观察到了荧光信号。因此，可以通过简单地降低激发能量来提高这些漂白时间。

讨论

证明了通过利用支持溶液中的WGM的TSOM MF颗粒显著提高了与分光光度分辨精确性相关的光谱变化。该结果进一步证明了在基于溶液的WGM试验中可以成功地使用较低强度的CCD，而没有失去重要的光谱信息。MF颗粒荧光较慢的漂白时间进一步加强了聚合物颗粒在WGM生物检测平台中的作用。

高通量的、基于微流体的WGM诊断工具的下游发展应当利用高折射率的同质微球体。自动化扫描装置应当呈现微孔形式的溶液中的颗粒。该装置还应当结合与流式细胞计数器和共焦激光扫描显微镜中发现的那些相似的激光激发系统。颗粒必须通过固定位置来激发，以最小化信号可变性。固定激发位置或替换地以固定位置呈现颗粒将减少使用昂贵物镜和高精确性成像软件的需要。

实施例9

使用硅石和蜜胺甲醛颗粒的WGM的比较

图17(A)和(B)显示了使用硅石颗粒(B)和蜜胺甲醛颗粒(A)获得的WGM剖析图的比较。(A)和(B)中的实线是空气中获得的剖析图，而虚线表示颗粒在含水介质中时的剖析图。

使用硅石珠子在水中的捕获产生了非常微弱的荧光，但没有WGM(图16(B))。使用蜜胺甲醛时，获得了强WGM剖析图。

实施例10

免疫-WGM

基于免疫的WGM试验提供了用于诊断平台的设备。数据证明从抗体(人α-IgM)修饰的MF颗粒来源的荧光WGM信号可以用于在室温反应中分辨对照试剂和目标抗原(图17)。免疫-WGM试验提供了可替换的识别形式，对于过多的生物分子目标具有可调的特异性，生物分子目标如蛋白、抗体、动物和植物病原体、细菌、白细胞间介素、肽、RNA、mRNA和朊病毒。免疫-WGM试验在食品卫生工业、环境水测试、农业生产、军事(生物战)、病毒学、微生物学诊断学和药物筛选的应用中具有潜能。

本领域技术人员将认识到除了特意所述的那些，在此所述的本发明易于改变和变化。将理解本发明包括所有这样的改变和变化。本发明还包括本发明书中单独或集中地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任意两个或多个的任意和所有组合。

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Claims

1.一种用于检测介质中的分析物的方法，包括步骤：

(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；

2.如权利要求1的方法，其中微球体颗粒包含选自以下的材料：蜜胺或其衍生物；硅石；乳胶；氧化钛；二氧化锡；氧化钇；氧化铝；其他二价金属氧化物；钙钛矿和其他压电金属氧化物；PLGA；蔗糖和琼脂糖。

3.如权利要求2的方法，其中微球体颗粒包含蜜胺甲醛。

4.如权利要求1的方法，其中选择相对于其中进行检测的介质具有更高折射率的微球体颗粒。

5.如权利要求4的方法，其中微球体颗粒具有高于1.40的折射率。

6.如权利要求1至5任一项的方法，其中介质是液相或气相。

7.如权利要求1至6任一项的方法，其中液相是水溶液、缓冲液或生物流体，气相是空气。

8.如权利要求1的方法，其中分析物或其各自的配体包含选自以下的分子：核酸；蛋白；肽；抗体；脂质；碳水化合物；细菌；病毒；细胞和任何小分子或化学实体。

9.如权利要求8的方法，其中分析物或其各自的配体包含核酸。

10.如权利要求8的方法，其中核酸包含单链DNA。

11.如权利要求10的方法，其中通过用限制性核酸内切酶和/或核酸外切酶消化双链DNA来制备单链DNA。

12.如权利要求11的方法，其中限制性核酸内切酶是1型限制性核酸内切酶。

13.如权利要求11的方法，其中核酸外切酶是λ核酸外切酶。

14.如权利要求10的方法，其中从RNA:DNA杂交分子制备单链DNA。

15.如权利要求14的方法，其中RNA:DNA杂交分子包含与通过逆转录制备的信使RNA杂交的DNA。

16.如权利要求14的方法，其中RNA是病毒RNA。

17.如权利要求1的方法，其中分析物或配体源自获自生物、工业、实验室或环境来源的分离样品。

18.如权利要求17的方法，其中样品包含矿物、合成的、真核生物的、原核生物的或病毒来源的材料。

19.一种方法在制造检测分析物和配体之间的结合事件的试验中的用途，该方法包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒，其中如果微球体颗粒是蜜胺甲醛，则其可以与荧光团偶联或包含量子点；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具。

20.一种用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤：(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的或量子点标记的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将蜜胺甲醛微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将蜜胺甲醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将蜜胺甲醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。