CN101027546A - 利用微球中回音廊模式的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测靶分析物存在的生物传感器。该生物传感器由微球颗粒组成，所述微球颗粒具有固定于其表面的靶分析物的结合配偶体。该结合配偶体可以是核苷酸；肽、蛋白质、酶、抗体等等。当分析物结合其配偶体时，微球颗粒回音廊模式(WGM)分布型改变而使得该分布型的峰经历红或蓝－移。固定的结合配偶体可包括荧光团等等以使其发射荧光、磷光、白热等等。这些荧光团可采取纳米晶体或量子点的形式。

Description

利用微球中回音廊模式的生物传感器
发明领域
本发明总的涉及分析物检测领域。更具体地，本发明涉及利用通过分析物结合颗粒上固定的结合配偶体而诱导的微球颗粒的回音廊模式(WGM)分布型的变化来检测分析物的存在。本发明进一步涉及复合方案和通过WGM分布型变化检测的分析物。
背景技术
本说明书中提供的参考文献的书目详述列于说明书的结尾。
本说明书中对任何现有技术的参考不是并且不应该视为在对任何国家中该现有技术形成公知常识部分的认可或任何提示的形式。
基因组学和蛋白质组学的快速发展已突出了用于检验和检测两种分子之间相互作用的传统劳动密集型方法的不适当。有必要设计用于不同分子之间相互作用的分析和样本中分析物检测的高度敏感的方法。使所述分析不需要标记一种或其他或两种分析物和/或其结合配偶体的方法的开发将是特别理想的。
目前，利用固定至载玻片的寡核苷酸阵列的基因-芯片提供了高通量核酸分析的方法。然而，该技术依赖于至少一种分子的标记。
尝试开发用于检验分子相互作用的方法和装置(其不依赖标记一种或多种分子)包括生物传感器，其基于光学方法最常用于检验DNA和/或蛋白质。参见例如，Baird和Myszka，J Mol Recognit 14：261-268，2001，Rich和Myszka，J Mol Recognit 15：352-376，2002，Li等.Science 299：840-843，2003以及Lin等.Science 278：840-843，1997，其描述了包括干涉量度装置的光学方法。Malmqvist，Nature 361：186-187，1993公开了表面胞质团共振传感器(SPR)。SPR检测＜10pg.mm-2质量负荷的极限(Karlsson和Stahlberg，AnalBiochem 228：274-280，1995)并且允许生物分子相互作用的实时检测。然而，SPR需要特定的和昂贵的测试设备以及用于多路测量的能力是有限的。
本发明提供尤其用于分析物和其结合配偶体之间相互作用的检测而无需任何一种分子标记的试剂和方法。
发明内容
本发明提供尤其用于检测样本中分子的方法和试剂。这些分子在此指分析物。分析物的存在或结构不必已知并且因此本方法可理想地用于检测孤受体至今未知的结合配偶体以及核酸表达或蛋白质包括酶活性、折叠、抗原性或功能的潜在调节剂。本发明的方法在某种程度上基于包埋于微球颗粒内或之上的光学可检测标记物显示特有的回音廊模式(WGM)特征的现象。对“光学可检测的”的引用包括对通过光谱测定方法的检测的引用。当靶分析物与固定至微球颗粒的结合配偶体相互作用时，WGM分布型变化能进行即使十分罕见的结合事件很敏感的检测。
WGM仅允许确定波长的光从颗粒发射。该现象的结果为例如来自荧光团的常见宽发射(10-100nm宽)波段受限制并且作为有效对应颗粒内光不变模式图形的一系列尖锐峰而出现。根据本发明，已确定WGM分布型对微球颗粒表面的变化高度敏感并且当微球颗粒与其环境内的分析物或分子相互作用时WGM分布型改变。
因此，本发明的一个方面涉及检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球颗粒与推定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球颗粒内的每一颗粒包括光学可检测的标记物以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)特征，其中所述分析物与所述固定结合配偶体的结合引起所述至少一组微球颗粒WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
本发明的方法可应用于检测微颗粒WGM分布型的调整，其中所述调整由样本中分子与固定至微球颗粒表面的潜在结合颗粒的结合或其他缔合的检测而产生。基于WGM分布型灵敏变化的分析物和其结合配偶体之间结合反应的检测能鉴定和分离分析物。
本发明的特征为微球颗粒可用各种各样的光源激发，利于许多不同WGM分布型的测量。
“光学可检测标记物”可以是任何分子、原子或离子，其发射荧光、磷光和/或白热。在本发明的一个优选实施方案中，光学可检测标记物为荧光团，其可包括许多光学可检测的标记物如化学荧光团和染料以及量子点。
本发明还提供如此处所述固定至固相支持物的微球颗粒，例如固相支持物可包括显微镜载玻片。
在一具体的实施方案中，本发明提供包含乳胶或二氧化硅颗粒的微球颗粒，其为1μm至100μm直径，用光学可检测标记物，如荧光团或量子点标记，该颗粒进一步包括所检测分析物假定的结合配偶体。光学可检测标记物在可见波长处为可检测的并且微球颗粒呈现一种或多种WGM分布型。当分析物与颗粒上固定的结合配偶体相互作用时可检测地调整了微球颗粒的一种或多种WGM分布型。WGM分布型的任何所述变化为已结合其结合配偶体的分析物存在的指示。
分析物和结合配偶体的实例包括化学分子、核酸分子、蛋白质、脂类、脂肪酸和碳水化合物。
本发明的主题方法不需要分析物存在、出现或结构的任何认识。例如，如果想发现与酶或酶的催化部位相互作用或位于或靠近酶或蛋白质抗原表位的分子(即分析物)，则本方法不需要知道所述分析物是否存在。在那种情况下，微球颗粒将携带在其表面上或附近的靶结合配偶体并且WGM分布型的变化用于检测与靶结合配偶体相互作用的样本如组合文库、化学文库或天然产物来源(例如环境样本、血清、血浆或生物提取物)中的分析物。
本发明通过引入多组微球颗粒而能多路进行，其中每组包括不同尺寸和/或用不同荧光染料标记和/或不同靶结合配偶体的颗粒。
本发明进一步提供通过本方法和可用于实践本方法的试剂盒鉴定的分析物。
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，单词“包含”或变体如“包括”或“含有”将理解为包括所述的要素或整体或要素组或整体组而不排除任何其他的要素或整体或要素组或整体组。
表1中提供此处所用的简写表。
表1-简写
    简写     说明
    APS     氨丙基硅烷
    GAG     糖胺聚糖
    HEX     六氯荧光素
    HLGAG     肝素-样糖胺聚糖
    IR     红外光
    JOE     7’-二甲氧荧光素
    NIR     近红外光
    PEI     聚乙烯亚胺
    PSS     聚苯乙烯磺酸盐
    PVP     聚乙烯吡咯烷酮
    QD     量子点
    SPR     表面胞质团共振
    TAMRA     羧基四甲基若丹明
    TET     四氯荧光素
    TIR     全内反射
    UV     紫外光
    WGM     回音廊模式
附图说明
图1为显示用于产生量子点标记的微球颗粒方法简图的图示。
图2为显示呈现二氧化硅微球颗粒半径极小的变化引起计算的微球颗粒WGM分布型清晰变化的计算曲线的图示。
图3为显示包含量子点(QD)光学可检测标记物的微球颗粒的图示，其呈现清晰的特有荧光和确定的WGM分布型。
图4为显示当生物聚合物单层被吸附至微球颗粒时呈现观察到的微球颗粒WGM分布型转变的实验光谱的图示。QD＝无涂层微球颗粒的量子点对照；PSS＝具有吸附的聚苯乙烯磺酸盐(PSS)单层的微球颗粒；PVP＝具有吸附的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)单层的微球颗粒。
图5为WGM分布型的图示：(a)DNA作为48-聚体偶联至Q-Sand颗粒；(b)Q-Sand珠杂交Transprobe DNA，Transprobe的反向补体；和(c)Q-Sand珠杂交PCR产物。
优选实施方案的详述
本发明提供尤其用于检测此处称为能参加与称为其结合配偶体的另一个分子结合作用的分析物的分子的方法，该结合配偶体固定至用光学可检测标记物(其提供颗粒确定的WGM分布型)标记的微球颗粒表面。对“光学可检测的”的引用包括对通过光谱测定方法的检测的引用。分析物和结合配偶体之间的相互作用产生WGM分布型的变化。此处所述的方法可用于检测样本中的分析物和分析物之间的相互作用。重要的是，分析物和其结合配偶体均不需要标记物。该相互作用诱导微球颗粒的WGM分布型变化。本发明的方法在某种程度上以包埋在微球颗粒内或其上的荧光发射体产生确定的WGM分布型的现象为基础。微球颗粒可由各种各样的光源激发。此利于许多不同构型的测量并且利于多路复用。
WGM仅允许确定波长的光从颗粒发射。该现象的结果为来自荧光团的常见宽发射(10-100nm宽)波段受限制并且作为有效对应颗粒内光不变模式图形的一系列尖锐峰而出现。
WGM分布型对与微球颗粒表面的相互作用或缔合高度敏感。因此，由于WGM分布型的变化可检测甚至十分罕见的结合事件。
除非另有说明，将理解本发明不限于具体的微球颗粒制剂、生产方法、诊断或测定方案等等，因为所述可以改变。还应理解此处所用的术语仅用于描述具体的实施方案而不试图限制。对“分析物”和“结合配偶体”的引用不应推断为分析物结构的任何知识为已知的或要求为已知的。
必须指出，除非上下文已另有规定，如本说明书中所用的，单数形式“一”、“一个”和“这个”包括复数方面。因此例如，“峰”或“特征”的引用包括单个峰或特征以及两个或更多峰或特征；“微球颗粒”包括单个颗粒以及两个或更多颗粒等等。
在一个方面，本发明涉及检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球颗粒与推定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球颗粒内的每一颗粒包括光学可检测的标记物以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)特征，其中所述分析物结合所述固定的结合配偶体引起所述至少一组微球颗粒WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
本发明涉及的“微球颗粒”包括含任何材料，同质的或可基于其光学可检测标记物产生一种或多种WGM分布型的颗粒。如对本领域技术人员显而易见的，几乎任何材料，同质的或不同的材料可用于该微球颗粒。此处涉及的微球颗粒还可包含一种以上物质，并且可包含壳、合金或有机和/或无机物的混合物。如果微球颗粒包含具有各向同性折射率的基本上同质的材料并且其还为不吸收的(而不是光学可检测标记物，其如下进一步描述)，则有利于通过本发明方法产生的数据的定量。
可用于本发明并且代表本发明具体实施方案的尤其有用的材料包括选自下列的材料：二氧化硅(例如：石英或玻璃)、乳胶、二氧化钛、二氧化锡、氧化钇、矾土和其他二元金属氧化物(如ZnO)、钙钛矿和其他压电金属氧化物(如BaTiO3)、ZnS、蔗糖、琼脂糖和其他聚合珠。在特别优选的实施方案中，“颗粒”和/或“微球颗粒”包含二氧化硅。
此外，本发明涉及的颗粒可以任何适当的规则或不规则3-维形状产生。然而，虽然许多材料的形状可维持WGM分布型，实际上通常合成小球体或类球形颗粒。所述球体或类球形颗粒在此也称为“微球颗粒”或“微球体”。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的“颗粒”和“微球颗粒”基本上为球形的或类球状的或包含“微球体”。
虽然本发明的颗粒可称为“微球”，但微球颗粒的实际尺寸取决于各种因素并且颗粒事实上可能或可能不包括测微计范围的度量单位。在一个优选实施方案中，本发明的微球颗粒包括约1μm至约100μm的直径(或非-球形颗粒的同等尺寸)，包括1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm、81μm、82μm、83μm、84μm、85μm、86μm、87μm、88μm、89μm、90μm、91μm、92μm、93μm、94μm、95μm、96μm、97μm、98μm、99μm和100μm。这些微球尺寸的引用包括整数的分数。例如，1μm和2μm之间包括1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、195或2.0。
具体的实施方案中，微球颗粒为微球体。
包含一组微球体的一组微球颗粒包括具有共同标记物或尺寸或固定的结合配偶体的多样(即两种或多种)颗粒或微球体。
如此处所用的，术语“光学可检测标记物”指任何分子、原子或离子，其发射荧光、磷光和/或白热。可选择光学可检测标记物以任何可很容易地分辩WGM分布型的波长发射。此取决于发射波长与颗粒半径的比率。假定球体半径为任意的，发射可适当地选自紫外线(约350nm至约3nm波长范围)、可见光(约350nm至约800nm波长范围)、近红外线(NIR)(约800nm至约1500nm波长范围)和/或红外线(IR)(约1500nm至约10μm波长范围)的范围。然而，由于检测的容易程度，尤其在一个优选实施方案中，该光学可检测标记物在可见波长范围中为可检测的。
在一个具体的实施方案中，该光学可检测标记物可以是响应红外激发发射可见光辐射的光学可检测标记物。所述光学可检测标记物在此也称为“上转换器”。
因此，本发明的另一个方面提供检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球形颗粒与推定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球形颗粒内的每一颗粒包括具有响应红外激发而发射可见辐射的标记物以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)特征，其中所述分析物结合所述固定的结合配偶体引起所述至少一组微球颗粒WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
光学可检测标记物的唯一限制为所选的标记物中的发射应产生空腔谐振模式发射。
本发明另外的实施方案中，该光学可检测标记物包括选自荧光团、半导体颗粒、磷颗粒、掺杂颗粒或纳米晶体和量子点的一种或多种标记物。此外，来自小金属颗粒的散射光(表面胞质团发射)可用作光学可检测标记物。
因此，本发明进一步的方面涉及检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球颗粒与推定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球颗粒内的每一颗粒包括选自荧光团、半导体颗粒、磷颗粒、掺杂颗粒或纳米晶体和量子点的光学可检测标记物以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)特征，其中所述分析物结合所述固定的结合配偶体引起所述至少一组微球颗粒的WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
本发明的另一实施方案中，该光学可检测标记物为荧光团。如此处所用的，术语“荧光团”指呈现荧光特征的任何分子。为此，术语“荧光”可定义为分子吸收特定波长光并且再发射更长波长光的特征。波长的改变与该过程中发生的能量损失有关。术语“荧光团”可包括多种光学可检测标记物如化学荧光团和染料以及量子点。
在具体的实施方案中，本发明提供检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球颗粒与推定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球颗粒内的每一颗粒包括量子点形式的荧光团以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)特征，其中所述分析物结合所述固定的结合配偶体引起所述至少一组微球颗粒的WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
可用于本发明的一种特别方便的光学可检测标记物是将荧光颗粒包埋于微球颗粒上或中。这些光学可检测标记物颗粒可以小至其特征和发射变成尺寸依赖性的。如此小的光学可检测标记物颗粒在本领域称为半导体纳米颗粒、量子点、量子线、量子棒或纳米晶体或Q粒。然而如此处所用的，术语“量子点”或“QD”应理解为包括所有这样的颗粒。此外，包括QD的光学可检测标记物可包括近似球形或类球形的颗粒，或涂布的球形或类球形颗粒。然而，术语QD不应以任何方式认为限于球状的、类球状的、圆形的、圆柱的或“点”的任何其他形态。例如如此处所用的，QD还可包括其他的形态，尤其包括棒-样、椭圆体的或涂布的棒-样或椭圆体的颗粒。
QD包括半导体材料的纳米比例的结晶核；生物学活性形式通常由防护壳和外涂层包围。例如，QD可包括半导体微晶，其为约2nm至约30nm直径(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nm)并且可包含晶体内大约50-500,000个原子，包括发光晶体，所述发光晶体包括如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、PbTe、HgS、HgSe、HgTe、Si、ZnO的材料。
QD发出具有宽吸收光谱和窄发射光谱的荧光。不同于具有不同吸收光谱的其它荧光团，QD吸收超过宽光谱段的光，其允许量子点受多种光源，如激光、弧光灯或LED的激发。此外，许多不同的QD的集合可用于仅利用单个激发光源的多路应用。然而，每个点的发射光谱通常非常窄，约为30nm量级，准确的颜色取决于颗粒的直径和组成。此外，QD的窄发射光谱允许相邻点的光谱分辨率。除以上好处外，QD还相对耐光，甚至在强激发期间，并且比荧光团更亮。
根据上述，还应理解的是本发明包括使用不同尺寸QD以优化波长，在该波长可在微球颗粒中产生WGM分布型。
此外，本发明涉及用方法如热处理、表面改性、合金、表面钝化或用表面涂层加盖处理而使QD能发射高量子产量并且长期改善光稳定性的QD。
QD也可从公司如Quantum Dot Corp.(QDC)购得，其生产QD如Qdot[商标]605链亲和素共轭物，包含在605nm发射的镉-硒化物核。还可得到在525、565、585和655nm发射的Qdot共轭物。然而，应理解本发明不以任何方式受QD的具体组成(或任何其他光学可检测标记物)的限制并且任何QD(商品化的或另外的)可适于本发明。
还存在本领域可用的许多荧光染料，其可根据本发明用作荧光团。确定荧光染料或其他荧光团使用潜力的重要性质为荧光团的激发波长；其必须匹配光源的有效波长。然而，许多不同的荧光染料和其他荧光团对本领域技术人员来说是熟知的，并且对荧光标志物的选择决不限制本发明。
可用于微球颗粒标记的方便的“荧光团”包括任何荧光标志物，其可利用选自以下的光源激发：
(i) 氩离子激光器-包括蓝色，488nm系，其适于在绿色至红色区域中发荧光的许多染料和荧光染料的激发。在波长范围(其中458nm、488nm、496nm、515nm)发射的可调氩激光器也是可用的。
(ii) 二极管激光器-具有635nm的发射波长。现有的其他二极管激光器在532nm运行。该波长最佳地激发碘化丙锭(PI)。发射约476nm光的蓝色二极管激光器也是可用的。可方便地运用所述二极管激光器在微球颗粒内激发WGM。
(iii) HeNe气体激光器-以红色633nm系运行。可方便地运用所述激光器在微球颗粒内激发WGM。
(iv) HeCd激光器-在325nm运行。可方便地运用所述激光器在微球颗粒内激发WGM。
(v) 100W汞弧灯-用于UV染料如Hoechst和DAPI激发的最有效光源。
(vi)Xe弧光灯和石英卤素灯同样可用作激发WGM并且因此利用颗粒作为传感器的设备。
本发明具体的实施方案中，荧光标记物选自：Alexa Fluor染料；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；Cy染料，尤其是Cy3、Cy5和Cy 5.5；6-FAM(荧光素)；荧光素dT；六氯荧光素(HEX)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)；Oregon绿染料，包括488-X和514；若丹明染料，包括若丹明绿、若丹明红和ROX；羧基四甲基若丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；以及Texas红。两种染色技术通常用于荧光标记微球颗粒的内部染色和外部染色(表面-标记)。这两种技术产生具有独特性质的颗粒，每种有利于不同的应用。内部染色产生具有通常窄荧光发射的非常稳定的颗粒。这些颗粒常常呈现对光漂白更大的抗性。由于荧光团位于珠内部，表面基团可有效用于共轭配体(蛋白质、抗体、核酸等等)至珠表面。为此，内部标记的珠通常用于分析物-检测和免疫测定应用。表面-标记包括荧光团共轭至微球颗粒表面。由于荧光团位于颗粒表面上，其能与其环境相互作用就像荧光团位于染色的细胞上一样。结果为标准颗粒，其在各种不同条件如污染物存在或pH改变下呈现如染色的细胞样本一样的激发和发射性质。表面-标记颗粒的“环境响应”性质使得其非常适于模拟生物样本。外部标记的颗粒常常在许多利用荧光检测的应用中用作对照和标准。然而，本发明涉及颗粒与荧光标记物通过任何方法的缔合。
术语“磷光颗粒”、“磷颗粒”和“磷光体”在此可互换使用。本领域技术人员很容易理解什么组成磷光光学可检测标记物。然而作为举例而决不限制本发明，合适的磷光体包括ZnS、ZnS:Cu、Eu氧化物和显示设备中所用的其他磷光体的小颗粒。
包括“掺杂颗粒”的光学可检测标记物可包括具有一种或多种稀土离子，如Eu、Y、Yb、Sm等等封闭量的颗粒。
如此处所用的，术语“光学可检测标记物”应理解为还包括多个光学可检测标记物、光学可检测标记物的混合物、涂布的纳米晶体、合金和其他的复杂混合物，其对于技术人员来说是显而易见的。微球颗粒上所有所述光学可检测标记物的用途被认为在此处所述方法和试剂的范围内。
根据本发明，已表明任何具体标记物的发射取决于该标记物在微球颗粒中的分布，标记物的类型和标记物的浓度。然而，本发明的方法仍然可实行而不管光学可检测标记物是否在微球颗粒表面、作为壳存在于微球颗粒内、位于微球颗粒的核或存在于一种以上的所述部位。
应当指出本发明的方法并不基于来自光学可检测标记物发射的猝灭。然而本发明的方法在某种程度上基于作为分析物与固定至微球颗粒表面的结合配偶体相互作用或缔合结果的光学可检测标记物WGM分布型的调制(即改变)。
WGM，当用电磁辐射处理时为电磁谐振，其可在入射光与比其周围介质具有更高折射率的颗粒相互作用时产生。对于给定的粒径，WGM在特定的光共振波长出现，并且WGM的性质可尤其随着包含WGM的颗粒的尺寸和颗粒以及周围介质的折射率而改变。此外，颗粒的尺寸还可影响其中产生的WGM。当入射光在颗粒表面经历全内反射时产生WGM。
全内反射(TIR)可在两种非吸收性介质之间的界面处存在。当高折射率介质中传播的一束光以超过临界角的入射角接触较低折射率介质的界面时，光在该界面全反射并且传播返回高折射率介质。如对本领域技术人员显而易见的，3-维介质中光可在高折射率颗粒内多次反射。WGM中，光集中接近颗粒周边并且可为指定的模数和模式阶次。模数n提供颗粒周边的波长数目，而模式阶次1提供颗粒内电磁场半径依赖性的最大数目。
如此处规定的，包埋于颗粒上或内的荧光发射体呈现确定的WGM分布型。这些模式仅允许确定波长的光自颗粒发射。该现象的结果是光学可检测标记物通常相对宽的发射光谱(例如，荧光团通常以10-100hm宽)受限制并且作为有效对应颗粒内光不变模式图形的一系列尖锐“峰”而出现。作为本发明微球颗粒内WGM建立结果而产生的一系列峰在此称为“回音廊模式分布型”或“WGM分布型”。
WGM分布型对包埋的光学可检测标记物的位置及其浓度以及相互间的立体构型高度敏感。此外，在确定WGM分布型中所见的发射波长中粒径和折射率同样重要。
提示WGM分布型中一个或多个峰的位置和振辐可受微球颗粒与样本或外界环境中分子的相互作用或缔合的强烈影响。
在一个实例中，分子与微球颗粒的缔合或结合改变微球颗粒的有效折射率，从而改变由微球颗粒产生的WGM分布型。
术语“折射率”可很容易由本领域技术人员所理解。简而言之，介质的折射率为根据在真空中与在更大密度的第二种介质中光速的比率计算的值。在微球颗粒情况下，“有效折射率”的变化可以是全部微球颗粒的折射率变化，或者有效折射率的变化可以是微球颗粒的区域或部分的折射率的变化。例如微球颗粒的有效折射率的变化可包括微球颗粒表面和/或外周部折射率的改变。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于检测分子结合或缔合至或者接近微球颗粒表面或亚-表面的方法，其中该分子与该分子固定的结合配偶体的结合或缔合影响该微球颗粒表面有效折射率的改变。
“亚-表面”包括颗粒周围的袋或孔或其在颗粒的内部环境和外部环境之间形成共-连续的界面。
在又一个方面，本发明涉及本发明的方法用于检测微球颗粒形态、形状或尺寸改变的应用，其中该微球颗粒包含用光学可检测标记物标记的颗粒并且携带固定至该颗粒表面或亚-表面的分子，其中所述微球颗粒呈现一种或多种WGM分布型，并且其中基于所述微球颗粒标记物的一种或多种WGM分布型随着分析物与固定的分子相互作用时微球颗粒形态、形状或尺寸的变化的可检测地改变；该方法包括：
(i)确定微球颗粒原始的WGM分布型；
(ii)在分析物和固定的分子之间潜在的相互作用之后，使微球颗粒经历假定的微球颗粒形态、形状或尺寸的改变；
(iii)确定微球颗粒一种或多种随后的WGM分布型；
其中相对原始的WGM分布型，微球颗粒的一种或多种随后的WGM分布型的调制为微球颗粒的形态、形状或尺寸的改变以及与固定的分子结合的分析物存在的指示。
如此处所指的微球颗粒的“形态、形状或尺寸”指微球颗粒的空间尺寸。因此，微球颗粒形态、形状或尺寸的改变包括微球颗粒任何空间尺寸的改变，包括但不限于高度、宽度、深度、半径、直径、周长等等的改变。
又一个方面中，本发明涉及包含用光学可检测标记物标记的颗粒的微球颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型在分析物与固定至所述微球颗粒的分子相互作用时可检测地调制。
如此处所用的，分子或固定至微球颗粒的结合配偶体或样本中的分析物指任何化学体。所述化学体包括但不限于，小的化学分子；肽、多肽和蛋白质或其类似物、核酸分子或其类似物、金属原子或离子或包含所述原子或离子的化合物。对于核酸分子，尤其涉及短的干扰RNA(单或双链)[siRNA]、干扰RNA复合物(RNAi)和DNA以及RNA寡核苷酸。化合物包括组合文库或化学文库中产生的实体。此外，从生物源进行天然产物的筛选。其他来源中，提及的生物源包括环境样本、生物提取物、植物或动物提取物、血清、尿、排泄物、精子、血浆、土壤样本、河流或密封样本、地球外样本。
如此处所用的短语“结合，或与...缔合”指分子与微球颗粒关联的任何过程。介导所述关联的例证性方式可包括但不限于：共价键、氢键作用、范德华力、离子键、金属键、极性键和配价键(共价的)等等。
包括结合配偶体的分子还可通过促进或提高该分子吸附或结合至该微球颗粒表面的试剂附着于微球颗粒，所述试剂在此称为“接头”。例如，多核苷酸可通过包含巯基、胺或羧基的接头与微球颗粒连接。合适接头的实例包括氨基-末端的硅烷如氨基-丙基三甲氧基硅烷或氨基-丙基三乙氧基硅烷。除硅烷外，化合物如非-共价附着于如玻璃表面和静电吸附多核苷酸的磷酸基的聚L-赖氨酸也在本发明的范围内。因此，适于促进多核苷酸、多肽或其他化合物结合或连接至微球颗粒表面的其他分子，包括其他的硅烷可由技术人员很容易地鉴定，并且本发明不受接头选择的限制。
在一实施方案中，本发明涉及包含用光学可检测标记物标记的颗粒的微球颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型在分子例如通过包含结合至或与微球颗粒表面连接的核酸分子的分子与微球颗粒结合或连接时可检测地调制。
如本领域技术人员很容易理解的，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物，正义链和反义链，并且可经化学或生物化学修饰或可包含非天然的或衍生的核苷酸碱基。所述修饰包括例如，标记、甲基化、一种或多种天然存在的核苷酸用类似物(如吗啉环)的取代、核苷酸内修饰如不带电的键(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸盐等等)、带电荷的键(如硫代磷酯、二硫代磷酸酯等等)、悬挂部分(如多肽)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等等)、螯合剂、烷化剂和修饰的键(如α-异头核酸等等)。还包括模拟能通过氢键作用和其他的化学相互作用结合指定序列的多核苷酸的合成分子。所述分子在本领域已知并且包括例如，该分子主链中肽键以磷酸盐键代替的那些。
本发明的另一个实施方案涉及如以上所述的微球颗粒，其中该微球颗粒进一步包括结合至或与微球颗粒连接的DNA。
本发明的还一个优选实施方案涉及如上所述的微球颗粒，其中该微球颗粒进一步包括结合至或与微球颗粒表面连接的RNA或RNA复合物(例如RNA-Rnase复合物)。
在可选择的实施方案中，本发明涉及包含用光学可检测标记物标记的颗粒的微球颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型在肽、多肽或蛋白质或其类似物结合至或与微球颗粒表面连接时可检测地调制。
在一实施方案中，肽、多肽或蛋白质为酶。
在另一实施方案中，肽、多肽或蛋白质为抗体。
术语“抗体”指能与抗原结合、互相作用或缔合的免疫球蛋白家族的蛋白质。因此抗体为抗原-结合分子。术语“抗原”在此以其广义使用，指能与抗体的抗原结合部位反应或结合的物质。根据本发明，抗原还包括抗体的个体基因型。
术语“免疫球蛋白”在此用于指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白分子包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、和μ恒定区、轻链(κ和1)，以及无数的免疫球蛋白可变区。免疫球蛋白的一种形式组成抗体的基本结构单元。该形式为四聚物并且由两个免疫球蛋白链的相同对组成，每对具有一条轻链和一条重链。每对中，轻和重链可变区共同负责结合抗原，而恒定区负责抗体效应物功能。除抗体外，免疫球蛋白可以各种其他形式存在，包括例如，Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2和嵌合抗体并且所有这些变体由此处所用的术语“抗体”所包括。此外，来自其他动物(如禽类、哺乳动物、鱼、两栖动物和爬行动物)的免疫球蛋白具有类似的功能，但具有不同的命名并且这些也认为是“抗体”。
本发明还涉及包含结合至或与此缔合的抗-个体基因型抗体的微球颗粒。如此处所用的，术语“抗-个体基因型抗体”指识别和结合靶抗体可变区内，例如VH和/或VL结构域的抗原决定簇的抗体。这些抗体可变区内的抗原决定簇被称为抗体的“个体基因型”。因此，这些区域的特异性抗体称为“抗-个体基因型抗体”。
在此提及的肽、多肽和/或蛋白质的“类似物”包括但不限于包含侧链修饰的肽、多肽或蛋白质，在合成和利用交联剂和其他方法对肽、多肽或蛋白质强行构象限制期间引入非天然氨基酸的合成肽和/或其衍生物。
侧链修饰的实例包括氨基的修饰，例如通过与醛反应随后由NaBH4还原的还原性烷基化作用；用甲基亚氨逐乙酸酯(methylacetimidate)的脒基化(amidination)；用乙酸酐的酰化；用氰酸盐的氨基的甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基的三硝基苄基化；用琥珀酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基的酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸酯，接着用NaBH4还原的赖氨酸的吡哆醛化。
精氨酸残基的胍基可通过与试剂例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。
羧基可通过形成O-acylisourea进行碳化二亚胺活化，接着进行后来的衍生，例如形成相应的酰胺来修饰。
巯基可通过以下方法来修饰，例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；利用对氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、苯汞氯化物、2-氯汞基-4-硝基酚以及其它汞制剂形成汞衍生物；用氰酸盐在碱性pH下甲氨酰化方法。
色氨酸残基可通过，例如用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤化物(sulphenyl halides)烷基化吲哚环来进行修饰。在另一方面，酪氨酸残基，可通过四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物加以改变。
组氨酸残基的咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化完成。
在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于，利用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基戊酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文考虑的非天然氨基酸列表在表3中显示。
表2-非常规氨基酸编码
    非常规氨基酸     编码     非常规氨基酸     编码
    α-氨基丁酸α-氨基-α-丁酸甲酯氨基环丙烷-羧酸酯氨基异丁酸氨基降冰片基-羧酸酯环己基丙氨酸环戊基丙氨酸D-丙氨酸D-精氨酸D-天冬氨酸D-半胱氨酸     AbuMgabuCproAibNorbChexaCpenDalDargDaspDcys     L-N-甲基丙氨酸L-N-甲基精氨酸L-N-甲基天冬酰胺L-N-甲基天冬氨酸L-N-甲基半胱氨酸L-N-甲基谷氨酰胺L-N-甲基谷氨酸L-N-甲基组氨酸L-N-甲基异亮氨酸L-N-甲基亮氨酸L-N-甲基赖氨酸L-N-甲基甲硫氨酸L-N-甲基正亮氨酸     NmalaNmargNmasnNmaspNmcysNmglnNmgluNmhisNmileNmleuNmlysNmmetNmnle
    D-谷氨酰胺D-谷氨酸D-组氨酸D-异亮氨酸D-亮氨酸D-赖氨酸D-甲硫氨酸D-鸟氨酸D-苯丙氨酸D-脯氨酸D-丝氨酸D-苏氨酸D-色氨酸D-酪氨酸D-缬氨酸D-α-甲基丙氨酸D-α-甲基精氨酸D-α-甲基天冬酰胺D-α-甲基天冬氨酸D-α-甲基半胱氨酸D-α-甲基谷氨酰胺D-α-甲基组氨酸D-α-甲基异亮氨酸D-α-甲基亮氨酸D-α-甲基赖氨酸D-α-甲基甲硫氨酸D-α-甲基鸟氨酸D-α-甲基苯丙氨酸D-α-甲基脯氨酸     DglnDgluDhisDileDleuDlysDmetDornDpheDproDserDthrDtrpDtyrDvalDmalaDmargDmasnDmaspDmcysDmglnDmhisDmileDmleuDmlysDmmetDmornDmpheDmpro     L-N-甲基正缬氨酸L-N-甲基鸟氨酸L-N-甲基苯丙氨酸L-N-甲基脯氨酸L-N-甲基丝氨酸L-N-甲基苏氨酸L-N-甲基色氨酸L-N-甲基酪氨酸L-N-甲基缬氨酸L-N-甲基乙基甘氨酸L-N-甲基-t-丁基甘氨酸L-正亮氨酸L-正缬氨酸α-甲基-氨基异丁酸α-甲基-γ-氨基异丁酸α-甲基环己基丙氨酸α-甲基环戊基丙氨酸α-甲基-α-萘基丙氨酸α-甲基青霉胺N-(4-氨基丁基)甘氨酸N-(2-氨基乙基)甘氨酸N-(3-氨基丙基)甘氨酸N-氨基-α-甲基丁酸α-萘基丙氨酸N-苯甲基甘氨酸N-(2-氨甲酰基乙基)甘氨酸N-(氨甲酰基甲基)甘氨酸N-(2-羧基乙基)甘氨酸N-(羧基甲基)甘氨酸     NmnvaNmornNmpheNmproNmserNmthrNmtrpNmtyrNmvalNmetgNmtbugNleNvaMaibMgabuMchexaMcpenManapMpenNgluNaegNornNmaabuAnapNpheNglnNasnNgluNasp
  D-α-甲基丝氨酸D-α-甲基苏氨酸D-α-甲基色氨酸D-α-甲基酪氨酸D-α-甲基缬氨酸D-N-甲基丙氨酸D-N-甲基精氨酸D-N-甲基天冬酰胺D-N-甲基天冬氨酸D-N-甲基半胱氨酸D-N-甲基谷氨酰胺D-N-甲基谷氨酸D-N-甲基组氨酸D-N-甲基异亮氨酸D-N-甲基亮氨酸D-N-甲基赖氨酸N-甲基环己基丙氨酸D-N-甲基鸟氨酸N-甲基甘氨酸N-甲基氨基异丁酸酯N-(1-甲基丙基)甘氨酸N-(2-甲基丙基)甘氨酸D-N-甲基色氨酸D-N-甲基酪氨酸D-N-甲基缬氨酸γ-氨基丁酸L-t-丁基甘氨酸L-乙基甘氨酸L-同型苯丙氨酸   DmserDmthrDmtrpDmtyDmvalDnmalaDnmargDnmasnDnmaspDnmcysDnmglnDnmgluDnmhisDnmileDnmleuDnmlysNmchexaDnmornNalaNmaibNileNleuDnmtrpDnmtyrDnmvalGabuTbugEtgHphe   N-环丁基甘氨酸N-环庚基甘氨酸N-环己基甘氨酸N-环癸基甘氨酸N-环十二烷基甘氨酸N-环辛基甘氨酸N-环丙基甘氨酸N-环十-烷基甘氨酸N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸N-(3-胍丙基)甘氨酸N-(1-羟乙基)甘氨酸N-(羟乙基))甘氨酸N-(咪唑基乙基))甘氨酸N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸N-甲基-γ-氨基丁酸D-N-甲基甲硫氨酸N-甲基环戊基丙氨酸D-N-甲基苯基丙氨酸D-N-甲基脯氨酸D-N-甲基丝氨酸D-N-甲基苏氨酸N-(1-甲基乙基)甘氨酸N-甲基-萘基丙氨酸N-甲基青霉胺N-(对-羟苯基)甘氨酸N-(硫甲基)甘氨酸青霉胺L-α-甲基丙氨酸   NcbutNchepNchexNcdecNcdodNcoctNcproNcundNbhmNbheNargNthrNserNhisNhtrpNmgabuDnmmetNmcpenDnmpheDnmproDnmserDnmthrNvalNmanapNmpenNhtyrNcysPenMala
    L-α-甲基精氨酸L-α-甲基天冬氨酸L-α-甲基半胱氨酸L-α-甲基谷氨酰胺L-α-甲基组氨酸L-α-甲基异亮氨酸L-α-甲基亮氨酸L-α-甲基甲硫氨酸L-α-甲基正缬氨酸L-α-甲基苯丙氨酸L-α-甲基丝氨酸L-α-甲基色氨酸L-α-甲基缬氨酸     MargMaspMcysMglnMhisMileMleuMmetMnvaMpheMserMtrpMval     L-α-甲基天冬酰胺L-α-甲基-t-丁基甘氨酸L-α-甲基乙基甘氨酸L-α-甲基谷氨酸L-α-甲基同型苯丙氨酸N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸L-α-甲基赖氨酸L-α-甲基正亮氨酸L-α-甲基鸟氨酸L-α-甲基脯氨酸L-α-甲基苏氨酸L-α-甲基酪氨酸L-N-甲基同型苯丙氨酸     MasnMtbugMetgMgluMhpheNmetMlysMnleMornMproMthrMtyrNmhphe
    N-(N-(2，2-二苯基乙基)氨甲酰基甲基)甘氨酸N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨甲酰基甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷     NnbhmNnbheNmbc
交联剂可被用来，例如，稳定三维构象，利用同基双官能交联剂如具有(CH2)n间隔基团，其中n＝1到n＝6的双官能酰亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及异源双官能试剂，该试剂通常具有氨基反应基元如N-羟基琥珀酰亚胺和其它基团特异性反应基元如马来酰亚胺或二硫基基元(SH)或碳化二亚胺(C00H)。此外，肽可以从构象上被束缚，例如，通过掺入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键以及通过引入共价键，如在N和C末端之间、在两个侧链之间、或者在侧链和N或C末端之间形成酰胺键来形成环肽或类似物。
在又一个可选择的实施方案中，本发明涉及包含用光学可检测标记物标记的颗粒的微球颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型在碳水化合物分子或其类似物结合至或与微球颗粒表面连接时可检测地调制。
一个尤其优选的实施方案中，碳水化合物分子为糖胺聚糖(GAG)分子或GAG-样分子。
GAG普遍存在并且在人体内的许多炎性过程中起着关键作用。这些大分子量多糖促进如癌症转移、关节炎、移植排斥和哮喘的过程并且因此更多对这些过程了解可引导改进用于所述病症最终治疗的药物。目前，一种最广为人知的GAG为硫化多糖的肝素家族，并且充分了解了这些分子的抗凝剂活性。
肝素-样GAG(HLGAG)为分子的异基因组(Conrad，Heparinbinding proteins.Academic Press，San Diego，1998；Lander和Selleck，J Cell Biol 148(2)：227-232，2000)。肝素和硫酸乙酰肝素，与所有HLGAG一样，为长的线性多糖(Sasisekharan和Venkataraman，Curr Opin Chem Biol 4(6)：626-631，2000；Casu，Ann NY Acad Sci 556：1-17，1989；Casu，Adv Carbohydr Chem Biochem43：51-134，1985)。其作为包含葡糖醛酸(GIcA)和葡糖胺(GlcN)的重复二糖单元的非-硫化链而合成，其在高尔基体中在顺着其长度的不同部位被修饰。肝素比硫酸乙酰肝素更广泛地被修饰并且大多数GlcN单元通过硫化基团修饰而变成N-硫化GlcN以及大多数GlcA单元通过表异构酶作用转变成艾杜糖醛酸(IdoA)而被修饰。由于对硫化链的修饰常常不完全，因此HLGAG为异基因的。结果为大量的中间体修饰区域。
因此例如，硫酸乙酰肝素链由高度硫化的结构柔性的结构域组成，所述结构域富集2-O-硫化的IdoA，与主要由N-乙酰GlcN和GlcA的低硫化区域(为刚性结构)交替。HLGAG的硫化模式是复杂的，尤其对于6-O-硫酸盐的定位。因此，不是所有的HLGAG分子都相同。它是主要确定特定HLGAG的蛋白质结合特征的硫化模式。
一些蛋白质仅结合HLGAG链内特定的结构基序，而反之，一些GAG仅结合蛋白质上的特定部位或区域。例如抗-凝血酶III结合呈现特定硫化基团排列的独特的戊糖序列而肝素戊糖结合抗-凝血酶III蛋白上的特异性位点(Whisstock等.J Mol Biol 301：1287-1305，2000)。基础成纤维细胞-来源的生长因子(FGE-2)和肝细胞生长因子(HGF)均结合肝素，而结合必需的肝素结构对于每种很不相同并且不同于抗-凝血酶III结合需要的(Maccarana等.J Biol Chem 268(32)：23898-23905，1993；Lyon等.J Biol Chem 269：11216-11223，1994)。另外，已显示肝素结合FGF-2上的特定区域(Faham等.Science 271：1116-1120，1996)。
FGF-2识别在规定位置中包含单个IdoA 2-O-硫酸盐的基序，而对于HGF，GlcN 6-O-硫酸盐基团的定位很关键。制剂内的一些肝素分子将运载结合戊糖的抗-凝血酶III和结合基序的FGF-2，而其它将运载结合基序的HGF和FGF-2基序而非结合戊糖的抗-凝血酶III。实际上，平均起来肝素制剂内仅三分之一分子运载结合戊糖的抗-凝血酶III(Conrad，1998，上文)。
GAG-样分子还可源自非-哺乳动物的来源。例如，来自大肠杆菌K5的荚膜多糖由α-N-乙酰基氨基葡萄糖(α-GlcNAc)和β-葡糖醛酸(β-GlcA)单元交替组成并且不包含硫酸盐或其他带电基团。肝素主链由具有不同程度硫化的下列基序o-GlcNAc、β-GlcA、α-GlcNAc、β-艾杜糖醛酸(β-IdoA)组成。GlcA和IdoA之间仅有的差异为C-5位羧酸基的构型，因此肝素主链和大肠杆菌K5主链结构非常相似。
在又一个方面，本发明提供检测能参与固定至或与如上所述包含光学可检测标记物的微球颗粒连接的分子和样本中所述分子的假定的分析物结合配偶体之间结合相互作用的分子的方法，所述方法包括：
(i)确定包含固定至或与此关联的分子的微球颗粒的原始WGM分布型；和
(ii)将包含所述固定的或与此关联的微球分子的微球颗粒与包含所述分子的假定的分析物结合配偶体的样本接触；
其中相对原始WGM分布型，微球颗粒的WGM分布型的可检测的改变为分子和该分子分析物结合配偶体之间结合或相互作用的指示。
如此处所用的“WGM分布型的可检测的改变”可包括任何两种WGM分布型之间可观察到的任何差异。
在一个的优选实施方案中，该可检测的改变可包括一种WGM分布型相对另一种WGM分布型的一个或多个峰的红移或蓝移。
如此处所用的术语“红移”指WGM分布型的一个或多个峰最大振辐点移位至更长的波长。不管该名称“红”，红移可存在于电磁波谱的任何部分并且不限于可见光。如此处所用的术语“红移”包括峰至更长波长的任何移位。反之，术语“蓝移”指峰至更短波长的任何移动。
在尤其优选的实施方案中，WGM分布型中峰的红移或蓝-移通常包括大约1至100nm峰的最大振辐的波长的改变。所述1至100nm包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100nm的波长。具体的实施方案中，WGM分布型中峰的红移或蓝移包括大约1至20nm峰最大振辐的波长的改变，其包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20nm的波长。虽然具体地举例说明了可见光峰中相关的波长移位，但本发明还涉及电磁波谱的其他区域中同等的和/或成比例的红移和蓝移。
本发明另外的实施方案中，微球颗粒一种或多种WGM分布型的改变，其由微球颗粒上固定的分子与分析物的相互作用引起，可包括一种或多种WGM分布型中一个或多个峰的出现或一种或多种WGM分布型中一个或多个峰的消失。
在此所述的微球颗粒的WGM分布型可利用对本领域技术人员显然的任何适当的方法确定。基本上可检测电磁辐射的一个或多个波长的任何检测方法都可用于检测WGM分布型。优选，检测方法足够灵敏而使得其可区分WGM分布型中的峰，更优选该检测方法可区分两个峰，其为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100nm相隔。可用于确定微球颗粒WGM分布型的尤其适当的方法包括流式-细胞计数器、阵列阅读器和共聚焦显微镜。
如此处所用的术语“共聚焦显微镜”在其范围内包括激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和多光子共聚焦显微镜。
本发明还提供固定至固相支持物的微球颗粒。
因此，另一方面中，本发明提供包含用光学可检测标记物标记的颗粒的微球颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型随着所述微球颗粒固定于固相支持物上和/或分析物与固定颗粒上捕获的结合配偶体相互作用而可检测地调制。
如此处所用的该术语“固相支持物”指微球颗粒可固定于其上的任何固体基质。本发明优选的实施方案中，固相支持物包括允许待检测的固定至其上的微球颗粒的WGM分布型的固相支持物。因此，优选的固相支持物为可用于固定用于利用共聚焦显微镜分析的微球颗粒的那些。在尤其优选的实施方案中，固相支持物为显微镜载玻片。
又一个方面中，本发明涉及其中包含一个或多个凹痕的显微镜载玻片，其中每个凹痕适于固定如此处所述的微球颗粒。优选，通过所述颗粒沉降入或包埋入所述载玻片的凹痕中，微球颗粒固定于所述载玻片上。
又一个方面中，本发明提供检测假定在样本中的分析物的方法，所述方法包括：
(i)  确定微球颗粒的原始WGM分布型，所述微球颗粒包含用光学可检测标记物标记的颗粒和固定至或与此连接的分子的颗粒，其中该微球颗粒呈现WGM分布型并且其中该微球颗粒的WGM分布型在所述微球结合或与所述样本中假定的分析物相互作用时可检测地调制；
(ii)将所述样本施加至所述微球颗粒一段时间并且处于允许分析物与固定或连接至该微球颗粒的分子相互作用的条件下；
(iii)随后确定该微球颗粒的WGM分布型；
其中相对原始WGM分布型，WGM分布型可检测的改变为所述样本中所述分析物存在的指示，并且相对原始WGM分布型，WGM分布型可检测改变的缺乏为所述样本中所述分析物缺乏的指示。
在一实施方案中结合至或与所述微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括核酸分子。更优选，该核酸分子为DNA或RNA。
本发明这方面的另一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括如此处定义的肽、多肽或蛋白质或其类似物。
本发明这方面的又一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括碳水化合物分子。更优选的实施方案中，碳水化合物分子为GAG分子。
本发明这方面的又一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括结合至或与核酸、肽、多肽、蛋白质和/或碳水化合物分子相互作用的分子。
本发明的又一个方面中，提供鉴定目的分子结合配偶体的方法，所述方法包括：
(i)确定包含用光学可检测标记物标记的颗粒和固定至或与此关联的分子的微球颗粒的原始WGM分布型；
(ii)将包含所述目的分子潜在结合配偶体的一种或多种样本施加至微球颗粒一段时间并且处于允许目的分子与潜在的结合配偶体相互作用的条件下；
(iii)随后确定该微球颗粒的WGM分布型；
其中WGM分布型相对原始WGM分布型的调制指示所述样本中一种或多种结合配偶体的存在，并且相对原始WGM分布型，WGM分布型可检测改变的缺乏为所述样本中一种或多种结合配偶体缺乏的指示。
在一优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括核酸分子。更优选，该核酸分子为DNA或RNA。
本发明这方面的另一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括如此处定义的肽、多肽或蛋白质或其类似物。
本发明这方面的又一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括碳水化合物分子。更优选的实施方案中，碳水化合物分子为GAG分子。
本发明这方面的又一个优选实施方案中，结合至或与该微球颗粒表面关联的分子和/或所述分析物包括结合至或与核酸、肽、多肽、蛋白质和/或碳水化合物分子相互作用的分子。
本发明的微球颗粒可用于下列应用：环境监测，如水质(来源中的军团杆菌属、贾第虫属、隐孢子虫属)和护理诊断点、空气传播的病原体和毒素、蛋白质：蛋白质相互作用筛选、蛋白质：碳水化合物相互作用筛选和药物筛选以及小分子文库筛选。
由于具有两组或更多组的微球颗粒，本发明能进行多路复用。任何一组中的颗粒可具有共同的光学可检测标记物和/或共同的尺寸和/或共同的固定的结合颗粒。因此，可利用许多组微球颗粒检测多种分析物。
本发明进一步提供通过本发明的方法检测的分析物。
本发明还进一步提供包含标记的或预标记的微球颗粒的试剂盒。颗粒可用于产生检测颗粒周围环境改变的测定法。
本发明进一步通过下列非-限制性实施例描述：
实施例1
量子点标记的微球颗粒的产生和标记
通常，可通过用量子点涂覆任何所需组成或尺寸的商品化珠而制备微球颗粒。对于更耐用的材料，其应当用另一种硅氧层涂覆以最小化与介质或吸附物的相互作用。
不限制许多可能性，此处描述的为利用玻璃/二氧化硅珠制备微球颗粒的典型方法。
0.1g的5微米直径的商品化二氧化硅珠置于20ml 2-丙醇中并且添加20微升巯基丙基硅烷(MPS)或氨基丙基硅烷(APS)。在80℃回流溶液以允许MPS或APS的化学吸附，其导致珠表面上硫醇或氨基的产生。通过离心除去过量MPS或APS。
除了硅烷功能化的珠以外，还可以通过吸附阳离子聚合物活化珠。例如不受限制并且仅为举例说明该方法的目的，0.1g二氧化硅珠与20mL水相PEI(聚(吖丙啶)溶液(1g/L，0.5M NaCI)混合。反应一小时后，离心溶液以除去过量聚合物并且重悬浮于纯水中。该过程重复3次。
通过添加QD的氯仿悬浮液至珠的干2-丙醇悬浮液而将QD吸附于APS或PEI涂布的珠上。添加的量达到以约10个单层涂覆该珠的程度。珠和QD在旋转平底玻璃杯中平衡10分钟。随后，通过离心分离涂布的珠。
QD标记的珠可进一步通过用更多的二氧化硅涂覆而稳定。以两种方法完成此步骤：
第一种，碱性水或氯仿(1mL)中的5μl APS添加至QD涂布的二氧化硅微球颗粒并且利用旋转平底玻璃杯以0.2Hz搅拌下反应1小时。通过在碱性水或氯仿中反复的离心/重悬浮循环除去过量APS后，5mL“活性二氧化硅”(pH 8.7的5mL水中5μl 2w/w％的硅酸钠)添加至该颗粒并且使其反应过夜。此产生约沉积在颗粒上的3-5nm二氧化硅。通过离心分离过量成核的游离二氧化硅并且颗粒再分散于2-丙醇∶水(4∶1)中。最后根据所需利用TEOS和氨增加二氧化硅层以获得所需厚度。
第二种方法包括乙醇中直接的二氧化硅生长而无在水中的初步沉积步骤。此包括PVP的吸附以及随后二氧化硅的生长。添加足够的PVP(MW 30,000)以通过将其溶于氯仿∶2-丙醇中(9∶1)而提供每nm2表面60个PVP分子。此立即添加至微球体，混合物超声处理并且搅拌下反应过夜。
离心微球体(对于5微米二氧化硅在3800rpm 5秒)并且再分散于2-丙醇中(第一次)。搅拌添加NH3(4.2％)随后为TEOS(2-丙醇中10vol％)并且使其沉积12个小时。
显示产生QD标记微球颗粒的方法的简图在图1中呈现。该一般方案允许从1微米上至100微米的任何实际尺寸，用具有不同发射性质的一种或多种不同纳米颗粒标记的耐光二氧化硅微球体的制备。
共聚焦显微镜下观察到的QD标记的微球颗粒的实例在图2中显示。
实施例2
DNA检测
Q-Sand珠共轭至DNA，形成具有Q-Sand珠和固定的48-聚体DNA的复合物。48-聚体的第五个碱基位点为具有掺入胺的胸腺嘧啶核苷碱基。此胺用于利用标准的缩合反应标记具有BODIPY.630/650 NHS酯的DNA。共轭至48-聚体DNA的Q-Sand珠的WGM分布型在图5中显示，a图。
图5的b图显示共轭至α-Transprobe DNA的该图Q Sand珠的WGM分布型，所述o-Transprobe DNA杂交至与Q-Sand珠共轭的DNA的碱基6-24。如图5的b图所示，得到的WGM分布型对于所有峰有大约2.4nm的位移。此外，Q-因子(微共振器性质的测量)降低大约5X。
最后，图5的a图中显示的Q Sand珠杂交至包含与DNA 48-聚体的DNA碱基25-48互补区域的PCR产物。PCR产物产生自HeLa细胞DNA并且通过Exo1和λExo酶切消化制备用于杂交。生成的WGM分布型对于所有峰都有2.4nm的位移。Q-因子从仅Q-Sand的对照下降大约10X。
实施例3
二氧化硅微球颗粒的表面功能化
二氧化硅微球颗粒的表面功能化可以用与原始二氧化硅微球颗粒的同样的方式，通过在包含MPS或APS或其他硅烷的2-丙醇中回流QD-二氧化硅微球颗粒以活化表面并且添加与靶生物吸附物反应的官能团来完成。
共轭物的制备
用在560nm发射的橙色QD标记并且涂有10nm二氧化硅的5微米微球颗粒用MPS处理、离心并且洗涤。微球体允许与共轭物，如核酸、多肽、抗体、碳水化合物等等在水中反应约1小时。随后离心并且洗涤以产生生物活性的QD微球体(BQDM)。
结合测定：
一些BQDM置于共聚焦显微镜下的显微镜载玻片上。一滴参比溶液置于微球体上并且利用488nm激光激发收集光谱。随后包含假定与BQDM上的共轭物相互作用试剂的一微升溶液添加至该滴并且反应半小时以上。收集光谱并且检测WGM分布型的任何改变，如一个或多个峰的红移或蓝移，其中观察到的改变为微球颗粒上共轭物与外源添加试剂之间相互作用的指示。
实施例4
利用WGM分布型区分微球颗粒
通过尺寸的区分
利用此处所述的方法产生不同尺寸的微球颗粒。利用共聚焦显微镜确定每一不同粒径的WGM分布型。
如图3所示，每一不同尺寸颗粒呈现的WGM分布型随着微球颗粒的半径改变。
复合表面化合物的区分
利用此处所述的方法生产包含结合至其表面的不同分子的QD标记的微球颗粒。利用共聚焦显微镜确定每一不同微球颗粒的WGM分布型。
如图4所示，QD指无复合物结合至表面的QD标记的微球颗粒，PSS指包含结合聚苯乙烯磺酸盐(PSS)的微球颗粒，而PVP指具有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)吸附单层的微球颗粒。
如根据数据显而易见的，QD标记的微球颗粒对复合物结合其表面敏感。此外，观察到的WGM分布型位移还表现出对结合至表面的复合物的性质敏感。
实施例5
样本中假定的结合配偶体的检测
通过5’聚丙烯酸酯(acrydite)分子将具有功能性表面巯基的二氧化硅微球体共轭至单链寡核苷酸，其之前用荧光染料标记。
具有附着的、标记的寡核苷酸的微球体随后杂交至互补或无关的寡核苷酸或PCR产物。
杂交的和未杂交的微球体在Milli Q水中广泛洗涤并且点样于显微镜盖玻片上使其风干。
干燥的微球体随后在适于所使用的荧光染料的、具有激光器和滤波器的共聚焦显微镜上检验。记录和比较产生的回音廊模式以确定具有另外的DNA杂交于微球体表面上的微球体和仅具有附着的标记寡核苷酸的微球体之间回音廊模式模式的波长位移。
得到的回音廊模式的波长图形的位移可用于确定测试样本中互补DNA序列的存在或缺乏。
实施例6
检验复合物的筛选
利用此处所述的方案产生微球颗粒。不同的珠可通过WGM分布型鉴定。即使特定类型珠之间存在一些可变性，但在规定尺寸的珠上具有既定荧光发射体的给定靶的WGM分布型几乎等同。可同时检验至少50个不同的Q-Sand珠。
微球颗粒排列于反应载体中。这些载体为具有用于不同复合物的区域的网格载玻片。扫描网格并且计算和保存WGM。读数为预复合对照WGM。
每个反应载体用一种或多种检测分子检验。
通过洗涤步骤减少非特异性结合。
洗涤后再扫描反应载体。通过WGM位移与预检测分子的对照WGM比较来鉴定阳性。
实施例7
微球体合成方案
材料：
(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APS 99％)、(3-巯丙基)三甲氧基硅烷(MPS，95％)、四乙基原硅酸酯(TEOS，98％)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW 40,000)、氢氧化铵(29.1％wt％NH3水)(Sigma-Aldrich)。5μm二氧化硅颗粒(Bangs Laboratories，Inc.)氯仿(CH3Cl3)和2-丙醇(AnalaR，Merck，Kilsyth，Victoria)。
仪器：
Olympus荧光显微镜(Olympus，Bonn，Germany)，机械回转轮，Shake和Stack(Thermohybaid，Glochester UK)，超声波清洁器(Cole-Parmer Instrument Company，Illinois，USA)。
常规的重要注意点：
*用乙醇灭菌所有玻璃-小瓶和磁性搅拌器并且使其完全干燥。
*利用过滤的枪头用于所有的移液。
*所有玻璃小瓶必须为1.5-5ml体积之间平底的和有螺旋帽。
*当反应需要搅拌-过夜时用石蜡膜封闭所有玻璃螺旋帽的反应小瓶。
*如Brendan Toohey指示的进行二氧化硅珠的表面功能化。
*洗涤步骤和PVP的溶解期间的超声处理不是必需的。
表面功能化二氧化硅珠
1.用1次丙酮和2次2-丙醇充分清洁圆底烧瓶。
2.添加20ml 2-丙醇至清洁的圆底烧瓶并且置于加热罩中，利用塑料盖夹使得任何盖扣紧并且开始通过shlenk line推进水。
3.为了最佳反应进行，2-丙醇需要在恒定的搅拌下加热至80℃，因此用温度计不断监测2-丙醇的温度直至其达到该温度，确保温度计在每次温度检查之前用乙醇擦拭。
4.一旦达到温度，添加20μl APS和0.1g未处理的Bang’s珠，其等同于1ml厂家的珠浆液并且在恒定搅拌下处理2小时。
5.处理后转移瓶的内容物至合适的瓶，用于洗涤。
6.2-丙醇中洗涤2次随后重悬浮于10ml Milli-Q水并且用石蜡膜封瓶。
A部分：制备PVP
步骤 要点 推荐 避免
1.称取所需量的PVP(所用二氧化硅微球的S.A.每nm260个PVP分子)在15ml螺旋帽玻璃小瓶中
2.在1小时温和搅拌或振荡或涡旋下溶于2ml 9∶1(9ml)CHCl3∶(1ml)2-丙醇溶剂中直至介质变澄清 ◆具有溶解的PVP的介质变澄清◆PVP完全溶解 ◆PVP悬浮于1-2ml溶剂后，振荡&涡旋◆使用前一小时通过在搅拌下溶解而制备PVP ◆在超声处理时加热◆超过15分钟的过度超声处理
3.原液9∶1溶液重组
B部分：钝化纳米晶体以功能化5μm的二氧化硅珠
步骤 要点 推荐 避免
1.混合200-500μlAPS/MPS功能化的二氧化硅浆液(0.02g/ml)&50-200μl Qdots于1.5ml的Eppendorf管中 人工振荡1-2分钟 APS功能化的二氧化硅珠具有对量子点更高的亲和力 不振荡
2.放于Min-rpm的机械轮上 ◆至少15分钟-1小时◆Min-rpm 旋转1小时
3.添加2-丙醇以破坏2相，振荡，涡旋随后在3600rpm离心10秒，随后弃去上清 ◆振荡，涡旋&在3600rpm离心10秒◆在UV光下检查沉淀物荧光
4.将沉淀物重悬于CHCl3中，振荡并且超声处理(Blitz)随后在3600rpm离心10秒。弃去上清并且再次洗涤 ◆剧烈振荡和超声处理◆当最终洗涤后弃去上清时，如果继续进行到步骤5或者重新开始，则在UV光下检查沉淀物荧光 也可用2-丙醇作为洗涤溶剂
5.将洗涤的沉淀物重悬于A部分制备的PVP溶液中，随后与原液PVP溶液结合&简短地超声处理随后搅拌过夜 ◆用部分PVP溶液(1-2ml)重悬洗涤的沉淀物并且移液2-3次以尽量回收样本，随后与原液PVP溶液结合◆用15ml的螺旋帽玻璃小瓶作为反应管 在搅拌下添加重悬的沉淀物
6.搅拌过夜。如果样本在2-丙醇中成功洗涤2次则用铝箔覆盖并且储藏于4℃ ◆用石蜡膜封闭螺旋帽小瓶◆温和搅拌◆不加热 凹底小瓶
C部分：TEOS涂敷PVP加帽的掺杂纳米晶体的微球
步骤 要点 推荐 避免
1.取1-5mlPVP加帽的微球样本 ◆超声处理样本(仅Blitz)
2.与原液4.2％NH3溶液1∶1组合(如1mlPVP加帽的珠和1ml 4.2％NH3溶
液)
3.搅拌下将100μlTEOS[1ml 2-丙醇中5μl纯TEOS(1∶2 00溶液)]施加至NH3/PVP微球溶液并且搅拌过夜 ◆当枪头在介质中时添加TEOS但加至小瓶侧面或反应介质中间◆用石蜡膜封闭螺旋帽小瓶◆平底的螺旋帽小瓶◆温和搅拌◆不加热 凹底小瓶
4.TEOS成功涂布后用2-丙醇进行洗涤步骤，即添加1ml 2-丙醇，充分振荡，超声处理(Blitz)。随后在3600rpm离心样本10秒并且弃去上清而重悬于新鲜的2-丙醇中。 ◆用铝箔覆盖样本并且储藏在4℃◆重复洗涤至少3次
本领域技术人员将理解此处所述的本发明可易于进行不同于具体所述的那些改变和改进而不是局限于具体所述。应理解本发明包括所有这样的改变和改进。本发明还包括本说明书中分别或总体涉及的或指明的所有步骤、特征、组成和复合，以及任何更多所述步骤或特征的任何及所有组合。
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Claims (37)

1.检测分析物的方法，所述方法包括将至少一组微球颗粒与假定包含所述分析物的样本接触，其中一组微球颗粒内的每一颗粒包括光学可检测的标记物以及固定的所述分析物的假定结合配偶体，其中每一颗粒组具有确定的回音廊模式(WGM)分布型，其中所述分析物结合所述固定的结合配偶体引起所述至少一组微球颗粒WGM分布型的变化，其为所述分析物存在的指示。
2.权利要求1的方法，其中该光学可检测标记物为荧光团。
3.权利要求2的方法，其中每种微球颗粒组用不同的荧光团标记。
4.权利要求1的方法，其中每种微球组用不同的、固定的所述分析物的假定结合配偶体标记。
5.权利要求1的方法，其中每种微球颗粒组的颗粒尺寸不同。
6.权利要求1的方法，其中每种微球颗粒组具有两种或多种：
a.不同的光学可检测标记物；
b.不同尺寸；和/或
c.不同的固定的分析物的结合配偶体。
7.权利要求1的方法，其中所述微球颗粒包括选自以下的材料：二氧化硅、乳胶、二氧化钛、二氧化锡、氧化钇、矾土、其他二元金属氧化物、钙钛矿和其他压电金属氧化物、蔗糖、琼脂糖和其他聚合物。
8.权利要求7的方法，其中所述颗粒包括二氧化硅。
9.权利要求1至8任何一项的方法，其中所述颗粒基本上为球形或类球形颗粒。
10.权利要求5的方法，其中所述颗粒包括约300nm至约30μm的直径。
11.权利要求1的方法，其中所述光学可检测标记物为发射荧光的分子、原子或离子。
12.权利要求1的方法，其中所述光学可检测标记物为发射磷光的分子、原子或离子。
13.权利要求1的方法，其中所述光学可检测标记物为发射白热的分子、原子或离子。
14.权利要求1的方法，其中所述光学可检测标记物在任何一种或多种紫外线、可见光、近红外线(NIR)和/或红外线(IR)波长范围中为可检测的。
15.权利要求11的方法，其中所述光学可检测标记物在可见波长范围中为可检测的。
16.权利要求1的方法，其中所述光学可检测标记物包括选自下列的标记物：荧光团、半导体颗粒、磷颗粒、掺杂颗粒或纳米晶体和量子点。
17.权利要求16的方法，其中所述光学可检测标记物为荧光团。
18.权利要求16或17的方法，其中所述光学可检测标记物为量子点。
19.权利要求1的方法，其中所述核酸分子包括核酸分子。
20.权利要求19的方法，其中所述核酸分子包括DNA。
21.权利要求19的方法，其中所述固定的结合颗粒包括RNA。
22.权利要求1的方法，其中所述固定的结合颗粒包括肽、多肽或蛋白质。
23.权利要求22的方法，其中所述肽、多肽或蛋白质为酶。
24.权利要求22的方法，其中所述肽、多肽或蛋白质为抗体。
25.权利要求1的方法，其中所述固定的结合颗粒包括碳水化合物分子。
26.权利要求25的方法，其中所述碳水化合物为糖胺聚糖分子。
27.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型的调制包括所述分布型中一个或多个峰的红移。
28.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型的调制包括该分布型中一个或多个峰的蓝移。
29.权利要求27或28的方法，其中所述红移或蓝移包括所述峰或多个峰的波长1和100nm之间的改变。
30.权利要求29的方法，其中所述红移或蓝移包括所述峰或多个峰的波长的1和20nm之间改变。
31.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型的调制包括一种或多种所述WGM分布型中一个或多个峰的出现。
32.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型的调制包括一种或多种所述WGM分布型中一个或多个峰的消失。
33.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型通过利用共聚焦显微镜结合分光计而确定。
34.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型通过利用阵列扫描仪结合分光计而确定。
35.权利要求1的方法，其中所述WGM分布型通过测量来自单个颗粒的光的装置结合分光计而确定。
36.权利要求35的方法，其中所述装置为流式细胞仪。
37.通过权利要求1的方法检测的分析物。
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