MX2011005366A - Ensayo de deteccion de analitos. - Google Patents

Abstract

Un ensayo de detección de analitos sensible y rápido está basado en modos de gallería de murmullos de partículas esferoidales marcadas fluorescentemente. Los ligandos para el analito, tales como ácidos nucleicos, son anclados a las partículas. Las marcas fluorescentes pueden comprender fluoróforos o puntos cuánticos. En este último caso, las partículas pueden comprender melamina formaldehido. El ensayo puede ser usado para detectar analitos en muestras acuosas.

Description

ENSAYO DE DETECCIÓN DE ANALITOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne al campo de la detección de analitos. Más particularmente, la presente invención concierne a biosensores y a la detección rápida y sensible de analitos usando un ensayo basado en el modo de galería de murmullos (WGM, Whispering Gallery Mode) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas por autor en esta especificación están ordenados alfabéticamente al final de la descripción.

No es referencia a cualquier arte previo en esta especificación, y no deberá tomarse como un reconocimiento o cualquier forma de sugestión de que este arte previo forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

Los modos de óptica circulares en resonadores monolíticos son mencionados como "modo de galería de murmullos" (WGM) o "resonancias dependientes de la morfología (MDR, Morphology Dependent Resonances). Dichos modos o resonancias son trayectorias próximas de rayos luminosos (ondas luminosas en reposo) soportadas por reflexiones internas totales de los límites de un resonador. Un WGM ocurre cuando ondas luminosas en reposo de un perfil de emisión particular son confinadas por una reflexión interna casi total en el interior de la superficie de una cavidad dieléctrica periférica (Moller y colaboradores, Applied Phys Letters 83 (13): 2686- 2688, 2003).

La tecnología de GM es descrita con detalle en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2005/116615, la cual es incorporada a la presente como referencia. La tecnología de WGM es predicada en parte, sobre el fenómeno que fluoróforos facilitan la generación un perfil de WGM distintivo. Los fluoróforos son incorporados sobre Puntos cuánticos que están adentro de las micropartículas por difusión o pueden ser incorporados durante su fabricación. El tipo de fluoróforo es ilimitado y puede ser por ejemplo, un colorante orgánico, un lumóforo basado en tierras raras, un nanocristal semiconductor de varias morfologías y composiciones. Un fósforo u oro material que emite luz cuando es iluminado. Este fluoróforo o mezcla de éstos es entonces fijado a partículas microesferoidales . Cuando un analito objetivo interactúa con un compañero de enlace inmovilizado a la partícula microesferoidal, el perfil de WGM cambia, facilitando la detección del evento de enlace.

WGM permite solamente ciertas longitudes de onda de rayos a ser emitidos desde la partícula. El resultado de este fenómeno es que bandas amplias emisiones usuales (10 - 100 nm de amplitud) desde, por ejemplo, un fluoróforo, se constriñen y apareen como una serie de picos afilados que corresponden efectivamente a patrones de luz en modo de reposo en la partícula. El perfil de WGM es extremadamente sensible a cambios en la superficie de la partícula microesferoidal y a cambios en el perfil de WGM cuando la partícula microesferoidal interactúa con analitos o moléculas en su medio ambiente.

La detección de analitos raros en muestras de origen diverso requiere un medio de detección sensible, práctico y versátil. Existe una necesidad de concebir métodos para incrementar la sensibilidad, versatilidad y el sentido práctico de WGM para la detección de analitos.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método sensible y reactivos basados en ensayos de detección por el modo de galería de murmullos (WGM) , para, inter alia, detectar analitos en una muestra.

En particular, es el objetivo de la presente invención describir un método por medio del cual analitos sin marca pueden ser detectados rutinariamente en cualquier medio (líquido o gas) explotando las sensibilidades de WGMs al medio ambiente. La referencia a liquido y gas incluye soluciones acuosas y reguladores biológicos y aire.

El método y reactivos de la presente invención son predicados, por una parte, sobre la determinación inesperada de que el recubrimiento de microesferas con un fluoróforo per se, como opuesto a usar puntos cuánticos discretos, mejora la sensibilidad de la detección basada en WGM. Por otra parte, la selección de partículas tales como una partícula con grupos químicos funcionalizados sobre su superficie incrementa la sensibilidad ya sea cuando tienen lugar puntos cuánticos o el recubrimiento directo de fluoróforos. Aún por otra parte, la partícula es seleccionada de modo que tenga un índice de refracción más alto en relación al medio en el cual se conduce el ensayo. En una modalidad, la partícula microesferoidal tiene un índice de refracción mayor que 1.40.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método de detección de analitos en un medio, el método que comprende someter a microesferas recubiertas con un fluoróforo y una multiplicidad de ligandos a medios de detección por WGM para identificar un evento de enlace entre uno o más ligandos y un ligando que enlaza a un analito .

En otro aspecto la presente invención proporciona un método de detección de analitos en un medio, el método que comprende someter microesferas , en donde las microesferas tienen un índice de refracción más alto que el medio, que comprende el analito recubierto con un fluoróforo y una multiplicidad de ligandos a medios de detección por WGM para identificar un evento de enlace entre uno o mas ligandos y un analito enlazado a un ligando. En una modalidad, la partícula microesferoidal tiene un Indice de refracción mayor que 1.40.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto las partículas micoresferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

Otro aspecto de la invención comprende, un método para detectar un analito en un medio, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos al analito a una población de partículas micoresferoidales conjugadas a fluoróforo en donde si la partícula microesferoidal es melamina formaldehido entonces puede ser conjugada con el fluoróforo o comprender un punto cuántico; (ii) poner en contacto las partículas microesféricas con una muestra de control negativo y determinar el espectro de referencia. (iii) poner en contacto las partículas micoresferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en modo de galería de murmullos (WGM) para detectar un evento de enlace.

En una modalidad particular, las partículas microesferoidales son funcionalizadas por medio de porciones químicas tales como con grupos azida, alquino, amina, aldehido, sulfato o tiol, carboxilo, carboxilato y/o hidroxilo. En un aspecto, las partículas microesferoidales son partículas amina-aldehido tales como, pero no limitándose a partículas de melamina o partículas de melamina formaldehido .

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales funcionalizadas conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microeferoidales funcionalizadas con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales funcionalizadas con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por WGM para detectar un medio de enlace .

En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de amina aldehido conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra de control negativo y determinar une espectro de referencia, (iii) poner en contacto las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de amina-aldehido a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

En una modalidad mas particular, las partículas de amina aldehido son partículas de melanina formaldehido .

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehido conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales funcionalizadas conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales funcionalizadas con una muestra de control negativo y determinar une espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales funcionalizadas con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por GM para detectar un evento de enlace .

En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de amina-aldehido conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de amina-aldehido a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

En una modalidad más particular, las partículas de amina-aldehido son partículas de melamina formaldehido .

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehido conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido a medios de detección en WGM para detectar un evento de enlace.

Cuando las partículas son melamina formaldehido, las partículas pueden también comprender puntos cuánticos. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehido que comprenden puntos cuánticos recubiertos de fluoróforo; (ii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativa y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en GM para detectar un evento de enlace .

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales que tienen un índice de refracción más alto que el medio que comprende el analito, las partículas microesferoiales que codifican a un fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en WGM para detectar un evento de enlace .

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona un método de detectar un analito, el método que comprende poner en contacto a al menos una población de partículas microesferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito, en donde cada partícula en una población de partículas microesferoidales comprende un fluoróforo, el cual emite radiación visible en respuesta a excitación infrarroja y un compañero de enlace putativo inmovilizado del analito en donde cada población de partículas tiene un perfil de WGM definido, en donde el enlace del analito al compañero de enlace inmovilizado da como resultado un cambio en el perfil en WGM de la al menos una población de partículas microesferoidales , lo cual es indicador de la presencia del analito.

En una modalidad, el analito, o su ligando respectivo comprende una molécula seleccionada de la lista que consiste de: ácido nucleico; proteína; péptido; anticuerpo; lípido; carbohidrato; y cualquier molécula pequeña o entidad química, incluyendo células (por ejemplo, células de cáncer), bacterias y virus.

En una modalidad especifica, los ligandos anclados en las partículas microesferoidales son moléculas de ácidos nucleicos y los analitos a ser detectados son moléculas complementarias de ácidos nucleicos.

En otra modalidad, el ligando del ácido nucleico o analito es una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN de una sola hebra.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un método que comprende las etapas de (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y de terminar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en WGM en la fabricación de un ensayo para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando.

En una modalidad adicional, las microesferas pueden ser re-cicladas. Además, el ensayo puede ser conducido en cualquier medio tal como aire u otro gas o en una fase líquida tal como una solución acuosa, regulador biológico o fluido biológico complejo.

En aún otro aspecto la presente invención proporciona un equipo que comprende partículas microesferoidales conjugadas a fluoroforo y una multiplicidad de ligandos para anclar a éstas, para detectar un evento de enlace entre un ligando y un analito por medios de detección en WGM.

En una modalidad específica, el equipo comprende partículas microesferoidales conjugadas a fluoroforo a la cual han sido fijadas una multiplicidad de ligandos. Cuando las partículas son melamina formaldehido, el fluoroforo puede ser recubierto sobre un colorante orgánico o un punto cuántico .

En un aspecto adicional la presente invención proporciona un biosensor que comprende medios de detección e WGM en donde el biosensor es una unidad auto-contenida que comprende una fuente de polvo, fuente de luz, cámara de manejo de muestra y un espectrofotómetro .

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos son referidas por un número identificador de la secuencia (SEC ID NO) . Las SEC ID Nos. corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <400> 1 (SEC ID NO: 1), <400> 2 (SEC ID NO: 2), etc. Un resumen de los identificadores de secuencia se proporciona en la Tabla 1. Un listado de secuencias se proporciona después de las reivindicaciones.

Un resumen de los identificadores de secuencias usados en el transcurso del tema de la especificación se proporciona en la Tabla 1.

Tabla 1 Resvanen de identiflcadores de secuencias BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Algunas de las figuras contienen representaciones o entidades de color. Las fotografías a color están disponibles del requerimiento de patente o de una Oficina de Patentes apropiada. Puede imponerse un premio, si se obtuvo de una Oficina de Patentes.

Las Figuras 1A, IB, 1C y ID son una representación gráfica de biodetección de ADN en WGM que demuestra desplazamientos consistentes y mesurables después de enlace. Estas mediciones han sido llevadas a cabo en una solución acuosa que contiene reguladores de pH y un electrólito. Se observó un desplazamiento demostrable en el perfil en WGM para cada una de las perlas 9, 10, 11 y 12 (A, B, C y D respectivamente) , después de que las perlas o partículas microesferoidales fueron puestas en contacto con un analito de ácido nucleico complementario al compañero de enlace del analito del ácido nucleico anclado en la superficie de las perlas. Cada una de las perlas era de 5.6 m de diámetro.

La Figura 2 es una representación esquemática de los medios y aparatos de detección en WGM.

La Figura 3A es una representación gráfica del espectro de WGM generado con luz incidente de 6.3 W. La fuente luminosa tuvo una longitud de onda de 532 nm y el tiempo de exposición fue de 200 ms .

La Figura 3B es una representación gráfica del espectro de WGM generado con luz incidente de 50.2 W. La fuente luminosa tuvo una longitud de onda de 532 nm y el tiempo de exposición fue de 200 ms .

La Figura 3C es una representación gráfica del espectro de WGM generado con luz incidente de 214.5 W. La fuente luminosa tuvo una longitud de onda de 532 nm y el tiempo de exposición fue de 200 ms .

La Figura 3D es una representación gráfica del espectro de WGM generado con luz incidente de 1160.5 pW. La fuente luminosa tuvo una longitud de onda de 532 nm y el tiempo de exposición fue de 200 ms .

La Figura 4A es una representación gráfica del perfil de WGM generado después de iluminación de partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 W) por 10 ms .

La Figura 4B es una representación gráfica del perfil de WGM generado después de iluminación de partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 \iV¡) por 60 ms .

La Figura 4C es una representación gráfica del perfil de WGM generado después de iluminación de partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 pW) por 200 ms .

La Figura 4D es una representación gráfica del perfil de WGM generado después de iluminación de partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 yW) por 1,000 ms .

La Figura 4E es una representación gráfica del perfil de WG generado después de iluminación de partículas microesferoidales con luz incidente (532 nm, 50 \i ¡) . La visibilidad disminuyó gradualmente hasta el tiempo de exposición de 5 segundos (E) .

La Figura 5 es una imagen fotográfica de partículas microesferoidales de la presente invención inmovilizadas sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

La Figura 6 es una representación fotográfica que muestra las etapas de la reacción química simplificada usando partículas de sílice funcionalizadas con grupos mercaptano. Se logró a través de enlace covalente, la conjugación de fragmentos de oligonucleótidos de una sola hebra-acriloilo marcados fluorescentemente. Este proceso conduce a la fabricación consistente efectiva en costo de microesferas fluorescentes que propagan WGM. Etapa 1, funcionaliza microesferas de S1O2 crudas con grupos mercaptano en isopropanol a 80°C; Etapa 2, oligonucleótidos de una sola hebra objetivo marcados fluorescentemente en el sitio de NH libre (primer nucleótido base); Etapa 3, fija oligo' s objetivo marcados a microesferas vía enlazador acriloilo a grupos mercaptanos.

La Figura 7 es una representación gráfica que muestra la gráfica de las posiciones pico de cuatro picos de WG importantes a partir de una microesfera única como una función de la etapa de ensayo a la cual fueron registradas. La gráfica demuestra claramente los desplazamientos en rojo de los cuatro picos principales durante la hibridización, desplazamientos en azul durante la desnaturalización y desplazamientos en rojo de nuevo después de re-exposición al objetivo .

La figura 8A es una representación fotográfica que muestra una vista superior de la síntesis de partículas y ensayo de hibridización por WGM. Indica las características claves de las microesferas de S1O2 de 7.50 µp? modificadas con el oligonucleotido enl de 70 bases. TMR =tetrametil rodamina marca-colorante La figura 8B es una representación fotográfica que muestra una vista superior de la síntesis de partículas y ensayo de hibridización por WGM. Las partículas para la preparación de la placa de ensayo de partículas son inmovilizadas sobre el sustrato de hibridización que sigue a la adquisición de la señal de emisión (pre-tratamiento) . (i) inmoviliza partículas sobre sustrato de sílice triturado; (ii) adquiere la señal de emisión de pre-hibridización de referencia .

La figura 8C es una representación fotográfica que muestra una vista superior de la síntesis de partículas y ensayo de hibridización por WGM. Las placas de ensayo son tratadas con una solución control o sonda de ADN, seguido por lavado con el sustrato y finalmente adquisición de señal de emisión, (i) Tratar partículas inmovilizadas con la sonda de ADN deseada o con solución control (por ejemplo, solamente Milli-Q) ; (ii) reubica partículas y adquiere señal de emisión post-hibridización .

La figura 8D es una representación fotográfica que muestra una vista superior de la síntesis de partículas y ensayo de hibridización por WGM. La etapa final involucra el análisis de las señales pre/post-emisión a partir de una partícula individual, las posiciones del pico desde el espectro adquirido son comparadas para determinar el efecto de la solución de tratamiento; (i) las longitudes de onda de los picos pre- y post-tratamiento son analizadas; (ii) el desplazamiento en WGM dependiente de la dosis es determinado finalmente .

La Figura 9A es una representación fotográfica que muestra salidas de señales de emisión por WGM y espectroscopia de partícula individual. Una señal de emisión típica capturada en aire desde una partícula de sílice oligo-modificada de 7.50 µp? usando dos determinaciones de caracterización de WGM acoplada a un espectrómetro Ocean Optic (± 0.9 nm) , el diagrama esquemático muestra dos partículas, microesferas A y B marcadas cada una de la misma muestra, ambas partículas han sido modificadas químicamente de manera idéntica. Observe que las señales de emisión adquiridas a partir de las partículas individuales son diferentemente únicas.

La Figura 9B es una representación fotográfica que muestra salidas de señales de emisión por G y espectroscopia de partícula individual. Una señal de emisión típica capturada en aire desde una partícula de sílice oligo-modificada de 7.50 m usando dos determinaciones de caracterización de WGM con el espectrómetro Triax (± 0.05 nm) ; el diagrama esquemático muestra dos partículas, microesferas A y B marcadas cada una de la misma muestra, ambas partículas han sido modificadas químicamente de manera idéntica. Observe que las señales de emisión adquiridas a partir de las partículas individuales son diferentemente únicas .

La Figura 9C es una representación fotográfica que muestra salidas de señales de emisión por WGM y espectroscopia de partícula individual. Una señal de emisión típica capturada en aire desde una partícula de sílice oligo-modificada de 7.50 µp? usando dos determinaciones de caracterización de WGM. El concepto de espectroscopia de partícula individual, el diagrama esquemático muestra dos partículas, microesferas A y B marcadas cada una de la misma muestra, ambas partículas han sido modificadas químicamente de manera idéntica. Observe que las señales de emisión adquiridas a partir de las partículas individuales son diferentemente únicas.

La Figura 10A es una representación gráfica que muestra datos de desplazamientos espectrales de microesfera individual a partir de una selección de sensores usados en un ensayo de hibridización de cADN basado en la concentración. Las posiciones pico graficadas Pre- (cajas sólidas de línea verde) y post-hibridización estrellas sólidas de línea roja) contra la concentración de cADN mencionada a cuatro longitudes de onda de referencia. De las partículas seleccionadas se notó un desplazamiento observado en todas las señales de WG post-hibridización. Se observaron desplazamientos rojos reproducibles en modo de perfiles resultaron cuando partículas oligo-modificadas - base 70 fueron hibridizadas con concentraciones de cADN de 10-7 a 10-14 M, además desplazamientos de picos no consistentes fueron evidentes en la muestra de control.

La Figura 10B es una representación gráfica que muestra datos de desplazamientos espectrales de microesfera individual a partir de una selección de sensores usados en un ensayo de hibridización de cADN basado en la concentración. Desplazamientos (??) como una función de la concentración de cADN. El cálculo de errores del desplazamiento de los picos aproximadamente max fueron calculados como ± 0.44 nm.

La Figura 10C es una representación gráfica que muestra datos de desplazamientos espectrales de microesfera individual a partir de una selección de sensores usados en un ensayo de hibridización de cADN basado en la concentración. El análisis de la posición del pico de la misma partícula objetivo enl antes y después de exposición a muestra concentrada 1CT18 M de ADN complementario sin marca. Los resultados indican cada uno de los desplazamientos en rojo de los picos fluorescentes después de exposición a la solución de sonda de ADN sin marcar concentrada en atomoles (1CT18 moles) .

La Figura 11 es una ilustración esquemática de la reacción química utilizada para funcionalizar partículas de melamina formaldehido (MF) crudas con fragmentos de oligonucleótidos de una hebra marcados. Note que la reacción es completada en una sola etapa a temperatura ambiente usando solamente regulador. Los fragmentos enlazados covalentemente con grupo -NH sobe la superficie de la partícula. Etapa 1, oligonucleótidos objetivo modificados con acriloílo marcados son fijados a partículas en una reacción individual a temperatura ambiente.

La Figura 12A es una representación gráfica que muestra la excitación de partícula que se logró a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Las señales de emisión capturadas en aire y agua desde microesferas oligo-modificadas-base 30 de 7.50 m (TMR) de sílice. Las microesferas fueron inmersas en una gotita individual de Milli-Q y fueron analizadas espectralmente, y el agua se separo por evaporación antes de explorar fueron captadas en aire. El espectro de referencia adquirido desde una partícula individual de MF de 7.52 µp? individual antes de funcionalización del oligonucleótido, a través de una integración de 2 s usando un espectrómetro TRIAX 550 (± 0.05 nm) .

La Figura 12B es una representación gráfica que muestra la excitación de partícula que se logró a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Las señales de emisión capturadas en aire y agua desde microesferas oligo-modificadas-base 30 de 7.50 µ?a (TMR) de Melamina. Las microesferas fueron inmersas en una gotita individual de Milli-Q y fueron analizadas espectralmente, y el agua se separo por evaporación antes de explorar fueron captadas en aire. Note que en el ejemplo la partícula de melamina excitada después de la adición de agua a la señal de emisión de WGM podría aún observarse. El espectro de referencia adquirido desde una partícula individual de MF de 7.52 µp\ individual antes de funcionalización del oligonucleótido, a través de una integración de 2 s usando un espectrómetro TRIAX 550 (± 0.05 nm) ; C) aire, D) solución (Milli-Q-H20) .

La Figura 12C es una representación gráfica que muestra la excitación de partícula que se logró a través de una lámpara de mercurio de 80 y un bloque filtrante de 420-490 nm. Las señales de emisión capturadas en aire y agua desde microesferas oligo-modificadas-base 30 de 7.50 µp? (TMR) . Las microesferas fueron inmersas en una gotita individual de Milli-Q y fueron analizadas espectralmente, y el agua se separo por evaporación antes de explorar fueron captadas en aire. El espectro de referencia adquirido desde una partícula individual de MF de 7.52 µp\ individual antes de funcionalización del oligonucleótido, a través de una integración de 2 s usando un espectrómetro TRIAX 550 (+ 0.05 nm) ; en aire .

La Figura 12D es una representación gráfica que muestra la excitación de partícula que se logró a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Las señales de emisión capturadas en aire y agua desde microesferas oligo-modificadas-base 30 de 7.50 µ?? (TMR) . Las microesferas fueron inmersas en una gotita individual de illi-Q y fueron analizadas espectralmente, y el agua se separo por evaporación antes de explorar fueron captadas en aire. El espectro de referencia adquirido desde una partícula individual de MF de 7.52 µp? individual antes de funcionalización del oligonucleótido, a través de una integración de 2 s usando un espectrómetro TRIAX 550 (± 0.05 nm) ; en solución (MÍIIÍ-Q-H2O) .

La Figura 13A es una representación gráfica que muestra mediciones de señales de emisión tomadas usando las placas de ensayo derivadas de varios materiales compuestos; la excitación de partículas fue lograda a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Placa de distribución de sílice triturado.

La Figura 13B es una representación gráfica que muestra mediciones de señales de emisión tomadas usando las placas de ensayo derivadas de varios materiales compuestos; la excitación de partículas fue lograda a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Placa de cultivo celular de 96 pocilios con base polimérica .

La Figura 13C es una representación gráfica que muestra mediciones de señales de emisión tomadas usando las placas de ensayo derivadas de varios materiales compuestos; la excitación de partículas fue lograda a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Placa de 384 citopocillos de policarbonato.

La Figura 13D es una representación gráfica que muestra mediciones de señales de emisión tomadas usando las placas de ensayo derivadas de varios materiales compuestos; la excitación de partículas fue lograda a través de una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Placa de microtítulo de grado óptico de 384 pocilios.

La Figura 14 es una representación gráfica que muestra análisis de estabilidad térmica de partículas de MF de 7.52 pm funcionalizada con oligonucleótido (TMR) . Las partículas fueron sumergidas en solución bajo calor constante a 90°C durante un período de 3 horas en regulador Milli-Q o MES (pH de 5.4). Se colectó una WGM a partir de cada partícula de prueba utilizando una lámpara de mercurio de 80 W y un bloque filtrante de 420-490 nm. Observe que la partícula seleccionada calentada en MES exhibe una marcada reducción en su señal de emisión en WGM (espectro punteado) en relación al tratado con PBS seleccionado (espectro negro) y partículas de MF oligo-modificadas tratadas con Milli-Q (espectro gris) .

La Figura 15A es una representación gráfica de un ciclo de hibridización del control que muestra el estudio de enlace por hibridización termo-ciclado. Un gradiente de temperatura en dos etapas (37 °C - 72 °C fue creado usando una etapa del microscopio termo-regulado acoplado a la graduación confocal/TRIAX. El ADN objetivo (Tm 71.2 °C) fue complementario a los fragmentos objetivo rsl0434 fijados a la partícula. Se completaron los ciclos de hibridización en una microesfera individual con H20 Milli-Q (control) y ADN objetivo. Se capturó una señal de fluorescencia a cada gradiente de temperatura y se observó la ??.. Todos los desplazamientos azules de los picos fluorescentes a máxima temperatura de ciclo (72°C) [solamente cuando el ADN objetivo está presente] y desplazamientos rojos cuando la etapa de temperatura fue < a Tm de la sonda objetivo.

La Figura 15B es una representación gráfica de dos ciclos de hibridización del control que muestra el estudio de enlace por hibridización termo-ciclado. Un gradiente de temperatura en dos etapas (37°C - 72 °C fue creado usando una etapa del microscopio termo-regulado acoplado a la graduación confocal/TRIAX. El ADN objetivo (Tm 71.2 °C) fue complementario a los fragmentos objetivo rsl0434 fijados a la partícula. Se completaron los ciclos de hibridización en una microesfera individual con H20 Milli-Q (control) y ADN objetivo. Se capturó una señal de fluorescencia a cada gradiente de temperatura y se observó la ??.. Todos los desplazamientos azules de los picos fluorescentes a máxima temperatura de ciclo (72°C) [solamente cuando el ADN objetivo está presente] y desplazamientos rojos cuando la etapa de temperatura fue < a Tm de la sonda objetivo.

La Figura 15C es una representación gráfica de un ciclo de hibridización de la sonda objetivo que muestra el estudio de enlace por hibridización termo-ciclado. Un gradiente de temperatura en dos etapas (37°C - 72 °C fue creado usando una etapa del microscopio termo-regulado acoplado a la graduación confocal/TRIAX . El ADN objetivo (Tm 71.2 °C) fue complementario a los fragmentos objetivo rsl0434 fijados a la partícula. Se completaron los ciclos de hibridización en una microesfera individual con H20 Milli-Q (control) y ADN objetivo. Se capturó una señal de fluorescencia a cada gradiente de temperatura y se observó la ??.. Todos los desplazamientos azules de los picos fluorescentes a máxima temperatura de ciclo (72°C) [solamente cuando el ADN objetivo está presente] y desplazamientos rojos cuando la etapa de temperatura fue < a Tm de la sonda objetivo.

La Figura 15D es una representación gráfica de dos ciclos de hibridización de la sonda objetivo que muestra el estudio de enlace por hibridización termo-ciclado. Un gradiente de temperatura en dos etapas (37°C - 72 °C fue creado usando una etapa del microscopio termo-regulado acoplado a la graduación confocal/TRIAX . El ADN objetivo (Tm 71.2 °C) fue complementario a los fragmentos objetivo rsl0434 fijados a la partícula. Se completaron los ciclos de hibridización en una microesfera individual con H20 Milli-Q (control) y ADN objetivo. Se capturó una señal de fluorescencia a cada gradiente de temperatura y se observó la ??.. Todos los desplazamientos azules de los picos fluorescentes a máxima temperatura de ciclo (72°C) [solamente cuando el ADN objetivo está presente] y desplazamientos rojos cuando la etapa de temperatura fue < a Tm de la sonda obj etivo .

La Figura 16A es una representación gráfica que muestra líneas sólidas de WGM de perlas de melamina: las líneas sólidas don WGM de perlas de melamina formaldehido individuales obtenidas en aire. El espectro adquirido en medio acuoso se muestra en líneas punteadas, La Figura 16B es una representación gráfica que muestra WGM de perlas de sílice: las líneas sólidas son WGM de perlas de sílice individuales obtenidas en aire. El espectro adquirido en medio acuoso se muestra en líneas punteadas. La adquisición en agua produjo fluorescencia muy desvanecida y ningún WGM.

La Figura 17 es una representación gráfica del inmuno-ensayo en WG de anticuerpo. Una partícula de MF de 7.52 µ?t? individual funcionalizada con anticuerpo de -IgM humana marcada con FITC fue inmovilizada en un micro-pocilio individual. Se efectuó el ensayo entero a temperatura ambiente. La partícula sin tratar fue excitada a través de un láser Ar+ para obtener una señal de referencia, luego se trató con Milli-Q seguido por IgM humana sin marcar. En relación al WGM sin tratar, el grupo de picos representativos indica un desplazamiento en rojo típico de varios nanómetros que resultó después del tratamiento con IgM. Un desplazamiento mínimo se observó 30 minutos después de la adición. Los espectros fueron adquiridos a través de una graduación de Triax 550/CCD confocal (resolución espectral ± 0.05 nm) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el transcurso de esta especificación, a menos que el contexto requiera de otra manera, la palabra "comprender" o variaciones como "comprende" o "que comprenda", se entenderán para implicar la inclusión de un elemento o entero o grupo de elementos o enteros declarados pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Como se usa en la especificación, las formas singulares "un, una, uno" (antes de consonante) y "un, una, uno" (antes de vocal) y "el, la, lo" incluyen aspectos plurales a menos que 1 contexto dicte claramente de otra manera. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "un ligando" incluye un ligando individual, así como también dos o más ligandos; la referencia a "un analito" incluye un analito individual, así como también dos o más analitos; la referencia a "el fluoróforo" incluye un fluoróforo individual, así como también dos o más fluoróforos ; la referencia a "la invención" incluye aspectos individuales o múltiples de una invención; y así sucesivamente.

La presente invención proporciona una multiplicidad de compañeros de enlace al analito o ligandos conjugados a partículas microesferoidales recubiertas de fluoróforo. Cuando estas partículas son iluminadas, se emite un espectro en modos de galería de murmullos ( GM) "referencia") o perfil. Cada población de partículas microesferoidales tiene una firma de referencia en WGM única. Este perfil de referencia es alterado por enlace de analitos al compañero de enlace del analito o ligando sobre la superficie de las partículas microesferoidales , causando un desplazamiento detectable en el espectro de WGM. Las partículas microesferoidales de la presente invención comprenden microesferas recubiertas con fluoróforos, los cuales cuando se iluminan, emiten luz fluorescente. La luz emitida es atrapada en las microesferas y resuenan en la esfera creando un espectro de longitudes de onda discretas denominadas modos de galería de murmullos o "WGM". El recubrimiento de las partículas microesferoidales con un fluoróforo opuestamente a usar puntos cuánticos discretos mejora la sensibilidad de la detección basada en WGM. La presente invención se extiende a partículas microesferoidales recubiertas con un fluoróforo (es decir, sin usar puntos cuánticos) o el uso de puntos cuánticos en combinación con partículas de melamina formaldehido . Las partículas microesferoidales pueden también ser seleccionadas con base en que tienen un índice de refracción más alto en relación al medio que comprende el analito. En una modalidad, la partícula microesferoidal tiene un índice de refracción mayor que 1.40.

Como se usa en la presente, el término "punto cuántico" o "QD" se comprenderá que abarca partículas conocidas en el arte como nanopartículas semiconductoras, nanocristales , puntos cuánticos, o partículas Q.

Los términos "partículas microesferoidales" y "microesferas" son usados indistintamente en la presente e incluyen partículas esféricas que comprenden cualquier material, homogéneo o de otra manera que pueda producir uno o más perfiles de WGM con base en su fluoróforo. Como será evidente para los expertos en el arte, casi cualquier material, homogéneo o de otra manera, puede ser usado para la partícula microesferoidal . Las partículas microesferoidales contempladas en la presente pueden comprender también más de una sustancia, y como tales pueden comprender envolventes, aleaciones o mezclas de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. Es ventajoso para cuantificación de los datos generados por medio de los métodos de la presente invención si la partícula microesferoidal comprende un material sustancialmente homogéneo con un índice de refracción isotrópico y el cual sea también no-absorbente (diferente del fluoróforo, el cual es descrito de manera adicional posteriormente) .

Las partículas microesferoidales de la presente invención comprenden un material seleccionado de la lista que consiste de: melamina o un derivado químico de ésta tal como melamina formaldehido; sílice; látex; titania; dióxido de estaño; ytria; alúmina; otros óxidos de metales binarios; perovskitas y otros óxidos metálicos piezoeléctricos ; PLGA; sacarosa, agarosa; y otros polímeros.

En una modalidad particular, las partículas microesferoidales son funcionalizadas proporciones químicas tales como grupos amina, aldehido, sulfato o tiol, carboxilo, carboxilato, y/o hidroxilo. En un aspecto, las partículas microesferoidales son partículas de amina-aldehido tal como pero no limitándose a partículas de melamina formaldehido (MF) . Las partículas de MF proporcionan un sustrato de conjugación sólido para oligonucleótidos objetivo modificados con acriloilo y proteínas a enlazar. El enlace covalente permanece intacto¦ después de exposición a soluciones de pH alto y temperaturas extremas, cuando una WGM de alta calidad pueda requerir post-tratamiento.

La melamina es un trímero de cianamida y es también conocida como: 1, 3, 5- triazin- 2, 4, 6-triamina; 2, 4, 6-triamino- s- triazina; cianurotriamida; cianurotriamina o cianuramida. En una modalidad particular, la melamina es melamina formaldehido.

La presente invención también se extiende al uso de partículas magnéticas en el ensayo de WGM. Dichas partículas pudieran presentarse en posiciones fijas muy precisas. La inmovilización de partículas con habilidad magnética facilita el análisis de partícula individual discreto y alivia la necesidad de fabricar sustratos de inmovilización de costumbre.

En una modalidad particular, partículas de índice de refracción alto son seleccionadas, las cuales soportan WGM en solución tales como sílice coloidal, zirconia o titania. Alternativamente, microesferas envueltas con materiales con índice de refracción más alto proporcionan plataforma detectora ideal útil. Estas partículas contienen modos radiales de orden alto en la capa adsorbida y como un resultado se facilitarla la adquisición de espectros de WGM de Q alto que contiene los modos de orden alto.

El empleo de nanocristales semiconductores (por ejemplo, CdSe, CdTe, CdS) representa otra alternativa sólida fluorescentemente. Una partícula estable fluorescentemente , la cual soporta WGM en solución puede ser producida por medio de la adsorción de una monocapa de nanocristales en una microesfera homogénea seguido por una envolvente de índice de refracción alto estabilizante. Una lista de materiales y partículas de índice de refracción alto disponibles comercialmente se proporcionan a continuación.

El término fluoróforo es general y no se limita a colorantes orgánicos, sino que incluye cualquier producto químico, molécula o material, que tenga la propiedad de emitir luz de longitud de onda bien definida cuando se ilumina. Este incluye, pero no se restringe a; colorantes orgánicos, complejos organometálicos, puntos cuánticos (incluyendo nanobastoncillos , nanoalambres y otras morfologías, QDs recubiertos y no recubiertos, aleaciones y mezclas de los mismos) , iones de tierras raras o mezclas de éstos, sobre convertidores y también fluoróforos que emiten rayos infrarrojos, los cuales pueden ser ventajosos al absorber muestras. Pueden también incorporarse otros materiales como materiales fluorescentes defectuosos tales como diamante que contenga defectos inducidos por nitrógeno o vacíos .

WGMs pueden ser generados por fluoróforos que estén fijados a la superficie de la microesfera, pero pueden también ser generados cuando el fluoróforo está embebido o distribuido en la microesfera. La distribución de fluoróforos afecta la intensidad de modos diferentes de WGM, pero para los propósitos de esta invención, no se hace ninguna distinción entre fluoróforos que están sobre la superficie o en la microesfera.

Metales Titania Ti02 (2.20) , Aluminio A1203 (1.77) , Mylar (1.65) , Cobre Cu (2.43) , Platino Pt (2.33) Minerales (gemas) Diamante (2.42), Cuarzo (1.54-1.55), Rubí (1.76-1.78) , Safiro (1.76-1.78), Safiro Estrella (l.76-1.77), Espesarita (1.79-1.81), Espinelas (1.72-1.73) , Espinelas Azules (1.72-1.74), Espinelas Rojas (1.71-1.74) , Rubí Estrella (1.76-1.77), Tanzanita (1.69-1.70) , Topacio (1.61-1.63), Cristal (2.00) Plásticos Resina de Melamina Formaldehido (C5H8N60)n [no se confunda con melamina] (1.68), es elaborado a partir del proceso de polimerización de melamina con formaldehido .

Cerámicas Silicato de Circonia Cerámica (2.00-2.20) , Zirconia Zn02 (2.40) Vidrio Vidrio de alto índice de refracción (2.00), Sílice Fusionado (cuarzo 1.46) , Vidrio Refractario (1.47) , Plexiglás (1.48) Materiales Transparentes Comunes Lucita (1.49) La presente invención está descrita, en parte, sobre la determinación de que medios de detección por WGM no requieren que las microesferas sean cubiertas con puntos cuánticos .

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método de detección de analitos en un medio, el método comprende someter a microesferas cubiertas con un fluoróforo y una multiplicidad de ligandos a medios de detección por WGM para identificar un evento de enlace entre uno o más ligandos y un ligando que enlaza al analito .

En otro aspecto la presente invención proporciona un método de detección de analitos en un medio, el método comprende someter a microesferas en donde las microesferas tienen un índice de refracción más alto que el medio que comprende el analito cubierto con un fluoroforo y una multiplicidad de ligandos a medios de detección por WGM para identificar un evento de enlace entre uno o más ligandos y una ligando que enlaza al analito.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un analito en un medio, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos para el analito a una población de partículas microesferoidales conjugadas a fluoroforo en donde si la partícula microesferoidal es melamina formaldehido entonces puede ser conjugada con el fluoroforo o comprender un punto cuántico; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por u tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su respectivo ligando; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en modos de galería de murmullos ( GM) para detectar un evento de enlace.

La referencia a "cubiertos" o "conjugados" se comprenderá como referencia a la incorporación de un fluoróforo sobre la superficie de una partícula microesferoidal sin la ayuda de un punto cuántico o de su equivalente funcional.

Como se usa en la presente, el término "fluoróforo" se refiere a cualquier molécula que exhibe la propiedad de fluorescencia. Para el propósito de la presente, el término "fluorescencia" puede ser definido como la propiedad de una molécula para absorber luz de una longitud de onda particular y re-emitir luz de una longitud de onda mayor. El cambio de longitud de onda se relaciona con una pérdida de energía que tiene lugar en el proceso. El término "fluoróforo" puede abarcar un intervalo de fluoróforos tales como fluoróforos químicos y colorantes.

El fluoróforo puede ser seleccionado para emitir a cualquier longitud de onda a la cual el perfil de WGM puede ser fácilmente resuelto. Esto depende de la proporción de la longitud de onda de la emisión al radio de la partícula. Dado que el radio de la esfera es arbitrario, la emisión puede ser seleccionada adecuadamente a partir de intervalos ultravioleta (la longitud de onda varia de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 3 nm) , visible (la longitud de onda varia de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 800 nm) , cercana a la infrarroja [NIR, Near InfraRed (la longitud de onda varia de aproximadamente 800 nm a aproximadamente 1500 nm) , y/o infrarojo [IR] (la longitud de onda varían de aproximadamente 1500 nm a aproximadamente 10 m) . No obstante, debido a la facilidad de detección, en un modalidad particularmente preferida, el fluoróforo es detectable en el intervalo de longitud de onda visible.

En una modalidad particular, el fluoróforo emite radiación visible en respuesta a excitación infrarroja. Dichos fluoróforos son también mencionados en la presente como "sobreconvertidores" .

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método de detectar un analito, el método comprende poner en contacto a al menos una población de partículas microesferoidales con una muestra que comprende putativamente el analito, en donde cada partícula en una población de partículas microesferoidales comprende un fluoróforo que emite radiación visible en respuesta a excitación infrarroja y un compañero de enlace putativo del analito inmovilizado en donde cada población de partículas tiene un perfil de WGM definido, en donde el enlace del analito al compañero de enlace inmovilizado da como resultado un cambio en el perfil de WGM, en comparación con el perfil de WGM de referencia, de al menos una población de partículas microesferoidales , lo cual es indicador de la presencia del analito .

En una modalidad particular, las partículas microesferoidales son funcionalizadas por porciones químicas tales como grupos amina, tiol y/o aldehido, grupos sulfato, carboxilato, hidroxilo, azida y/o alquinas. Además, partículas basadas en amina-aldehido tales como melamina formaldehido, proporcionan un sustrato útil para oligonucleótidos objetivo modificados con acriloilo y proteínas a enlazar.

Por consiguiente, otro aspecto d la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales funcionalizadas conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales funcionalizadas con una muestra de control negativo y determinar une espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales funcionalizadas con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por GM para detectar un evento de enlace .

En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de amina-aldehido conjugadas a fluoróforo; (ii)poner en contacto a las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de amina-aldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de amina-aldehido a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

En una modalidad más particular, las partículas de amina-aldehido son melamina formaldehido . Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehido conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina-formaldehido con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas micoresferoidales de melamina formaldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace .

Cuando la partícula es melamina formaldehido pueden usarse los puntos cuánticos.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehido que comprendan puntos cuánticos cubiertas de fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas micoresferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales que tengan un índice de refracción más alto que el medio que comprende el analito, las partículas microesferoidales que codifiquen al fluoroforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas micoresferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección por WGM para detectar un evento de enlace.

El único inconveniente sobre el fluoroforo es que la emisión podría dar como resultado la emisión en modo de cavidad, y los fluoróforos de la presente invención excluyen específicamente puntos cuánticos.

Hay muchos colorantes fluorescentes que están disponibles en el arte, los cuales pueden ser usados como fuoróforos de conformidad con la presente invención. Una propiedad importante de un colorante fluorescente o de otro fluoróforo, el cual determina su potencial para uso es la longitud de onda de excitación del fluoróforo; debe de emparejar con las longitudes de onda de la fuente luminosa. Sin embargo, muchos colorantes fluorescentes diferentes y oros fluoróforos serán familiares para los expertos en el arte, y la selección de marcador fluorescente no limita el tema de la invención.

Los "fluoróforos" convenientes que pueden ser usados para el mareaje de una partícula microesferoidal comprenden cualquier marcador fluorescente que sea excitable usando una fuente luminosa seleccionada del grupo siguiente: (i) láseres con iones de argón: comprende una línea de 488 nm, azul, la cual es adecuada para la excitación de muchos colorantes y fluorocromos que manifiestan fluorescencia en la región del verde al rojo. Láseres de argón sintonizables están también disponibles, que emiten en un intervalo de longitudes de onda (458 nm, 488 nm, 496 nm, 515 nm entre otras) . (ii) Láseres de diodo - tienen una longitud de onda de emisión de 635 nm. Otros láseres de diodo que están actualmente disponibles operan a 532 nm. Estas longitudes de onda excitan al ioduro de propidio (PI) óptimamente. Láseres de diodo azul que emiten luz a alrededor de 476 nm están también disponibles. Dichos láseres de diodo pueden ser empleados convenientemente para excitar a WGMs en las partículas microesferoidales . (iii) Láseres de gas HeNe - operan con la línea roja a 633 nm. Dichos láseres pueden ser empleados convenientemente para excitar WGMs en las partículas microesferoidales . (iv) Diodos emisores de luz (LEDs) (v) láseres de HeCd - operan a 325 nm. Dichos láseres pueden ser convenientemente empleados para excitar WGMs en las partículas microesferoidales . (vi) Lámpara de arco de mercurio de 100 W - la fuente luminosa más eficiente para la excitación de colorantes UV como Hoechst y DAPI. (vii) Lámparas de arco de Xe y lámparas de halógeno-cuarzo - pueden ser usadas como un medio para excitar WGMs y por consiguiente utilizar las partículas como detectores .

En una modalidad particular de la presente invención, los marcadores fluorescentes son seleccionados de: Colorantes Alexa Fluor; colorantes BoDipy, incluyendo BoDipy 630/650 y Bo Dipy 650/665; colorantes Cy, particularmente Cy3, Cy5 y Cy 5.5; 6-FAM ( fluoresceina ) ; Fluorescein dT; Hexafluoresceina (HEX) ; 6- carboxi- 4', 5'-dicloro- 2', T- dimetoxifluoresceina ( JOE) ; colorantes verdes de Oregón, incluyendo 488-X y 514; colorantes de Rodamina, incluyendo Verde de Rodamina, Rojo de Rodamina y ROX; Carboxitetrametilrodamina (TAMRA) ; Tetraclorofluoresceina (TET) ; y Rojo de Texas.

Dos técnicas de coloración, coloración interna y coloración externa (mareaje de superficie) , son usadas comúnmente para marcar fluorescentemente partículas microesferoidales . Las dos técnicas producen partículas con propiedades únicas, cada una benéfica para diferentes aplicaciones. La coloración interna produce partículas extremadamente estables con emisiones de fluorescencia típicamente estrechas. Estas partículas a menudo presentan una mayor resistencia a la fotodecoloración . Cuando el fluoróforo está en el interior de las partículas, grupos superficiales están disponibles para uso al conjugar ligandos (proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) en la superficie de la perla. Por esta razón, partículas marcadas internamente son usadas típicamente en la detección de analitos y en aplicaciones de inmunoensayos . El mareaje de superficie involucra la conjugación del fluoróforo a la superficie de la partícula microesferoidal . Porque los fluoróforos están en la superficie de la partícula, son capaces de interactuar con su medio ambiente justamente cuando los fluoróforos sobre una célula teñida. El resultado es una partícula estándar que exhibe la misma excitación y propiedades de emisión que muestras de células teñidas, bajo una variedad de condiciones diferentes, tales como la presencia de contaminantes o cambios en el pH. La naturaleza "conforme ambientalmente" de partículas marcadas superficialmente las hace idealmente adecuadas para imitar muestras biológicas. Partículas marcadas externamente son usadas frecuentemente como controles y estándares e numerosas aplicaciones que utilizan detección fluorescente. No obstante, la presente invención contempla la asociación de una partícula con una marca fluorescente vía cualquier medio .

Como se usa en la presente, el término "fluoróforo" se comprenderá que abarca también múltiples fluoróforos y mezclas de fluoróforos. El uso de todos los fluoróforos mencionados sobre partículas microesferoidales se considera que está en el alcance de los métodos y reactivos descritos en la presente.

De conformidad con la presente invención, se ha mostrado que la emisión de cualquier fluoroforo particular depende de la distribución del fluoroforo en la partícula microesferoidal, el tipo de fluoroforo y la concentración del fluoroforo. No obstante, los métodos de la presente invención son aún practicables independientemente de si el fluoroforo está en la superficie de la partícula microesferoidal, presente como una envolvente en la partícula microesferoidal, localizada en el núcleo de la partícula microesferoidal o está presente en más de una de las localizaciones mencionadas .

Se hace notar que los métodos de la presente invención no mencionan sobre la extinción de la emisión del fluoroforo. Los métodos de la presente invención, no obstante, son mencionados, en parte, sobre una modulación (es decir, un cambio) en el perfil de WGM del fluoroforo como un resultado de una interacción de un analito con un compañero de enlace inmovilizado en la superficie de una partícula microesferoidal .

WGM, cuando se trata con radiación electromagnética, son resonancias electromagnéticas que pueden ser establecidas cuando la luz incidente interactúa con una partícula de mayor índice de refracción que su medio circundante. WGM tiene lugar a longitudes de onda resonantes particulares de luz para un tamaño de partícula dado, y la naturaleza del WGM puede cambiar con, ínter alia, el tamaño de la partícula que contiene al WGM y los índices de refracción tanto de la partícula como del medio circundante. Además, el tamaño de las partículas puede también afectar al WGM establecido en ellas. WGM están establecidos cuando la luz incidente sufre reflexión interna total en la superficie de la partícula.

La reflexión interna total (TIR, Total Internal Reflection) puede tener lugar en la interfase entre dos medios no absorbentes. Cuando un haz de rayos que se propagan en el medio de índice de refracción más alto encuentra una interfase en un medio de de índice de refracción más bajo en un ángulo de incidencia superior a un ángulo crítico, la luz es totalmente reflejada en la interfase y retro-propagada en el medio de índice de refracción alto. Como será evidente para un experto en el arte, en un medio tri-dimensional la luz puede ser reflejada muchas veces en la partícula de índice de refracción más alto. En un WGM, la luz es concentrada cerca de la circunferencia de la partícula y puede ser asignada a un número de modo y a un orden de modo. El número de modo, n, proporciona el número de longitudes de onda alrededor de la circunferencia de la partícula, y el orden de modo, 1, proporciona el número de máxima en la dependencia radial del campo electromagnético en la partícula .

Emisores de fluorescencia impregnados sobre una partícula, como se definieron anteriormente, presentan perfiles de GM definidos. Estos modos permiten solamente que sean emitidas ciertas longitudes de onda de rayos luminosos desde la partícula. Los resultados de este fenómeno es que el espectro de emisión relativamente amplio de un fluoroforo (por ejemplo, los fluoróforos típicamente emiten una banda de amplitud de 10 -100 nm) , se restringen y aparecen como una serie de "picos" afilados correspondientes efectivamente a patrones de modo en reposo de luz en la partícula. La serie de picos generados como un resultado del establecimiento de un WGM en la partícula microesférica de la presente invención son mencionados en la presente como "perfiles en modo de galería de murmullos" o "perfiles en WGM".

El perfil de WGM es extremadamente sensible tanto a la posición del fluoroforo impregnado como a su concentración y configuración espacial de uno con respecto a los otros. El tamaño de partícula y el índice de refracción son los dos parámetros más importantes en la determinación de las longitudes de onda de emisión vistas en un perfil de WGM.

Se ha propuesto que la posición y la amplitud de uno o más picos en un perfil de WGM pueden ser influenciados fuertemente por interacciones o asociaciones de la partícula microesferoidal con moléculas en una muestra o medio ambiente externo .

En un ejemplo, la asociación o enlace de una molécula a una partícula microesferoidal altera el índice de refracción efectivo de la partícula microesferoidal alterando el perfil de WGM generado por la partícula microesferoidal .

Cualquier número de medios conocidos en el arte son adecuados para conjugar fluoróforos a la superficie de microesferas . Las superficies de microesferas pueden ser optimizadas o funcionalizadas por adsorción hidrofóbica o fijación covalente de moléculas incluyendo fluoróforos o cualquier molécula química o biológica. La presente invención no se extiende a y específicamente excluye el uso de puntos cuánticos para marcar las microesferas.

La superficie de microesferas puede ser funcionalizada por medio de la adición de numerosos grupos funcionales incluyendo: azida, alquina, maleimida, succinimida, epóxido, metacrilato, acriloilo, amina, aldehido, sulfato o tiol; carboxilo; carboxilato; hidroxilo; etc .

En una modalidad moléculas de ácido maleico son enlazadas a una superficie cubierta don azufre de una microesfera de sílice. La silanización con 3- mercaptopropiltrimetoxisilano seguido por lavado exhaustivo se usa para crear esta superficie. Moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, oligonucleótidos de ADN son fabricadas con grupos 5'-tiol o acilo y son fijadas a los azufres libres sobre la superficie.

Los ligandos de la presente invención no se limitan en manera alguna a una especie e incluyen ligandos seleccionados del grupo que consiste de: ácidos nucleicos; péptidos; polipéptidos ; carbohidratos; lipidos; glicoproteinas; lipoproteinas; lipopéptidos; lipopolisacáridos ; moléculas orgánicas pequeñas y moléculas inorgánicas pequeñas. Cuando son cubiertas con un antigeno o anticuerpo, las partículas son usadas en un ensayo "inmuno-WGM o ensayo WGM- con base inmune.

Los términos "ácidos nucleicos", "nucleótido" y "polinucleótido incluyen ARN, cADN, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mezclados, tanto de hebras en el sentido o en sentido contrario, y pueden ser química o bioquímicamente modificados o pueden contener bases de nucleótidos derivadas o no - naturales, como apreciará fácilmente el experto en el arte. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se encuentran de manera natural con un análogo (tal como un anillo morfolina) , modificaciones inter nucleótidos tales como ligaduras descargadas (por ejemplo fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), ligaduras cargadas (por ejemplo, fósforotioatos, fósforoditioatos, etc.), porciones suspendidas (por ejemplo polipéptidos) , intercaladores , (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), secuestrantes, alquiladores y ligaduras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos a-monoméricos , etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan polinucleótidos en su habilidad para enlazar a una secuencia designada vía enlace hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas son conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, aquellas en las cuales ligaduras peptídicas se sustituyen por ligaduras fosfato en la estructura principal de la molécula.

El término "anticuerpo" se refiere a una proteína de la familia de inmunoglobulinas que es capaz de combinar, interactuar o de otra manera asociarse con un antígeno. Un anticuerpo es, por consiguiente, una molécula que enlaza al antígeno. El término "antígeno" es usado en la presente en su sentido más amplio para referirse a una sustancia que sea capaz de reaccionar con o enlazar al sitio de enlace antigénico de un anticuerpo. Con referencia a la presente invención, un antígeno también incluye el idiotipo de un anticuerpo .

El término "inmunoglobulina" es usado en la presente para referirse a una proteina que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulinas reconocidas incluyen las regiones constantes ?, ?, , ?, (IgGi, IgG2, IgG3, IgG4) , d, e y µ, cadenas ligeras (? e I), asi como también las regiones variables de la mirlada de inmunoglobulinas. Una forma de inmunoglobulinas la constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste de dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, cada par que tenga una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada son juntas responsables del enlace a un antigeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo. Además de anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir como una variedad de otras formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab, Fab' , y (Fab') 2 y anticuerpos quiméricos y todas estas variantes son abarcadas en el término "anticuerpo" como se usa en la presente. Además, las inmunoglobulinas de otros animales (por ejemplo, pájaros, mamíferos, pees, anfibios, y reptiles) tienen función similar, pero nomenclatura diferente y éstos son considerados también "anticuerpos".

En una modalidad, el ligando que enlaza al analito es una molécula de ADN que comprende un ADN de una sola hebra sobre-suspendido, y el analito a ser detectado es una molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar al ligando. Cuando tiene lugar la hibridización, un desplazamiento en el perfil de WGM es detectable. Inversamente, cuando no hay hibridización entre la secuencia de ácido nucleico complementaria, no tiene lugar ningún desplazamiento en el perfil de WGM.

En una modalidad especifica los compañeros de enlace di analito o ligandos son moléculas de ADN preparadas por: (i) digestión de ADN de doble hebra con una enzima que genera un ADN de una sola hebra suspendido, por ejemplo, una endonucleasa de restricción; y (ii) digestión con una enzima exonucleasa. El ADN digerido resultante comprende ADN de una sola hebra capaz de hibridizar ínter alia a, ácidos nucleicos de una sola hebra complementarios.

"Endonucleasa de restricción" como se usa en la presente significa una enzima nucleasa que hidroliza nucleótidos en secuencias especificas en una molécula de ADN. Las endonucleasas de restricción comprenden endonucleasas de restricción de Tipo I, de Tipo II y de Tipo III .

La Tabla 2 enlista un subgrupo de endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II que generan suspensiones 5' de 4 bases.

Tabla 2 Endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II con suspensiones en 5' de 4 bases Tabla 2 (Continuación) La Tabla 3 enlista un subgrupo de endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II que generan suspensiones en 3', mayormente de cuatro bases de extensión.

Tabla 3 Endonucleasas de restricción de Tipo I y de Tipo II con suspensiones en 3' , mayormente de 4 bases Exonucleasa" como se usa en la presente significa una enzima nucleasa que hidroliza nucleótidos desde los extremos de las hebras de ADN. Un ejemplo de una enzima exonucleasa adecuada para la preparación de los ligandos que enlazan al analito y/o a los analitos a ser detectados es la exonucleasa lambda (?) . La exonucleasa lambda es una exonucleasa de ADN de doble hebra que degrada al ADN de doble hebra en una dirección de 5' a 3' . La exonucleasa lambda reguiere que el extremo 5' del ADN sea de doble hebra y fosforilado. La digestión de la exonucleasa lambda puede ser usada preferentemente para degradar hebras especificas de ADN de doble hebra para generar ligandos que enlacen al analito de ADN de una sola hebra y los analitos a ser detectados.

En una modalidad especifica, partículas microesferoidales de la presente invención son cubiertas con ácidos nucleicos derivados de un agente patógeno tal como un virus, bacteria, levadura o parásito. La detección de un evento de enlace es indicador de la presencia de ácidos nucleicos complementarios en la muestra y por consiguiente, es indicador de la presencia del agente en la muestra y/o en la fuente de la muestra.

"Complementario" como se usa en la presente, se refiere a la capacidad para emparejamiento preciso entre dos nucleobases de un compuesto oligomérico. Por ejemplo, si un nucleobase en una cierta posición de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico) , es capaz de enlace hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, dicho ácido nucleico objetivo que sea un ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido, entonces la posición del enlace hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo es considerada una posición complementaria. El oligonucleótido y el ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido adicionales son complementarias entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden enlazar hidrógeno entre sí. Por consiguiente, "específicamente hidrolizable" y "complementario" son términos que son usados para indicar un grado suficiente de emparejamiento preciso o complementaridad sobre un suficiente número de nucleobases de modo que tengan lugar enlaces específicos y estables entre el oligonucleótido y un ácido nucleico objetivo.

La presente invención es particularmente útil para pruebas por la presencia de una amplia distribución de analitos en una muestra individual.

No es necesario conocer la identidad del analito a ser detectado, ni es necesario marcar ya sea el analito o el ligando con, por ejemplo, una marca radioactiva o fluorescente .

Debido a la sensibilidad de los medios de detección por WGM, la presente invención es útil para la detección de analitos raros los cuales están presentes en una muestra a bajas concentraciones. Por ejemplo, en una modalidad específica, la invención es útil para la detección de elementos en trazas de contaminantes como alérgenos, pirógenos y contaminantes microbiológicos o químicos en alimentos y medicinas; contaminantes o tóxicos en el medio ambiente y muestras industriales; explosivos; agentes de bio-terrorismo; etc. Como se usa en la presente el término "raro" significa que se encuentra infrecuentemente o no común o relativamente pocos en número o en concentración relativamente baja.

La presente invención también es útil para la identificación de analitos previamente desconocidos por enlazar a un ligando particular. Por ejemplo, en una modalidad especifica de la invención, las partículas micoresferoidales son cubiertas con una enzima o una molécula receptora en la cual la conformación del sitio catalítico o sitio de enlace de ligando putativo o sitio catalítico está intacto. Analitos que enlazan a dichas partículas representan agonistas o antagonistas putativos de actividad enzimática o enlace de ligando-receptor. En otras palabras, la presente invención es útil para identificación y diseño de fármacos. El diseño racional de fármacos permite la producción de análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan (por ejemplo, agonistas, antagonistas, inhibidores o mejoradores) a fin de diseñar fármacos los cuales son, por ejemplo, formas más activas o estables del polipéptido, o el cual por ejemplo mejora o interfiere con la función de un polipéptido in vivo. Véase, por ejemplo, Hodgson (Bio/Technology 9: 19-21, 1991). En un procedimiento, una primera determinación de la estructura tri-dimensional de una proteína de interés, por cristalografía de rayos X, por modelaje por computación o más típicamente, por una combinación de procedimientos. Información útil concerniente a la estructura de un polipéptido puede también ser obtenida por modelaje basado en la estructura de proteínas homologas. Un ejemplo de diseño de fármaco racional es el desarrollo de inhibidores de VIH proteasa (Erickson y colaboradores, Science 249:527-533, 1990). Además, moléculas objetivo pueden ser analizadas por una exploración de alanina (Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705, 1991) . En esta técnica, un residuo de aminoácido es reemplazado por Ala y se determina su efecto sobre la actividad del péptido. Cada uno de los residuos de aminoácidos del péptido es analizado de esta manera para determinar las regiones importantes del péptido.

En otra modalidad, la presente invención es útil para la detección de genes o sus proteínas codificadas asociadas con condiciones patológicas y enfermedades específicas. Por ejemplo, en una modalidad específica, las partículas microesferoidales de la invención son cubiertas con un ligando o biblioteca de ligandos específicos conocidos por ser expresados en cáncer humano, o inversamente, con un anticuerpo o biblioteca de anticuerpos específicos para un antígeno o antígenos conocidos por estar asociados con cáncer. Por consiguiente, la detección de un evento de enlace es indicador de la presencia en una muestra de un analito conocido por estar asociado con cáncer.

Debido a su sensibilidad, los medios de detección por WGM de la presente invención proporcionan, ínter alia, un método para la detección temprana de cáncer.

En una modalidad adicional, el ligando o analito a ser detectado comprende un polimorfismo de nucleótido individual (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) o una modificación post-transnacional específica.

Los métodos de la presente invención son útiles para varias aplicaciones en el campo de, por ejemplo la medicina, ciencia veterinaria, agricultura, ciencia forense, biotecnología, tecnología alimenticia, ciencia de los deportes, ciencia nutricional, fabricación, diseño y desarrollo de fármacos, biodefensa, detección de materiales explosivos, insecticidas, fertilizantes y toxinas.

Además, los métodos de la presente invención son útiles para diagnóstico de condiciones patológicas o enfermedades incluyendo enfermedades genéticas, cáncer, trastornos autoinmunes, alergias, enfermedades infecciosas, enfermedades cardíacas, enfermedades neurológicas , proteopatías , y enfermedades metabólicas, enfermedades por virus y bacterias y contaminación, identificación de bacterias o virus desconocidos u otros microorganismos en muestras naturales.

Aún adicionalmente, los métodos de la presente invención son útiles para, ínter alia, tipificación de tejido, tipificación de sangre, pruebas genéticas, pruebas de fármaco, análisis de analitos de sangre, pruebas de alcohol, pruebas de embarazo, etc.

Los métodos de la presente invención son particularmente útiles para cribar muestras biológicas por la presencia de un analito. Una "muestra biológica" se comprende como una muestra derivada de una fuente biológica tal como una muestra ambiental, extracto del organismo, extracto animal o vegetal, suero, orina, exudado, semen, plasma, muestra de suelo, río o muestra sellada, muestra extraterrestre, entre otras fuentes.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un biodetector. Un "biodetector" como se usa en la presente significa un dispositivo detector para detectar cantidades de, incluyendo cantidades muy pequeñas, o cambios en una sustancia química o bioquímica, en la cual un evento de enlace intermolecular es registrado y traducido a datos.

"Biodetector" como se usa en la presente significa cualquiera de una variedad de procedimientos que usan sondas biomoleculares para medir la presencia o concentración de moléculas biológicas, estructuras biológicas, microorganismos, etc. por translación de una interacción bioquímica en una señal física cuantificable .

Las aplicaciones de biodetectores de la invención no se limitan en manera alguna e incluyen: aplicaciones ambientales , por ejemplo, detección de pesticidas y contaminantes de agua de río; detección remota de bacterias aéreas o esporas de éstas, por ejemplo, en actividades contra-bioterroristas ; detección de patógenos; niveles determinantes de sustancias tóxicas antes de y después de bioreparación; detección de organofosfatos ; mediciones analíticas de rutina de analitos bioquímicos; detección de residuos de fármacos en alimentos, tales como antibióticos y promotores de crecimiento; descubrimiento de fármacos y evaluación de la actividad biológica de nuevos compuestos.

La presente invención proporciona, ínter alia, un biodetector óptico basado en el sistema de detección GM. En una modalidad particular, el biodetector es compacto y portátil. Los biodetectores de la presente invención proporcionan un medio para la detección sensible y rápida de analitos .

En una modalidad, el biodetector está particularmente adaptado para uso conveniente en laboratorios de investigación y analítico y en el campo. El equipo de detección por WGM per se es adaptable para auto-contención, miniaturización y portabilidad . De manera importante, esta adaptabilidad permite detección de analito rápida y conveniente en gabinete o en el campo, sin requerimientos de componentes caros y volumen.

En una modalidad particular de la presente invención, el equipo de detección por WGM no requiere una fuente de poder voluminosa, ni un espectrofotómetro caro o lentes ópticos. Por ejemplo, algunas modalidades proporcionan un lente del objetivo de microscopio 60X y un espectrofotómetro sin enfriamiento es usado con un ancho de ranura de 0.5 mm. En algunas modalidades el equipo de detección por WGM es un biodetector.

Una fuente de poder de aproximadamente 10 yW a aproximadamente 2000 es suficiente para generar datos espectrales por WGM de conformidad con los métodos de la presente invención.

En una modalidad, las partículas microesferoidales conjugadas a fluoróforo de la presente invención son expuestas a la luz por aproximadamente 20 a 2000 milisegundos . Luz a una longitud de onda de 532 nM es particularmente adecuada para generar espectros por WGM de conformidad con la presente invención.

En ciertos aspectos, las partículas microesferoidales de la invención son inmovilizadas por "horneado" en una matriz de soporte sólido, por ejemplo, vidrio. El soporte sólido comprende material, a través del cual puede viajar la luz en el espectro infrarrojo, visible y ultravioleta .

En una modalidad, las microesferas son secadas en una superficie de vidrio por más tiempo que 10 minutos a temperatura superior a 40°C.

Un requerimiento clave del sistema es que los espectros pueden ser comparados automáticamente y las diferencias entre antes y después de enlace pueden ser cuantificadas . Esto ha sido logrado usando una transformación logarítmica del espectro de tiempo-modo.

La presente invención también proporciona un equipo para detección de analitos por medios de WGM. Dichos equipos comprenden partículas microesferoidales conjugadas a fluoróforo a las cuales están fijadas una multiplicidad de ligandos de enlace al analito. En una modalidad, las partículas microesferoidales son inmovilizadas en una superficie de vidrio. La multiplicidad de ligandos a ser anclados a las partículas microesferoidales puede ser diseñada para detectar un arreglo específico de analitos. Por ejemplo, en una modalidad específica, una muestra ambiental es probada por la presencia de uno o más patógenos humanos de significado para la salud pública, por ejemplo, Legionella pneumophila , Mycobacterium tuberculosis , Staphylococcus aureus resistente a vancomicina y los similares. En una modalidad las microesferas son cubiertas con una biblioteca de ácidos nucleicos derivados de numerosos patógenos diferentes. Las combinaciones de ligandos para anclar a las partículas microesferoidales no tiene límite.

Cuando las partículas microesferoidales son melamina formaldehido, el equipo puede contener también puntos cuánticos.

"Muestra ambiental" como se usa en la presente significa un espécimen de cualquier material colectado de una fuente ambiental, tal como aire, agua o suelo. Una "fuente ambiental" como se usa en la presente concierne al medio ambiente, ambientes hechos por el hombre o ambiente extra-terrestre. Otras muestras incluyen muestras de alimentos. Por consiguiente, el ensayo de WGM es útil para la industria alimenticia, pruebas de agua ambiental, la industria agrícola, pruebas de bioterrorismo y pruebas farmacológicas.

Las partículas pueden también ser re-cicladas para uso continuo y para cribado de alto rendimiento.

Los cambios en el WGM indican la presencia de un analito. Es también posible recabar información adicional a partir de cambios en las intensidades relativas, anchos de línea y longitudes de onda de los picos de WGM de una microesfera particular.

La presente invención es descrita adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Partículas microesferoidales (QSand-Trademark) conjugadas a una multiplicidad de ligandos de ADN demostraron desplazamientos consistentes de WGM cuando se enlazaron a un analito .

Partículas microesferoidales conjugadas a fluoróforo (QSand [marca comercial : partículas de sílice]) conjugadas a una multiplicidad de ligandos de ADN demostraron una diferencia consistente y medible después de enlace del analito específico. Partículas microesferoidales, ya sea de 4.87, 5.6, 6.8 o 7.5 \im de diámetro fueron conjugadas a una multiplicidad de moléculas de ADN 22-meros con una marca de T R en la posición del nucleótido 1. WGMs fueron adquiridos antes de y después de hibridización con 22-emeros complementarios (Figura 1) .

EJEMPLO 2 Optimización del equipo de WGM para biodeteccion Se evaluaron numerosos parámetros a fin de determinar si el sistema de detección por WGM pudiera ser adaptado para miniaturización, auto-contención y portabilidad.

La Figura 2 proporciona una ilustración esquemática del sistema de detección por WGM. Primero, la potencia de la fuente de luz fue variado para determinar su efecto sobre la resolución de WGM. Una potencia incidente para la fuente de luz (532 nm, 200 milisegundos ) de 6.3, 50.2, 214.5 o 1160.5 W fue suficiente para resolver WGMs (Figura 3B) . Dicha potencia es lograble con un láser de bajo costo estándar (indicador luminoso) .

El tiempo de excitación fue variado a fin de determinar su efecto sobre WGMs. Se evaluaron los WGMs después de exposición por 10, 60, 200 y 1000 milisegundos de luz incidente (50 µ??, 532 nm) . Se determinó que un tiempo de exposición tan corto como 200 ms fue suficiente para resolver WGMs (Figura 4C) con visibilidad decreciente hasta tiempo de exposición de 5 segundos (Figura 4E) . 200 milisegundos de exposición a 50 microwats de potencia luminosa mostraron ser adecuados para WGMs de alta calidad.

EJEMPLO 3 Prototipo de biodetector por WGM El biodetector prototipo por WGM es construido para especificaciones que dan como resultado espectros de WGM bien resueltos antes y después de enlace de un analito a una partícula microesferoidal . El dispositivo es de aproximadamente 30 x 15 x 15 cm y 2 - 5 kg, y está completamente auto-contenido que comprende una fuente de poder, fuente luminosa, cámaras para manejo de muestras y espectrofotómetro .

EJEMPLO 4 Inmovilización de partículas microesferoidales Se inmovilizaron partículas microesferoidales (QSand [marca comercial: partículas de sílice]) en la superficie de un cubreobjetos deslizable de microscopio en una configuración (Figura 5) . El cubreobjetos con partículas de QSand (marca comercial) inmovilizadas fue capaz de acoplarse directamente en la ranura del espectrofotómetro .

EJEMPLO 5 Desarrollo y caracterización de una plataforma de partícula individual para detección de oligonucleotidos objetivo sin marcar, usando los Modos en Galería de Murmullos en microesf ras fluorescentes, individuales En este Ejemplo, se demostró el desarrollo de un sistema de biodetección basado en modos en galería de murmullos (WGP) , altamente sensible, no costoso. El sistema comprende una microesfera de sílice funcionalizada con un fluoróforo y una monocapa densa de oligonucleotidos de una hebra. La adsorción de la hebra complementaria causa desplazamientos espectrales en el espectro de emisión de la microesfera que pueden ser registrados usando un detector de CCD y microscopio óptico convencional.

Materiales Microesferas de Si02 de 7.50 µ?t? de diámetro fueron adquiridas de icroparticles GmbH, Berlín, Alemania. Partículas de sílice de 6.8 µp? y 5.06 µp? fueron adquiridas de (Bangs Laboratories Inc., USA). Cubreobjetos reticulados fotomordentados (18 x 18 mm) fueron adquiridos de Bélico Glass, Vineland, NJ, USA). (3- mercaptopropil ) trimetoxisilano (MPS, 95 %); ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98 %), polivinilpirrolidona (PVP, Peso Molecular de 40,000), Hidróxido de amonio (29.1 % en peso de NH3 en agua); (2- [N-morfolino] etansulfónico hidratado (MES), acetato de sodio (NaOAc) , persulfato de amonio (> 98 %) y dimetil sulfoxida (> 99.9 %) se obtuvieron de Sigma-Aldrich . Acido nítrico de grado analítico, etanol, metanol y 2- propanol fueron adquiridos de Merck, Victoria, Australia. Tetrametil rodamina (TMR) marca colorante del éste succinimidílico, Bodipy 630/650 y Alexa 647 fueron adquiridos de Molecular Probes, Eugene, USA. Se usó agua de grado Milli-Q (R > 18 M O cm) en toda la prueba. Oligonucleótidos modificados con acriloilo fueron diseñados en casa y construidos por Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA. Las construcciones de oligonucleótidos fueron recibidas secadas y resuspendidas a 200 µ? con H20 Milli-Q ultra-purificada antes de uso.

Instrumentación para la caracterización Montajes Ocean Optics Se llevaron a cabo experimentos en un microscopio Nikon Eclipse TE2000-S. La excitación de la fluorescencia de la esfera se logró con una lámpara de mercurio Nikon de 80 W a través de un bloque filtrante de 420-490 nm. Las señales de emisión en modo de galería de murmullos de las microesferas excitadas fueron capturadas en aire con un espectrofotómetro Ocean Optics QE6500. Todos los datos fueron capturados usando el programa Spectra Suite correspondiente. Típicamente los espectros de WGM fueron colectados en 1 - 2 segundos con una resolución espectral de ± 0.9 nm con un tiempo de integración de 800 ms . La luz excitada a través del filtro fue medida a una potencia de radiación consistente de 35.52 m . Las partículas fueron sometidas a formación de imágenes a través de un objetivo 100X de inmersión Nikon Plan Fluor Oil, con una distancia de trabajo de 1.30 mm. La resolución espectral (± 0.9 mm) define la precisión con la cual fue medida la longitud de onda del pico de fluorescencia. Los desplazamientos de pico en una curva de respuesta a WGM pueden ser observados rutinariamente entre 0.1 nm hasta varios nm. La resolución óptica establecida por los fabricantes indica picos con 0.14 nm - 7.7 nm FWHM pueden ser detectados rutinariamente.

Cuando se utilizan los picos QE6500 observados a 575 nm, 585 nm, 605 nm fueron generalmente usados como picos de referencia debido a la baja señal a ruido y agudeza de picos individuales a estas longitudes de onda.

Microscopía Confocal En algunos casos se usó un espectrofotómetro TRIAX 550 enfriado con nitrógeno (Horiba Jovin Yvon, USA) fijado a un microscopio confocal Olympus para colectar espectros con una resolución espectral de ± 9.95 nm. Los resultados de ambos instrumentos fueron iguales sin error experimental. El espectrofotómetro TRIAX 500 el cual fue incrementado en la sensibilidad (resolución espectral calibrada ± 0.05 nm) y capacidades en el intervalo de exploración (0-1500 nm) , es utilizado en combinación con el montaje de Ocean Optics para proporcionar una plataforma efectiva para confirmar y monitorear los desplazamientos de WGM, particularmente cuando se detectan muestras de ADN de concentración extremadamente baja .

Se registraron los espectros de emisión en estado estacionario en un Jovin Yvon Fluorolog - 3 Fluorimetro. Una descripción más extensiva del montaje de microscopio y condiciones de exploración usadas se presentan en el Ejemplo 6.

Microscopio Electrónico de Exploración (SEM, Scanning Electron Microscope) Se colectaron imágenes de las microesferas usando un SEM de emisión de campo Philips XL-30. Hecho esto, las esferas fueron lavadas con H20 Milli-Q y se inmovilizaron directamente sobre sustratos de sílice circulares de 12 mm, los cuales fueron entonces montados sobre el soporte del SEM. Las muestras fueron cubiertas por atomización con 3 - 5 nm de oro usando un Recubridor por Atomización Edwards S150B.

Diseño y Construcción de fragmentos de oligonucleótidos Las siguientes secuencias de oligonucleótidos complementarias y objetivo de una sola hebra fueron diseñadas aleatoriamente y denominadas para el único propósito de esta investigación; por consiguiente las homologías con secuencias de genes conocidos son coincidentales y no deberán considerarse. Las secuencias diseñadas fueron sintetizadas y ordenadas a partir de tecnologías de ADN integradas, Coralville, Iowa, USA. Los oligonucleótidos fueron mantenidos como reservas de trabajo de 200 µ? en agua Milli-Q ultra pura .

Las secuencias de oligonucleótidos y los nombres abreviados usados en el transcurso de este Ejemplo se proporcionan a continuación. La modificación "iAm" proporciona un grupo amina interna libre (por ejemplo, usado para fijar fluóforos) sobre el fragmento de ADN el cual esencialmente es un nucleotido base T con el grupo NH- libre f i j ado . enl (T) 5 ' - /Acrd//iAm/ AT GGA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAG GAC AGC TAT GGA CTG CTT CTA CAC AGT CTC CTG TAC CTG GGC A - 3' (SEC ID N0:1) ot-enl ( T ) 5' - CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG TCC ATA GCT - 3' (SEC ID NO:2) oc-enl de 40 bases (T) 51 - GT CCT CCC CTT CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG TCC ATA GCT (SEC ID NO: 3) oí-enl de 20 bases (T) 5' - CAG GAG AC/iAm/GTG TAG AAG CAG - 3' (SEC ID NO: 4) oc-enl de 10 bases (T) 5' - CAG GAG AC/iAm/G - 3' (SEC ID NO: 5) Control (secuencia objetivo aleatoria no especifica aleatoria) ( ? ) 5' - /Acrd//iAm/ TTA GGC CTA TGG ACA CGT GCG CAT GAT TTG CCT ATT CCG AAT CCG CAG GAT GGG CCT TAC A - 3' (SEC ID NO: 6) La secuencia /Acrd/ denota un grupo 5'acriloilo (Acrylite-marca comercial, Integrated DNA Technologies, USA) grupo fijado a las secuencisa de oligonucleótidos y /iAm/ especifica la posición de un nucleótido base T modificado que posee un grupo amina interno libre usado para fijación del fluoróforo (Integrated DNA Technologies, USA).

Métodos Funcionanzación de la superficie de 2a microesfera Las microesferas de sílice usadas en esta investigación fueron funcionalizadas con grupos tiol usando procedimientos de la literatura estándares (Battersby y colaboradores, Chemical Communications 14:1435-1441, 2002; Corrie y colaboradores, Langmuir 22 ( 6) : 2731-2737 , 2006; Miller y colaboradores, Chemical Communications 38: 4783-4785, 2005; Johnston y colaboradores, Chemical Communications 7:848-850, 2005; Verhaegh y Vanblaaderen, Lagmuir 10 (5): 1427-1438, 1994) . Alícuotas de 5 mL de microesferas crudas fueron lavadas en 20 mL de H20 Milli-Q por centrifugación por 2 minutos a 1800 rpm. El compactado fue resuspendido en 20 mL de ácido nítrico 1.5 M seguido por inversión suave sobre una rueda de agitación motorizada por 30 minutos; el proceso se repitió tres veces. Las microesferas fueron entonces lavadas con alícuotas de 20 mL de 2-propanol y fueron reflujadas en 2- propanol (20 mL) a 80°C bajo agitación constante mientras (100 µ?_) de MPS puro al 0.5 % en volumen fueron administrados cada 30 minutos durante un periodo de 4 horas para funcionalizar las partículas con grupos mercaptano. Las esferas funcionalizadas fueron lavadas a 1800 rpm con 2-propanol y resuspendidas en 10 mL de 2- propanol recientemente obtenido. Esta suspensión de microesferas fue dividida en alícuotas y compactados a 800 rpm por 5 s y secadas en un desecador bajo nitrógeno por 230 min. Finalmente, fueron agitadas y curadas térmicamente para asegurar evaporación completa del 2- propanol (90°C) por 30 minutos sobre un bloque de calentamiento. Todas las microesferas funcionalizadas fueron almacenadas desecadas a 4°C bajo nitrógeno. El procedimiento anterior condujo a funcionalización densa, reproductible de la superficie de sílice, y aseguró adicionalmente repeptización cuantitativa de las microesferas después de almacenamiento.

Síntesis de microesferas dopadas con nanocristales estratificados en la superficie Se usaron núcleos/envolventes de nanocristales de CdSe@ZnS los cuales emitieron naranja con emisión máxima a 593 nm; FWHM 32 n . Se tomaron alícuotas de una solución madre de 10 µ?. Perlas de sílice funcionalizadas con MPS fueron combinadas con nanocristales de en núcleo/envolvente de CdSe@ZnS en una proporción de 1:2.5, se sacudieron manualmente, luego se pusieron sobre un rotador a rpm mínimas por 15 min - 1 hora. Después de pasivación, se usó 2-propanol para emulsificar las dos fases y la suspensión coloidal fue centrifugada decrecientemente a 800 rpm por 5 segundos; el sobrenadante fue entonces descartado y se efectuaron varios lavados de CHCI3 para remover nanocristales no absorbidos o libres. 60 moléculas de PVP/nm2 de área superficial sobre la microesfera fueron requeridas para cubrir las microesferas pasivadas con CdSeSZnS, se disolvió el PVP bajo agitación por 1 hora en solvente de reacción de CHCI3 : 2-propanol en proporción de 9:1. El compactado de pasivación fue resuspendido en la mezcla de reacción y sometida a vórtice instantáneo y la reacción se dejó reaccionar toda la noche. El grupo amida polar en el anillo pirrolidona sobre la molécula de PVP más probablemente facilita la quimiosorción en la superficie de nanocristal vía enlaces covalentes. Además, debido al carácter anfifílico de las moléculas, el recubrimiento ofrece estabilidad a la microesfera (hidrofobicidad y estabilidad en agua) y permite a la molécula ser absorbida sobre muchas superficies. Esto incrementa la afinidad de la partícula en el recubrimiento de la envolvente de sílice final sin el empleo de un agente de acoplamiento. Al día siguiente, las partículas que reaccionaron fueron lavadas varias veces (8000 rpm; 5 s) en 2-propanol y se mantuvieron a 4°C en 2-propanol recientemente obtenido. Las microesferas fueron cubiertas en una solución 1:200 de TEOS, 1 mL de una solución de NH3 al 4.2 % (en H20) (100 pL por 0.005 g de microesferas cubiertas con PVP) . Se añadió TEOS bajo agitación y se dejó reaccionar toda la noche seguido por varios lavados en 2-propanol. Todas las microesferas se conservaron suspendidas en 2-propanol y se mantuvieron a 4°C.

Mareaje específico de oligonucleotidos hase Para marcar con colorante el grupo amina interno libre de enl modificado con 5'-acriloilo recibidos y secuencias de oligonucleotidos Control, se combinaron 15 µ]1. de solución madre de oligonucleotido de 200 µ? con 3.5 µL de fluoróforo de éster TMR succinimidílico y 4.5 iL de solución 1 M de NaHC03 en un tubo de Eppendorf. La solución fue incubada en la oscuridad (para minimizar la foto-decoloración del colorante) por 2 horas a temperatura ambiente con mezclado ocasional. Para lavar y precipitar los oligonucleotidos marcados la preparación fue tratada con una mezcla de 58 µL de H20 Milli-Q, 10 µL de NaOAc, y 200 µ?? de etanol, los cuales fueron añadidos directamente a la reacción y la solución fue entonces almacenada en un congelador a -20 °C por 30 minutos. Las muestras fueron entonces centrifugadas por 20 minutos a 13, 800 rpm y se removió el sobrenadante. Estas etapas fueron repetidas hasta que el sobrenadante de la muestra, estuvo libre de fluoróforo en exceso. Finalmente, los oliognucleótidos marcados fueron diluidos a una solución madre de trabajo de 200 µ con 100 µ?, de H20 illi-Q ultra pura y se almacenó en un congelador a -20°C.

Acoplamiento de oligozmcleótidos modificados con acriloilo a microesferas Microesferas funcionalizadas con tiol fueron derivatizadas con oligonucleótidos modificados con acriloilo en 5' objetivo Control y enl usando protocolos estándares (Hermanson, Bioconj ugative Techniques, San Diego: Academic Press Incorporated, 785, 1996) como sigue: En un tubo de Eppendorf se pesaron 0.002 g de microesferas de PS funcionalizadas y luego se saturaron con 100 µ?, de metanol vía microcentrifugación (8000 rpm por 5 segundos), y se descartó el sobrenadante. El compactado fue resuspendido en MES 0.5 M recientemente preparado (pH de 5.4), seguido por la adición de 15 ]i de 200 µ? de secuencia de oligo marcada con TMR modificada con acriloilo (enl o control) junto con 100 µ?, de solución de persulfato de amono al 10 % en peso/volumen.

La reacción fue sometida a vórtice y luego mezclada suavemente sobre una rueda motorizada por 1 hora. Las microesferas acopladas fueron lavadas con Regulador de Fosfato-Solución Salina (Regulador) [pH = 9.0] y se compactaron en una microcentrifuga (800 rpm por 5 s) para remover el sobrenadante. Todas las preparaciones de microesferas oligo-conjugadas fueron resuspendidas en 1 mL de Regulador (2 g de esferas/litro) y se almacenaron a 4°C. Los métodos utilizados para fabricar rutinariamente partículas de sílice modificadas con oligonucleótidos fluorescentes, las cuales producen WGM presentadas en este Ejemplo y presentadas posteriormente en el Ejemplo 6 se ilustran en la Figura 6. Estas partículas son utilizadas para demostrar las capacidades de detección altamente sensibles y consistentes de WGM cuando se utilizó en una plataforma de reconocimiento específico de ADN.

Método para inmovilización de microesferas en dispuestas en rejilla Por cada placa de ensayo, alícuotas de 10 L (20 pg de microesferas por ensayo) de microesferas con en lo control fueron lavados 3 - 4 veces separadamente en tubos de Eppendorf con porciones de 1 mL de H20 Milli-Q (8000 rpm por 5 s) . Las microesferas lavadas fueron resuspendidas en 120 L de H20 Milli-Q y sometidas a vórtice y teñidas sobre placas de sílice reticuladas individuales. Cada una de las distribuciones montadas en partícula fue entonces colocada sobre una placa/bloque de calentamiento (90°C.) para inmovilizar las partículas y separar completamente por evaporación cualquier exceso de agua. Durante el calentamiento las placas ordenadas fueron sometidas a vórtice suave acoplando un mezclador por vórtice al bloque de calentamiento para asegurar la dispersión profunda de los coloides .

Condiciones del ciclo de hibridizacion Como en las preparaciones para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Rychlik y colaboradores, Nucí. Acids Res. 18 (21 ): 6409-6412 , 1990) se empleó un gradiente de temperatura de dos etapas para todos los ciclos de la reacción de hibridizacion. Una vez que se ha administrado el cADN, las placas ordenadas fueron colocadas en un bloque de calentamiento a 90 °C por tiempos que variaron desde 10 s. 5 min. Después de lo cual, las alineaciones fueron enfriadas a temperatura ambiente durante 5 min para asegurar tiempo suficiente para que las sondas de cADN se fortalecieran sobre oligonucleótidos objetivo.

Ensayo de hibridizacion de cADN de partícula individual Se diluyó una muestra de solución madre de cADN de 200 µ? con PBS (1:40), y la muestra se sometió a vórtice. Se aplicó a cada una de las placas ordenadas una alícuota de 120 pL (suficiente para sumergir completamente el área dispuesta en rejilla) . Cada disposición montada sobre partícula se sometió entonces a ciclo de hibridización individual de 90 s. Para el ensayo del control-reactivo cada rejilla fue tratada con 120 L de las soluciones control: H20 Milli-Q seguido por regulador (PBS), ADN no específico y cADN (como anteriormente) y se corrió un ciclo de hibridización de 90 s para cada placa de tratamiento. Todas las alineaciones permanecieron a temperatura ambiente por 5 min, luego se lavó suavemente con porciones de 100 \i de H20 Milli-Q para remover cualquier ADN (sin reaccionar) en la fase de solución. A menos que se indique de otra manera, se removió el exceso de agua en todos los ensayos post tratamiento de cADN por evaporación sobre un bloque de calentamiento (90°C) . La excitación de fluorescencia y las mediciones de la señal de emisión de las esferas tratadas fueron entonces capturadas en aire.

Ensayo de desnaturalización de cADN Se llevó a cabo la hibridización como se hizo anteriormente y luego se efectuó la desnaturalización por calentamiento de las muestras hibridizadas sobre un bloque de calentamiento a 90°C por 30 s. El regulador fue removido inmediatamente por medio de varios lavados con 100 con H20 Milli-Q. Las etapas de desnaturalización se repitieron tres veces, seguido por la evaporación del exceso de liquido y finalmente la medición de la emisión de las partículas seleccionadas .

Estudio de caracterización de partículas Fabricación de partículas El objetivo inicial de este Ejemplo involucró la funcionalización de superficie de microesferas de sílice (< 10 µp?) con envolventes de núcleos de CdSe (emisores) para facilitar la creación de una señal de GM vía iluminación ultravioleta (UV) (Gómez y colaboradores, Small 1(2): 238-241, 2005) . Las partículas de NC fueron entonces cubiertas con varias capas de estabilizantes orgánicos y la capa funcional final fue prevista para estar con una bio-molécula seleccionada. Desafortunadamente, la estabilidad de los nanocristales utilizados en los experimentos fue comprometida; tratamientos progresivos condujeron a fotodegradación consistente y a una pérdida de picos de WGM discernible antes de que pudiera efectuarse cualquier conjugación posible con una molécula biológica. La pérdida significativa de fotoluminiscencia fue debida probablemente a la disminución de la deserción/desintegración de la capa de nanocristales. La foto-estabilidad de los nanocristales fue claramente comprometida cuando se expusieron a los solventes de reacción utilizados en las fases de cubrimiento con TEOS y PVP. El procedimiento alternativo de los siguientes perfiles de investigación, los cuales involucraron la funcionalización de la superficie de una microesfera con fragmentos oligoméricos , de una sola hebra, marcados con colorante directamente a una superficie de partícula funcionalizada con tioles. El procedimiento alternativo representa la base de los Ejemplos subsecuentes.

Ensayo de hibridización de partícula individual Cada microesfera individual funcionalizada exhibió una huella dactilar de WGM única. Consecuentemente, es necesario para los bioensayos ser llevados a cabo sobre las mismas partículas antes de y después de exposición a una solución de prueba. Para lograr esto, las partículas fueron inmovilizadas sobre una ordenación de sílice reticulado y se colectó un mapa de la microesfera detallado de las rejillas de ensayo Control y objetivo de enl se colectaron. Cada microesfera fue numerada de conformidad con la otra de su señal de emisión que es medida; su localización específica fue entonces mapeada usando el número de exploración correspondiente, el cual se indicó sobre una gráfica esquemática que representó una rejilla mordentada individual. Usando las ordenaciones reticuladas, la misma microesfera pudiera ser rutinariamente localizada después de exposición a varias soluciones de prueba y controles. No obstante, el índice de refracción de las microesferas es muy bajo y fue difícil obtener espectros de alta calidad desde microesferas sumergidas en solución debido al contraste del bajo índice de refracción. Este fue un problema fundamental e inesperado. El índice de refracción disparejo entre sílice coloidal y agua es insuficiente para soportar una WGM. Consecuentemente, los protocolos fueron diseñados de modo de que todos los espectros pudieran ser colectados en aire.

Las placas dispuestas fueron tratadas con 120 pL de a-??? complemento del objetivo. La etapa de hibridi zación inicial involucró que las rejillas de ensayo fueran colocadas sobre un bloque de calentamiento a 90 °C; por calentamiento lentamente de la solución, cualquier ADN agregado u oligomérico que está presente en la solución objetivo es peptizado para facilitar la hibridización con el ADN sonda sobre la perla. El enlace acriloilo/ sulfhidrilo formado cuando el oligonucleótido sonda fue conjugado con la superficie de las microesferas efectivamente sujetado e inmovilizó a la secuencia de la sonda-objetivo en la superficie esférica, y no fue afectado por el subsecuente calentamiento 90°C. Las distribuciones fueron enfriadas por 5 min a T.A. para permitir suficiente tiempo para que las sondas de cADN de a-enl para fortalecer en microesferas objetivo de enl. Las rejillas fueron entonces lavadas y todo el exceso de agua fue removido por evaporación sobre un bloque calentador. Después del tratamiento con la sonda de oren1 las partículas individuales iguales fueron relocalizadas y se colectó en aire un segundo grupo de espectros. Un espectro de fluorescencia del TMR con marca colorante empleado para marcar secuencias objetivo de oligonucleótidos enl y control fue analizado fluorométricamente . El intervalo de emisión del colorante demostró el intervalo esperado de señales de emisión de microesferas que serían definidos por el intervalo de emisión del fluoróforo seleccionado. La señal de emisión de WGM cae en el intervalo de excitación del colorante de TMR. El espectro de WGM muestra un desplazamiento rojo claro aunque no cada pico se desplaza igualmente. Para la muestra mostrada, los desplazamientos de pico observados post hibridización de cADN a-enl medidos a longitudes de onda de 575 (1.1 nm) , 585 (1.5 nm) , 595 (1.1 nm) y 605 (1.1 nm) son todas longitudes de onda más largas en comparación con la señal de emisión pre-hibridización, es decir, la hibridización condujo a desplazamientos rojos de los picos principales en el espectro de WGM.

Enlace no-específ co, reactivos control y efectos del regulador Se estableció entonces un ensayo control para investigar los efectos de reactivos control sobre la señal en modo de galería. Una placa de ensayo individual fue tratada con H20 Milli-Q, una secuencia de ADN no específica y finalmente la sonda de cADN. Se corrió un ciclo de hibridización de 90 s por cada etapa de tratamiento, las esferas seleccionadas fueron relocalizadas y se colectó el espectro de fluorescencia después de cada etapa. Cuando la microesfera seleccionada fue expuesta a Milli-Q y el tratamiento de ADN no específico, no se observaron desplazamientos de pico consistentes. No obstante se observaron desplazamiento rojos consistentes cuando la microesfera fue expuesta a cADN ( -enl) . La causa de los desplazamientos azules resultantes no es clara después del tratamiento con H20 Milli-Q, no obstante en comparación con la exposición al ADN objetivo complementario, el resultado clave es que no hay indicada relación post-tratamiento con el reactivo control y ADN no específico. Esta no es una señal parásita concerniente al formato de partícula individual de los experimentos considerados para ésta así en esta etapa el resultado sugiere simplemente que el desplazamiento azul es un resultado no específico aleatorio.

Ciclaje del ensayo de WGM El aspecto involucró probar si los ensayos son reversibles, esto es, si la desnaturalización de ADN diera como resultado un desplazamiento azul a la posición original y si la reacción de hibridización llevada a cabo una segunda vez sobre la misma microesfera también causaría un desplazamiento rojo. Esto nos facilitaría confirmar que los desplazamientos espectrales son debidos a reconocimiento biomolecular y no solo enlace no específico por ADN. Además, la habilidad para ciclar a través de ciclos de adsorción-desorción repetidos facilitaría el diseño de un ensayo más confiable estadísticamente, en el cual los desplazamientos de pico durante varios ciclos pudiera ser promediado. Después de hibridizar el cADN en la microesfera sonda, se fortaleció a 90°C en regulador diluido para tratar y desnaturalizar el ADN y causar desorción de la secuencia objetivo.

Los espectros fueron registrados y los desplazamientos se muestran en la Figura 7, junto con resultados de un segundo ciclo de hibridización. Como puede verse, fortalecimiento extendido en regulador diluido conduce a un desplazamiento azul de los cuatro picos, y una segunda hibridización no da como resultado desplazamientos rojos, indicando que los ciclos de ensayo pueden ser repetidos ¿, aunque los desplazamientos observaos no sean consistentes con la reversibilidad completa. La Figura 7 es una representación simplificada de las posiciones de los picos en cada etapa del ensayo de hibridización a partir de una esfera relocalizada seleccionada .

EJEMPLO 6 Detección en a omóles de objetivos oligoméricos libres de marcas usando el modo de galería de murmullos en microesferas fluorescentes individuales En este Ejemplo, se determinaron la sensibilidad y limite y la velocidad con la cual el ensayo puede ser efectuado. El Ejemplo 5 mostró que coloides de sílice individuales funcionalizados con fragmentos de oligonucleótidos de una sola hebra y que pueden delinearse entre diferencias de 10 nucleótidos bases de una sonda objetivo de cAD . En este ejemplo, los resultados demuestran que el sistema basado en WGM es capaz de detección específica de objetivo, rápida de fragmentos de ADN complementarios a temperatura ambiente (TA) , a concentraciones sub-picomolares y en solo unos cuantos minutos usando muestras de varios microlitros. Los resultados indican que la detección en atomoles de fragmentos de ADN sin marca es posible sobre una base de rutina.

Sección experimental Un esquema simplificado que detalla los métodos de ensayo de hibridización y la síntesis de partículas se presenta posteriormente (Figura 8). Los fragmentos de ADN utilizados fueron como se usaron en el Ejemplo 5 junto con el equipo de caracterización en modo de galena de murmullos. Métodos de caracterización e instrumentación Se colectaron espectros de resolución más altas en aire en un microscopio Microscopio 1X71 de exploración por rayos láser FV-500 Olympus Fluorview (Olympus, USA) acoplado a 1 detector externo CCD-3000v (Jobin Yvon, USA) y espectrofotómetro Triax 550 . Las partículas fueron sometidas a formación de imágenes a través de un objetivo 100XO de inmersión Olympus UplanSApo Oil, con una distancia de trabajo de 0.13 mra. Los espectros podrían ser colectados en 5 s - 2 min (dependiendo de un intervalo de exploración de longitud de onda) con una resolución espectral de 0.05 nm. La fotoluminiscencia de la muestra y los espectros fueron colectadas usando una cámara CCD con enfriamiento por nitrógeno liquido (137 K) . Las partículas fueron excitadas a través de un Melles Griot X2 multi-línea por rayos láser Ar+ (Melles (Griot, USA) típicamente a una potencia de excitación de 350 ]iV¡ . Las señales de emisión fueron colectadas típicamente con el punto centra de longitud de onda a 600 nm a través de un filtro de corte de 550 nm con un tiempo de integración de 2 s .

Métodos Un medio ambiente de ensayo "real" es uno en el cual partículas funcionalizadas son expuestas a varios reactivos control, analito sin marcar especifico y no especifico y regulador de hibridización bajo variadas condiciones de reacción como se prescribe en el Ejemplo 5. Una plataforma de detección comparativa en el mercado actual seria capaz de detectar rutinariamente concentraciones sub-picomolares de analito. Este ejemplo investiga si el ensayo por WGM puede ser efectuado a temperatura ambiente y se determinó el limite de detección del sistema presentados en el Ejemplo 5.

Sensibilidad y ensayo de hibridización de sonda copl mentaria } Para el siguiente ensayo de hibridización se efectuaron diluciones en serie con la solución madre de a-enl cADN de 200 µ? para crear soluciones objetivo de concentración variable desde 10~15 M a 10"7 M. Cada muestra fue sometida a vórtice y una alícuota de 120 iL de cada solución de sonda fue aplicada al arreglo objetivo de enl individual. Cada distribución montada sobre rejilla fue entonces colocada sobre un bloque de calentamiento a 90°C y se corrió la reacción de hibridización por 90 s. Las muestras fueron mantenidas en reposo a temperatura ambiente por 5 minutos y fueron lavadas con porciones de 100 µ?, de H20 Milli-Q. Las placas dispuestas para post-tratamiento fueron lavadas con H20 Milli-Q para diluir el regulador de solución salina, y asegurar que cuando el exceso de reactante fuera separado por evaporación el depósito de los cristales de sal sobre las placas de ensayo fuera mínimo. Las partículas fueron entonces recubiertas y se midieron las señales de emisión "post-hibridización" relevantes.

Se prepararon cinco arreglos con detectores objetivo de enl inmovilizados. Se observaron los mapas de partícula correspondientes y se colectaron los espectros de WGM a través de microscopía de fluorescencia y excitación como se detalló anteriormente. Dado que el ensayo fue efectuado a TA, la sonda preparada por tratamiento en regulador (2.50 x 1CT8 M de -enl) fue calentada por 10 minutos a 90 °C antes de uso para asegurar que los fragmentos de a-enl ADN fueran de una sola hebra. Cada placa ordenada preparada fue entonces tratada con alícuotas de 120 yL de la solución de 2.50 x 10"8 M de a-enl de una sola hebra elaborada en regulador. Los ordenamientos fueron corridos para un ciclo de hibridación individual ya sea de 10 s, 30 s, 60 s, 180 s, o 300 s a TA. Las placas ordenadas post-tratamiento fueron mantenidas en reposo por 5 min a TA, lavadas con H20 Milli-Q y secadas. Los detectores fueron entonces recuperados y se midieron las señales de emisión relevantes.

Investigación de hibridización a temperatura ambiente y sensibilidad Ensayo por WGM de partícula individual Los reconocimientos del modo de galería fueron adquiridos a partir de partículas de sílice de 7.50 pm funcionalizadas con fragmentos de oligonucleótidos de 70 bases marcados con TMR usando dos formas de caracterización. El primer, un microscopio de fluorescencia Nikon TE2000-S acoplado a un detector Ocean Optic CCD (± 0.9 nm) (Figura 8A) y espectros de más alta resolución fueron adquiridos usando un microscopio de exploración láser Olympus Fluorview 1X71 (Olympus, USA) acoplado a un espectrómetro TRIAX (± 0.05 nm) , Figura 8B. El aspecto clave de la plataforma de reconocimiento desarrollada es el método de 'partícula individual' utilizado para evaluar la partícula. La representación esquemática siguiente (Figura 8C) ilustra la razón fundamental para el formato seleccionado y porque es crucial en un sistema basado en WGM. El punto clave tomado de la representación esquemática es que el uso de las propiedades ópticas de WGM es una plataforma de detección, espectros promedio de resultados en conjunto pueden no ser efectuados exitosamente como muestra el ejemplo dos partículas modificadas idénticamente, a partir de la misma muestra tienen firmas de emisión únicas. Finalmente, una partícula individual actúa como su 'propia referencia' , por consiguiente una partícula individual puede ser vista como un experimento individual. Este parámetro formó la variable analítica fundamental en el ensayo de hibridización desarrollado .

Sensibilidad Una dilución en serie inicial (regulador) de la solución madre de sonda de cADN se preparó con concentraciones que varia desde 10-7 M a 10-15 M. Las señales de emisión a partir de la selección de microesferas individuales fueron capturadas pre- y post- exposición al tratamiento de cADN. Las longitudes de onda del pico de emisión o posiciones de modo a las longitudes de onda cercanas a 575, 585, 595 y 605 nm fueron analizadas como una función de la concentración de cADN (Figura 9A) . La Figura 9B presenta la relación entre el desplazamiento del pico ??) del espectro de emisión como una función de la concentración de cAD . Hay un desplazamiento rojo claro en el espectro de emisión después de exposición para todos los picos de emisión por GM virtualmente en contraste al ensayo de control (tratamiento con Milli-Q) , el cual no dio como resultado desplazamiento de pico direccional consistente. Para propósitos de ensayo, es suficiente puntualizar que virtualmente todos los modos exhiben un desplazamiento rojo después de adsorción del ADN. Además, es reversible a partir de la desnaturalización del ADN a temperaturas superiores a la temperatura de fusión. Dado que los desplazamientos ?? fueron justamente 1 - 4 nm para la mayoría de los ensayos, una investigación más detallada de los desplazamientos de modo fue llevada a cabo usando un espectrofotómetro TRIAX 550 con una resolución espectral de ± 0.05 nm. La Figura 9C presenta un espectro de GM típico a partir de la misma partícula objetivo con enl antes y después de exposición a cADN.

Es importante reconocer que puesto que cada microesfera individual tiene su propia firma de WGM, la detección está basada solamente en los desplazamientos observados o no observados con la misma microesfera individual. No es posible promediar los resultados sobre microesferas múltiples. Actualmente, los desplazamientos observados por detección positiva con cualquier microesfera individual son típicamente de 1 - 2 nm para las microesferas empleadas y menos de estos para control. Por consiguiente, aunque los niveles de detección son extremadamente bajos, cada experimento puede ser correlacionado solamente con el comportamiento de la misma partícula. Los datos como los mostrados en la Figura 9A, donde los resultados de diferentes microesferas son mostrados, las diferencias en los desplazamientos absolutos para cada partícula no son significativos. Los criterios para detección son si desplazamientos espectrales consistentes son detectados por cualquier partícula individual para una exposición a reactivo dada .

Discusión La resolución espectral del grupo de CCD empleado generalmente en esta investigación podría limitar la sensibilidad de los detectores de WGM. La sensibilidad depende críticamente de la resolución espectral dada del detector empleado. El detector de Ocean Optics tiene una resolución de 0.9 nm, y los picos de emisión de WGM son disminuidos debido a la baja resolución espectral. No obstante, no hay información que pueda ser recabada a partir de la conformación del modo. No obstante estos espectrómetros simples facilitan que el ensayo sea llevado a cabo a bajo costo y rutinariamente podría ser hecho en el campo.

Los desplazamientos rojos inducidos por la hibridización son observados rutinariamente con partículas oligo-modificadas de 70 bases tratadas con concentraciones de cADN sub-picomolares a partir de volumen de dosificación de 120 L. Monocromadores reticulados y CCDs enfriados con LN2, de escritorio son necesarios para observar y caracterizar apropiadamente los modos de WGM de las microesferas, pero para propósitos de ensayo dicha alta resolución no es un pre-requisito. A las concentraciones de ADN mínimas, uno puede observar desplazamientos azules aleatorios, pequeños a partir de partículas post-hibridizadas . Esto indica que la emisión en WGM puede ser influenciada por pequeñas perturbaciones tales como cambio de minutos en el índice de refracción de la solución debido a fluctuaciones de temperatura y a concentraciones del electrólito. Estas determinan el límite práctico final en sensibilidad posible para estos bioensayos en medio acuoso. Consecuentemente, solamente desplazamientos rojos consistentes de cuatro o más picos son tomados para indicar un evento de detección positivo.

También se ha demostrado que el sistema puede ser empleado exitosamente a temperatura ambiente con detección de objetivo indicada por desplazamiento en modo de resonancia en señales de emisión de microesferas en 10 segundos de exposición a cADN. Esto minimiza los problemas asociados con deposición y cristalización de sales, cambios de pH, secado y contaminación que tiene lugar cuando el ambiente de la microesfera es de temperatura gradual para desnaturalizar cualquier sonda enlazada no específicamente y facilitar el fortalecimiento efectivo del ADN en las microesferas. Los mejoramientos mencionados anteriormente son importantes para el desarrollo general de la plataforma de bio-detección basado en WGM para análisis de ADN.

EJEMPLO 7 Detección libre de marca basada en solución de polimorf smo de nucleotidos individuales objetivo, usando modos de galería de murmullos en microesferas de melamina individuales Una desventaja de WGM basada en sílice es no poder ser usada enteramente en solución. En este Ejemplo, las limitaciones asociadas con el sistema de WGM actual son aliviadas por medio del diseño de un protocolo de conjugación junto con el desarrollo de una solución en modo de galería de murmullos (WGM) , altamente sensible, basado en sistema de genotipado. El sistema comprende una microesfera (= 7.52 ym) de melamina formaldehido altamente reticuladas, uniformes funcionalizadas con un fluoróforo y una monocapa de oligonucleótidos de una sola hebra. Usando un sistema de pocilio de microplaca, puede completarse enteramente un ensayo en solución. El sistema de WGM libre de marca puede evaluar ADN amplificado polimórfico objetivo a sensibilidad sub-picomolar . Los desplazamientos de frecuencia detectados en agua pueden ser usados para monitorear la desnaturalización del complejo de post-hibridización de doble hebra a temperaturas elevadas. Controlado por un gradiente de temperatura en dos etapas la capacidad de interrupción óptica del detector basado en polímero es también demostrada ya que los desplazamientos de WGM pueden ser invertidos y reactivados rutinariamente.

Con esto en mente partículas compuestas de melamina biocompatibles están comercialmente disponibles en una amplia variedad de tamaños de partículas (300 nm - 12 µp?) . El alto índice de refracción del material (?G 1.48), sílice y la mayoría de otros materiales de vidrio (?G 1.47 - 1.50) ofrecen una clara ventaja. Los cálculos usando la teoría de Mié sugieren, el índice de refracción creciente disparejo entre una partícula de MF y un medio acuoso externo (?G 1.33) mejorarían el factor de calidad de las WGMs . De manera importante, las diferencias son suficientemente grades de modo que facilitan que sean llevados a cabo ensayos simplificados en solución.

Este Ejemplo examina el desarrollo de un ^ensayo húmedo' de WGM libre de marca, de partícula individual para detección de objetivos oligoméricos . Las partículas poseen factores Q similares a los de microesferas de sílice del mismo tamaño en aire. Usando señales luminiscentes de WGM, el ensayo puede detectar rutinariamente niveles sub-picomolares de fragmentos de oligonucleótido sin marca en solución en un formato de mesa de microplaca de pocilios. Los hallazgos presentados muestran que señales de WGM fluorescentes en microesferas (<10 µp?) de melamina formaldehido (MF) altamente reticuladas discrimina positivamente un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) , Single Nucleotide Polymorphism) entre fragmentos amplificados por PCR sin marca de ADN genómico (gADN) de tres individuos que portan nucleótidos diferente en un loci particular.

Sección experimental Materiales Se adquirieron microesferas de resina de melamina formaldehido (C5HBN60)n [MF] de 7.52 µp? de Microparticles GmbH, Berlín, Alemania. Placas de microtítulo de policarbonato de 384 pocilios, placas de cultivo celular de 96 pocilios y placas de microtítulo óptico de 384 pocilios fueron adquiridas de NUNC, Bruselas, Bélgica. Bodipy 630/650 marcado con colorante éster succinimidílico originario de Molecular Probes Eugene, USA. Todos los otros reactivos , reguladores y microesferas compuestas fueron originarios de los proveedores reportados previamente. Toda la instrumentación y métodos de caracterización por WGM utilizados son como se describió en los Ejemplos 5 y 6.

Instrumentación Se utilizó un sistema de microscopio PE100-NI con la etapa por efecto Peltier invertido para estudios de hibridización por termociclado . El sistema comprendió un intervalo de Diaphot de visualización invertida con tablero XY adaptado para un tablero de microscopio Nikon TE200/300. El intervalo de temperatura de la etapa (-5 a 99°C) fue controlado con una etapa por efecto Peltier de calentamiento/enfriamiento PE100-I. La etapa fue acoplada a una bomba de circulación de agua para regular la temperatura de la etapa. Con modificaciones menores el montaje anterior fue también montado sobre un microscopio Olympus 1X71.

Secuencias de ADN objetivo de SNP humano Rsl0434 Objetivo (conjugado a partícula) (T) 5' - /5Acrd//iAm/TC GCC GGG ACA TCT GCC AGT GG[T] CTC CTG -3' (SEC ID NO:7) A-rsl0434 A (complemento) (T) 5'- CAG GAG [A]CC AC/iAm/ GGC AGA TGT CCC GGC GAA - 3' (SEC ID NO: 8) A-rsl0434 B (disparejos) (T) 5'- CAG GAG [C]CC AC/iAm/ GGC AGA TGT CCC GGC GAA -3' (SEC ID NO: 9) *los paréntesis indican los nucleótidos base disparejos Los fragmentos de ADN enlistados anteriormente fueron marcados como se prescribió en el Ejemplo 5 a menos que se indique de otra manera (Nhhiji y Mulvaney, Small 3(8) : 1408-1414, 2007) .

Región SNP de rsl0434 5' - TGG AAG ATT CAG GAG CCT GGG CGG CCT TCG CTT ACT CTC ACC TGC TTC TGA GTT GCC CAG GAG [A/G] CC ACT GGC AGA TGT CCC GGC GAA GAG AAG AGA CA - 3' (SEC ID NO: 10) Regiones amplificadas por PCR de gADN que contenían el SNP de rsl0434 marcado Individuo 1 [A/A]; Individuo 2 [A/G]; Individuo 3 [G/G] fueron proporcionadas por International Diabetes Institute ( elbourne , Australia) . Se llevó a cao el genotipado usando el sistema MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA) , como se describió previamente (Peyrefitte y colaboradores, Mechanisms of Development 104(1-2): 9-104, 2001). Resumiendo, cebadores de PCR fueron diseñados para rsl0434 usando el SpectroDESIGNER para amplificar un fragmento de 97 pb que circundaba el sitio variable. Las reacciones fueron efectuadas usando 2.5 ng de ADN genómico, 2.5 mmoles/L de gCl2, concentraciones estándares de otros reactivos para PCR y 0.1 unidades de HotStar TaqDNA polymerase (Qiagen, Alemania) en un volumen de reacción total de 5 µ?_. Los fragmentos fueron aislados por electroforesis usando el equipo de extracción sobre gel Qiaquick (Qiagen, Alemania) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Cebador en sentido directo ****ACGTTGGATGATGTGTCTCTTCTCTTCGCC (SEC ID NO: 11) Cebador en sentido inverso ***-*-ACGTTGGATGCCTTCGCTTACTCTCACCTG (SEC ID NO: 12) Métodos Conjugación mediada por acriloilo de fragmentos de oligonucleótxdos a microesferas Las partículas de melamina crudas fueron lavadas varias veces en Milli-Q (8000 rpm por 5 s)y fueron almacenadas secas y desecadas a 4°C bajo nitrógeno. Partículas de MF lavadas (2 mg) fueron pesadas en un tubo Eppendorf. La química de superficie nativa de las partículas de melamina (Gao y colaboradores, macromolecular Materials and Engineering 286 ( 6) : 355-361, 2001) proporcionó una superficie de conjugación consistente para inmovilizar los fragmentos de oligonucleótido de una sola hebra. Utilizando fragmentos modificados con grupo ácido 5'-acrílico (acriloilo) , se llevó a cabo la funcionalización de partícula en una reacción individual a temperatura ambiente (Sharmin y colaboradores, Progress in Organic Coatings 50(l):47-54, 2001) . Las partículas fueron re-suspendidas en PBS recientemente preparado por la adición de 15 L de oligonucleótidos marcados con 200 µ? de TMR acriloilo. La reacción fue sometida a vórtice y mezclada suavemente sobre una rueda motorizada por 1 hora. Las microesferas acopladas fueron lavadas con regulador en una microcentrífuga (8000 rpm por 5 s) para remover el sobrenadante. Todas las microesferas oligo-conjugadas fueron resuspendidas en 1 mL de regulador (2 g de esferas/ Litro) y se almacenaron a 4°C. Una representación esquemática del proceso de conjugación se presenta en la Figura 10.

Estudio de la etapa térmica de microesferas en partícula individual (i) Dilución de las microesferas Las microesferas fueron inicialmente diluidas en una serie de cuatro diluciones tomando 1 yL de la solución madre de microesferas (2 mg/1 mL) y resuspendiéndolo en 1 mL de Milli-Q (dilución 1) y sometiéndolo a vórtice: Luego, 250 pL de la dilución fueron resuspendidos en 1 mL de H20 Milli-Q y fueron sometidos a vórtice. Este proceso fue repetido con la nueva dilución tres veces. Una alícuota de 1 pL de las diluciones 3 y 4 contendrían típicamente 1 partícula/pL . (ii) Inmovilización de la microesfera individual Una alícuota de 1 \il¡ de la dilución 3 fue aplicado a la base de un micropocillo individual y se monitoreó el número de microesferas en la gotita. Cuando se estableció bien la cuenta de una partícula se registró el espectro de emisión de partículas después de la adición de un volumen de 49 yL de regulador recientemente preparado a pH de 7.0. Las partículas de melamina fueron inmovilizadas sobre la base de micropocillos individuales bajo los efectos de la gravedad. (iii) Ensayo de Control (solamente regulador) y sonda objetivo rsl0434 La temperatura de la etapa térmica fue incrementada a 37°C y se dejó equilibrar por 2 minutos y luego se capturó un espectro individual. 5 L de Milli-Q o 2 µ? de solución de sonda objetivo fueron entonces aplicados al pocilio. La temperatura de la etapa fue incrementada a 72 °C y mantenida por 2 minutos seguido por la adquisición espectral. Finalmente la temperatura de la etapa fue disminuida a 37 °C o temperatura ambiente.

Ensayo de hibridización de rsl0434 usando fragmentos de ADN de muestras de ADN genómico control amplificado por PCR (i) ratamiento de la sonda objetivo por hibridización Se aplicaron 2 yL de la solución de la sonda de ADN objetivo deseada (10 ng/ L) directamente a un pocilio que contenia una partícula individual de rsl0434 objetivo. Se efectuó un ciclo de hibridización de 5 min a 90°C seguido por un ciclo de enfriamiento a temperatura ambiente de 10 minutos. Se adquirieron las exploraciones de señal de emisión después de cada ciclo (x3) . Se repitió el tratamiento de hibridización por muestras de ADN de los individuos 1, 2 y 3. Todas las señales de emisión fueron capturadas en solución y no emprendió ningún lavado o cambio del regulador de reacción.

A menos que se indique de otra manera todos los ensayos post-tratamiento de exposición a sonda objetivo fueron explorados mientras las microesferas permanecieron sumergidas en regulador de hibridización. Las mediciones de señal de emisión y excitación de fluorescencia de esferas tratadas fueron capturadas en solución, típicamente a 500 ms 2 s de tiempo de integración usando placas de sílice triturado y placas ópticas de 384 pocilios. Las placas pudieron ser almacenadas a 4°C y las microesferas pudieron ser empleadas exitosamente en ensayos de hibridización adicionales según se requiera.

Estudio de caracterización y desarrollo de partículas Propagación de WGMs en solución Los fragmentos de oligonucleótidos usados para funcionalizar las microesferas fueron diseñados y construidos para imitar la región de SNP de rsl0434 que separa la hebra de 30 bases del genoma humano. La secuencia es homologa en la región sobre el cromosoma 6. El análisis de secuencias indica la región que codifica para el receptor del factor d crecimiento endotelial vascular (VEGF, Vascular Endotelial, Groth Factor) [Awats y colaboradores, Biochemical ad biophysial Research Communications 333 (3) : 679-685, 2005; Errera y colaboradores, Diabetes Care 30 (2) : 275-279, 2007; Jousen y colaboradores Ophtalmologe 100 (5) : 363-370, 2003; Sowers y Epstein, Hypertension 26(6:869-879, 1995; Uhlmann y colaboradores, Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 11 (6) :275-294, 2006]. Una búsqueda extensiva de BLAST de la región SNP de rsl0434 completa reveló dos parejas, la secuencia tiene homologías en 866 pb sobre el lado 5' (precursor e isoforma del factor de crecimiento endotelial vascular), localización: 6pl2; y 215111 pb sobre 1 lado 3': proteína hipotética LOC221416, localización 6p21.1. Individuos con predisposición en esta región tienen susceptibilidad creciente a retinopatía diabética, Diabetes Melitus, Diabetes Melitus No Dependiente de la Insulina también conocida como Diabetes de Tipo 2 (NIDDM o T2D) , Diabetes que Principia en la Madurez (MOD) y Resistencia a la Insulina. La hiperglicemia experimentada por pacientes diabéticos causa función celular vascular anormal, en particular en el endotelio en etapas tardías de la enfermedad. Estos individuos comúnmente experimentan degeneración progresiva déla micro- y macro-circulación, lo cual consecuentemente conduce a daño orgánico (Laselva y colaboradores, Acta Diabetologica 30(4): 190-200, 1993; Ciulla y colaboradores, Acta Ophtalmologica Scandinavica 80(5): 468-477, 2002). Los estudios han demostrado que la región de DNP seleccionada podría ser usada potencialmente como un marcador para T2D y enfermedades relacionadas. Los descubrimientos presentados aquí demuestran la validez de la plataforma de WGM optimizada como una herramienta de diagnóstico efectiva para evaluar rutinariamente enfermedades objetivos de SNP relacionados con humanas conocidas.

Las partículas de Melamina formaldehido oligo-modificadas tienen un diámetro de 7.52 micrones y fueron bioconjugadas directamente con oligonucleótidos marcados con TMR modificados con acriloilo en 5' . Hay excitación de fluorescencia de la partícula a través de un láser Ar+ multilínea azul a una potencia de excitación de 350 µ?/? a través de un filtro protector de 550 nm de ?. El perfil de intensidad de fluorescencia demuestra la conjugación entre los fragmentos de ADN acriloilo y los grupos NH nativos sobre la superficie de las partículas son consistentes (Krajnc y Toplak, Reactive & Functional Polymers 52(1): 11-18, 2002).

Sílice versus Melamina Con estudios previos de microesferas compuestas todas las mediciones fueron tomadas en el aire. Esto requirió evaporación de líquido de reacción en exceso para mejorar la emisión de señal desde una partícula individual. El principal objetivo de esta sección fue desarrollar un ensayo de hibridación basado en una solución de WGM de partícula individual optimizada. La señal de emisión fue medida sistemáticamente desde una partícula de sílice y de F (?G 1.68) individual inmovilizada en aire y en agua. Inicialmente las señales de emisión respectivas fueron capturadas en aire luego se administró una gotícula individual de H20 Milli-Q (R> 18 ?O cm) sobre cada placa inmovilizada para sumergir completamente las partículas. Las señales en modo de galería fueron obtenidas de esferas relocalizadas en aire y agua después de repetir el proceso varias veces. La Figura 11 demuestra un rendimiento típico después de los tratamientos indicados. Para las microesferas de sílice cada tratamiento en agua dio como resultado la disipación de los picos de señales de emisión y la conjunción de señales capturadas las de TMR libre en medio acuoso [Nuhiji y Mulvaney, 2007 supra] (espectros azules y rojos) . No obstante, después de evaporación de la Milli-Q, el perfil de emisión de WGM característico se re-desarrolló, Figura 11A (espectros negro, verde y azul aqua) . Tuvo lugar una amplitud y pérdida de modos en conjunción con una disminución en la intensidad de modo cuando las partículas de melamina fueron expuestas a Milli-Q; no obstante, varios picos bien definidos pudieron aún ser reproduciblemente colectados (Figura 12B , espectros rojo y azul) . Como las partículas de MF fueron el foco principal de esta investigación desde este punto sobre, los espectros de referencia se proporcionan también en los paneles C) y D) de la Figura 11.

Ensayo en Placas de micro-pocilios La habilidad de las partículas de MF para soportar una WGM en solución condujo a la siguiente investigación, la cual fue para seleccionar un sustrato de hibridización que facilite la obtención de rutina de WGMs de relativamente alta Q en solución. Presentando las partículas en un formato de placa de microtítulo se mueve una etapa más próxima hacia la dirección de un ensayo automático de alto rendimiento. Los análisis se basaron en la calidad de señal de WGM que pudiera ser colectada a partir de partículas de MF oligo-modificadas mientras se inmovilizaron sobre un micropocillo y sustrato de placa de ensayo. Partículas de MF modificadas fueron inmovilizadas sobre una placa en distribución de rejilla de sílice, en una citoplaca de policarbonato de 384 pocilios de pocilio individual, la placa óptica de 384 pocilios y la placa de cultivo celular polimérica de 96 pocilios. Las señales de emisión fueron colectadas desde partículas seleccionadas mientras se sumergieron en regulador de hibridización estándar. La Figura 12 ilustra un perfil de emisión representativo obtenido usando cada sustrato seleccionado. Debido a la pequeña amplitud de trabajo del sustrato se esperó que la distribución en rejilla de sílice produciría altos rendimientos de señal a partir de una partícula de MF seleccionada (Figura 12A) . No obstante, para un formato de alto rendimiento, un sistema basado en pocilios fue la dirección deseada. El primer análisis del sistema de microplacas fue llevado a cabo con una placa de cultivo de 96 pocilio de base plástica (Figura 12B) . La señal de emisión colectada indica un perfil de GM que consiste de varios picos amplios de baja intensidad. Esto fue simplemente debido a un gran ancho de la base de cada pocilio y al hecho de que el plástico tiene propiedades de difusión altas. También el uso de una potencia de amplificación de objetivo más baja (x40) para considerar que una gran distancia de trabajo reduzca la señal global. No obstante, la transparencia del material consideró la facilidad de formación de imágenes y la localización de las partículas. Usando lentes con distancias de trabajo mayores está dirigida por una correlación, como un incremento en distancias de trabajo está directamente asociado con un incremento en la pérdida de señal. Después se analizó una placa de base polímero/poliestireno de marca comercial CC3 de 384 pocilios, la cual imita a poli-D-lisina usando un recubrimiento no biológico, estéril. El recubrimiento está cargado positivamente y promueve la adhesión de células débilmente adhesivas y en nuestro caso ayudaría en la inmovilización de las partículas de MF de 7.52 micrones recubiertos de oligo/ADN cargadas negativamente. Cada pocilio tuvo un volumen de trabajo total más pequeño (placa de base polimérica: ancho de base de 100 µp?; área de pocilio, 0.05 cm2/pocillo con un volumen de trabajo total de 120 µ??/pocillo) . También la geometría del pocilio de fondo plano y la transparencia visible permitió fácil acceso a la placa y manipulación usando el microscopio de etapa de trabajo orientada X/Y. La Figura 12C muestra un ejemplo de una señal de emisión típica desde una partícula de MF. Están presentes una serie de picos de alta intensidad fluorescente, estrechos identificables . Una placa óptica de 384 fue también empleada con las mismas dimensiones y volúmenes de de trabajo que la placa polimérica. No obstante, el ancho de la base fue más estrecho (50 µp?) y la base del pocilio no retuvo una carga positiva. Se observaron nueve picos de emisión distintos en el perfil de WGM como se indica en las Figuras 13A y C. El espectro de partícula obtenido a través de la placa de grado óptico de 384 pocilios indicó que la intensidad de cada modo identificable fue mejorada (Figura 12D) en comparación con los espectros en los paneles 12a -12C) . El efecto dupleto en cada m¿x indicado en los resultados de WGM presentados en la Figura 4 es simplemente un efecto de obtención d señal de WGM en solución.

Efectos térmicos Por consiguiente, se ha establecido la ventaja de presentar las partículas de MF en un formato de micro-pocilios en en ensayo de trabajo. No obstante, durante una reacción de hibridización de ADN las microesferas pueden ser expuestas a condiciones de reacción extremas > 90 °C. La funcionalización de las partículas con los fragmentos de oligonucleótido con acriloilo permanece intacta cuando se hacen reaccionar bajo condiciones ligeras (<37°C) . No obstante, se desconoce aún como excesiva carga térmica afectaría la conjugación. Usando una placa de micropocillos ópticos de 384 pocilios se desarrolló un estudio térmico para determinar la resiliencia del enlace químico a temperatura elevadas. Fueron inmovilizadas las partículas de MG individuales en micropocillos y luego se sumergieron en regulador, MES (pH de 5.4) o H20 Milli-Q (control). Se midió la señal de fotoluminiscencia de referencia (PL, PhotoLuminiscence) de las partículas seleccionadas y la placa fue calentada a temperatura de ensayo de hibridización estándar (90°C). La temperatura fue mantenida por tres horas tiempo durante el cual las partículas seleccionada fueron relocalizadas y la señal de emisión fue colectada regularmente. La Figura 14 presenta espectros de WGM normalizados obtenidos de las partículas seleccionadas después de 3 horas de exposición térmica. Durante el periodo de 3 horas el mayor efecto se obtuvo en la partícula sumergida en MES (línea punteada negra) la cual exhibió una pérdida significativa de la señal de PL en comparación con partículas sumergidas en regulador de hibridización (línea negra llena) . La señal más fuerte después de tratamiento térmico fue observada en la partícula control la cual fue mantenida solamente en illi-Q (línea llena gris) . El nivel de la señal de emisión varió entre muestras. No obstante, un perfil de WGM claro con varios picos identificables pudo aún ser obtenido desde cada partícula después de 3 horas de calentamiento .

Los experimentos de caracterización llevados a cabo demostraron que las partículas descritas en este Ejemplo pueden soportar WGMs en solución. Después se empleó una etapa en un microscopio termo-controlado Linkam PE100-NI para investigar perturbaciones de la señal de WGM en 'tiempo real' en un ensayo de hibridización basado en solución en micropocillo . Se desarrolló un ensayo utilizando un montaje de etapa para determinar si cambios térmicos al medio local alrededor de la microesfera superiores o inferiores Tm de una sonda complementaria hibridizada pudieran ser detectadas cíclicamente. Las sondas objetivo de 30 bases construidas marcadas como a-rsl0434 A (Tm = 71.2°C) fueron complementarias a los fragmentos fijados a las partículas de MF. Una partícula objetivo de MF-rsl0434 de 7.52 micrones individual fu ciclada a través de un gradiente de so pasos (37°C - 72°C). Una reacción de hibridización inicial fue completada después de adición de 5 µ?? de H20 Milli-Q. Los espectros obtenidos a un tiempo de integración de 2 s a cada gradiente de temperatura a través de varios ciclos no indicó movimiento consistente de los picos de WGM (Figura 15 A a Figura 15 B. Usando la misma partícula se repitieron las condiciones experimentales con adición de 1 ADN de sonda objetivo (5 µ?? de una solución madre de 2 µ?) . Después de un ciclo de hibridización inicial los datos de la señal de emisión obtenida mostraron que la exposición a solución del fragmento -rsl0434 a 72°C dio como resultado un desplazamiento azul de los picos de WGM principales y una disminución de la temperatura de la etapa a 37 °C, el mismo pico desplazado rojo (Figura 15C) . Un ciclo de hibridización repetido dio como resultado desplazamientos rojos observados consistentemente de los picos de WGM cuando la temperatura de la placa local fue de menos de la Tm de la sonda objetivo y el desplazamiento azul cuando la temperatura fue incrementada a más de la Tm de la sonda objetivo (Figura 15D - 15E) .

Ensayos objetivo de genoma humano Usando gADN control obtenido de tres controles individuales (individuos saludables ) se amplificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 20 bases usando cebadores que espaciaron la región de SNP de rsl0434. Los genotipos de los individuos anteriores fueron determinados usando la plataforma de genotipificación Sequenom MassARRAY. Cada individuo tuvo un genotipo diferente. El individuo 1 fue homozigótico para el alelo A (A/A) , el individuo 2 fue heterozigótico (A/G) y el individuo 3 fue homozigótico para el alelo G (G/G) en este locus . El objetivo aquí fue determinar si una diferencia de un par base individual pudiera ser detectada a partir de las muestras amplificadas por PCR usando el sistema WGM. Una partícula de MF-rsl0434 individual especifica para el alelo A de la variante de ADN de rsl0434 fue inmovilizada en un pocilio de microplaca; la partícula fue expuesta entonces a 3 diferentes analitos durante reacciones de hibridización separadas. Cada hibridización fue completada a 90°C por 5 min después de adición de 2 µL de la muestra de ADN (individuos 1-3) . Se colectaron las señales de emisión después de cada reacción de hibridización respectivamente después de que el gradiente de temperatura de reacción ha sido disminuido a temperatura ambiente. Se obtuvieron las firmas de WGM obtenidas después de cada tratamiento en relación a la señal de referencia (espectro negro) . Las posiciones de los picos fueron analizadas en relación al perfil de WGM sin tratar y al ?? indicado. Los espectros obtenidos mostraron las posiciones de longitud de onda de los picos como una función del desplazamiento del pico aproximadamente a la longitud de onda de referencia dada. Un desplazamiento rojo positivo de todos los modos de galería fluorescente importante resultó después de exposición a la muestra del Individuo 1 (cuadrados llenos negros) . La misma partícula fue entonces tratada con muestra de ADN del Individuo 2. La señal de WGM obtenida postexposición indicó un desplazamiento rojo de todos los picos fluorescentes (en comparación con la señal sin tratar) . No obstante, en relación a las posiciones del pico en longitud de onda post-tratamiento con la muestra del Individuo 1, el tratamiento con la muestra del Individuo 2 heterozigótico causó un desplazamiento azul de los modos fluorescentes. El tratamiento con el ADN del Individuo 3 (triángulos llenos verdes) entonces dio como resultado otro desplazamiento de WGM azul en relación la firma del modo obtenida posttratamiento con ADN amplificado del Individuo 1. Estos desplazamientos azules muy pequeños observados son el resultado de la introducción de las sondas de ADN disparejas de los Individuos 2 y 3. Estas sondas enlazan no específicamente y como un resultado disminuyó el número de sitios de enlace disponibles para el ADN emparejado del Individuo 1.

Discriminación objetivo Para confirmar que las microesferas modificadas pueden discriminar rutinariamente una base individual dispareja en un ensayo de trabajo, se construyeron dos sondas de ADN objetivo sintetizadas en laboratorio con una amina interna libre para fijación de molécula de colorante. El primer objetivo (a-rsl0434 A) fue diseñado para imitar la variante alélica [A] rsl0434, los fragmentos fueron marcados fluorescentemente con T R. El analito alternativo contuvo una sola base dispareja y fue identificado con Bodipy 630/650. Las partículas de MF objetivo de rsl0434 sin marcar individuales fueron inmovilizadas en tres micropocillos de una placa óptica de 384. Antes de exponer la sonda objetivo se captó una señal de misión de referencia en solución (regulador) de las partículas seleccionadas. Dos ensayos individuales fueron completados con las sondas objetivo o¡-rsl0434 y a-rsl0434 durante ciclos de hibridización individuales. Los resultados muestran una hibridización de la sonda objetivo a-rsl0434 A. La obtención de una señal de emisión de WGM fluorescente aguda fue verificada con una exploración de imagen de intensidad fluorescente tomada de la misma partícula que muestra una partícula fluorescente esférica. Una débil señal de WGM fluorescente fue obtenida desde la partícula expuesta a a-rsl0434 que contenía la diferencia individual no obstante, una exploración de imagen de intensidad de fluorescencia mostró fluorescencia no detectable. La exposición de una partícula individual a ambas sondas objetivo dio como resultado un desplazamiento azul de los principales picos en modo de galería de fluorescencia post- tratamientos con a-rsl0434 B, si la partícula fue expuesta inicialmente a fragmentos objetivo -rsl0434 A.

Estudios de partículas individuales en una dilución de volúmenes en serie también demostraron que estas partículas poliméricas oligo-funcionalizadas pueden detectar niveles de ADN de analito. Dichos volúmenes de detección destacan el uso efectivo de volúmenes de reacción pequeños para completar un ensayo de hibridización de partícula individual completo. Además, esto demuestra que las partículas pueden detectar rutinariamente concentraciones sub-picomolares de ADN de sondas objetivo.

Discusión Los resultados expuestos en la presente demuestran claramente que enlace no covalente de hebras complementarias de ADN a las microesferas de MF modificadas con oligonucleótidos pueden ser detectadas en solución. Los desplazamientos de longitudes de onda de los modos en galería fluorescente pueden ser empleados para detectar rutinariamente la adsorción y resorción de fragmentos de ADN complementarios no marcados bajo varias condiciones de reacción .

La superficie nativa de las partículas de MF facilita la conjugación de una monocapa densa de fragmentos de oligonucleótido modificados con acriloilo. La conjugación es esencialmente la ligadura covalente de una molécula de melamina con un ácido acrílico. Las partículas modificadas con oligonucleótido son altamente resilientes cuando se exponen a soluciones de pH alto a temperaturas elevadas (90°C) cuando señales de WGM de alta calidad pueden ser colectadas desde las partículas después de exposición prolongada. Los datos demuestran que anticuerpos de cx-IgM humanos marcados con FITC pueden enlazar también efectivamente a las partículas de MF no modificadas. Estas partículas pueden entonces ser utilizadas en ensayos de enlace antígeno-anticuerpo .

El ADN tiene un índice de refracción más alto en la conformación de una sola hebra (desnaturalizado) ( Parthasarathy y colaboradores, Applied Physics Letters 87(11:113901-3, 2005). En su forma nativa el índice de refracción de ADN es similar al de polímeros orgánicos típicos (Samoc y colaboradores, Chemical Physics Letters 431 (1-3) : 132-134, 2006) . ADN de doble hebra existen de manera natural como un material dieléctrico, y alternativamente en la forma desnaturalizada se vuelven semiconductores con un espacio de banda de unos cuantos cientos de mili-electrovoltios (Rakitin y colaboradores, Physical Review Letters 86(16): 3670, 2001). Por consiguiente, los desplazamientos de WGM descritos en este Ejemplo (post-hibridización) son gobernados por una disminución o incremento en el índice de refracción relativo en la superficie de la microesfera en asociación directa con un incremento en el diámetro de las microesferas (Niu y Daraf, Smart Materials and Structures 11 ( 5 ) : 778-782 , 2002). Está aún sin aclarar cómo estos parámetros influyen específicamente a WGM, sin embargo en contraste los desplazamientos característicos son reproducibles rutinariamente usando ambas partículas compuestas.

Estos estudios de partículas individuales demuestran que durante un ensayo de hibridización los desplazamientos ?? en una señal de WGM obtenida de partículas modificadas con rsl0434 pueden ser usados para discriminar un cambio de base individual en ADN d sondas sintetizadas en laboratorio. Cuando las partículas son presentadas en formato de micro-placa los desplazamientos de pico consistentes son confirmados en un sistema automático usando gADN amplificado por PCR que contenga la región que se espera que contenga el cambio de nucleótido individual de interés. Las partículas objetivo de MF-rsl0434 descritas en este Ejemplo pueden discriminar entre varios alelos del SNP de rsl0434 relacionado con diabetes {= 100 b) . La posición del fluoróforo en el primer nucleótido base de los oligonucleótidos con acriloilo fijados (aproximadamente 5 -10 nm de la superficie coloidal) , facilita la reflexión interna total de rutina de la luz excitada en medios aéreo y acuoso .

La habilidad para excitar WGM en solución en un ensayo con formato de micro-pocilio evita completamente problemas encontrados con el sistema descrito en los Ejemplos 5 y 6. Un sistema que utiliza un formato de micro-pocilio disminuye el tiempo de corrida para completar un ensayo, cuando partículas son localizadas rápidamente y no se requieren etapas de lavado. Finalmente este formato facilita que se efectúe un ensayo entero sobre la misma partícula en solución, lo cual también proporciona un sistema organizado para el re-empleo de los detectores para pruebas adicionales.

Además, el sistema descrito en el Ejemplo actual no utiliza métodos de acoplamiento de fibra óptica para excitar un WGM , lo cual simplifica drásticamente el ensayo. Volúmenes en atomoles de solución de sondas de ADN objetivo pueden ser detectados rutinariamente. Los desplazamientos de WGM reversibles cíclicamente observados en las microesferas de MF de manera importante indican que las partículas pueden ser recicladas. Se mostró que los desplazamientos de picos de WGM fueron reversibles cuando la temperatura local fue oscilada suprior e inferior a Tm de la sonda objetivo; por consiguiente, los desplazamientos rojos espectrales son específicamente debidos a la hibridización de ADN complementario. La afinidad de enlace de una sonda objetivo es significativamente decreciente cuando un fragmento de ADN tiene una única base dispareja. El enlace no específico, aunque se encontró despreciable puede causar pequeños desplazamientos azules en un espectro de WGM de partícula si la misma partícula es inicialmente expuesta a un objetivo complementario. En una reacción de hibridización de partícula individual de pocilio individual el espectro de emisión de WGM comparado indica que una sonda objetivo específica tiene una afinidad de enlace más distante que la opuesta a un fragmento que contiene una sola base dispareja.

Estos hallazgos muestran que partículas de melamina de alto índice de refracción modificadas con fragmentos de oligonucleótidos marcados (30 bases) rutinariamente emiten WGM en solución. Cuando la partícula es excitada en solución, la señal de excitación no disminuye en intensidad de fotoluminiscencia y los modos fluorescentes son ampliados. No obstante, una serie de picos de resonancia de GM bien definidos pueden aún ser identificados cotidianamente.

EJEMPLO 8 Condiciones óptimas para la excitación en modo de galería de murmullos, en microesferas de melamina modificadas y de sílice fluorescente individuales Este ejemplo reporta sobre el desarrollo de una serie de parámetros optimizados para excitar de manera rutinaria en modo de galería de murmullos (WGM) de alta calidad en los coloides fluorescentes. En el trascurso de este ejemplo se utilizaron microesferas de melamina y de sílice modificadas con oligonucleótido específico objetivo (TSOM) (7.50 - 7.52 µp?) [Microparticles Germany GmbH] presentadas en los Ejemplos 5 a 7.

Sección experimental Materiales Los materiales y métodos empleados para síntesis de partículas, estrategias de inmovilización y caracterización de WGM se describieron en los Ejemplos 5 a 7.

Investigación de parámetros de excitación en modo de galería de murmullos Efectos de la posición de acoplamiento Usando montaje confocal, se diseñó una técnica espectroscópica resuelta en ángulo para caracterizar la emisión de WGM como un resultado de alterar la posición de la excitación láser. Se prepararon cubreobjetos con partículas de MF y de sílice modificado con TSOM como se prescribió previamente (Ejemplos 5 a 7) . El sistema confocal empleado fue utilizado para alterar la posición de excitación alrededor de la circunferencia de la partícula usando la imagen de transmisión de partículas obtenida como una referencia. A una potencia de radiación de 350 pW las partículas seleccionadas fueron excitadas a través de un rayo láser Ar+ multi-línea. Se colectaron los espectros de emisión a un tiempo de integración de 2 s. Para todo el trabajo confocal en la presente se usó un rayo láser Ar+ para excitación de partículas. La posición de excitación fue alterada a incrementos de 45° durante una rotación de 360° alrededor del límite periférico de las microesferas en relación a la coordenada a 0° (referencia) . Cuando una WGM de partícula es excitada en el montaje confocal normalmente es utilizada la posición de excitación 0o, esto da como resultado la obtención de WGMs de alta calidad de rutina. NO obstante, la excitación en posiciones seleccionadas a través de 360 °C también da como resultado la colección de espectros de WGM fuertes. El análisis del grupo de espectros para el ejemplo seleccionado demuestra que ningún desplazamiento de pico detectable es observado para las posiciones de excitación seleccionadas (en la resolución espectral del espectrofotómetro TRIAX 550 ± 0.05 nm) . En algunos casos una distorsión de pico puede tener lugar. La distorsión fue consistentemente observada en cada uno de los espectros de WG obtenidos en las longitudes de ondas dadas.

Una partícula de MF seleccionada fue entonces explorada en aire bajo las mismas condiciones. El análisis del grupo de espectros de WGM demuestra que en relación a espectro a 0o, desplazamientos de pico detectables, son observados (resolución espectral de la CCD ± 0.05 nm. Desplazamientos azules son observados en la muestra seleccionadas, no obstante, es improbable que el índice de refracción de las partículas haya cambiado para causar los desplazamientos observados. Estos efectos pudieran ser debidos al movimiento de la posición de excitación pro son más probablemente el resultado de los límites umbral de la CCD.

La reflexión interna total de la luz a través de una partículas TSOM-MF inmovilizada en solución se demostró en el Ejemplo 7. Una partícula de MF individual inmersa en solución fue entonces excitada en las posiciones radiales seleccionadas. Todos los picos fluorescentes en el intervalo de exploración (en relación a la exploración a 0o) consistentemente se desplazaron en rojo. Los resultados indican que los desplazamientos de picos en relación a la exploración a 0o fueron significativamente más grandes con los resultados en aire. La variación del pico creciente es asimismo en atribuida a las propiedades de la alta dispersión de la luz de agua. Se indicó que las variaciones de la posición del pico son máximas en la posición de 180°, 270° y 315° (hasta 0.89 nm) . Estos resultados sugieren que una posición de excitación fija deberá ser utilizada para la excitación de WGM en las partículas de TSOM.

Estudio de excitación repetida La continuación de la investigación investigada en un análisis de los efectos causados por la excitación repetida de una partícula d TSOM a través de una posición individual y como un resultado obsérvese el deterioro en relación al de la señal de WGM. Durante un ensayo de hibridización de partícula individual se utilizó un punto de excitación individual (0°= para todos los espectros de WGM. La importancia de usar una posición de excitación ha sido demostrada. De manera importante esto mejoraría las variaciones de los picos.

De manera rutinaria, una microesfera-TSOM es excitada (explorada) aproximadamente 2 a 5 veces durante un ensayo de trabajo. Es importante que una señal de WGM de microesferas permanezca estable durante este tiempo, así pueden obtenerse espectros de WGM después de varios tratamientos. Por consiguiente, el propósito de este experimento fue determinar los niveles de deterioro de la señal de luminiscencia asociados con las partículas de TSOM descritas en esta tesis.

Estudio de deterioro de WGM en aire Las partículas fueron inmovilizadas en cubreobjetos de vidrio, los sustratos fueron entonces montados en un microscopio confocal. Las microesferas de MF y de sílice seleccionadas fueron excitadas en aire a través de la posición de excitación a 0o [tiempo de integración 2 s) . El grupo de espectros obtenidos a un tiempo de integración de 2 s de las microesferas de sílice seleccionadas. La fotointensidad (PI) de WGM disminuye significativamente la intensidad de fluorescencia después de la serie de exploraciones. Se identificaron diez picos diferentes, en el escaneo 1 y 9-10 picos desde la exploración 20.

Una partícula de MF con TSOM individual fue entonces expuesta a los mismos parámetros experimentales. El número de picos identificados a través de la exploración 1 y la exploración 2 permaneció consistente (aproximadamente 16) . El factor Q disminuye en un factor de siete y la variación de la posición del pico es despreciable.

Estudio de de deterioro de WGM en agua La siguiente etapa fue excitar repetidamente una sola partícula de F y TSOM en solución (H20 illi-Q=. Una partícula individual fue expuesta a rayos láser en la posición de 0°C y el grupo de espectros fue capturado en un tiempo de integración. El número de picos identificados disminuyó en el intervalo de escaneo seleccionado (ocho) en comparación con las mediciones en aire. No obstante, el número de picos permaneció sin cambio después de que las exploraciones fueran completas (exploración 1-20). Una disminución de seis veces en el factor Q es observada entre las exploraciones 1 y 20 respectivamente.

Los espectros a escala colectados a partir de las exploraciones de GM finales consistieron de entre 8 - 16 picos identificables . Estos resultados demuestran un perfil de WGM que puede ser colectado rutinariamente (> 20) a partir de la misma partícula después de exposiciones repetidas a rayos láser (potencia de radiación de 350 pW) a través de un punto de excitación fijo (0o). Además la ampliación de picos debido a fotodegradación de la marca de colorante de TMR y la inmovilización de la partícula en agua, no dio como resultado alguna variación de pico significativa. Como un resultado las propiedades de resiliencia de las partículas en un ensayo de trabajo son puestas en evidencia.

Resolución de CCD Como se demostró en el Ejemplo anterior, la sensibilidad de un espectrómetro desempeña un papel importante en las mediciones de WGM durante un ensayo de trabajo. El espectrómetro determina la cantidad de información espectral que uno puede adquirir a partir de una partícula excitada y los límites de sensibilidad de la plataforma de detección de WGM. En este ejemplo, se comparan los montajes de microscopios y la sensibilidad de los detectores de CCD.

Una partícula de sílice fue primero excitada (posición 0o) en aire, y se colectaron los espectros con un espectrómetro TRIAX 550 (resolución espectral de ± 0.05 nm) a un tiempo de integración de 2 s . Se obtuvo un espectro desde la misma partícula a través de una lámpara de mercurio (potencia de salida de excitación de 35.52 mW) . Un sistema Ocean Optics QE6500 (resolución espectral ± 0.9 nm) a un tiempo de integración de 2 s se utilizó para obtener un espectro. Se observó una ampliación clara de varios picos principales a partir del espectro adquirido con el espectrómetro QE6500. Además el espectro obtenido a través del TRIAX 550 indica varios picos ( max: 577.54 nm, 588.47 nm, y 599.95 nm) no están presentes en los espectros de QE6500. La variación en F HM ( max PI= 1.00) se calculó y fue de 0.38 nm (TRIAX) y 0.98 nm (QE6500), respectivamente. Las mismas mediciones fueron tomadas en aire con una partícula de MF con TSOM individual: El espectro obtenido a través de TRIAX 550 indica que una pérdida de varios picos resulta cuando se utilizó el QE6500 para la obtención de WGM (?p,3?: 578.81 nm, 584.65 nm, 588.07 nm, 597.73 nm y 608.08 nm) . Los valores de FWHM en TRIAX (0.72 nm) y QE6500 (1.27 nm) indican adicionalmente la diferencia en calidad espectral.

Después, una partícula de MF individual inmovilizada en solución fue excitada fluorescentemente y se capturó su espectro. Los resultados indican que el espectro tomado en agua no mostró pérdida de picos de misión después de cada exploración respectiva. El espectro de emisión capturado por TRIAX indica una FWHM de 0.81 nm ( max donde PI = 1.00) y 1.15 nm a partir del espectro obtenido en QE6500. El grado de ampliación de pico fue comparativamente de menos que el medido para las partículas de sílice y MF en aire.

Estos grupos de datos demuestran WGMs de alta calidad con un mayor número de picos espectrales pueden ser obtenidos cuando se utiliza un CCD de alta potencia. Los perfiles de WGM obtenidos también contienen mas información espectral. No obstante, la variabilidad entre estos espectrómetros es significativamente mejorada (aproximadamente 0.24 nm) cuando las mediciones son tomadas en solución.

El desplazamiento del pico de GM entre espectrómetros es simplemente debido a la diferencia de sensibilidad de los espectrómetros. Por ejemplo, la resolución espectral del instrumento define la precisión en la cual una posición de pico puede ser medida como un max 'verdadera'. Por consiguiente, el sistema Ocean Optics (± 0.9 nm) es menos preciso en relación a max Verdadera' para cada pico de WGM observado en comparación con el sistema TRIAX (± 0.05 nm) . Por consiguiente con base en esta condición se esperó que habrá variabilidad entre las curvas de respuesta a WGM.

Tiempos de decoloración Se determinó un umbral de decoloración de las microesferas mientras están bajo excitación constante a través de una posición de acoplamiento fija. Los perfiles de decoloración fueron medidos usando el montaje de caracterización confocal. Partículas individuales fueron sometidas a rayos láser en aire bajo una onda continua a 488 nm (Ar+) usando una energía de salida de 350 W a través del punto de excitación 0o. Todos los perfiles de decoloración fueron medidos al reverso de un objetivo 100X (NA = 1.4), y se formó la imagen. La velocidad de decoloración se observó como una función del tiempo (s) [200 s] . Los perfiles de decoloración de fluorescencia de las partículas seleccionadas fueron colectados para 100 partículas a partir de partículas de TSOM sobre sílice (n = 100) y sobre MF (n = 100 ] . Los perfiles de decoloración fueron promediados a partir de cada colección de exploraciones. Se aplicó un ajuste tres exponencial para ajustar los datos promediados. La curva de tiempo de decoloración promediada para las partículas de sílice, indica que 60 % de la fluorescencia se disipa durante la excitación constante en 023 s. Un 31 % adicional de la señal de fluorescencia de las partículas se decolora luego después de 2.51 s. Finalmente el remanente 9 % de la fluorescencia de las partículas decolora después de 26.40 s. Para la muestra de sílice dada la mayoría de la fluorescencia de las partículas se disipa después de aproximadamente 3.30 s. Comparativamente las partículas de TSOM-MF se mostró que son más consistentes. Los datos indican que 50 % de la fluorescencia de las partículas se degrada después de 31.10 s. Usando el mismo modelo de ajuste tres exponencial, el máximo porcentaje de señal de fluorescencia se foto-degrada después de 6.28 s, lo cual es un mejoramiento significativo en comparación con las partículas de TSOM sobre sílice.

Se utilizó una potencia de rayos láser considerablemente alta para excitación de partículas (350 pW) . No obstante los resultados indican una señal de fluorescencia podría aún ser observada después de 26.40 s (sílice) y 31.10 s (MF) durante excitación constante. Estos tiempos de decoloración pueden por consiguiente, ser mejorados simplemente por disminución de la energía de excitación .

Discusión La variación espectral asociada con la precisión de resolución espectrofotométrica se demostró que fue significativamente mejorada utilizando las partículas de MF TSOM las cuales soportan WGMs en solución. Este resultado demuestra adicionalmente una CCD de menor resistencia puede ser exitosamente empleada en un ensayo de WGM basado en solución sin la pérdida de información espectral importante. El tiempo de decoloración más lento de la fluorescencia de las partículas de MF refuerzan adicionalmente el papel de las partículas poliméricas en una plataforma de bio-detección de WGM. El desarrollo posterior de una unidad de diagnóstico de WGM basado en microfluidos, de alto rendimiento utilizaría microesferas homogéneas de alto índice de refracción. Una unidad de exploración automática deberá presentar partículas en solución en un formato de micro-pocilio. La unidad deberá incorporar también un sistema de excitación por rayos láser similar al encontrado en citómetros de flujo y en microscopios de exploración por rayos láser confocal. Las partículas deben ser excitadas a través de una posición fija para minimizar la variabilidad de la señal. La fijación de la posición de excitación o alternativamente la presentación de las partículas en una posición fija aliviará la necesidad de emplear lentes de objetivo costosos y programas para formación de imágenes de alta precisión.

EJEMPLO 9 Comparación de WGM usando partículas de melamina formaldehido y sílice Las Figuras 17 (A) y (B) muestran una comparación del perfil de WGM obtenido usando partículas de sílice (B) y partículas de melamina formaldehido (A) . Las líneas llenas en (A) y (B) fueron los perfiles obtenidos en aire y las líneas punteadas representan los perfiles cuando las partículas estuvieron en medio a acuoso.

La adquisición en agua usando perlas de sílice produjeron fluorescencia muy pálida pero no WGM (Figura 16 (B) ). Cuando se usó melamina formaldehido, se obtuvo un fuerte perfil de WGM.

EJEMPLO 10 Inmuno-WGM Un ensayo de WGM con base inmune proporciona un ajuste para una plataforma de diagnóstico. Los datos demuestran una señal de WGM fluorescente intitulada a partir de una partícula de MF modificada por anticuerpo (a-IgM humano) (Figura 17) en una reacción a temperatura ambiente. El ens'ayo de WGM con base inmune proporciona un formato de reconocimiento alternativo con especificidad adaptable a una plétora de objetivos biomoleculares tales como proteínas, anticuerpos, patógenos animales y vegetales, bacterias, interleuquinas, péptidos, ARN, mARN y priones. El ensayo inmunológico de WGM tiene potencial en aplicaciones en la industria de higiene alimenticia, pruebas de agua del medio ambiente, industria agrícola, militar (guerra biológica) , virología, diagnóstico s de microbiología y cribados farmacológicos .

Los expertos en el arte apreciaran que la invención descrita en la presente es susceptible de variaciones y modificaciones diferentes de las descritas específicamente. Se comprenderá que la invención incluye todas las variaciones y modificaciones mencionadas. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados en o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y cualquiera de todas las combinaciones de dos o más cualesquiera de dichas etapas o características.

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Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para detectar un analito en un medio, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos al analito para una población de partículas micoresferoidales conjugadas con fluoróforo en donde si la partícula microesferoidal es melamina formaldehido entonces puede ser conjugada con el fluoróforo o comprender un punto cuántico; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar el espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas micoresferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección en modo de galería de murmullos (WGM) para detectar un evento de enlace.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las partículas microesferoidales comprenden un material seleccionado de la lista que consiste de: melamina o derivados de ésta; sílice; látex; titania; dióxido de estaño; ytria; alúmina; otros óxidos metálicos binarios; perovskitas y otros óxidos metálicos piezoeléctricos; PLGA; sacarosa y agarosa.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la partícula microesferoidal comprende melamina formaldehido.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las partículas microesferoidales son seleccionadas que tengan un índice de refracción más alto en relación al del medio en el cual tiene lugar la detección.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la partícula microesferoidal tiene un índice de refracción mayor que 1.40.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio es una fase líquida o gaseosa.

7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque la fase líquida es una solución acuosa, regulador o fluido biológico y la fase gaseosa es aire.

8. - El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el analito o su respectivo ligando comprenden una molécula seleccionada de la lista que consiste de: ácido nucleico; proteína; péptido; anticuerpo; lípido; carbohidrato; bacterias; virus; células y cualquier molécula pequeña o entidad química.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el analito o su respectivo ligando comprende un ácido nucleico.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido nucleico comprende ADN de una hebra .

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ADN de una hebra es preparado por digestión de ADN de doble hebra con endonucleasas y/o exonucleasas de restricción.

12. - El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque las endonucleasas de restricción son endonucleasas de restricción de Tipo I.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la exonucleasa es lambda exonucleasa .

14. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ADN de una hebra es preparado a partir de una molécula híbrida de ARNrADN.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la molécula híbrida de ARNrADN comprende ADN hibridizado a ARN mensajero preparado por transcripción inversa.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ARN es ARN viral.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el analito o ligando es derivado de una muestra aislada obtenida de una fuente biológica, industrial, de laboratorio o ambiental.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la muestra comprende material de origen mineral, sintético, eucariótico, procariótico o viral.

19. - Uso de un método caracterizado porque comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas micoresferoidales conjugadas a fluoróforo en donde si la partícula microesferoidal es melamina formaldehido entonces puede ser conjugada con el fluoróforo o comprender un punto cuántico; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro de referencia; (iii) poner en contacto a las partículas micoresferoidales con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales a medios de detección de WG en la fabricación de un ensayo para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando .

20.- Un método para detectar un evento de enlace entre un analito y un ligando, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas micoresferoidales de melamina formaldehido marcadas con puntos cuánticos o conjugadas a fluoróforo; (ii) poner en contacto a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido con una muestra de control negativo y determinar el espectro de referencia; (iii) poner en contacto las partículas micoresferoidales de melamina formaldehido con una muestra que comprenda putativamente el analito por un tiempo y bajo condiciones suficientes para facilitar un evento de enlace entre el analito y su ligando respectivo; y (iv) someter a las partículas microesferoidales de melamina formaldehido a medios de detección WGM para detectar un evento de enlace.