CN115414703A

CN115414703A - 染料修饰后的核酸探针纯化方法

Info

Publication number: CN115414703A
Application number: CN202211364952.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡晶晶; 李星豪; 苏敏; 李俊
Original assignee: Briggs Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Briggs Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-11-03
Also published as: CN115414703B; WO2024093150A1

Abstract

本发明提供染料修饰后的核酸探针纯化方法，本发明方法通过吸附剂与游离修饰染料和染料修饰后的核酸探针的非极性官能团之间的作用力，将过量的游离修饰染料和所述染料修饰后的核酸探针保留在吸附剂上，然后用含有机溶剂的水溶液洗脱含吸附剂的柱子，利用所述游离修饰染料与所述染料修饰后的核酸探针之间的极性差异，将所述染料修饰后的核酸探针选择性地从吸附剂上洗脱下来。本发明方法不需要预冷试剂，工艺流程简单；去除游离修饰染料的操作过程时间由4‑15小时缩短为10‑20分钟，极大的缩短了操作周期。

Description

染料修饰后的核酸探针纯化方法

技术领域

本发明涉及核酸合成领域，特别涉及一种染料修饰后的核酸探针纯化方法。

背景技术

单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。而对DNA或者RNA的结构进行一些修饰染料标记，就形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。DNA/RNA修饰探针广泛应用在分子诊断QPCR（实时荧光定量）、STR（短串联重复序列）、以及FISH（荧光原位杂交技术）等领域。

一般地，有两种常见的方法可用于单链DNA核酸与RNA核酸的修饰染料标记。一种为固相亚磷酰胺三酯法，另一种为液相氨基活化酯加成法。传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性基团的DNA/RNA核酸探针溶解在碱性的缓冲液中，然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的活化酯修饰染料，在常温反应4-12小时。为了除掉反应中过量的游离修饰染料，反应完成后需要使用乙醇沉淀法对DNA/RNA修饰探针进行沉淀，同时用70%的冰冻乙醇对沉淀物进行洗涤，得到沉淀固体。

在现有技术中，反应完成后体系中含有过量的游离修饰染料以及缓冲盐，针对特定应用领域，这些未反应的游离修饰染料及缓冲盐需要在后续生产中提前去除，故在反应后处理中，需要大量使用有机溶剂反复进行沉淀清洗，产生较多有害废液，同时针对大规格的DNA/RNA修饰探针，处理时间长达4-15小时，极大浪费时间。沉淀洗涤过程中使用的乙醇试剂需要-20℃预冷，工艺要求高，过程繁琐。

同时，乙醇沉淀法不能完全沉淀DNA/RNA修饰探针，过程损失较大，一般沉淀损失率约为3-10%。另外在处理过程中需要大量使用有机溶剂反复进行沉淀清洗，材料成本浪费太高。对于大规格的DNA/RNA核酸探针来说，因游离修饰染料与核酸大分子结构相互包裹，即便经过多次沉淀清洗，在经过高效液相色谱仪纯化后，产品中仍会残留少量游离修饰染料，对于STR等类型的探针，少量或微量残留的游离修饰染料会影响到结果的解读。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明了一种染料修饰后的核酸探针纯化方法，所述方法通过吸附剂与游离修饰染料和染料修饰后的核酸探针的非极性官能团之间的作用力，将过量的游离修饰染料和所述染料修饰后的核酸探针保留在吸附剂上，然后用含有机溶剂的水溶液洗脱含吸附剂的柱子，利用所述游离修饰染料与所述染料修饰后的核酸探针之间的极性差异，将所述染料修饰后的核酸探针选择性地从吸附剂上洗脱下来，而所述游离修饰染料保留在吸附剂上，以纯化所述染料修饰后的核酸探针；所述吸附剂是C18吸附柱，所述含有机溶剂的水溶液中乙腈所占体积是5-15%。

本发明中核酸探针的修饰染料是在荧光探针中使用的染料，诸如CY7 SE(花菁素7琥珀酰亚胺活化酯)、CY5 SE(花菁素5琥珀酰亚胺活化酯)、CY5.5 SE(花菁素5.5琥珀酰亚胺活化酯)、CY3 SE(花菁素3琥珀酰亚胺活化酯)、TAMRA SE(简写TAM)(羟基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺活化酯)、ROX SE(6-羟基-X-罗丹明琥珀酰亚胺活化酯)、TexasRedSE(简写TXR)(德克萨斯红琥珀酰亚胺活化酯)。

在一种实施方式中，所述含有机溶剂的水溶液中乙腈所占体积是10%。

在一种实施方式中，用所述含有机溶剂的水溶液洗脱二次。

在一种实施方式中，所述染料是ROX、TXR、TAM、CY3、CY5、CY5.5或CY7。

在一种实施方式中，所述核酸探针是DNA核酸探针或RNA核酸探针。

本发明提供了一种在染料修饰后的核酸探针中快速去除游离修饰染料的方法，该方法不需要预冷试剂，工艺流程简单；该方法的操作过程时间由4-15小时缩短为10-20分钟，极大的缩短了操作周期；该方法对DNA/RNA核酸探针的保留性高，过程损失非常小，一般损失率约为1-4%；该方法解决了在高效液相色谱仪纯化后游离修饰染料在DNA/RNA核酸探针中残留的问题，提高了产品纯度。该方法只需加入少量的有机溶剂洗脱，极大的降低有害废液的产生。

具体实施方式

为了使本领域的技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例一不同吸附剂的选择实验

本实验对吸附剂的种类进行筛选，选择两种吸附剂八烷基硅烷键合硅胶填料（C8）、十八烷基硅烷键合硅胶填料（C18），分别装在有筛板的塑料柱管中，制成C8吸附柱和C18吸附柱。使用这两种吸附柱在相同的实验条件下分别对染料修饰后的核酸探针和游离修饰染料的吸附效果进行比较。因游离修饰染料的最大吸收波长与染料修饰核酸探针的染料最大吸收波长一致，在高效液相色谱上，选择修饰染料的最大吸收波长作为检测波长，对比原液与回收溶液中游离修饰染料的峰面积占比，来表征游离修饰染料的吸附程度。用酶标仪测量溶液中核酸探针的吸光值再转换成nmol值，计算核酸探针含量。

具体实验方案如下：

1. 将400nmol含有氨基结构的DNA/RNA核酸探针溶解于400ul pH为8.5的0.5MNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，充分震荡混匀；

2. 用150ul DMF溶剂去溶解1200nmol活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，充分震荡混匀；

3. 将上述混合溶液放入摇床，震荡4-12小时；

4. 取4nmol对应的粗品体积，在高效液相色谱上分析，计算染料最大吸收波长下的游离染料峰面积的占比；

5. 分别在C8吸附柱与C18吸附柱中加入10ml甲醇溶液，静置5min后缓慢滴下，弃废液；

6. 分别在C8吸附柱与C18吸附柱中加入10ml超纯水，缓慢滴下，弃废液；

7. 分别在C8吸附柱与C18吸附柱的下端口放置10ml离心管；

8. 将步骤（3）所述溶液均分为2份，分别倒入C8与C18吸附柱中，缓慢滴下，收集回收溶液；

9. 用酶标仪测量回收溶液的吸光值，计算回收溶液中修饰探针的nmol含量。

10. 取4nmol对应的回收溶液体积，在高效液相色谱上分析，计算修饰染料最大吸收波长下的游离修饰染料峰面积的占比；

11. 表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。核酸探针的在不同吸附柱上的吸附率数据如表1所示，游离染料在不同吸附柱上的吸附量数据如表2所示，各个样品核酸序列如表3所示，数据的计算公式如下：

核酸探针吸附率=（核酸探针的投料量-回收溶液中核酸探针的含量）/核酸探针的投料量

表1

表2

表3

结论：从表1可以看出，C8吸附剂对于短链核酸探针吸附效果尚可，但对于长链核酸探针吸附效果较差；C18吸附剂对于短链、长链核酸探针的吸附效果都比C8吸附剂好，修饰探针吸附率都在95%以上。从表2可以看出，使用C8吸附剂和C18吸附剂吸附，回收液中游离修饰染料的峰面积占比偏差不大，且占比均低于5%，达到预期要求；且相应的C18比C8溶液中游离染料的峰面积占比明显小。综合数据考虑，C18吸附剂为最优选项。

实施例二不同洗脱剂的选择实验

本实施例对洗脱剂的类型进行筛选，考虑到DNA/RNA核酸探针在有机溶剂中的溶解性，实验使用的洗脱剂均为80%有机溶剂+20%超纯水（体积比）的比例液。在相同的实验条件下分别对染料修饰后的核酸探针和游离修饰染料的洗脱效果进行比较。在高效液相色谱上，仍选择修饰染料的最大吸收波长作为检测波长，对比原液与回收溶液中游离修饰染料的峰面积占比，来表征游离修饰染料的残留程度。用酶标仪测量溶液中核酸探针的吸光值再转换成nmol值，计算核酸探针含量。

具体操作如下：

1. 将800nmol含有氨基结构的DNA/RNA核酸探针溶解于800ul pH为8.5的0.5MNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，充分震荡混匀；

2. 用300ul DMF溶剂去溶解2400nmol活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，充分震荡混匀；

3. 将上述混合溶液放入摇床，震荡4-12小时；

5. 在C18吸附柱中加入10ml甲醇溶液，静置5min后缓慢滴下，弃废液；

6. 在C18吸附柱中加入10ml超纯水，缓慢滴下，弃废液；

7. 将步骤（3）所述溶液均分为4份，分别倒入4个C18吸附柱中，缓慢滴下，弃废液；

8. 在4个C18吸附柱的下端口分别放置10ml离心管；

9. 在4个C18吸附柱中分别加入8ml的80%甲醇、80%乙腈、80%乙醇、80%丙醇溶液，缓慢滴下，收集回收溶液

10. 测量回收溶液的吸光值，计算回收溶液中修饰探针的nmol含量。

11. 取4nmol对应的回收溶液体积，在高效液相色谱上分析，计算修饰染料最大吸收波长下的游离修饰染料峰面积的占比；

12. 表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。核酸探针的回收率数据如表4所示，游离染料的峰面积占比数据如表5所示，各个样品核酸序列如表6所示，数据的计算公式如下：

核酸探针回收率=回收溶液中核酸探针的含量/核酸探针的投料量

表4

表5

表6

结论：从表4数据来看，使用80%甲醇洗脱，修饰核酸探针的回收率明显低于80%乙腈、80%乙醇和80%丙醇洗脱；同时从表5数据来看，使用上述四种溶剂洗脱，回收液中游离修饰染料的残留都比较高，超出预期标准，但是使用80%甲醇和80%乙腈洗脱，回收液中游离修饰染料的残留明显低于80%乙醇和80%丙醇洗脱，综合考虑既要尽可能提高染料修饰核酸探针的回收率，又要尽可能降低回收液中游离修饰染料的残留，因此80%乙腈溶液洗脱为本实验的最佳方案。

实施例三不同体积浓度乙腈水溶液洗脱的实验

对于本发明来说，80%乙腈洗脱，回收液中游离修饰染料的残留仍然很高，为验证洗脱溶剂中有机溶剂的含量是否对回收溶液中游离修饰染料的残留有影响，本实施例选择五种含不同比例乙腈的水溶液，在相同的条件下进行洗脱实验。实验中仍选择修饰染料的最大吸收波长作为检测波长，对比原液与回收溶液中游离修饰染料的峰面积占比，来表征游离修饰染料的残留程度。用酶标仪测量溶液中核酸探针的吸光值再转换成nmol值，计算核酸探针含量

具体操作如下；

1. 将1000nmol含有氨基结构的DNA/RNA核酸探针溶解于1000ul pH为8.5的0.5MNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，充分震荡混匀；

2. 用375ul DMF溶剂去溶解3000nmol活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，充分震荡混匀；

3. 将上述混合溶液放入摇床，震荡4-12小时；

6. 在C18吸附柱中加入10ml超纯水，缓慢滴下，弃废液；

7. 将步骤（3）所述溶液均分为5份，分别倒入5个C18吸附柱中，缓慢滴下，弃废液；

8. 在5个C18吸附柱的下端口分别放置10ml离心管；

9. 在5个C18吸附柱中分别加入8ml的1%乙腈、10%乙腈、30%乙腈、50%乙腈、70%乙腈溶液（体积比），缓慢滴下，收集回收溶液1；

10. 更换5个C18吸附柱下端口的10ml离心管；

11. 再在5个C18吸附柱中分别加入8ml的1%乙腈、10%乙腈、30%乙腈、50%乙腈、70%乙腈溶液（体积比），缓慢滴下，收集回收溶液2；

12. 更换5个C18吸附柱下端口的10ml离心管；

13. 再在5个C18吸附柱中分别加入8ml的1%乙腈、10%乙腈、30%乙腈、50%乙腈、70%乙腈溶液（体积比），缓慢滴下，收集回收溶液3；

14. 对5个样品分别测量回收溶液1、回收溶液2、回收溶液3的吸光值，计算回收溶液中修饰探针的nmol含量；

15. 合并回收溶液1、回收溶液2、回收溶液3，取4nmol对应的合并液体体积，在高效液相色谱上分析，计算修饰染料最大吸收波长下的游离修饰染料峰面积的占比；

16. 表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数，核酸探针的回收率数据如表7所示，游离染料的峰面积占比数据如表8所示，各个样品核酸序列如表9所示，数据的计算公式如下：

表7

表8

表9

结论：从表7数据来看，使用1%乙腈溶液洗脱，总的修饰探针回收率偏低，不能达到要求。使用10%乙腈、30%乙腈、50%乙腈和70%乙腈溶液洗脱，总的探针回收率可达97%以上，但是分别从回收液1、回收液2、回收液3中修饰探针的含量来看，回收液3中修饰探针的含量极低，在总回收量中占比极少；从表8数据来看，洗脱液中乙腈的含量对游离修饰染料的残留有很大的影响，乙腈比例越高，游离修饰染料的残留越大。从回收液1的数据值来看，在30%乙腈、50%乙腈和70%乙腈溶液洗脱下，游离修饰染料的残留占比已经超出预期的不高于5%标准。综合考虑既要修饰探针的回收率高又要游离修饰染料的残留少，本实验的最佳方案为使用10%乙腈，洗脱回收两次。

为了进一步优化洗脱剂的浓度，再次使用5%、10%、15%、20%和25%乙腈水溶液进行了比较试验，参照上述试验过程，对上述五个浓度进行了两次洗脱实验比较，将两次洗脱回收液合并计算核酸探针的总回收率，其数据如表10所示，游离染料的峰面积占比数据如表11所示：

表10

表11

测试结果表明使用5%、10%、15%、20%和25%的乙腈溶液洗脱两次核酸探针的总回收率均能达到70%以上，但在使用20%、25%乙腈溶液洗脱时，回收液中游离修饰染料的峰面积占比已经超过5%，超出预期的标准范围，综合考虑核酸探针的回收率和游离修饰染料的残留占比，5-15%乙腈溶液为洗脱剂，可以满足本发明纯化的目的，10%乙腈溶液为洗脱剂效果最优。

实施例四不同类型的活化酯比较试验

为拓展本发明的普遍适应性，在相同的实验条件下分别对不同染料修饰后的核酸探针进行实验，对核酸修饰探针的回收率和游离修饰染料的峰面积占比进行比较。因游离修饰染料的最大吸收波长与染料修饰核酸探针的染料最大吸收波长一致，在高效液相色谱上，选择修饰染料的最大吸收波长作为检测波长，对比原液与回收溶液中游离修饰染料的峰面积占比，来表征游离修饰染料的去除程度。用酶标仪测量溶液中核酸探针的吸光值再转换成nmol值，计算核酸探针含量。

具体实验方案如下：

1. 将200nmol含有氨基结构的DNA/RNA核酸探针溶解于200ul pH为8.5的0.5MNa₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中，充分震荡混匀；

2. 用75ul DMF溶剂去溶解600nmol活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，充分震荡混匀；

3. 将上述混合溶液放入摇床，震荡4-12小时；

6. 在C18吸附柱中加入10ml超纯水，缓慢滴下，弃废液；

7. 将步骤（3）所述溶液倒入C18吸附柱中，缓慢滴下，弃废液；

8. 在C18吸附柱的下端口放置10ml离心管；

9. 在C18吸附柱中加入8ml的10%乙腈，缓慢滴下，收集回收溶液1

10. 更换C18吸附柱下端口的10ml离心管

11. 在C18吸附柱中加入8ml的10%乙腈，缓慢滴下，收集回收溶液2

12. 合并回收溶液1、回收溶液2，测吸光值，计算回收溶液中修饰探针的nmol含量；

13. 取4nmol对应的合并溶液体积，在高效液相色谱上分析，计算修饰染料最大吸收波长下的游离修饰染料峰面积的占比

14. 表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数，核酸探针的回收率数据如表12所示，游离染料的峰面积占比数据如表13所示，各个样品核酸序列如表14所示，数据的计算公式如下：

表12

表13

表14

结论：从实验数据可以看出，本发明对于DNA/RNA核酸探针中不同类型游离修饰染料的残留去除都有较好的效果，特别是对于ROX、TXR、TAM的残留去除效果比CY3、CY5、CY5.5、CY7更好。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims

1.染料修饰后的核酸探针纯化方法，其特征在于，所述方法通过吸附剂与游离修饰染料和染料修饰后的核酸探针的非极性官能团之间的作用力，将过量的游离修饰染料和所述染料修饰后的核酸探针保留在吸附剂上，然后用含有机溶剂的水溶液洗脱含吸附剂的柱子，利用所述游离修饰染料与所述染料修饰后的核酸探针之间的极性差异，将所述染料修饰后的核酸探针选择性地从吸附剂上洗脱下来，而所述游离修饰染料保留在吸附剂上，以纯化所述染料修饰后的核酸探针；所述吸附剂是C18吸附柱，所述含有机溶剂的水溶液中乙腈所占体积是5-15%。

2.根据权利要求1所述的核酸探针纯化方法，其特征在于，所述含有机溶剂的水溶液中乙腈所占体积是10%。

3.根据权利要求1所述的核酸探针纯化方法，其特征在于，用所述含有机溶剂的水溶液洗脱二次。

4.根据权利要求1所述的核酸探针纯化方法，其特征在于，所述修饰染料是ROX、TXR、TAM、CY3、CY5、CY5.5或CY7。

5.根据权利要求1所述的核酸探针纯化方法，其特征在于，所述核酸探针是DNA核酸探针或RNA核酸探针。