WO2018087093A1 - Stationäre phase zur detektion eines bestimmten analyten in einem gemisch, verwendungen hiervon und verfahren zur detektion eines bestimmten analyten in einem gemisch - Google Patents

Stationäre phase zur detektion eines bestimmten analyten in einem gemisch, verwendungen hiervon und verfahren zur detektion eines bestimmten analyten in einem gemisch Download PDF

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WO2018087093A1
WO2018087093A1 PCT/EP2017/078492 EP2017078492W WO2018087093A1 WO 2018087093 A1 WO2018087093 A1 WO 2018087093A1 EP 2017078492 W EP2017078492 W EP 2017078492W WO 2018087093 A1 WO2018087093 A1 WO 2018087093A1
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zone
stationary phase
fret
solid phase
oligonucleotide
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PCT/EP2017/078492
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Dr. Ralph SPERLING
Dr. Ralf Himmelreich
Dr. Tobias SCHUNCK
Dr. Raphael THIERMANN
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Definitions

  • Stationary phase for detecting a particular analyte in a mixture uses thereof, and method for detecting a particular analyte in a mixture
  • a stationary phase for the detection of at least one particular analyte in a mixture is presented.
  • the stationary phase contains a divided into several zones solid phase for the transport of liquid via capillary force.
  • the solid phase contains at least a first zone suitable for receiving a liquid sample, a second zone on which a receptor is immobilized, wherein the receptor is suitable for binding a ligand, and a third zone on which quantum dots are immobilized which function as a FRET donor and are linked via at least one oligonucleotide linker to at least one suitable FRET acceptor.
  • the stationary phase has improved detection sensitivity and allows simultaneous and multiparameter detection of a wide variety of analytes. Uses of the stationary phase are proposed and Furthermore, a method for the detection of at least one particular analyte in a mixture presented.
  • Quantum dots are fluorescent colloidal particles composed of inorganic semiconductor materials.
  • the fluorescence properties result from the bandgap of the material as well as the particle size in the range of a few nanometers ("quantum confinement effect") .
  • the surface of the QDs is usually coated with a layer of organic molecules, which
  • other molecules, especially biomolecules can be chemically covalently coupled to the QDs through different strategies, or chemisorbed onto the inorganic surface of the QDs, displacing the original stabilizer molecules, thus rendering the QDs non-functional only as optically active species, but also serve as carrier particles for other (bio-) molecular species or functionalities.
  • Fluorescence resonance energy transfer also known as Förster resonance energy transfer (“FRET” for short), denotes a non-radiative transfer of energy from one excited species (FRET donor, eg a fluorescent molecule or QD) to another (FRET acceptor)
  • FRET donor eg a fluorescent molecule or QD
  • FRET acceptor Förster resonance energy transfer
  • the acceptor transitions into an excited state from which it can possibly emit a photon (fluorescence), while the donor leaves its excited state without emitting a photon (quenching)
  • FRET donor eg a fluorescent molecule or QD
  • FRET acceptor Förster resonance energy transfer
  • a stationary phase e.g., for lateral flow strips
  • a particular analyte in a mixture which has high detection sensitivity and multiparametric detection of multiple analytes simultaneously, i. in one application step.
  • a stationary phase for detecting a particular analyte in a mixture.
  • the stationary phase contains a divided into several zones solid phase for the transport of liquid via capillary force, wherein the solid phase at least
  • a) contains a first zone which is suitable for receiving a liquid sample; contains a second zone on which a receptor for attachment of an antibody and / or an aptamer is immobilized;
  • the quantum dot contains a third zone, are immobilized on the quantum dot as a FRET donor, wherein the quantum dots are each connected via at least one oligonucleotide linker with at least one FRET acceptor.
  • the stationary phase according to the invention allows the binding of an antibody and / or an aptamer for the specific binding of the particular analyte to be detected.
  • a reaction solution containing stoichiometric complexes of antibody / aptamer and an analyte-nuclease conjugate can now be used.
  • an amount of analyte-nuclease conjugate proportional to the amount of analyte in the test sample is thereby released and is no longer bound to the antibody or aptamer. Consequently, this amount of certain analyte will also not be bound to the second zone as the liquid sample flows from the first zone to the second zone. Thus, this amount of certain analyte reaches the third zone where the analyte-bound nuclease cuts the oligonucleotide linker between FRET donor and FRET acceptor, thus destroying the FR ET effect. Consequently, it is possible to detect the presence of the particular analyte to be detected by means of the stationary phase according to the invention and FRET spectroscopy.
  • the nuclease-catalyzed cleavage of the oligonucleotide linker causes an enzymatic amplification of the detection signal and thus a high detection sensitivity.
  • the stationary phase according to the invention is inexpensive to provide.
  • the quantum dots are each connected via a plurality of oligonucleotide linkers with a plurality, preferably at least two, more preferably at least five, in particular at least 10 (preferably identical), FRET acceptors.
  • a plurality preferably at least two, more preferably at least five, in particular at least 10 (preferably identical), FRET acceptors.
  • the solid phase for transporting liquid via capillary force is preferably a solid phase for transporting an aqueous liquid via capillary force.
  • a capillary ascension in the transport direction is effected.
  • the solid phase wetting properties which improves a transport of the liquid phase (eg an aqueous liquid) via capillary forces.
  • these are preferably hydrophilic properties.
  • the solid phase (eg the solid phase of a lateral flow strip) may have hydrophobic properties (eg hydrophobic areas) at least in some areas in order to prevent the transport of an aqueous liquid in the transport direction in at least one direction other than the transport direction.
  • hydrophobic properties eg hydrophobic areas
  • the solid phase at least partially parallel to the transport direction strip-shaped hydrophobic regions contains (eg via a strip-like wetting of the solid phase with a hydrophobic substance, such as wax).
  • strip-shaped hydrophobic areas constitute a barrier for the aqueous liquid and thus permit transport of the aqueous liquid in a plurality of separate webs along the transport direction.
  • the solid phase contains or consists of a plurality of contacting particles and / or fibers.
  • the particles and / or fibers may in this case form intermediate spaces which have a maximum extent in all spatial directions of less than 1 mm, preferably less than 100 ⁇ m, particularly preferably less than 10 ⁇ m.
  • the solid phase is selected from the group consisting of solid phase of a lateral flow strip, solid phase in a chamber and / or in a channel (eg a capillary, a tube and / or a column) of a microfluidic chip, solid phase of a chromatography column and combinations thereof.
  • the dimensions of the chamber and / or the channel of the microfluidic chip in a direction perpendicular to the transport direction are preferably less than 10 mm, particularly preferably less than 1 mm, in particular less than 100 ⁇ m. More preferably, the solid phase is the solid phase of a lateral flow strip.
  • the solid phase can be selected from the group consisting of solid phase of a lateral flow strip, solid phase in a chamber and / or in a channel (eg a capillary, a tube and / or a column) of a microfluidic chip, solid phase of a chromatography column and combinations thereof.
  • inorganic particles preferably contain or consist of inorganic particles and / or an inorganic fiber, preferably selected from the group consisting of aluminum oxide, glass fiber, mineral wool fiber, rockwool fiber and mixtures thereof; and or
  • ii) contain or consist of organic particles and / or an organic pulp, preferably selected from the group consisting of polymer particles, polymer pulps and mixtures thereof, more preferably cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose, polyvinylidene fluoride, nylon, nylon derivatives, polyethersulfone, carbon nanotubes and mi about this.
  • the first zone of the solid phase can be
  • the second zone of the solid phase may be arranged next to the first zone on the stationary phase, the transport of liquid via capillary force optionally in at least one direction, preferably in at least two directions at an angle of 180 ° to each other, at the surface of the second Zone is blocked, in particular by at least one edge of the stationary phase and / or a wall of the second zone contacting component (eg, the wall of a lateral flow strip, a mikrofluisichen chip and / or a chromatography column).
  • the receptor immobilized on the second zone can
  • i) be chemically covalently bound to the solid phase; and / or ii) be bonded to the solid phase via noncovalent bonds, preferably via noncovalent bonds selected from the group consisting of ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals interactions, hydrophobic effect, chelate bonds, thiol-gold bonds,
  • Bindings and combinations thereof more preferably via non-binding covalent bonds selected from the group consisting of antigen-antibody binding, ligand-aptamer binding, biotin-streptavidin binding, HisTag, Ni-NTA binding, and combinations thereof; and / or iii) contain or consist of biotin or derivatives thereof; and / or iv) contain or consist of streptavidin or derivatives thereof.
  • the third zone can be any one of the first zone.
  • Directions is blocked at the surface of the third zone, in particular by at least one edge of the stationary phase and / or a wall of a third zone contacting component (eg the wall of a LateralhnestMails, a mikrofluisichen chip and / or a chromatography column); or
  • a first and a second end of the stationary phase preferably in the middle of the stationary phase, wherein the transport of liquid via capillary force optionally in at least one direction, preferably at least two at an angle of 180 ° to one another directions, is blocked on the surface of the first zone, in particular by at least one edge of the stationary phase and / or a wall of a third zone contacting component (eg the wall of a lateral flow strip, a mikrofluisichen chip and / or a chromatography column).
  • a third zone contacting component eg the wall of a lateral flow strip, a mikrofluisichen chip and / or a chromatography column.
  • the third zone is subdivided into a plurality of spatially separated subzones, and quantum dots are immobilized on each of these subzones as FRET donors, which are connected via an oligonucleotide linker to at least one FRET acceptor, whereby the oligonucleotide Linker of each subzone has a specific for a particular endonuclease cleavage site and the specific for a particular endonuclease cleavage site is different for all U.
  • the simultaneous detection of a large number of very different analytes is made possible (eg via the coupling of the various analytes to be detected to different analytes) Endonucleases, each of the different endonucleases being specific for an interface found only in a particular subzone).
  • This embodiment is also advantageous because, in addition to the particular analyte, marker molecules (eg certain proteins of pathogenic and harmless bacteria) can be detected simultaneously and the
  • Marker molecules can thus serve as a kind of internal standard.
  • multiparametric detection is spatially resolved using the same fluorescent species.
  • the detection of different species may be by spectral multiplexing, i. each analyte will have its own FRET
  • Pair associated which can then be detected in a mixture by its distinguishable fluorescence emission.
  • the quantum dots may contain or consist of a material selected from the group consisting of II-VI semiconductors, III-V semiconductors,
  • the oligonucleotide linker can be any suitable oligonucleotide linker.
  • a) have a specific for a particular endonuclease cleavage site
  • the first, second, third and / or fourth single-stranded oligonucleotide can be any single-stranded oligonucleotide.
  • i) have a length in the range of 5 to 100 base pairs; and / or ii) have an interface specific for a particular endonuclease; and or
  • the second single-stranded oligonucleotide is at least partially hybridized with the first oligonucleotide
  • the third single-stranded oligonucleotide at least partially hybridized with the second oligonucleotide and / or the fourth single-stranded oligonucleotide at least partially hybridized with the third oligonucleotide.
  • the specific endonuclease-specific site may be located at the first, second, third, and / or fourth single-stranded oligonucleotide.
  • the oligonucleotide linker may contain or consist of an oligonucleotide selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA, CeNA, NP, tcDNA, xDNA, hybrids thereof, and mixtures thereof.
  • the solid phase may contain a control enzyme zone, which is preferably located between the first zone and the second zone, with a particular control endonuclease immobilized on the control enzyme zone, which is preferably bound to the solid phase via non-covalent interactions.
  • the solid phase may contain a control oligonucleotide zone, which is preferably located between the second zone and a liquid wicking zone, with a quantum dot immobilized on the control oligonucleotide zone as a FRET donor connected to at least one FRET donor via at least one oligonucleotide linker wherein the oligonucleotide linker preferably has an interface specific for a particular control endonuclease.
  • the solid phase may include a liquid suction zone preferably located at a second stationary phase end, wherein the suction zone preferably contains or consists of a suction pad ("suction pad").
  • the second zone, the control enzyme zone, the third zone and / or the control oligonucleotide zone may be between a first and a second
  • the transport of liquid via capillary force optionally in at least one direction, preferably in at least two at an angle of 180 ° to each other standing directions the surface of the zone is blocked, in particular by at least one edge of the stationary phase and / or a wall of the zone (or zones) contacting component (eg the wall of a lateral flow strip, a micro fluidic chip and / or a chromatography column ).
  • the invention further provides a kit for detecting a particular analyte in a mixture comprising at least one stationary phase according to the invention and a reaction solution, wherein the reaction solution a) contains a nuclease, wherein the nuclease chemically to at least one particular analyte and / or at least one determined
  • Analyte is bound to analogous molecule; and b) contains an antibody and / or an aptamer, wherein the antibody and / or the aptamer are adapted to bind the at least one particular analyte;
  • nuclease is fully in a complex with the antibody and / or the aptamer.
  • the binding of the nuclease to the at least one particular analyte (or an analyte-analog molecule) may be via non-covalent chemical interactions (eg, non-covalent bonds selected from the group consisting of ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals interactions , hydrophobic effect, chelate bonds, thiol-gold bonds, and combinations thereof, preferably selected from the group consisting of antigen-antibody binding, ligand-aptamer binding, biotin-streptavidin binding, HisTag, Ni-NTA binding and combinations thereof) or a chemically covalent bond.
  • the bond is a chemically covalent bond.
  • reaction solution a mixture that might contain the at least one particular analyte
  • step f comparing the FRET signal measured in step d) and step e); and g) determining the presence of the particular analyte in the mixture based on the difference determined in step f).
  • the comparison of the FRET signal measured in step d) and step e) in step f) can be done once at the end of the process (end point measurement) and / or can be repeated until the end of the process, i. at different times to accommodate the kinetics of the evolution of the FRET signal.
  • the binding of the nuclease to the at least one specific analyte is governed by non-covalent chemical interactions (eg non-covalent bonds selected from the group consisting of ionic bonds, hydrogen bonds, vanadium). der Waals interactions, hydrophobic effect, chelate bonds, thiol-gold bonds, and combinations thereof, preferably selected from the group consisting of antigen-antibody binding, ligand-ateramer binding, biotin-streptavidin binding, HisTag, Ni-NTA - Binding and combinations thereof) or a chemically covalent bond can be configured.
  • the bond is a chemically covalent bond.
  • a stationary phase according to the invention for the detection of at least one particular analyte in a mixture by means of FRET spectroscopy is proposed.
  • anchor group e.g., biotin
  • Receptor e.g., streptavidin
  • nuclease (endonuclease or exonuclease)
  • reaction solution Reaction solution with nuclease analyte antigen / aptamer complex 13: Addition of analyte (s) to be determined to the reaction solution
  • suction zone (contains, for example, a suction pad)
  • Figure 1 shows an antibody 1 (or an aptamer) chemically linked (e.g., via a covalent bond) to an anchor group 2 (e.g., biotin). Further, a receptor 3 (e.g., streptavidin) is shown, on the second
  • Zone 4 of the solid phase is immobilized.
  • Figure 1 shows a nuclease 5 (e.g., an endonuclease or exonuclease) chemically bound (e.g., via a covalent linkage) to the analyte 6 (or a molecule analogous thereto).
  • the free analyte to be determined 7 is shown.
  • the reference symbols for the symbol shown in FIG. 1 also apply to FIGS. 2 to 4.
  • FIG. 2 shows schematically an embodiment of the method according to the invention.
  • an addition 13 of analyte (s) to be determined takes place.
  • the reaction solution is applied to the first zone of the stationary phase solid phase 22.
  • Capillary forces transport the liquid reaction solution along the stationary phase, with the molecules contained in the reaction solution passing through the second zone 4 of the solid phase.
  • all antibodies / aptamers and molecules bound thereto are immobilized so that only nuclease-analyte complexes not bound to antibody / aptamer can reach the third zone 11 of the solid phase.
  • FIG. 3 shows a further embodiment of the method according to the invention.
  • reaction solution 12 three different analytes 6, 16, 17 to be determined are added to the reaction solution 12, the reaction solution containing for each of the analytes to be determined a corresponding stoichiometric complex of nuclease analyte and the antibody / aptamer.
  • the reaction solution is applied to the first phase 18 of the stationary phase.
  • the capillary forces transport the liquid reaction solution along the stationary phase, the molecules contained in the reaction solution first passing through a control enzyme zone 21 before they to the second zone 4 of the fixed
  • each subzone it is sufficient, for example, for each subzone to have an oligonucleotide linker with a specific interface which can be cut either only by the nuclease of the first analyte 6, the nuclease of the second analyte 16 or the nuclease of the third analyte 17. If one of the specific analytes 6, 16, 17 with its specific nuclease strikes this sub-zone, the light emission 14 disappears in the case of FRET (eg emission of red light) and a light emission occurs in this sub-zone without FRET (eg emission of green light ). This change in the emission wavelength of the light can be read out separately for each subzone of the third zone 11 ' .
  • the stationary phase also contains a control oligonucleotide zone 19 and a suction zone (eg contains a suction pad).
  • FIG. 4 shows a possible connection of a quantum dot 10 (FRET).
  • oligonucleotide linker via an oligonucleotide linker to a FRET acceptor 8.
  • the first single-stranded oligonucleotide 25 is hybridized with a second single-stranded oligonucleotide 26, the second single-stranded oligonucleotide 26 having an anchoring group 24 for anchoring the third zone.
  • the first site 28 may be encoded for a nuclease.
  • a third single-stranded oligonucleotide 27 is hybridized to the second single-stranded oligonucleotide 26, wherein here optionally a second interface 29 may be encoded for a nuclease.
  • the third single-stranded oligonucleotide 27 carries the FRET acceptor 8 and places it in close proximity to the Quantum Dot 10 (FRET donor).
  • FRET donor Quantum Dot 10
  • Example 4 also shows what the structure after cleavage 30 of the oligonucleotide linker looks like by the action of the nuclease. It becomes clear that the FRET acceptor 8 after cleavage is no longer located in the immediate vicinity of the quantum dot 10 (FRET donor) and thus no more FRET can take place.
  • FRET donor quantum dot 10
  • sample a mixture that might contain the analyte of interest
  • sample a mixture that might contain the analyte of interest
  • reaction solution containing biotin-modified antibodies and antigen-nuclease conjugates, where the antibodies are directed against the antigen and at least one antigen is desired All antigen-nuclease conjugates of the reaction solution are in an antibody-bound state (ie complexed with antibody), and upon addition of the sample a competitive binding reaction occurs: In the presence of a structurally identical antigen
  • Analytes in the sample are partially displaced from the antibody-bound antigen-nuclease conjugates from the antibody and are now free in the reaction solution.
  • the mixed with the mixture reaction solution is then applied to the first zone of the stationary phase.
  • the dissolved molecules are driven by capillary force - optionally via a control enzyme zone - to the second zone of the stationary phase ("capture zone”) .
  • capture zone On the second zone a receptor (here: streptavidin) is immobilized for attachment of a biotinylated
  • Antibody is suitable (streptavidin-biotin binding). Consequently, in the biotinylated antibodies (and the antigen-nuclease conjugates bound to them) bound via the biotin-streptavidin bond in the second zone and can not move further towards the third zone of the stationary phase. Only the particular ones previously released by competitive interaction
  • Antigen nuclease conjugates ie, those antigen-nuclease conjugates whose antigen is structurally analogous or identical to the analyte, are further transported by capillary force to the third zone of the stationary phase ("detection zone").
  • the analyte-nuclease conjugate to the third zone of the oligonucleotide linker is cleaved by the enzymatic action of the nuclease. This causes specific by the Brownian molecular motion and driven by capillary flow to the spatial proximity between FRET Donor and FRET acceptor is lost.
  • the FRET between the QD as FRET donor and its FRET acceptor comes to a standstill, resulting in a positive signal over FRET spectroscopy can be read.
  • the signal is read out via a lateral flow reader with imaging and spectrally resolved fluorescence detection. This can be done with a spectrometer, but also with two color filters.
  • nuclease molecule can cause several or many cleavage reactions, thereby resulting in a cleavage reaction
  • the oligonucleotide linker contains a specific restriction endonuclease cleavage site, it is ideally located in the middle of the complementary base pairs. In the event that the restriction endonuclease cuts the oligonucleotide double strand with overhanging ends, the
  • An oligonucleotide linker of the invention between the QD as a FRET donor and the FRET acceptor may be composed of two single-stranded oligonucleotides.
  • the single-stranded oligonucleotides are hybridized with each other at least in certain regions. If the two oligonucleotides contain a specific restriction endonuclease cleavage site, this will be within the hybridized region.
  • first a first single-stranded oligonucleotide (“binding oligonucleotide”) is bound via an anchor group to the surface of a QD (eg via the 3 ' end of the oligonucleotide) .
  • the first single-stranded oligonucleotide contains a spacer sequence S (eg on 3 ' - end) and a linker sequence L (eg at the 5 ' end)
  • linker sequence L of the first single-stranded oligonucleotide is then a second single-stranded oligonucleotide (“linker oligonucleotide") via its linker sequence L ' (For example, at the 3 ' end of the second oligonucleotide) hybridized.
  • the second single-stranded oligonucleotide also has an interface sequence A (for example, at the 5 ' end of the second oligonucleotide), which for a particular
  • a third single-stranded oligonucleotide (“reporter oligonucleotide”) is then hybridized to the interface sequence A of the second oligonucleotide via its interface sequence A ' (eg at the 3 ' end of the third oligonucleotide.)
  • the third single-stranded oligonucleotide has (eg chemically covalently bonded) the FRET acceptor
  • a fluorescent dye on (eg at the 5 ' end of the third oligonucleotide).
  • oligonucleotide linker oligonucleotide and the reporter oligonucleotide a specificity of the oligonucleotide linker for particular restriction endonucleases can be introduced in a flexible manner. Due to the Y geometry of the oligonucleotide linker, the oligonucleotide sequence to be cut by the enzyme is sterically accessible and the dye is as close as possible to the QD to allow high FRET efficiency.
  • oligonucleotide linker simplifies the preparation and optimization of the individual components and allows a whole range of possible variants.
  • fourth oligonucleotide is attached, which is not cut by the nuclease and the immobilization of the QD in the third zone on the solid phase of the stationary phase mediates (eg via chemical covalent binding of Biotin to the fourth oligonucleotide when the solid phase of the third zone comprises the stationary phase immobilized streptavidin).
  • linker oligonucleotides described above via which the FRET acceptor is attached to the surface of the QD, these can additionally be equipped with other oligonucleotides or other suitable molecules in order to obtain further functionalities (eg further chemical anchor groups, eg for the immobilization ) or to increase the stability of the QD-FRET system.
  • Quantum dots are colloidal semiconductor nanoparticles with fluorescence properties. These are used for the inventive use via an oligonucleotide linker (preferably a sequence-specific nucleases cleavable oligonucleotide linker) with a FRET acceptor (eg, a fluorescent dye molecule).
  • a FRET acceptor eg, a fluorescent dye molecule
  • the FRET acceptor is selected such that the fluorescence excitation of the QD is transferred to it via Förster resonance energy transfer (FRET).
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • a fluorescent dye molecule can be used as the FRET acceptor, which emits red light through the QD in FRET.
  • a FRET acceptor a so-called “quencher” can be used which does not emit itself, but weakens the intensity of the QD's fluorescence emission to completely suppressed, in which case FRET does not emit emission at the emission wavelength of the QD (eg, green light).
  • the conjugation of the QD via the oligonucleotide linker to the FRET acceptor is preferably carried out chemically covalently.
  • each subzone may have a specific oligonucleotide linker which can only be cut by a particular restriction endonuclease and thus only by this particular antigen-nuclease combination in the Subzone a signal is generated.
  • the specific for the respective nuclease sequence is usually from about three base pairs, the cut can be made depending on the selected enzyme smooth or offset.

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Abstract

Es wird eine stationäre Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft. Die feste Phase enthält mindestens eine erste Zone, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist, eine zweite Zone, auf der ein Rezeptor immobilisiert ist, wobei der Rezeptor zur Bindung von einem Liganden geeignet ist und eine dritte Zone, auf der Quantum Dots immobilisiert sind, die als FRET- Donor funktionieren und über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem geeigneten FRET-Akzeptor verbunden sind. Die stationäre Phase weist eine verbesserte Detektionssensitivität auf und erlaubt eine gleichzeitige und multiparametrische Detektion verschiedenster Analyten. Verwendungen der stationären Phase werden vorgeschlagen und ferner ein Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt.

Description

FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT...e.V.
179PCT 2704
Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, Verwendungen hiervon und Verfahren zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch
Es wird eine stationäre Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft. Die feste Phase enthält mindestens eine erste Zone, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist, eine zweite Zone, auf der ein Rezeptor immobilisiert ist, wobei der Rezeptor zur Bindung von einem Liganden geeignet ist und eine dritte Zone, auf der Quantum Dots immobilisiert sind, die als FRET-Donor funktionieren und über mindestens einen Oligonukleotid- Linker mit mindestens einem geeigneten FRET-Akzeptor verbunden sind. Die stationäre Phase weist eine verbesserte Detektionssensitivität auf und erlaubt eine gleichzeitige und multiparametrische Detektion verschiedenster Analyten. Verwendungen der stationären Phase werden vorgeschlagen und ferner ein Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch vorgestellt.
Stationäre Phasen, beispielsweise solche von Lateralflussstreifen (engl.:„Late- ral Flow Strips") sind bereits seit Jahrzehnten bekannt. Das Problem bekannter stationärer Phasen von Lateralflussstreifen ist, dass sie für die Detektion mancher Analyten nicht sensitiv genug sind. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurde unter anderem versucht, die in diesen stationären Phasen als Reporterpartikel enthaltenen Gold-Nanopartikel durch andere Partikelarten zu ersetzen. Bekannt ist es, statt der Gold-Nanopartikel sog. „Quantum Dots"
(kurz: „QD"), „nanophosphors", Kohlenstoffnanopartikel und/oder Magnet- partikel einzusetzen.
Quantum Dots sind fluoreszierende kolloidale Partikel, die aus anorganischen Halbleitermaterialien bestehen. Die Fluoreszenzeigenschaften ergeben sich aus der Bandlücke des Materials sowie der Partikelgröße im Bereich einiger Nanometer („quantum confinement effect"). Um sie in ihrem flüssigen Trägermedium stabil zu halten, ist die Oberfläche der QDs in der Regel mit einer Schicht organischer Moleküle überzogen, die für sterische oder elektrostatische Abstoßung sorgt. Weitere Moleküle, insbesondere Biomoleküle, lassen sich über unterschiedliche Strategien chemisch kovalent an die QDs koppeln, oder durch Chemisorption an die anorganische Oberfläche der QDs binden und dabei die ursprünglich vorhandenen Stabilisatormoleküle verdrängen. Auf diese Weise dienen die QDs nicht nur als optisch aktive Spezies, sondern dienen auch als Trägerpartikel für weitere (bio-)molekulare Spezies bzw. Funktionalitäten.
Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer, auch Förster-Resonanzenergietransfer (kurz:„FRET"), bezeichnet einen nichtstrahlenden Energieübertrag von einem angeregten Spezies (FRET-Donor, z.B. ein fluoreszierendes Molekül oder QD) auf ein anderes (FRET-Akzeptor). Bei diesem Energieübertrag geht der Akzeptor seinerseits in einen angeregten Zustand über, aus dem er ggf. ein Photon emittieren kann (Fluoreszenz), während der Donor seinen angeregten Zustand verlässt, ohne ein Photon emittiert zu haben (Quenching). Notwendig für ei- nen solchen resonanten Übertragungsprozess ist ein spektraler Überlapp zwischen Donor-Emission und Akzeptor-Absorption, sowie eine örtliche Nähe zwischen Donor und Akzeptor. Die Effizienz des Ubertrages fällt mit der sechsten Potenz des Abstandes ab, so dass u.a. molekulare Konformationsänderungen mit diesem Prozess beobachtet werden können, was sich für biologische Nachweisreaktionen auf vielfältige Weise ausnutzen lässt.
Neben einer Veränderung der Reporterpartikel wurde zur Erhöhung der De- tektionssensitivität von Lateralflussstreifen versucht, ein anderes Detektions- verfahrens einzusetzen. Bei den ursprünglichen stationären Phasen der Late- ralflusstreifen wurde noch einfach visuell das molekulare Bindungsereignis abgelesen. Später kamen hierfür Fluoreszenzdetektoren und Resonanz- Spulen-Magnetometer zum Einsatz.
Neben der Änderung der Art der Partikel und des Detektionsverfahrens ist im Stand der Technik bekannt, die Detektionssensitivität durch den Einsatz von Enzymen zu erhöhen, welche die Bildung eines Farbstoffs katalysieren.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine stationäre Phase (z.B. für Lateralflussstreifen) zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitzustellen, die eine hohe Detektionssensitivität und eine multiparametrische Detektion von mehreren Analyten gleichzeitig, d.h. in einem Anwendungsschritt, ermöglicht.
Die Aufgabe wird gelöst durch die stationäre Phase mit den Merkmalen von Anspruch 1, das Kit mit den Merkmalen von Anspruch 16, das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 17 und die Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 18. Die abhängigen Ansprüche zeigen bevorzugte Ausgestaltungsformen auf.
Erfindungsgemäß wird eine stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt. Die stationäre Phase enthält eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft, wobei die feste Phase mindestens
a) eine erste Zone enthält, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist; eine zweite Zone enthält, auf der ein Rezeptor zur Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer immobilisiert ist; und
eine dritte Zone enthält, auf der Quantums Dot als FRET-Donor immobilisiert sind, wobei die Quantum Dots jeweils über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind.
Die erfindungsgemäße stationäre Phase erlaubt die Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer zur spezifischen Bindung des zu detek- tierenden, bestimmten Analyten. Zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch kann nun eine Reaktionslösung verwendet werden, die stö- chiometrische Komplexe aus Antikörper/Aptamer und einem Analyt- Nuklease-Konjugat enthält. Unter Analyt-Nuklease-Konjugat werden auch solche Konjugate verstanden, bei denen die Nuklease - optional über einen Spacer - an ein Moleküle gebunden ist, das im Wesentlichen die Struktur des Analyten aufweist, wobei damit gemeint ist, dass der zu bestimmende Analyt dazu geeignet ist, den Komplex aus Antikörper/Aptamer und dem Analyt- Nuklease-Konjugat zu dissoziieren. Wird dieser Reaktionslösung nun eine Testprobe zugegeben, die den bestimmten Analyten enthält (= flüssige Probe), so dissoziiert der freie flüssige Analyt den Komplex aus Antikörper/Aptamer und dem Analyt-Nuklease-Konjugat (kompetitive Verdrängungsreaktion).
Mit anderen Worten wird dadurch eine zu der Menge an bestimmten Analyt in der Testprobe proportionale Menge an Analyt-Nuklease-Konjugat freigesetzt und ist nicht mehr an den Antikörper bzw. das Aptamer gebunden. Folglich wird diese Menge an bestimmten Analyt auch nicht an der zweiten Zone gebunden, wenn die flüssige Probe von der ersten Zone zur zweiten Zone strömt. Folglich erreicht diese Menge an bestimmten Analyt die dritte Zone, in der die an den Analyt gebundene Nuklease den Oligonukleotid-Linker zwischen FRET-Donor und FRET-Akzeptor schneidet und damit den FR ET- Effekt zerstört. Folglich gelingt der Nachweis über die Gegenwart des zu detektie- renden, bestimmten Analyten mithilfe der erfindungsgemäßen stationären Phase und FRET-Spektroskopie. Ferner wird betont, dass die Nuklease-katalysierte Spaltung des Oligonukleotid-Linkers eine enzymatische Amplifikation des Detektionssignals und damit eine hohe Detektionssensitivität bewirkt. Zudem ist die erfindungsgemäße stationäre Phase kostengünstig bereitstellbar.
Darüberhinaus ergibt sich die Möglichkeit zur multiparametrischen Detektion: Im Falle eines selbst fluoreszierenden FRET-Akzeptors verschiebt sich im Falle eines positiven Signals die emittierte Strahlung von höherer zu niedrigerer Wellenlänge (Blauverschiebung der Fluoreszenz durch die Aufhebung des FRET-Effektes). Im Falle eines reinen, d.h. nicht emittierenden„Quenchers" als FRET-Akzeptors ist keine Blauverschiebung zu beobachten, sondern lediglich ein Anstieg der Fluoreszenz im Bereich der Emissionswellenlänge des FRET-Donors. Die Verwendung eines emittierenden Fluoreszenzfarbstoffs ist hierbei von Vorteil, da durch eine ratiometrische Detektion das Verhältnis von Donor- zu Akzeptorkonzentration direkt bestimmt werden kann, was eine robustere quantitative Detektion ermöglicht.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform sind die Quantum Dots jeweils über mehrere Oligonukleotid-Linker mit mehreren, bevorzugt mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens fünf, insbesondere mindestens 10 (bevorzugt identischen), FRET-Akzeptoren verbunden. Eine höhere Anzahl an FRET- Akzeptoren pro einzelnem Quantum Dot hat den Vorteil, dass die Signalstärke zunimmt (höhere Sensitivität) und sich das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.
Die feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft ist bevorzugt eine feste Phase zum Transport einer wässrigen Flüssigkeit über Kapillarkraft. In diesem Fall wird beim Einsatz einer wässrigen Flüssigkeit (als mobile Phase) eine Kapillaraszension in die Transportrichtung bewirkt. Besonders bevorzugt weist die feste Phase Benetzungseigenschaften auf, die einen Transport der flüssigen Phase (z.B. einer wässrigen Flüssigkeit) über Kapillarkräfte verbessert. Im Falle einer wässrigen Flüssigkeit sind dies bevorzugt hydrophile Eigenschaften. Die feste Phase (z.B. die feste Phase eines Lateralflussstreifens) kann jedoch zumindest bereichsweise hydrophobe Eigenschaften (z.B. hydrophobe Bereiche) aufweisen, um den Transport einer wässrigen Flüssigkeit in die Transportrichtung in mindestens einer anderen Richtung als der Transportrichtung zu vermeiden. So ist beispielsweise denkbar, dass die feste Phase zumindest bereichsweise parallel zur Transportrichtung streifenförmige hydrophobe Bereiche enthält (z.B. über eine streifenförmige Benetzung der festen Phase mit einer hydrophoben Substanz, wie z.B. Wachs). Diese streifenförmigen hydrophoben Bereiche stellen für die wässrige Flüssigkeit eine Barri- ere dar und ermöglichen somit einen Transport der wässrigen Flüssigkeit in mehreren, voneinander getrennten Bahnen entlang der Transportrichtung.
In einer bevorzugten Ausgesta Itu ngsfo rm enthält die feste Phase eine Vielzahl von sich kontaktierenden Partikeln und/oder Fasern, oder besteht daraus. Die Partikel und/oder Fasern können hierbei Zwischenräume ausbilden, die eine maximale Ausdehnung in alle Raumrichtungen von weniger als 1 mm, bevorzugt weniger als 100 μηι, besonders bevorzugt weniger als 10 μηι, aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltungsform ist die feste Phase ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus feste Phase eines Lateralflussstreifens, feste Phase in einer Kammer und/oder in einem Kanal (z.B. einer Kapillare, eines Rohrs und/oder einer Säule) eines mikrofluidischen Chips, feste Phase einer Chromatographie-Säule und Kombinationen hiervon. Die Abmessungen der Kammer und/oder des Kanals des mikrofluidischen Chips in einer Richtung senkrecht zur Transportrichtung betragen bevorzugt weniger als 10 mm, besonders bevorzugt weniger als 1 mm, insbesondere weniger als 100 μηι. Besonders bevorzugt ist die feste Phase die feste Phase eines Lateralflussstreifens. Die feste Phase kann
i) anorganische Partikel und/oder einen anorganischen Faserstoff enthalten oder daraus bestehen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumoxid, Glasfaser, Mineralwollefaser, Steinwollefaser und Mischungen hiervon; und/oder
ii) organische Partikel und/oder einen organischen Faserstoff enthalten oder daraus bestehen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymerpartikel, Polymerfaserstoffe und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Nylon, Nylonderivate, Polyethersulfon, Kohlenstoff nanoröhrchen und Mi- schungen hiervon. Die erste Zone der festen Phase kann
i) an einem ersten Ende der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule); oder
ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinan- der stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).
Die zweite Zone der festen Phase kann neben der ersten Zone auf der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der zweiten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die zweite Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule). Der auf der zweiten Zone immobilisierte Rezeptor kann
i) chemisch kovalent an die feste Phase gebunden sein; und/oder ii) über nicht-kovalente Bindungen an die feste Phase gebunden sein, bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der- Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-
Bindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt über nicht- kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen- Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin- Bindung, HisTag-, Ni-NTA-Bindung und Kombinationen hiervon; und/oder iii) Biotin oder Derivate hiervon enthalten oder daraus bestehen; und/oder iv) Streptavidin oder Derivate hiervon enthalten oder daraus bestehen.
Die dritte Zone kann
i) an einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende
Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der dritten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule); oder
ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet sein, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikrofluisichen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die dritte Zone in mehrere, voneinander räumlich separierte Unterzonen unterteilt und auf jeder einzelne dieser Unterzonen sind Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert, die über einen Oligonukleotid-Linker mit jeweils mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind wobei der Oligonukleotid-Linker jeder Unterzone eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist und die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle für alle U nterzonen unterschiedlich ist. Durch diese Ausgesta I tu ngsfo rm wird der gleichzeitige Nachweis einer Vielzahl verschiedenster Analyten ermöglicht (z.B. über die Kopplung der verschiedenen zu detektierenden Analyten an verschiedene Endonukleasen, wobei jede der verschiedenen Endonukleasen spezifisch für eine Schnittstelle ist, die sich nur in einer bestimmten Unterzone findet). Vorteilhaft ist diese Ausgestaltungsform auch deswegen, da neben dem bestimmten Analyten Markermoleküle (z.B. bestimmte Proteine pathogener und harmloser Bakterien) gleichzeitig mit erfasst werden können und die
Markermoleküle somit als eine Art interner Standard dienen können. In dieser Ausgestaltungsform erfolgt die multiparametrische Detektion ortsaufgelöst, unter Verwendung der gleichen fluoreszierenden Spezies. In einer anderen Ausgestaltungsform kann die Detektion unterschiedlicher Spezies durch spektrales Multiplexing erfolgen, d.h. jedem Analyten wird ein eignes FRET-
Paar zugeordnet, das dann in einer Mischung durch seine unterscheidbare Fluoreszenzemission detektiert werden kann.
Die Quantum Dots können ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Il-Vl-Halbleiter, Ill-V-Halbleitern,
Elementen der 4. Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, PbSe, Mischungen hiervon und Legierungen hiervon, bevorzugt ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HgTe, HgSe, HgS, CdTe, CdSe, ZnTe, ZnSe, ZnS, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, In As, InSb, Ge, Si und PbSe, wobei die Quantum Dots insbesondere eine Form aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus sphärische Form, Stäbchenform, verzweigte Form, Kern-Schale Partikel und Kombinationen hiervon.
Der Oligonukleotid-Linker kann
a) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweisen; und/oder
b) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder min- destens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder c) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder d) ein erstes, ein zweites, ein drittes und/oder ein viertes einzelsträngiges
Oligonukleotid aufweisen. Das erste, ein zweite, ein dritte und/oder vierte einzelsträngige Oiigonukieotid kann
i) eine Länge im Bereich von 5 bis 100 Basenpaaren aufweisen; und/oder ii) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweisen; und/oder
iii) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder iv) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweisen, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder v) den FRET-Akzeptor gebunden haben, wobei bevorzugt das dritte einzelsträngige Oiigonukieotid den FRET-Akzeptor gebunden hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite einzelsträngige Oiigonukieotid mit dem ersten Oiigonukieotid zumindest bereichsweise hybridisiert, das dritte einzelsträngige Oiigonukieotid mit dem zweiten Oiigonukieotid zumindest bereichsweise hybridisiert und/oder das vierte einzelsträngige Oiigonukieotid mit dem dritten Oiigonukieotid zumindest bereichsweise hybridisiert.
Die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle kann an dem ersten, zweiten, dritten und/oder vierten einzelsträngigen Oiigonukieotid lokalisiert sein. Entsprechendes gilt für die eine oder die mehreren Ankergrup- pe(n) zur Immobilisierung der Quantum Dots auf der dritten Zone und auch für den FRET-Akzeptor, wobei der FRET-Akzeptor besonders bevorzugt mit dem dritten einzelsträngigen Oiigonukieotid verbunden ist.
Der Oligonukleotid-Linker kann ein Oiigonukieotid enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, PNA, LNA, CeNA, NP, tcDNA, xDNA, Hybride hiervon und Mischungen hiervon. Die feste Phase kann eine Kontrollenzymzone enthalten, die bevorzugt zwischen der ersten Zone und der zweiten Zone angeordnet ist, wobei auf der Kontrollenzymzone eine bestimmte Kontroll-Endonuklease immobilisiert ist, die bevorzugt über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die feste Phase ge- bunden ist.
Die feste Phase kann eine Kontrolloligonukleotidzone enthalten, die bevorzugt zwischen der zweiten Zone und einer Saugzone für Flüssigkeiten angeordnet ist, wobei auf der Kontrolloligonukleotidzone ein Quantum Dot als FRET- Donor immobilisiert ist, der über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Donor verbunden ist, wobei der Oligonukleotid- Linker bevorzugt eine für eine bestimmte Kontroll-Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist. Die feste Phase kann eine Saugzone für Flüssigkeiten enthält, die bevorzugt an einem zweiten Ende der stationären Phase angeordnet ist, wobei die Saugzone bevorzugt ein Saugkissen („Saugpad") enthält oder daraus besteht.
Die zweite Zone, die Kontrollenzymzone, die dritte Zone und/oder die Kontrolloligonukleotidzone kann zwischen einem ersten und einem zweiten
Ende der stationäre Phase angeordnet sein, bevorzugt in der Reihenfolge zweite Zone, Kontrollenzymzone, dritte Zone und dann Kontrolloligonukleotidzone, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die Zone (bzw. die Zonen) kontaktierenden Bauteils (z.B. die Wandung eines Lateralflussstreifens, eines mikro- fluidischen Chips und/oder einer Chromatographie-Säule).
Erfindungsgemäß wird ferner ein Kit zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße stationäre Phase und eine Reaktionslösung, wobei die Reaktionslösung a) eine Nuklease enthält, wobei die Nuklease chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten
Analyten analoges Molekül gebunden ist; und b) einen Antikörper und/oder ein Aptamer enthält, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden;
dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt.
Die Bindung der Nuklease an den mindestens einen bestimmten Analyten (oder ein Analyt-Analoges Molekül) kann über nicht-kovalente chemische Wechselwirkungen (z.B. nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Grup- pe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van- der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold- Bindungen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Bio- tin-Streptavidin-Bindung, HisTag-, Ni-NTA-Bindung und Kombinationen hier- von) oder eine chemisch kovalente Bindung sein. Bevorzugt ist die Bindung eine chemisch kovalente Bindung.
Darüberhinaus wird Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch bereitgestellt, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend eine Nuklease, die chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist, und einen Antikörper und/oder ein Aptamer, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden, und wobei die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt;
b) Mischen der Reaktionslösung mit einem Gemisch, das den mindestens einen bestimmten Analyten enthalten könnte;
c) Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone der festen Phase der stationären Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche;
d) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie bevor die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat; e) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie nachdem die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat;
f) Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals; und g) Bestimmung der Anwesenheit des bestimmten Analyten in dem Gemisch anhand des in Schritt f) bestimmten Unterschieds.
Der Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals in Schritt f) kann einmalig am Ende des Verfahrens erfolgen (Endpunktmessung) und/oder kann mehrmalig bis zum Ende des Verfahrens, d.h. zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen, um die Kinetik der Entwicklung des FRET-Signals aufzunehmen.
Auch in dem Verfahren gilt, dass die Bindung der Nuklease an den mindestens einen bestimmten Analyten (oder ein Analyt-Analoges Molekül) über nicht- kovalente chemische Wechselwirkungen (z.B. nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag-, Ni-NTA- Bindung und Kombinationen hiervon) oder eine chemisch kovalente Bindung ausgestaltet sein kann. Bevorzugt ist die Bindung eine chemisch kovalente Bindung.
Letztlich wird die Verwendung einer erfindungsgemäßen stationären Phase zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch mit- hilfe von FRET-Spektroskopie vorgeschlagen. Bevorzugt ist die Verwendung zur Detektion mindestens eines Analyten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein, DNA, RNA, organisches Molekül mit einer Masse < 500 Da, anorganisches Molekül, anorganische Partikel, Zellen, Viren, Virenbestandteile und Kombinationen hiervon, insbesondere bakterielle Toxine, Antibiotika, bakterielle Zellen und Kombinationen hiervon. Anhand der nachfolgenden Beispiele und Figuren soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden ohne diesen auf die hier gezeigten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen. Bezugszeichenliste
1: Antikörper/Aptamer
2: Ankergruppe (z.B. Biotin)
3: Rezeptor (z.B. Streptavidin)
4: zweite Zone der festen Phase
5: Nuklease (Endonuklease oder Exonuklease)
6: an Nuklease gebundener zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül
7: freier zu bestimmender Analyt
8: FRET-Akzeptor
9: Oligonukleotid-Linker
10: Quantum-Dot (= FRET-Donor)
11: dritte Zone der festen Phase
11': dritte Zone der festen Phase mit mehreren Unterzonen
12: Reaktionslösung mit Nuklease-Analyt-Antigen/Aptamer-Komplex 13: Zugabe von zu bestimmenden Analyt(en) zur Reaktionslösung
14: Lichtemission bei FRET (z.B. Emission von rotem Licht)
15: Lichtemission ohne FRET (z.B. Emission von grünem Licht)
16: zweiter zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül
17: dritter zu bestimmender Analyt oder zu diesem analoges Molekül 18: erste Zobe der festen Phase zur Aufnahme einer flüssigen Probe
19: Kontrolloligonukleotidzone
20: Saugzone (enthält z.B. ein Saugpad)
21: Kontrollenzymzone
22: Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone 23: Ankergruppe zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers
24: Ankergruppe zur Verankerung an der dritten Zone
25: erstes einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers
26: zweites einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers
27: drittes einzelsträngiges Oligonukleotid des Oligonukleotid-Linkers 28: erste mögliche Schnittstelle für Nuklease
29: zweite mögliche Schnittstelle für Nuklease 30: Spaltung des Oligonukleotid-Linkers über N uklease
Figur 1 zeigt einen Antikörper 1 (bzw. ein Aptamer), der chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) an eine Ankergruppe 2 (z.B. Biotin) gebunden ist. Ferner ist ein Rezeptor 3 (z.B. Streptavidin) dargestellt, der auf der zweiten
Zone 4 der festen Phase immobilisiert ist. Desweiteren zeigt Figur 1 eine Nuklease 5 (z.B. eine Endonuklease oder Exonuklease), die chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) an den bestimmender Analyt 6 (bzw. ein zu diesem analoges Molekül) gebunden ist. Darüberhinaus ist der freie zu bestimmende Analyt 7 dargestellt. Letztlich stellt Figur 1 ein an der dritten Zone 11 der festen Phase immobilisiertes Quantum Dot 10 (= FRET-Donor) dar, wobei das Quantum Dot 10 chemisch (z.B. über eine kovalente Bindung) über einen Oiigonukleotid-Linker 9 mit einem FRET-Akzeptor (z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff) verbunden ist. Die Bezugszeichen für die in Figur 1 dargestellten Symbo- le gelten ebenso für die Figuren 2 bis 4.
Figur 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. In die Reaktionslösung 12, die einen stöchiometrischen Komplex aus Nuklease-Analyt und dem Antikörper/Aptamer enthält erfolgt eine Zugabe 13 von zu bestimmenden Analyt(en). Nach einer bestimmten I nkubationszeit wird die Reaktionslösung auf die erste Zone der festen Phase der stationären Phase aufgetragen 22. Über Kapillarkräfte wird die flüssige Reaktionslösung entlang der stationären Phase transportiert, wobei die in der Reaktionslösung enthaltenen Moleküle die zweite Zone 4 der festen Phase passieren. Dort werden alle Antikörper/Aptamere und daran gebundene Moleküle immobilisiert, sodass nur nicht an Antikörper/Aptamer gebundene Nuklease-Analyt- Komplexe die dritte Zone 11 der festen Phase erreichen können. Dort treffen diese auf das Quantum-Dot (FRET-Donor) und den FRET-Akzeptor, die über den Oiigonukleotid-Linker miteinander verbunden sind und Lichtemission 14 bei FRET zeigen (z.B. Emission von rotem Licht). Die N uklease schneidet nun den Oiigonukleotid-Linker, wodurch die räumliche Nähe zwischen FRET-Donor und FRET-Akzeptor zerstört wird und kein FRET mehr stattfinden kann. Folglich entsteht in der dritten Zone der festen Phase eine Lichtemission 15 ohne FRET (z.B. Emission von grünem Licht). Diese Änderung in der Emissionswel- lenlänge des Lichts kann spektroskopisch gemessen werden. Figur 3 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Hier werden drei verschiedene zu bestimmende Analyten 6, 16, 17 der Reaktionslösung 12 zugegeben, wobei die Reaktionslösung für jeden der zu bestimmenden Analyten einen entsprechenden stöchiometrischen Komplex aus Nuklease-Analyt und dem Antikörper/Aptamer enthält. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Reaktionslösung auf die erste Zone 18 der festen Phase der stationären Phase aufgetragen 22. Über Kapillarkräfte wird die flüssige Reaktionslösung entlang der stationären Phase transportiert, wobei die in der Reaktionslösung enthaltenen Moleküle die hier zunächst eine Kontrollenzymzone 21 passieren, bevor sie zu der zweite Zone 4 der festen
Phase gelangen. In der zweiten Zone 4 der festen Phase werden alle Antikör- per/Aptamere und daran gebundene Moleküle immobilisiert, sodass nur nicht an Antikörper/Aptamer gebundene Nuklease-Analyt-Komplexe die in dieser Ausführungsform mehrere Unterzonen enthaltende dritte Zone 11' der festen Phase erreichen können. Dort treffen diese in jeder der Unterzonen der dritten Zone 11' auf jeweils eine spezifische Paarung aus Quantum-Dot (FRET- Donor), FRET-Akzeptor und Oligonukleotid-Linker. Hierfür ist beispielsweise ausreichend, dass jede Unterzone einen Oligonukleotid-Linker mit einer bestimmten Schnittstelle aufweist, die entweder nur von der Nuklease des ers- ten Analyten 6, der Nuklease des zweiten Analyten 16 oder der Nuklease des dritten Analyten 17 geschnitten werden kann. Trifft einer der spezifischen Analyten 6, 16, 17 mit seiner spezifischen Nuklease auf diese Unterzone, verschwindet die Lichtemission 14 bei FRET (z.B. Emission von rotem Licht) und es entsteht in dieser Unterzone eine Lichtemission 15 ohne FRET (z.B. Emissi- on von grünem Licht). Diese Änderung in der Emissionswellenlänge des Lichts kann für jede Unterzone der dritten Zone 11' separat ausgelesen werden. In dieser Ausführungsform enthält die stationäre Phase zudem eine Kontrolloligonukleotidzone 19 und eine Saugzone (enthält z.B. ein Saugpad). Figur 4 zeigt eine mögliche Verbindung von einem Quantum Dot 10 (FRET-
Donor) über einen Oligonukleotid-Linker zu einem FRET-Akzeptor 8. Hierbei ist ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid 25 des Oligonukleotid-Linkers über eine Ankergruppe 23 (z.B. einen 6xHis-tag) an dem Quantum Dot 10 gebunden (Chelatbindung). Das erste einzelsträngige Oligonukleotid 25 ist mit ei- nem zweiten einzelsträngigen Oligonukleotid 26 hybridisiert, wobei das zweite einzelsträngige Oligonukleotid 26 eine Ankergruppe 24 zur Verankerung an der drittem Zone aufweist. An der Hybridisierungsstelle des ersten einzelsträngigen Oligonukleotids 25 und zweiten einzelsträngigen Oligonukleotids 26 kann erste Schnittstelle 28 für eine Nuklease codiert sein. Ferner ist in dieser Ausgestaltungsform ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid 27 an das zweite einzelsträngige Oligonukleotid 26 hybridisiert, wobei hier optional eine zweite Schnittstelle 29 für eine Nuklease codiert sein kann. Das dritte einzelsträngige Oligonukleotid 27 trägt den FRET-Akzeptor 8 und bringt diesen in unmittelbare räumliche Nähe zum Quantum Dot 10 (FRET-Donor). In Figur 4 ist zudem dargestellt, wie die Struktur nach Spaltung 30 des Oligonukleotid-Linkers durch Einwirken der Nuklease aussieht. Es wird deutlich, dass der FRET-Akzeptor 8 nach der Spaltung nicht mehr in unmittelbarer Nachbarschaft zum Quantum Dot 10 (FRET-Donor) angeordnet ist und damit kein FRET mehr stattfinden kann. Beispiel 1 - Beispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch
In einer Vorinkubation wird ein Gemisch, das den gesuchten Analyten enthalten könnte („Probe") mit einer Reaktionslösung vermengt, die Biotin- modifizierte Antikörper und Antigen-Nuklease-Konjugate enthält, wobei sich die Antikörper gegen das Antigen richten und mindestens ein Antigen dem gesuchten Analyten entspricht. Alle Antigen-Nuklease-Konjugate der Reaktionslösung liegen in Antikörper-gebundenen Zustand vor (d.h. sind mit Antikörper komplexiert). Nach Zugabe der Probe läuft eine kompetitive Bindungs- reaktion ab: Bei Anwesenheit von einem zum Antigen strukturell identischen
Analyten in der Probe werden die am Antikörper gebundenen Antigen- Nuklease-Konjugate teilweise vom Antikörper verdrängt und liegen nun frei in der Reaktionslösung vor. Die mit dem Gemisch versetzte Reaktionslösung wird anschließend auf die erste Zone der stationäre Phase aufgebracht. Nach dem Aufbringen auf die erste Zone der stationären Phase wandern die gelösten Moleküle getrieben über Kapillarkraft - optional über eine Kontrollenzymzone - zur zweiten Zone der stationären Phase („Fängerzone"). Auf der zweiten Zone ist ein Rezeptor (hier: Streptavidin) immobilisiert, der zur Anbindung von einem biotinylierten
Antikörper geeignet ist (Streptavidin-Biotin-Bindung). Folglich werden in der zweiten Zone über die Biotin-Streptavidin-Bindung alle biotinylierten Antikörper (und die an sie gebundenen Antigen-Nuklease-Konjugate) gebunden und können nicht weiter in Richtung dritte Zone der stationäre Phase gelangen. Nur die vorher durch kompetitive Wechselwirkung freigesetzten bestimmten
Antigen-Nuklease-Konjugate, d.h. solche Antigen-Nuklease-Konjugate, deren Antigen strukturell analog oder identisch mit dem Analyt ist, werden über Kapillarkraft weiter zur dritten Zone der stationäre Phase („Detektionszone") transportiert. In der dritten Zone treffen die Antigen-Nuklease-Konjugate auf Quantum-Dots als FRET-Donor, die auf der dritten Zone immobilisiert sind und über einen Oligonukleotid-Linker an einen FRET-Akzeptor gebunden sind. Die räumliche Nähe des FRET-Donors und FR ET- Akzeptors sorgt dafür, dass FRET stattfindet. Trifft nun jedoch das Analyt-Nuklease-Konjugat auf die dritte Zone wird der Oligonukleotid-Linker durch die enzymatische Wirkung der Nuklease gespalten. Dies bewirkt, dass durch die Brown'sche Molekularbewegung und den durch Kapillarkraft getriebenen Fluss die räumliche Nähe zwischen FRET- Donor und FRET-Akzeptor verloren geht. Der FRET zwischen dem QD als FRET- Donor und seinem FRET-Akzeptor kommt zum Erliegen, was als positives Signal über FRET-Spektroskopie ausgelesen werden kann. Beispielsweise wird das Signal über einen Lateral Flow Reader mit bildgebender und spektral aufgelöster Fluoreszenzdetektion ausgelesen. Das kann mit einem Spektrometer erfolgen, aber auch mit zwei Farbfiltern.
Wegen des katalytischen Charakters der Reaktion kann ein Nukleasemolekül mehrere oder viele Abspaltungsreaktionen bewirken, wodurch es zu einer
Signalamplifikation kommt.
Beispiel 2 - Hersteilung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Linkers Um die Hybridisierung einzelsträngiger Oligonukleotide bei Raumtemperatur
(25 °C) stabil zu halten sind ca. 10 bis 20 komplementäre Basenpaare nötig. Enthält der Oligonukleotid-Linker eine spezifische Schnittstelle einer Restrikti- ons-Endonuklease, so befindet sich diese idealerweise inmitten der komplementären Basenpaare. Für den Fall, dass die Restriktions-Endonuklease den Oligonukleotiddoppelstrang mit überhängenden Enden schneidet, darf der
Überhang nicht zu lang sein, um nicht nach dem Schnitt bei Raumtemperatur zu hybridisieren. Diese Voraussetzung trifft jedoch für einen Großteil aller bekannten Restriktions-Endonuklease zu.
Aufbau mit zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden (,,Ι -Form)
Ein erfindungsgemäßer Oligonukleotid-Linker zwischen dem QD als FRET- Donor und dem FRET-Akzeptor (z.B. einem Fl uoresze nzfa rbstoff ) kann aus zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden aufgebaut sein. Die einzelsträngigen Oligonukleotide sind hierfür zumindest bereichsweise miteinander hybridi- siert. Enthalten die beiden Oligonukleotide eine spezifische Schnittstelle für eine Restriktions-Endonuklease, so befindet sich diese innerhalb des hybridisierten Bereichs.
Aufbau mit drei einzelsträngigen Oligonukleotiden (,,Y"-Form)
In diesem Aufbau wird zunächst ein erstes einzelsträngiges Oligonukleotid („Bindungs-Oligonukleotid") über eine Ankergruppe an die Oberfläche eines QD gebunden (z.B. über das 3'-Ende des Oligonukleotids). Das erste einzelsträngige Oligonukleotid enthält eine Spacer-Sequenz S (z.B. am 3'- Ende) und eine Linker-Sequenz L (z.B. am 5'-Ende). An die Linker-Sequenz L des ersten einzelsträngigen Oligonukleotids wird dann ein zweites einzelsträngiges Oligonukleotid („Linker-Oligonukleotid") über dessen Linker- Sequenz L' (z.B. am 3'-Ende des zweiten Oligonukleotids) hybridisiert. Das zweite einzelsträngige Oligonukleotid weist zudem eine Schnittstellensequenz A (z.B. am 5'-Ende des zweiten Oligonukleotids) auf, die für eine bestimmte
Restriktions-Endonuklease spezifisch ist. An die Schnittstellensequenz A des zweiten Oligonukleotids wird dann ein drittes einzelsträngiges Oligonukleotid („Reporter-Oligonukleotid") über dessen Schnittstellensequenz A' (z.B. am 3'- Ende des dritten Oligonukleotids) hybridisiert. Das dritte einzelsträngige Oligonukleotid weist (z.B. chemisch kovalent gebunden) den FRET-Akzeptor
(z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff) auf (z.B. am 5'-Ende des dritten Oligonukleotids).
Durch den Aufbau über drei einzelsträngige Oligonukleotide ist es möglich, zunächst nur eine Art von DNA-funktionalisierter QD herzustellen, nämlich lediglich mit dem Bindungs-Oligonukleotid modifizierte QD. Anschließend kann auf flexible Art und Weise durch das Hinzufügen des Linker- Oligonukleotids und des Reporter-Oligonukleotids eine Spezifität des Oligonukleotid-Linkers für bestimmte Restriktions-Endonukleasen eingeführt werden. Durch die Y-Geometrie des Oligonukleotid-Linkers ist die vom Enzym zu schneidende Oligonukleotidsequenz sterisch gut zugänglich und der Farbstoff befindet sich so nah wie möglichen am QD, um eine hohe FRET-Effizienz zu ermöglichen.
Aufbau mit vier einzelsträngigen Oligonukleotiden (immobilisierte ,,Y"-Form)
Das modulare Konzept für den Aufbau des Oligonukleotid-Linkers vereinfacht die Präparation und Optimierung der einzelnen Komponenten und erlaubt eine ganze Reihe von möglichen Varianten. So kann z.B. an das Bindungs-Oligo neben den Linker-Oligos auch ein weiteres, viertes Oligonukleotid angebracht werden, das von der Nuklease nicht geschnitten wird und die Immobilisierung des QD in der dritten Zone auf der festen Phase der stationären Phase vermittelt (z.B. über chemisch kovalente Bindung von Biotin an das vierte Oligonukleotid, wenn die feste Phase der dritten Zone der stationäre Phase immobilisiertes Streptavidin aufweist).
Mischung von mit Oligonukleotiden
Neben den oben beschriebenen Linker-Oligonukleotiden, über die der FRET- Akzeptor an der Oberfläche der QD angebunden wird, können diese zusätzlich mit anderen Oligonukleotiden oder anderen geeigneten Molekülen ausgestattet werden, um weitere Funktionalitäen zu erhalten (z.B. weitere chemische Ankergruppen, z.B. für die Immobilisierung) oder die Stabilität des QD- FRET Systems zu erhöhen. Gemeint ist die kolloidale Stabilität sowie die Stabilität bei Trocknung, Lagerung und Befeuchtung während der Nachweisreaktion.
Beispiel 3 - Konjugation von Oiigonukieotid-Linker an QD und FRET- Akzeptor
Quantum Dots (QD) sind kolloidale Halbleiter-Nanopartikel mit Fluoreszenzeigenschaften. Diese werden für die erfindungsgemäße Verwendung über einen Oligonukleotid-Linker (bevorzugt einen über sequenzspezifische Nukleasen spaltbaren Oligonukleotid-Linker) mit einem FRET-Akzeptor (z.B. ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül) konjugiert. Der FRET-Akzeptor wird hierbei in Abhängigkeit der Art des QD so ausgewählt, dass die Fluoreszenzanregung des QD über Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auf sie übertragen wird. Als FRET-Akzeptor kann hierbei ein Fluoreszenzfarbstoff molekül eingesetzt werden, das bei FRET durch das QD rotes Licht emittiert. Alternativ kann als FRET- Akzeptor ein sog.„Quencher" verwendet werden, der selbst nicht emittiert, aber die Intensität der Fluoreszenzemission des QD schwächt bis vollständig unterdrückt. In diesem Falle ist bei FRET keine Emissionsintensität bei der Emissionswellenlänge des QD (z.B. grünes Licht) zu beobachten. Die Konjugation der QD über den Oligonukleotid-Linker an den FRET-Akzeptor erfolgt bevorzugt chemisch kovalent.
Durch den Einsatz unterschiedlicher Oligonukleotid-Linker können unterschiedliche Analyten nachgewiesen werden. Hierfür werden die zu detektie- renden Analyten (Antigene) an Nukleasen gekoppelt, welche nur in einer bestimmten Nukleotidsequenz des Oligonukleotid-Linkers schneiden (sog. Rest- riktions-Endonukleasen). Besteht die Detektionszone der stationäre Phase aus mehreren Subzonen, so kann jede einzelne Subzone einen spezifischen Oligonukleotid-Linker aufweisen, der sich nur durch eine bestimmte Restrikti- ons-Endonuklease schneiden lässt und damit nur durch diese bestimmte Anti- gen-Nuklease-Kombination in der Subzone ein Signal generiert wird. Die für die jeweilige Nuklease spezifische Sequenz besteht in der Regel aus ca. drei Basenpaaren, der Schnitt kann je nach ausgewähltem Enzym glatt oder versetzt erfolgen. Durch die Verwendung der spezifischen Nukleasen und spezifischen Schnittstellen in den Oiigonukleotid-Linkern lassen sich mittels einer ortsaufgelösten (bildgebenden) Detektion gleichzeitig mehrere Analyten nachweisen.

Claims

FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT...e.V. 179PCT 2704 Patentansprüche
1. Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, enthaltend eine in mehrere Zonen unterteilte feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft, wobei die feste Phase mindestens
a) eine erste Zone enthält, die zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist;
b) eine zweite Zone enthält, auf der ein Rezeptor zur Anbindung von einem Antikörper und/oder einem Aptamer immobilisiert ist, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden;
c) eine dritte Zone enthält, auf der Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, wobei die Quantum Dots jeweils über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET- Akzeptor verbunden sind.
2. Stationäre Phase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase zum Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft i) eine feste Phase zum Transport einer wässrigen Flüssigkeit über Kapillarkraft ist; und/oder
ii) hydrophile Eigenschaften, optional bereichsweise hydrophobe Eigenschaften, aufweist; und/oder
iii) eine Vielzahl von sich kontaktierenden Partikeln und/oder Fasern enthält oder daraus besteht, wobei die Partikel und/oder Fasern Zwischenräume ausbilden, die eine maximale Ausdehnung in alle Raumrichtungen von weniger als 1 mm, bevorzugt weniger als 100 μηι, besonders bevorzugt weniger als 10 μηι, aufweisen; und/oder iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus feste Phase eines Lateralflussstreifens, feste Phase in einer Kammer und/oder in ei- nem Kanal eines mikrofluidischen Chips, feste Phase einer Chromatographie-Säule und Kombinationen hiervon, wobei die Abmessungen der Kammer und/oder des Kanals des mikrofluidischen Chips in einer Richtung senkrecht zur Transportrichtung bevorzugt weniger als 10 mm, besonders bevorzugt weniger als 1 mm, insbesondere weniger als 100 μηι, betragen.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase
i) anorganische Partikel und/oder einen anorganischen Faserstoff enthält oder daraus besteht, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumoxid, Glasfaser, Mineralwollefaser, Steinwollefaser und Mischungen hiervon; und/oder
ii) organische Partikel und/oder einen organischen Faserstoff enthält oder daraus besteht, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymerpartikel, Polymerfaserstoffe und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt Cellulose, Celluloseacetat,
Nitrocellulose, Polyvinylidenfluorid, Nylon, Nylonderivate, Polyethersulfon, Kohlenstoffnanoröhrchen und Mischungen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zone der festen Phase
i) an einem ersten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils; oder
ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die erste Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zone neben der ersten Zone der festen Phase auf der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der zweiten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die zweite Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der auf der zweiten Zone der festen Phase immobilisierte Rezeptor
i) chemisch kovalent an die feste Phase gebunden ist; und/oder ii) über nicht-kovalente Bindungen an die feste Phase gebunden ist, bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Interaktionen, hydrophober Effekt, Chelatbindungen, Thiol-Gold-Bindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt über nicht-kovalente Bindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen-Antikörper-Bindung, Ligand-Aptamer-Bindung, Biotin-Streptavidin-Bindung, HisTag- NiNTA-Bindung und Kombinationen hiervon; und/oder
iii) Biotin oder Derivate hiervon enthält oder daraus besteht;
und/oder
iv) Streptavidin oder Derivate hiervon enthält oder daraus besteht. Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Zone der festen Phase i) an einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei senkrecht zueinander stehende Richtungen, besonders bevorzugt in mindestens drei senkrecht zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der dritten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils; oder ii) zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase, bevorzugt in der Mitte der stationäre Phase, angeordnet ist, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der ersten Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationäre Phase und/oder eine Wandung eines die dritte Zone kontaktierenden Bauteils.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Zone in mehrere, voneinander räumlich separierte Unterzonen unterteilt ist und auf jeder einzelne dieser Unterzonen Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, der über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Akzeptor verbunden sind, wobei der Oligonukleotid-Linker jeder Unterzone eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist und die für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle für alle Unterzonen unterschiedlich ist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantum Dots ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Il-Vl-Halbleiter, Ill-V-Halbleitern, Elementen der 4. Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, PbSe, Mischungen hiervon und Legierungen hiervon, bevorzugt ein Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HgTe, HgSe, HgS, CdTe, CdSe, ZnTe, ZnSe, ZnS, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, Ge, Si und PbSe, wobei die Quantum Dots insbesondere eine Form aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus sphärische Form, stäbchenform, verzweigte Form, Kern-Schale Partikel und Kombinationen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotid-Linker
a) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist; und/oder
b) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des
Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
c) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des
Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
d) ein erstes, ein zweites, ein drittes und/oder ein viertes
einzelsträngiges Oligonukleotid aufweist, das bevorzugt i) eine Länge im Bereich von 5 bis 100 Basenpaaren aufweist; und/oder
ii) eine für eine bestimmte Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist; und/oder
iii) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an der dritten Zone aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechselwirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
iv) eine oder mehrere Ankergruppe(n) zur Immobilisierung des Oligonukleotid-Linkers an den Quantum-Dots aufweist, wobei die Immobilisierung optional über nicht-kovalente Wechsel- Wirkungen und/oder mindestens eine chemisch kovalente Bindung stattfindet; und/oder
v) den FRET-Akzeptor gebunden hat, wobei bevorzugt das dritte einzelsträngige Oligonukleotid den FRET-Akzeptor gebunden hat.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Oligonukleotid-Linker ein
Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, PNA, LNA, CeNA, NP, tcDNA, xDNA, Hybride hiervon und Mischungen hiervon.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine Kontrollenzymzone enthält, die bevorzugt zwischen der ersten Zone und der zweiten Zone angeordnet ist, wobei auf der Kontrollenzymzone eine bestimmte Kontroll-Endonuklease immobilisiert ist, die bevorzugt über nicht- kovalente Wechselwirkungen an die feste Phase gebunden ist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine
Kontrolloligonukleotidzone enthält, die bevorzugt zwischen der zweiten Zone und einer Saugzone für Flüssigkeiten angeordnet ist, wobei auf der Kontrolloligonukleotidzone Quantum Dots als FRET-Donor immobilisiert sind, die über mindestens einen Oligonukleotid-Linker mit mindestens einem FRET-Donor verbunden sind, wobei der
Oligonukleotid-Linker bevorzugt eine für eine bestimmte Kontroll- Endonuklease spezifische Schnittstelle aufweist.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase eine Saugzone für Flüssigkeiten enthält, die bevorzugt an einem zweiten Ende der stationären Phase angeordnet ist, wobei die Saugzone bevorzugt ein Saugkissen enthält oder daraus besteht.
Stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zone, die Kontrollenzymzone, die dritte Zone und/oder die Kontrolloligonukleotidzone zwischen einem ersten und einem zweiten Ende der stationäre Phase angeordnet ist, bevorzugt in der Reihenfolge zweite Zone, Kontroilenzymzone, dritte Zone und dann Kontrolloligonukleotidzone, wobei der Transport von Flüssigkeit über Kapillarkraft optional in mindestens eine Richtung, bevorzugt in mindestens zwei in einem Winkel von 180° zueinander stehende Richtungen, an der Oberfläche der Zone blockiert ist, insbesondere durch mindestens einen Rand der stationären Phase und/oder eine Wandung eines die Zonen kontaktierenden Bauteils.
Kit zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, enthaltend mindestens ein stationäre Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche und eine Reaktionslösung, wobei die Reaktionslösung
a) eine Nuklease enthält, wobei die Nuklease chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist; und b) einen Antikörper und/oder ein Aptamer enthält, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden;
dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt.
Verfahren zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer Reaktionslösung enthaltend eine Nuklease, die chemisch an mindestens einen bestimmten Analyten und/oder mindestens ein dem bestimmten Analyten analoges Molekül gebunden ist, und einen Antikörper und/oder ein Aptamer, wobei der Antikörper und/oder das Aptamer dazu geeignet sind, den mindestens einen bestimmten Analyten zu binden, und wobei die Nuklease vollständig in einem Komplex mit dem Antikörper und/oder dem Aptamer vorliegt; b) Mischen der Reaktionslösung mit einem Gemisch, das den mindestens einen bestimmten Analyten enthalten könnte;
c) Kontaktieren der inkubierten Reaktionslösung mit der ersten Zone der festen Phase der stationären Phase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche;
d) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie bevor die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat;
e) Messung eines FRET-Signals in zumindest einem Teilbereich der dritten Zone über FRET-Spektroskopie nachdem die Reaktionslösung die dritte Zone der stationären Phase erreicht hat;
f) Vergleich des in Schritt d) und Schritt e) gemessenen FRET-Signals; und
g) Bestimmung der Anwesenheit des bestimmten Analyten in dem Gemisch anhand eines in Schritt f) bestimmten Unterschieds.
Verwendung einer stationären Phase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Detektion mindestens eines bestimmten Analyten in einem Gemisch mithilfe von FRET-Spektroskopie, bevorzugt mindestens eines Analyten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein, DNA, RNA, organisches Molekül mit einer Masse < 500 Da, anorganisches Molekül, anorganische Partikel, Zellen, Viren, Virenbestandteile und Kombinationen hiervon, bevorzugt bakterielle Toxine, Antibiotika, bakterielle Zellen und Kombinationen hiervon.
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