JP2019512208A - 細菌を迅速に検出するｎｍｒ法及びシステム - Google Patents

細菌を迅速に検出するｎｍｒ法及びシステム Download PDF

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Abstract

本発明は、病原体を検出し、菌血症及び敗血症を含む疾患を診断及び処置する方法、パネル、カートリッジ、及びシステムを特色とする。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、病原体を検出し、菌血症及び敗血症を含む疾患を診断及び処置する方法、パネル、カートリッジ、及びシステムを特色とする。
血流感染(BSI)は、罹患率及び死亡率の主要な原因である。死亡証明書に由来するデータに基づくと、これらの感染は、米国内で10番目に多い死因であり、BSIに起因する年齢調整死亡率は、過去20年間で、78%上昇している。院内感染性BSIの真の発生率は、未知であるが、毎年米国内で、約250,000例が生じると推定されている。菌血症とは、多様な種類の細菌が血流に侵入する場合に生じるBSIである。危険性がある者では、菌血症は、自らの消化管微生物叢内に存在する、自身の定着微生物叢が、血流に侵入する場合に生じうる。菌血症はまた、医療器具(例えば、中心静脈留置カテーテル)又はデバイスが、環境又は医療従事者の手に由来する細菌で汚染された場合にも生じる。菌血症は、体内の炎症性応答(例えば、敗血症及び敗血症性ショック)と関連しうる。特に、敗血症及び敗血症性ショックは、死亡率が比較的高い。場合によって、血流中の細菌は、体内の他の部分へも拡散しうる。
菌血症の症状は典型的に、特異的ではなく、患者は、原因不明の発熱を示すことが最も多い。菌血症及び敗血症の鑑別診断は、他の状態(例えば、全身性炎症反応症候群(SIRS))が類似の症状を示しうるという事実により複雑でありうる。菌血症は通例、血液培養及び培養後試験の組合せにより診断され、これによりまた、特異的種も同定される。これらの手順は、数日間を要求し、場合によって、種の同定は、6日間より長い日数を要求しうる。しかし、有効な処置には、適切な治療の早期の開始が重要である。例えば、不十分な初期抗微生物治療(例えば、開始が遅すぎる治療及び/又は不適切な薬物の投与を伴う治療)は、死亡率についての独立の予測因子であり、治療の遅延はまた、入院期間の延長とも関連しうる。
したがって、病原体関連解析物の存在を検出して、菌血症、敗血症、及びSIRSを含む疾患を診断及びモニタリングする、迅速且つ高感度の方法であって、好ましくは、試料調製の要求が最小限であるか、又はこれを要求しない方法が依然として必要とされている。特に、試料中の複数の病原体の存在を同時に検出し、存在する病原体を同定することが可能な方法及びパネルが必要とされている。
本発明は、病原体(細菌病原体を含む)を検出する、例えば、生物学的試料中の病原体を検出する方法、システム、カートリッジ、及びパネルを特色とする。本発明はまた、疾患を診断及び/又は処置する方法も特色とする。
一態様では、本発明は、液体試料中のアシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)(A.バウマニ(A. baumannii))細胞の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中のA.バウマニの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-CGT TTT CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG-3'(配列番号1)又は5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、A.バウマニの単位複製配列(アンプリコン)を含む増幅溶解物を形成するステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、A.バウマニ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、A.バウマニの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、A.バウマニの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、フォワードプライマーは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CGT TTT CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG-3'(配列番号1)を含む。他の実施形態では、フォワードプライマーは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含む。一部の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、液体試料中のエンテロコッカス(Enterococcus)属種の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中のエンテロコッカス属の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、エンテロコッカス属の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、エンテロコッカス属種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、エンテロコッカス属の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、エンテロコッカス属の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、種は、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であり、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)又は5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)又は5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む。一部の実施形態では、種は、エンテロコッカス・フェシウムであり、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)を含む。他の実施形態では、種は、エンテロコッカス・フェシウムであり、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む。一部の実施形態では、種は、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)であり、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、液体試料中のクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(K.ニューモニエ(K. pneumoniae))細胞の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中のK.ニューモニエの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、K.ニューモニエの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、K.ニューモニエ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、K.ニューモニエの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、K.ニューモニエの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、液体試料中の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(緑膿菌(P. aeruginosa))細胞の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中の緑膿菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、緑膿菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、緑膿菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、緑膿菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、緑膿菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)又は5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)又は5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む。一部の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)を含む。他の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、液体試料中の大腸菌(Escherichia coli)(大腸菌(E. coli))細胞の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中の大腸菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、大腸菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、大腸菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、大腸菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、大腸菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、大腸菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、液体試料中の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(黄色ブドウ球菌(S. aureus))細胞の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、(b)溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対又は第2のプライマー対の存在下で増幅して、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップであって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含むステップ、(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに(g)ステップ(f)の結果に基づき、黄色ブドウ球菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブは、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブは、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子は、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、ステップ(b)は、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む。一部の実施形態では、ステップ(b)は、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含み、第2のプローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む。一部の実施形態では、ステップ(b)は、第1の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅して、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成すること、及び第2の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅して、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成することを含み、ステップ(g)は、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列及び第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を検出することを含む。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブ及び第3のプローブは、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、第2のプローブ及び第4のプローブは、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、磁性粒子は、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、第1のプローブは、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2のプローブは、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3のプローブは、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4のプローブは、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ステップ(b)は、少なくとも第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす。一部の実施形態では、第3の単位複製配列は、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第1の領域、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第2の領域、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第3の領域、及び配列番号40のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第4の領域を含む。一部の実施形態では、第3の単位複製配列は、第1の単位複製配列のヌクレオチド配列及び第2の単位複製配列のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、方法のステップ(a)〜(g)を、5時間以内に完了する。一部の実施形態では、方法のステップ(a)〜(g)を、3時間以内に完了する。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、方法は、液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度のA.バウマニ、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、又は黄色ブドウ球菌を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、3CFU/mLの濃度を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、2CFU/mLの濃度を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、1CFU/mLの濃度を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、液体試料中の1〜10CFU/mL(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10CFU/mL)のA.バウマニ、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、又は黄色ブドウ球菌を検出することが可能である。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、液体試料は、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される。一部の実施形態では、液体試料は、全血である。一部の実施形態では、ステップ(a)は、対象に由来する全血試料中の赤血球を溶解させること、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成すること、上清の一部又は全部を廃棄すること、任意選択で、ペレットを洗浄すること、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成することを含む。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、ステップ(b)は、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む。一部の実施形態では、磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径を有する。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。一部の実施形態では、磁性粒子は、実質的に単分散である。
別の態様では、本発明は、液体試料中の種の存在を検出する方法であって、(a)液体試料中の、第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含む溶液を形成するステップであって、各標的核酸が、検出される種に特徴的であるステップ、(b)磁性粒子を液体試料へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、第1の単位複製配列又は第2の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、(c)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、(d)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、(e)ステップ(d)に続き、信号を測定するステップ、並びに(f)ステップ(e)の結果に基づき、種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、種は、植物種、哺乳動物種、又は微生物種である。一部の実施形態では、種は、微生物種である。一部の実施形態では、第1の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第1のプライマー対の存在下で増幅し、第2の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第2のプライマー対の存在下で増幅する。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブ及び第3のプローブは、第1の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、第2のプローブ及び第4のプローブは、第2の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、磁性粒子は、第1の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する。一部の実施形態では、ステップ(a)は、第3の単位複製配列を増幅することをさらに含み、第3の単位複製配列は、第1の標的核酸の核酸配列及び第2の標的核酸の核酸配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の標的核酸及び第2の標的核酸は、染色体上又はプラスミド上に位置する。一部の実施形態では、第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、約10〜約1000塩基対の間(例えば、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、又は1000塩基対)だけ隔てられている。一部の実施形態では、第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する。一部の実施形態では、方法は、液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、液体試料中の3CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法は、液体試料中の1CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である。一部の実施形態では、方法のステップ(a)〜(f)を、5時間以内に完了する。一部の実施形態では、方法のステップ(a)〜(f)を、3時間以内に完了する。一部の実施形態では、微生物種は、A.バウマニ、E.フェカリス(E. faecalis)、E.フェシウム(E. faecium)、K.ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌から選択される。一部の実施形態では、液体試料は、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される。一部の実施形態では、液体試料は、全血である。一部の実施形態では、方法は、ステップ(a)の前に、対象に由来する全血試料を用意するステップ、全血試料中の赤血球を溶解させるステップ、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成するステップ、上清の一部又は全部を廃棄するステップ、任意選択で、ペレットを洗浄するステップ、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ(b)は、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む。一部の実施形態では、磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径を有する。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。一部の実施形態では、磁性粒子は、実質的に単分散である。一部の実施形態では、増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)A.バウマニの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)A.バウマニの標的核酸を増幅することにより生成させた、A.バウマニの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)又は5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)又は5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、第1の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)を含み、第2の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)を含む。他の実施形態では、第1の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、第2の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む。一部の実施形態では、エンテロコッカス属の標的核酸は、エンテロコッカス・フェシウムの標的核酸である。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、エンテロコッカス属の標的核酸は、エンテロコッカス・フェカリスの標的核酸である。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成させた、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、緑膿菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)又は5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)又は5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。一部の場合には、第1の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)を含み、第2の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)を含む。他の場合には、第1の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、第2の核酸プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む。
別の態様では、本発明は、(a)(i)大腸菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)大腸菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、大腸菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む、磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、(a)(i)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を含有することが疑われ、各標的核酸が、微生物種に特徴的であるか、又は(ii)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅することにより生成させた、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、それらの表面へとコンジュゲートさせた結合性部分を有し、第1の単位複製配列に作動可能に結合して、凝集物を形成することが可能であり、第2の単位複製配列に結合して、凝集物を形成することが可能である磁性粒子を含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、磁性粒子は、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブ及び第3のプローブは、第1の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、第2のプローブ及び第4のプローブは、第2の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動する。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。
別の態様では、本発明は、全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、以下:(i)オリゴヌクレオチド配列:5'-CGT TTT CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG-3'(配列番号1)又は5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーを含む、A.バウマニの標的核酸を増幅するプライマー対、(ii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGATAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーを含む、エンテロコッカス属の標的核酸を増幅するプライマー対、(iii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーを含む、K.ニューモニエの標的核酸を増幅するプライマー対、(iv)オリゴヌクレオチド配列:5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーを含む、緑膿菌の標的核酸を増幅するプライマー対、(v)オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーを含む、大腸菌の標的核酸を増幅するプライマー対、並びに/又は(vi)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅する、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対であって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含む、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対から選択される、1つ以上のプライマー対を使用して、その中の標的の細菌核酸を増幅して、増幅溶解物溶液を形成するステップを含む方法により作製される増幅溶解物溶液を特色とする。一部の実施形態では、ステップ(c)の増幅することは、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含む。一部の実施形態では、ステップ(c)の増幅することは、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含む。一部の実施形態では、ステップ(c)の増幅することは、2つの黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対及び第2のプライマー対の存在下で増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を生成させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(c)の増幅することは、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらし、第3の単位複製配列の核酸配列は、第1の単位複製配列の核酸配列及び第2の単位複製配列の核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記全血試料中の、10CFU/mL以下(例えば、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1CFU/mL)の細菌は、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の5CFU/mL以下の細菌は、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の3CFU/mL以下の細菌は、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の1CFU/mLの細菌は、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。
別の態様では、本発明は、全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、その中の2つ以上の標的の細菌核酸を増幅して、2つ以上の細菌の単位複製配列を含む増幅溶解物溶液を形成するステップであって、前記全血試料中の10CFU/mL以下(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10CFU/mL)の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分であるステップを含む方法により作製される増幅溶解物溶液を特色とする。一部の実施形態では、ステップ(a)は、先行する洗浄ステップを伴わずに、ペレットを再懸濁させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(a)は、ペレットを再懸濁させる前に洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、2つ以上の標的の細菌核酸は、単一の細菌病原体に特徴的である。一部の実施形態では、ステップ(c)の増幅することは、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす。一部の実施形態では、第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する。一部の実施形態では、前記全血試料中の約10CFU/mL以下の細菌は、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の約5CFU/mL以下の細菌は、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の約3CFU/mL以下の細菌は、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。一部の実施形態では、前記全血試料中の約1CFU/mLの細菌は、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である。
別の態様では、本発明は、(a)(i)赤血球を溶解させ、(ii)試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、(iii)上清の一部又は全部を廃棄し、(iv)洗浄せずに、残余の細胞を溶解させて、抽出物を形成することにより調製される、細菌病原体を含有することが疑われる全血試料からの抽出物の一部、(b)配列番号1、3、5、7、9、11、59、又は110のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、(c)配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマー、(d)熱安定性ポリメラーゼ、並びに(e)デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、及びマグネシウムを含む組成物を特色とする。一部の実施形態では、フォワードプライマーは、配列番号1、3、5、7、9、11、59、又は110のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、フォワードプライマーは、配列番号1、3、5、7、9、11、59、又は110のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、フォワードプライマーは、配列番号1、3、5、7、9、11、59、又は110のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、リバースプライマーは、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、リバースプライマーは、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、リバースプライマーは、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本発明は、複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、先行する組成物のうちのいずれかを含む着脱式カートリッジを特色とする。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、複数のウェルを含み、この場合、着脱式カートリッジは、以下:(a)(a')(i)A.バウマニの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)A.バウマニの標的核酸を増幅することにより生成させた、A.バウマニの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第1のウェル、(b)(a'')(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)又は5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)又は5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第2のウェル、(c)(a''')(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第3のウェル、(d)(a'''')(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成させた、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第4のウェル、(e)(a''''')(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、緑膿菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b''''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)又は5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)又は5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第5のウェル、(f)(a'''''')(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'''''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子を含む組成物を含む第6のウェルのうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの2つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの3つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの4つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの5つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)を含む。
別の態様では、本発明は、複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、先行する組成物のうちのいずれかを含む着脱式カートリッジを特色とする。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、複数のウェルを含み、この場合、着脱式カートリッジは、以下:(a)(a')(i)A.バウマニの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)A.バウマニの標的核酸を増幅することにより生成させた、A.バウマニの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第1のウェル、(b)(a'')(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)又は5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)又は5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第2のウェル、(c)(a''')(i)大腸菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)大腸菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、大腸菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第3のウェル、(d)(a'''')(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成させた、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第4のウェル、(e)(a''''')(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、緑膿菌の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b''''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、オリゴヌクレオチド配列:5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)又は5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)又は5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子を含む組成物を含む第5のウェル、(f)(a'''''')(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに(b'''''')液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子を含む組成物を含む第6のウェルのうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの2つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの3つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの4つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)のうちの5つ以上を含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、(a)〜(f)を含む。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、1つ以上のアッセイ試薬を保持する、複数の試薬モジュールを保持する、1つ以上のチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、細胞を溶解させるビーズを含むチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、ポリメラーゼを含むチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、着脱式カートリッジは、1つ以上のプライマーを含むチャンバーをさらに含む。一部の実施形態では、1つ以上のプライマーは、配列番号1〜14、59、61、及び110から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本発明は、対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、先行する方法のうちのいずれか1つの方法に従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種は、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種は、エンテロコッカス・フェシウムである。
別の態様では、本発明は、対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、先行する方法のうちのいずれか1つに従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップを含む方法を特色とする。
別の態様では、本発明は、対象における血流感染又は敗血症を処置(治療)する方法であって、先行する方法のうちのいずれか1つに従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、及び(c)血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップを含む方法を特色とする。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種は、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種は、エンテロコッカス・フェシウムである。
別の態様では、本発明は、対象における血流感染又は敗血症を処置する方法であって、先行する方法のうちのいずれか1つに従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、(c)血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップを含む方法を特色とする。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、血流感染は、菌血症である。
先行する態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
本発明の他の特色及び利点については、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
本発明の例示的な標的を示す表である。 本発明の例示的なパネルを示す表である。 本発明の例示的なパネルを示す表である。 本発明の例示的なパネルを示す表である。 本発明の例示的なパネルを示す表である。 表示の対照femA又はfemBオリゴマーの、スクランブル化磁性粒子対(実施例2を参照されたい)とのハイブリダイゼーションの後に得られる滴定プロファイルを示すグラフである。対照オリゴマーの濃度は、ハイブリダイゼーション反応1回当たりの分子0〜1×1012個の範囲であった。各粒子上のfemAプローブ:femBプローブの比は、1:1(図2A)、1:2(図2B)、又は2:1(図2C)であった。黄色ブドウ球菌:Sa。 図２−１の続きである。 図２−２の続きである。 femA及びfemB単位複製配列/PCR産物に特異的なオリゴマーを伴う、スクランブル化(femA/femB)磁性粒子対の滴定を示すグラフである。femA+femB(「fA+fB」)曲線は、等モル量のいずれかのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション反応物へと添加することにより得た。 3CFU/mLの黄色ブドウ球菌株TCH595細胞とスパイクされた血液についての、PCR/T2MR組合せアッセイの結果を示すグラフである。femB/A粒子は、スクランブル化磁性粒子対(実施例2を参照されたい)を示す。N=12。 353bp隔てられた遺伝子座を増幅する2つのプライマー対の存在下で予測されうる、PCR産物についての概略表示である。プローブの結合性部位(5'側捕捉プローブ(「5」)及び3'側捕捉プローブ(「3」))を、ダークグレー及びライトグレーの矩形(それぞれ、femA及びfemB)として示す。また、単位複製配列間の距離及び単位複製配列の長さも、femA/Bのオペロン配列から推定することができる(黄色ブドウ球菌株Mu3のfemA/femBのオペロン配列については、配列番号56を参照されたい)。 ゲノムDNAを、陰性全血溶解物へと、反応1回当たり5及び10ゲノムコピー当量(cp)でスパイクした、7プレックス細菌パネルアッセイで得られる、平均T2の検出信号を示すグラフである。図5Aは、5つのA.バウマニ(Ab)株から得られる結果を示し、図5Bは、5つのE.フェシウム(Efm)株から得られる結果を示し、図5Cは、5つのE.フェカリス(Efs)株から得られる結果を示し、図5Dは、5つのK.ニューモニエ(Kp)株から得られる結果を示し、図5Eは、5つの緑膿菌(Pa)株から得られる結果を示す。内部対照(IC)は、陽性対照として用いられた。N=4。 図５−１の続きである。 図５−２の続きである。 図５−３の続きである。 図５−４の続きである。 表示の株に由来するSaのゲノムDNAを、陰性全血溶解物へと、反応1回当たり5及び10ゲノム当量でスパイクした、6プレックス細菌パネルアッセイで得られる、平均T2の検出信号を示すグラフである。N=4。 コンピュータによるデータに起因して選択された種についての除外試験から得られる平均T2検出信号を示すグラフである。図6Aは、アシネトバクター・バウマニの非常に近い近縁菌であるアシネトバクター(Acinetobacter)属種から得られる結果を示し、図6Bは、黄色ブドウ球菌との近縁菌であるS.ワルネリ(S. warneri)種から得られる結果を示し、図6Cは、大腸菌及びK.ニューモニエに対する近縁菌であるA.ハイドロフィラ(A. hydrophila)株から得られる結果を示す。全てのアッセイは、単離DNAを、陰性全血溶解物へと、反応1回当たり104及び105cpでスパイクして実施した。ICは、陽性対照として用いられた。各実験についてのN=4。 図６−１の続きである。 図６−２の続きである。 健常血液へのスパイク(40mlへの0.4ml)にもまた使用される、細胞ビュレット希釈液200μlの並行播種(実施例5を参照されたい)により決定されたスパイクレベルを示す表である。Ab-3及びAb-5は、A.バウマニについて、それぞれ、3CFU/mL及び5CFU/mLの標的を示す。Sa-3及びSa-5は、黄色ブドウ球菌について、それぞれ、3CFU/mL及び5CFU/mLの標的を示す。 表示の細菌種を二重スパイクした健常血液についてのLoD研究(実施例5を参照されたい)中に得られた全てのT2信号についての、平均(Avg)、標準偏差(stdev)、及び変動係数(CV%)を示す表である。グレーの影を付したフィールド/太字の数は、このアッセイシリーズにおいてスパイクされる種についての信号を示す。FN%(偽陰性%)行中のフィールドは、このアッセイシリーズについて観察される中断パーセントについて描示する。偽陰性値≦15%は、信頼性を95%とした、≧85%の検出と同等である。ダークグレーの影を付したフィールドは、検出レベル<85%について描示する。FP%は、偽陽性%を示す。FPは、偽陽性試料を示す。 実施例3で記載される、人為的健常血液検体中の、手作業による細菌パネルアッセイのアッセイ感度についての結果をまとめる表である。 実施例3で記載される細菌パネルアッセイにより解析される、臨床廃棄検体についての結果をまとめる表である。血液培養(BC)による種の同定及び細菌パネルアッセイによる同定を隣接列に示す。グレーの影を付したフィールドは、一致する結果について描示する。BCによる報告は、正確な種の同定を欠き、ファミリーの同定だけを列挙するので、ライトグレーの影を付したフィールド(#20-027及び20-254)は、一致するとみなされる。丸印のフィールドは、おそらく、偽陽性、又は増殖の欠如に起因して、BCにより同定されなかった種である。 T2Dx(登録商標)装置(T2 Biosystems, Inc.、Lexington、Massachusetts)を使用して、本明細書で記載される病原体を検出する、例示的なワークフローを示す図である。
本発明は、病原体(細菌病原体を含む)を検出する、例えば、生物学的試料中の病原体を検出する方法、システム、カートリッジ、及びパネルを提供する。いくつかの実施形態では、解析物は、微生物病原体に由来する。一部の実施形態では、解析物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、又は真菌病原体(例えば、酵母(例えば、カンジダ(Candida)属種)又はアスペルギルス(Aspergillus)属種)に由来する。一部の実施形態では、解析物は、アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ピティー(Acinetobacter pittii)、及びアシネトバクター・ノソコミアリス(Acinetobacter nosocomialis))、腸内細菌(Enterobacteriaceae)科種、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(耐性マーカーであるvanA/Bを伴うE.フェシウムを含む)及びエンテロコッカス・フェカリス)、クレブシエラ(Klebsiella)属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ(例えば、耐性マーカーであるKPCを伴うK.ニューモニエを含む)及びクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca))、シュードモナス(Pseudomonas)属種(例えば、緑膿菌)、ブドウ球菌(Staphylococcus)属種(例えば、黄色ブドウ球菌(例えば、耐性マーカーであるmecAを伴う黄色ブドウ球菌)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌属種、及びコアグラーゼ陰性(CoNS)ブドウ球菌属種を含む)、レンサ球菌(Streptococcus)属種(例えば、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、B群溶血性レンサ球菌(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・アンギノースス(Streptococcus anginosus)、ウシレンサ球菌(Streptococcus bovis)、G群溶血性レンサ球菌(Streptococcus dysgalactiae)、ミュータンスレンサ球菌(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)、及び化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes))、エスケリキア(Escherichia)属種(例えば、大腸菌)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)属種(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia))、プロテウス(Proteus)属種(例えば、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及びプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris))、セラチア(Serratia)属種(例えば、セラチア菌(Serratia marcescens))、シトロバクター(Citrobacter)属種(例えば、シトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)及びシトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri))、ヘモフィルス(Haemophilus)属種(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae))、リステリア(Listeria)属種(例えば、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes))、ナイセリア(Neisseria)属種(例えば、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis))、バクテロイデス(Bacteroides)属種(例えば、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis))、バークホルデリア(Burkholderia)属種(例えば、バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia))、カンピロバクター(Campylobacter)属(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)及びカンピロバクター・コリ(Campylobacter coli))、クロストリジウム(Clostridium)属種(例えば、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens))、キンゲラ(Kingella)属種(例えば、キンゲラ・キンゲ(Kingella kingae))、モーガネラ(Morganella)属種(例えば、モーガネラ・モーガニー(Morganella morganii))、プレボテラ(Prevotella)属種(例えば、プレボテラ・ブッケ(Prevotella buccae)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、及びプレボテラ・メラニノゲニカ(Prevotella melaninogenica))、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属種(例えば、アクネ菌(Propionibacterium acnes))、サルモネラ(Salmonella)属種(例えば、サルモネラ菌(Salmonella enterica))、赤痢菌(Shigella)属種(例えば、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)及びフレキシネル赤痢菌(Shigella flexneri))、及びエンテロバクター(Enterobacter)属種(例えば、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)及びエンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae))を含む細菌病原体に由来する。一部の実施形態では、本発明の方法、システム、カートリッジ、及びパネルは、vanA、vanB、mecA、IMP、CTX-M、KPC、NDM、OXA、VIM、及びFKSを含むがこれらに限定されない、抗微生物剤耐性マーカーをさらに検出しうる。一部の実施形態では、本発明の方法、システム、カートリッジ、及びパネルは、さらなる病原体、例えば、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、及びカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis))及びアスペルギルス属種(例えば、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus))を含む真菌病原体をさらに検出しうる。本発明はまた、単一の病原体(例えば、微生物の)種に由来する複数の単位複製配列を検出する方法、システム、カートリッジ、及びパネルも提供する。一部の実施形態では、本発明の方法、システム、カートリッジ、及びパネルを、疾患、例えば、侵襲性細菌感染、菌血症、敗血症、敗血症性ショックを含むBSI、及び微生物病原体により引き起こされるか、又はこれらと関連する疾患、例えば、全身性炎症反応症候群(SIRS)と類似の症状と共に顕在化しうる疾患の診断及び/又は処置において使用することができる。
一部の実施形態では、本発明の方法及びシステムは、磁性粒子を利用する。一部の実施形態では、方法及びシステムは、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2012/054639号において記載されている通り、NMRユニット、任意選択で、1つ以上の磁気支援型アグロメレーション(MAA)ユニット、任意選択で、1つ以上の、異なる温度のインキュベーションステーション、任意選択で、1つ以上のボルテクサー、任意選択で、1つ以上の遠心分離機、任意選択で、流体操作ステーション、任意選択で、ロボットシステム、及び、任意選択で、1つ以上のモジュラーカートリッジを利用する。一部の実施形態では、本発明の方法は、完全自動システムを使用して実施する。本発明の方法、システム、デバイス、パネル、及びカートリッジを使用して、生物学的試料(例えば、とりわけ、全血、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、尿、滑液、母乳、汗、涙、唾液、精液、糞便、膣液若しくは組織、痰、鼻咽頭の吸引物若しくはスワブ、涙液、粘液、又は上皮スワブ(口腔スワブ)、及び組織(例えば、組織ホモジネート)、臓器、骨、歯)についてアッセイすることができる。
定義
本明細書で記載される磁性粒子の文脈では、「凝集」、「アグロメレーション」、及び「クラスター形成」という用語は、互換的に使用され、例えば、多価解析物、解析物の多量体形態、抗体、核酸分子、又は他の結合性分子若しくは実体を介する、2つ以上の磁性粒子の、互いとの結合を意味する。一部の場合には、磁性粒子のアグロメレーションは、可逆性である。このような凝集は、単位複製配列、及び結合性部分を保有する磁性粒子を含みうる「凝集物」の形成をもたらしうる。
本明細書で使用される「増幅」若しくは「〜を増幅する」という用語、又はこれらの派生形は、標的又は鋳型核酸をコピーし、これにより選択された核酸配列のコピー数を増大させる、当技術分野で公知の1つ以上の方法を意味する。増幅は、指数的又は直線的でありうる。標的又は鋳型核酸は、DNAの場合もあり、RNAの場合もある。このようにして増幅された配列は、「増幅領域」又は「単位複製配列(アンプリコン)」を形成する。プライマープローブは、特異的な鋳型核酸配列をターゲティングするように、当業者がたやすくデザインすることができる。
「解析物」とは、解析される試料の物質又は成分を意味する。例示的な解析物は、以下:タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、RNA、DNA、抗体、炭水化物、多糖、グルコース、脂質、ガス(例えば、酸素又は二酸化炭素)、電解質(例えば、ナトリウム、カリウム、塩化物、重炭酸塩、血中尿素窒素(BUN)、マグネシウム、リン酸塩、カルシウム、アンモニア、乳酸塩)、リポタンパク質、コレステロール、脂肪酸、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポ多糖、細胞表面マーカー(例えば、病原体の細胞表面タンパク質)、細胞質マーカー(例えば、CD4/CD8又はCD4/ウイルス負荷)、治療剤、治療剤の代謝物、兵器を検出するマーカー(例えば、化学又は生物兵器)、生物、病原体、病原体副産物、寄生虫(例えば、原虫又は蠕虫)、原生生物、真菌(例えば、酵母又はカビ)、細菌、放線菌、細胞(例えば、全細胞、腫瘍細胞、幹細胞、白血球、T細胞(例えば、CD3、CD4、CD8、IL2R、CD35、又は他の表面マーカーを提示する)、又は1つ以上の特異的マーカーにより同定される別の細胞)、ウイルス、プリオン、植物成分、植物副産物、藻類、藻類副産物、植物成長ホルモン、殺虫剤、人造毒素、環境毒素、油成分、及びこれらから派生する成分のうちの1つ以上の1つ以上の分子種を含む。
「生物学的試料」とは、対象から得られる試料であって、とりわけ、全血、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、尿、滑液、母乳、汗、涙、唾液、精液、糞便、膣液若しくは組織、痰、鼻咽頭の吸引物若しくはスワブ、涙液、粘液、又は上皮スワブ(口腔スワブ)、組織(例えば、組織ホモジネート)、臓器、骨、歯を含むがこれらに限定されない試料である。
本明細書で使用される場合、「低分子」という用語は、ヒトへの治療的使用に想定される、薬物、薬、医薬、又は他の化学合成された化合物を指す。
「バイオマーカー」とは、生物の特定の疾患状態又は特定の生理学的状態の指標として使用しうる生物学的物質であり、一般に、バイオマーカーとは、それらの濃度が、疾患状態又は機能不全の、存在又は重症度又は病期分類を反映する、体液中において測定されるタンパク質又は他の天然化合物であり、疾患若しくは障害若しくは機能不全の処置の治療的進展についてモニタリングするのに使用することができ、又は臨床転帰若しくは進行の代用測定値として使用することができる。
「単離された」核酸分子とは、それが天然の環境から取り出された核酸分子を意味する。例えば、細胞のゲノム内に存在するか、又は遺伝子バンクの一部として存在する、天然の核酸分子は、単離されていないが、例えば、クローニングイベント、増幅、又は濃縮の結果として、ゲノムの残りの部分から分離された同じ分子は、「単離されている」。典型的に、単離核酸分子は、天然のゲノム内の5'又は3'端において、隣接する核酸領域(例えば、コード領域)を含まない。このような単離核酸分子は、ベクター又は組成物の一部でありえ、このようなベクター又は組成物は、その天然環境の一部ではないので、やはり単離されているとすることができる。
本明細書で使用される場合、「連結された」とは、共有結合、非共有結合により、接合若しくは結合しており、且つ/又はファンデルワールス力、水素結合、及び/若しくは他の分子間力を介して連結されていることを意味する。
「磁性粒子」という用語は、磁化率が正で大きい材料、例えば、常磁性化合物、超常磁性化合物、及び磁鉄鉱、ガンマ酸化鉄、又は金属鉄を含む粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「非特異的可逆性」とは、液体試料中の非特異的凝集に対する、磁性粒子のコロイドの安定性及び頑健さを指し、粒子を、特異的クラスター形成部分(すなわち、解析物又はアグロメレーター)の非存在下で、意図されたアッセイ条件下に置くことにより決定することができる。例えば、非特異的可逆性は、一様な磁界(<5000ppmとして規定される)内、0.45T、37℃で3分間にわたるインキュベーションの前及び後において、磁性粒子の溶液のT2値を測定することにより決定することができる。磁性粒子を、意図されるアッセイ条件下に置く前、及び置いた後におけるT2値の差異の変動が10%未満である(例えば、変動が9%、8%、6%、4%、3%、2%、又は1%未満である)場合、磁性粒子は、非特異的可逆性を有すると見なされる。差異が、10%を超えれば、粒子は、被験緩衝液、希釈液、及びマトリックス中で不可逆性を呈し、粒子が非特異的可逆性を有するシステムを作製するには、粒子及びマトリックス特性の操作(例えば、コーティング及び緩衝液の処方)が要求されうる。別の例では、1ガウス/mm〜10000ガウス/mmの勾配磁界内のインキュベーションの前及び後で、磁性粒子の溶液のT2値を測定することにより、検査を適用することができる。
本明細書で使用される場合、「NMR緩和率」という用語は、試料中において、以下:T1、T2、T1/T2ハイブリッド、T1rho、T2rho、及びT2 *のうちのいずれかを測定することを指す。本発明のシステム及び方法は、解析物が液体試料中に存在するかどうかについて特徴的なNMR緩和率をもたらすようにデザインされる。一部の場合には、NMR緩和率は、液体試料中に存在する解析物の数量に特徴的である。
本明細書で使用される場合、「T1/T2ハイブリッド」という用語は、T1及びT2の測定を組み合わせる任意の検出法を指す。例えば、T1/T2ハイブリッドの値は、2つ以上の異なるT1及びT2測定値の組合せ、比、又はこれらの間の差異によって得られる合成信号でありうる。T1/T2ハイブリッドは、例えば、T1及びT2を、交互に測定するか、又はインターリーブで収集したパルス列を使用することにより得ることができる。加えて、T1/T2ハイブリッド信号は、T1及びT2両方の緩和率又は機構から構成される緩和率を測定するパルス列により収集することができる。
「病原体」とは、その宿主に対して、疾患又は疾病を引き起こす作用物質、例えば、別の生物において疾患をもたらすことが可能な生物又は感染性粒子を意味し、細菌、ウイルス、原虫、プリオン、酵母及び真菌、又は病原体の副産物を含むがこれらに限定されない。「病原体副産物」とは、病原体から生じる生物学的物質であって、宿主に有害でありうるか、又は過剰な宿主免疫応答を刺激しうる生物学的物質、例えば、病原体の抗原、代謝物質、酵素、生物学的物質、又は毒素である。
「病原体関連解析物」とは、試料中の病原体(例えば、細菌、真菌、又はウイルス)の存在に特徴的な解析物を意味する。病原体関連解析物は、病原体に由来する特定の物質(例えば、病原体により産生される、タンパク質、核酸、脂質、多糖、又は他の任意の材料)、又は病原体に由来する混合物(例えば、全細胞又は全ウイルス)でありうる。ある特定の場合に、病原体関連解析物を、検出される病原体の属、種、又は特異的な株に特徴的であるように選択する。代替的に、病原体関連解析物を、病原体の特性、例えば、特定の治療に対する耐性を確認するように選択する。一部の実施形態では、病原体関連解析物は、増幅された標的核酸でありうる。他の実施形態では、病原体関連解析物は、病原体による感染に応答して発現する、宿主抗体又は他の免疫系タンパク質(例えば、IgM抗体、IgA抗体、IgG抗体、又は主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質)でありうる。
「パルス列」又は「RFパルス列」とは、試料へと適用され、例えば、ある特定のNMR緩和率、例えば、スピンエコー列を測定するようにデザインされた、1つ以上のラジオ周波数のパルスを意味する。パルス列はまた、1つ以上のパルスの後における信号の収集であって、ノイズを最小化し、結果として得られる信号値の精度を改善する収集も含みうる。
本明細書で使用される場合、「信号」という用語は、NMR緩和率、周波数のシフト、磁化率の測定値、拡散の測定値、又は相関の測定値を指す。
本明細書で使用される場合、磁性粒子の「サイズ」に対する言及は、顕微鏡法、光散乱、又は他の方法により決定される、磁性粒子の混合物についての平均直径を指す。
「対象」とは、動物、好ましくは哺乳動物(例えば、齧歯動物(例えば、マウス又はラット)、農場動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びロバ)、愛玩動物(例えば、ネコ及びイヌ)、又は霊長動物(例えば、非ヒト霊長動物及びヒト)を含む)である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者(例えば、病原体と関連するか、又はこれにより引き起こされる疾患を有するか、又はこれを有することが疑われる患者)でありうる。
本明細書で使用される場合、「実質的に単分散」という用語は、光散乱測定における粒子サイズの分布曲線の形状により決定されるサイズ分布において、多分散性を有する磁性粒子の混合物を指す。粒子分布曲線のFWHM(半値全幅)であって、ピーク位置から25%未満であるFWHMは、実質的に単分散であると考えられる。加えて、光散乱実験では1つのピークだけが観察されるべきであり、ピーク位置は、公知の単分散粒子集団の1標準偏差以内にあるものとする。
「粒子1つ当たりのT2緩和度」とは、磁性粒子の集団内の、粒子1つ当たりの平均T2緩和度を意味する。
本明細書で使用される場合、「非分画」とは、被験試料のうちのいずれの成分も、磁性粒子を試料へと添加した後、及びNMR緩和を測定する前に除去しないアッセイを指す。
特許請求される発明のユニット、方法、システム、及び工程は、本明細書で記載される実施形態からの情報を使用して開発される変化形及び適応形を包含することが想定される。本明細書を通して、ユニット及びシステムについて、特異的成分を有するか、若しくはこれらを含むものとして記載する場合、又は工程及び方法について、特異的ステップを有するか、若しくはこれらを含むものとして記載する場合、さらに、列挙された成分から本質的になるか、又はこれらからなる、本発明のユニット及びシステムが存在し、列挙された処理ステップから本質的になるか、又はこれらからなる、本発明に従う工程及び方法が存在することが想定される。本発明が作動可能なままである限りにおいて、ステップの順序、又はある特定の動作を実施する順序は、重要ではないことを理解されたい。さらに、多くの場合、2つ以上のステップ又は動作を、同時に行うことができる。
磁性粒子及びNMRベースの検出
本発明の方法及びシステムは、磁性粒子及びNMRの使用を伴いうる。解析物又は多価結合剤の存在下で、凝集物が形成されるように、磁性粒子を、結合性部分(例えば、オリゴヌクレオチド、抗体など)でコーティングすることができる。凝集は、溶媒のT2信号を破壊する微視的磁性の非一様性から試料の一部を除去し、T2緩和の増大をもたらす(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第WO2012/054639号の図3を参照されたい)。
T2の測定は、全てのスピン総体についての単一の尺度であり、測定は、典型的に、1〜10秒間にわたり存続し、これは、溶媒が、液体試料中の微視的非一様性と比べて長い距離である、数百ミクロン移動することを可能とする。各溶媒分子は、液体試料中のある容量をサンプリングし、T2信号は、試料中の溶媒分子上の全体(核スピン)の平均(正味の全信号)であり、言い換えれば、T2の測定値は、溶媒分子が経験する全環境の正味の測定値であり、試料中の全ての微視的非一様性についての平均測定値である。
液体試料中の溶媒分子の観察されるT2緩和率は、磁界の存在下では、高度な磁性双極子モーメントを形成する磁性粒子によって支配される。磁性粒子の非存在下では、液体試料について観察されるT2緩和率は、典型的に長い(すなわち、T2(水)=約2000ミリ秒、T2(血液)=約1500ミリ秒)。粒子濃度を増大させると、試料中の微視的非一様性は増大し、これらの微視的非一様性を通した溶媒の拡散は、スピンデコヒーレンスの増大及びT2値の低下をもたらす。観察されるT2値は、非直線的な形で、粒子濃度に依存し、粒子パラメータ1つ当たりの緩和度に依存する。
本発明の凝集アッセイでは、磁性粒子の数、及び、存在する場合、アグロメラント粒子の数は、アッセイ中に一定のままである。粒子がクラスター形成すると、粒子の空間的分布は変化する。粒子の、より均一な粒子分布ではなく、クラスターへの局在化を促進するため、凝集は、溶媒分子の平均「経験」を変化させる。高度の凝集時には、多くの溶媒分子は、磁性粒子により創出される微視的非一様性を経験せず、T2は、溶媒のT2に近づく。液体試料中では、凝集した磁性粒子の画分が増大するので、観察されるT2は、凝集及び単独(非凝集)磁性粒子の非一様な懸濁液についての平均である。本発明のアッセイは、凝集によるT2の変化を最大化させて、解析物の存在、及び解析物濃度の差異に対するアッセイの感度を増大させるようにデザインする。
一部の実施形態では、本発明の方法は、溶液(例えば、生物学的試料)を、液体試料1ミリリットル当たり、1×106〜1×1013個の間の磁性粒子(例えば、1ミリリットル当たり、1×106〜1×108、1×107〜1×108、1×107〜1×109、1×108〜1×1010、1×109〜1×1011、又は1×1010〜1×1013個の磁性粒子)と接触させるステップを伴う。
一部の実施形態では、本発明の方法及びシステムにおいて使用される磁性粒子は、150nm〜1200nm(例えば、150〜250、200〜350、250〜450、300〜500、450〜650、500〜700nm、700〜850、800〜950、900〜1050、又は1000〜1200nm)の平均直径を有する。例えば、一部の実施形態では、本発明の方法で使用される磁性粒子は、150nm〜699nm(例えば、150〜250、200〜350、250〜450、300〜500、450〜650、又は500〜699nm)の平均直径を有しうる。他の実施形態では、本発明の方法で使用される磁性粒子は、700nm〜1200nm(例えば、700〜850、800〜950、900〜1050、又は1000〜1200nm)の平均直径を有しうる。特定の実施形態では、磁性粒子は、700nm〜950nm(例えば、700〜750、700〜800、700〜850、又は700〜900nm)の平均直径を有しうる。
一部の実施形態では、本発明の方法で使用される磁性粒子は、粒子1つ当たり1×108〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度(例えば、1×108〜1×109、1×108〜1×1010、1×109〜1×1010、1×109〜1×1011、又は1×1010〜1×1012mM-1s-1)を有しうる。一部の実施形態では、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度(例えば、1×109〜1×1010、1×109〜1×1011、又は1×1010〜1×1012mM-1s-1)を有する。
一部の実施形態では、磁性粒子は、実質的に単分散でありうる。一部の実施形態では、液体試料(例えば、生物学的試料、例えば、全血)中の磁性粒子は、1つ以上の解析物及び/又は多価結合剤の非存在下では、非特異的可逆性を呈しうる。一部の実施形態では、磁性粒子は、アルブミン、魚類皮膚ゼラチン、ガンマグロブリン、リゾチーム、カゼイン、ペプチダーゼ、及びアミン保有部分(例えば、アミノポリエチレングリコール、グリシン、エチレンジアミン、又はアミノデキストランから選択されるブロッキング剤で修飾された表面をさらに含みうる。
解析物
本発明の実施形態は、1つ以上の解析物を検出及び/又はこれらの濃度を測定する方法及びシステムを含む。いくつかの実施形態では、解析物は、生物に由来する核酸でありうる。一部の実施形態では、核酸は、生物に由来する標的核酸であって、単位複製配列を形成するように増幅された標的核酸である。一部の実施形態では、生物は、植物、哺乳動物、又は微生物種である。
一部の実施形態では、解析物は、微生物病原体に由来しうる。一部の実施形態では、解析物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、又は真菌病原体(例えば、酵母(例えば、カンジダ属種)又はアスペルギルス属種)に由来する。一部の実施形態では、解析物は、アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ピティー、及びアシネトバクター・ノソコミアリス)、腸内細菌科種、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(耐性マーカーであるvanA/Bを伴うE.フェシウムを含む)及びエンテロコッカス・フェカリス)、クレブシエラ属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ(例えば、耐性マーカーであるKPCを伴うK.ニューモニエ)及びクレブシエラ・オキシトカ)、シュードモナス属種(例えば、緑膿菌)、ブドウ球菌属種(例えば、黄色ブドウ球菌(例えば、耐性マーカーであるmecAを伴う黄色ブドウ球菌)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌属種、及びコアグラーゼ陰性(CoNS)ブドウ球菌属種)、レンサ球菌属種(例えば、ストレプトコッカス・ミティス、肺炎レンサ球菌、B群溶血性レンサ球菌、ストレプトコッカス・アンギノースス、ウシレンサ球菌、G群溶血性レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サングイニス、及び化膿レンサ球菌)、エスケリキア属種(例えば、大腸菌)、ステノトロホモナス属種(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、プロテウス属種(例えば、プロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス)、セラチア属種(例えば、セラチア菌)、シトロバクター属種(例えば、シトロバクター・フロインディー及びシトロバクター・コセリ)、ヘモフィルス属種(例えば、インフルエンザ菌)、リステリア属種(例えば、リステリア・モノサイトゲネス)、ナイセリア属種(例えば、髄膜炎菌)、バクテロイデス属種(例えば、バクテロイデス・フラジリス)、バークホルデリア属種(例えば、バークホルデリア・セパシア)、カンピロバクター属(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリ)、クロストリジウム属種(例えば、ウェルシュ菌)、キンゲラ属種(例えば、キンゲラ・キンゲ)、モーガネラ属種(例えば、モーガネラ・モーガニー)、プレボテラ属種(例えば、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ・インターメディア、及びプレボテラ・メラニノゲニカ)、プロピオニバクテリウム属種(例えば、アクネ菌)、サルモネラ属種(例えば、サルモネラ菌)、赤痢菌属種(例えば、志賀赤痢菌及びフレキシネル赤痢菌)、及びエンテロバクター属種(例えば、エンテロバクター・アエロゲネス及びエンテロバクター・クロアカ)を含む細菌病原体に由来する。一部の実施形態では、解析物は、抗微生物剤耐性マーカーである。例示的で非限定的な抗微生物剤耐性マーカーは、vanA、vanB、mecA、IMP、CTX-M、KPC、NDM、OXA、VIM、及びFKSを含む。一部の実施形態では、解析物は、真菌病原体、例えば、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリス)及びアスペルギルス属種(例えば、アスペルギルス・フミガーツス)に由来する。
特定の実施形態では、病原体関連解析物は、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌から選択される細菌病原体に由来しうる。一部の実施形態では、解析物は、真菌病原体、例えば、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、及びカンジダ・トロピカリス)に由来しうる。
一部の実施形態では、病原体関連解析物は、上記で記載した生物のうちのいずれかに由来する核酸、例えば、DNA又はRNA(例えば、mRNA)でありうる。一部の実施形態では、核酸は、生物に由来する標的核酸であって、単位複製配列を形成するように増幅された標的核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、マルチコピー遺伝子座でありうる。特に、増幅を伴う方法における、マルチコピー遺伝子座に由来する標的核酸の使用は、アッセイにおける感度の増大をもたらしうる。例示的なマルチコピー遺伝子座は、例えば、リボソームDNA(rDNA)オペロン及びマルチコピープラスミドを含みうる。他の実施形態では、標的核酸は、シングルコピー遺伝子座でありうる。特定の実施形態では、標的核酸は、必須遺伝子座、例えば、必須のハウスキーピング遺伝子に由来しうる。特定の実施形態では、標的核酸は、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力遺伝子)に由来しうる。上記の実施形態のうちのいずれかでは、遺伝子座は、遺伝子及び/又は遺伝子内領域、例えば、rRNA遺伝子の間の内部転写配列(ITS)(例えば、16S rRNA遺伝子及び23S rRNA遺伝子の間のITS1、又は5S rRNA遺伝子及び23S rRNA遺伝子の間のITS2)を含みうる。
一部の実施形態では、標的核酸は、(a)種特異的、(b)種包含的(言い換えれば、所与の種の全ての株又は亜種に存在する)、(c)増幅/検出プロトコールに適合的、且つ/又は(d)複数のコピー内に存在しうる。特定の実施形態では、標的核酸は、染色体によりコードされ、これは、例えば、プラスミド交換及びプラスミドキュアリング/形質導入イベントによる喪失を回避する一助となりうる。
アシネトバクター属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、アシネトバクター属種、例えば、アシネトバクター・バウマニに特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニの標的核酸は、下記で記載される、アシネトバクター・バウマニに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、アシネトバクター・バウマニ菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのアシネトバクター属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、アシネトバクター属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのアシネトバクター属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、アシネトバクター属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、アシネトバクター属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、アシネトバクター属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もある。一部の実施形態では、アシネトバクター属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。他の実施形態では、アシネトバクター属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。
一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニの標的核酸は、5S及び23S rRNA遺伝子の間の内部転写配列(ITS)(すなわち、ITS2領域)の一部又は全部にわたる領域に由来する。例えば、特定の実施形態では、アシネトバクター・バウマニの標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-CGT TTT CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG-3'(配列番号1)又は5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。例えば、特定の実施形態では、アシネトバクター・バウマニの標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中のアシネトバクター・バウマニ存在を検出する。アシネトバクター・バウマニの標的核酸を増幅するのに使用しうる、代替的なフォワードプライマーは、5'-CTG AGT TCG GGA AGG GAT CAG G-3'(配列番号66)、5'-CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG CTG A-3'(配列番号67)、5'-AAA CCA AAT CTG TAA CAG ACT GGG CTG A-3'(配列番号68)、5'-ATG GGT AAT CCC ACA CTA CCA TCA G-3'(配列番号69)、5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号69)、及び5'-ACT CTT GCT ATG GTC GCC AGC ACA ACT-3'(配列番号70)を含む。アシネトバクター・バウマニの標的核酸を増幅するのに使用しうる、代替的なリバースプライマーは、5'-CGT GAG GCT TGA CTA TAC AAC ACC C-3'(配列番号72)、5'-CTT GAC TAT ACA ACA CCC AAG CAG TT-3'(配列番号73)、及び5'-GGC TTG ACT ATA CAA CAC CCA AGC AGT T-3'(配列番号74)を含む。
一部の実施形態では、A.バウマニの対照標的核酸は、配列番号45の核酸配列を含みうる。
エンテロコッカス属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、エンテロコッカス属種、例えば、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスに特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムの標的核酸は、エンテロコッカス・フェシウムに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、エンテロコッカス・フェシウム菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、標的核酸は、複数の(例えば、2つ、3つ、4つ、又は5つの)エンテロコッカス属種に特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、標的核酸は、下記で記載される、エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・フェカリスに特異的な配列エレメントを含みうる。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのエンテロコッカス属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのエンテロコッカス属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、エンテロコッカス属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もある。一部の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。特定の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。
一部の実施形態では、エンテロコッカス属種の標的核酸は、23S及び5S rRNA遺伝子の間のITSの一部又は全部にわたる領域に由来する。例えば、特定の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・フェカリスに特異的な標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-AAA ACT TAT ATG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号19)若しくは5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG-3'(配列番号20)若しくは5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中のエンテロコッカス・フェシウムの存在を検出する。特定の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中のエンテロコッカス・フェシウムの存在を検出する。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中のエンテロコッカス・フェカリスの存在を検出する。エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・フェカリスに特異的な標的核酸を増幅するのに使用しうる、代替的なフォワードプライマーは、5'-GTG AAG CCC ACC TCA AGA TGA GAT-3'(配列番号75)、5'-TGT TCT GCC AAG GGC ATT GCT G-3'(配列番号76)、及び5'-CTA TGT AGG GAA GGG ATA AAC GCT GA-3'(配列番号77)を含む。エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・フェカリスに特異的な標的核酸を増幅するのに使用しうる、代替的なリバースプライマーは、5'-ACA ATC GGC GCT AGA AGC TTA ACT-3'(配列番号78)、5'-ACA GGT GTA TCC TTC TCG CTA TCG C-3'(配列番号79)、5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号80)、及び5'-TCG GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号81)を含む。
一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムの対照標的核酸は、配列番号46の核酸配列を含みうる。他の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムの対照標的核酸は、配列番号118の核酸配列を含みうる。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリスの対照標的核酸は、配列番号47の核酸配列を含みうる。
クレブシエラ属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、クレブシエラ属種、例えば、クレブシエラ・ニューモニエに特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエの標的核酸は、下記で記載される、クレブシエラ・ニューモニエに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、クレブシエラ・ニューモニエ菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのクレブシエラ属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、クレブシエラ属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのクレブシエラ属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、クレブシエラ属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、クレブシエラ属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、クレブシエラ属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もある。一部の実施形態では、クレブシエラ属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。特定の実施形態では、クレブシエラ属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエの標的核酸は、23S rRNA遺伝子に由来する。例えば、特定の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエの標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)又は5'-GAG GCA CTA CGG TGC TGA AGT A-3'(配列番号82)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中のクレブシエラ・ニューモニエの存在を検出する。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエの対照標的核酸は、配列番号48の核酸配列を含みうる。
シュードモナス属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、シュードモナス属種、例えば、緑膿菌に特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、緑膿菌の標的核酸は、下記で記載される、緑膿菌に特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、緑膿菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのシュードモナス属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、シュードモナス属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのシュードモナス属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、シュードモナス属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、シュードモナス属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、シュードモナス属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もある。一部の実施形態では、シュードモナス属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。特定の実施形態では、シュードモナス属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。
一部の実施形態では、緑膿菌の標的核酸は、23S及び5S rRNA遺伝子の間のITSの一部又は全部にわたる領域に由来する。例えば、特定の実施形態では、緑膿菌の標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-GTG TGT TGT AGG GTG AAG TCG AC-3'(配列番号31)若しくは5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-CAC CTT GAA ATC ACA TAC CTG A-3'(配列番号32)若しくは5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の緑膿菌の存在を検出する。特定の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む5'側捕捉プローブ及び/又はオリゴヌクレオチド5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の緑膿菌の存在を検出する。緑膿菌に特異的な標的核酸を増幅するのに使用しうる、代替的なフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ、5'-CTC ACT GGG AAC TTG ATT CCC CTG-3'(配列番号83)及び5'-GGT GGT TCC AAC GCT CTA TGA TCG T-3'(配列番号84)である。
一部の実施形態では、緑膿菌の対照標的核酸は、配列番号49の核酸配列を含みうる。
ブドウ球菌属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、ブドウ球菌属種、例えば、黄色ブドウ球菌に特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、下記で記載される、黄色ブドウ球菌に特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、黄色ブドウ球菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのブドウ球菌属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、ブドウ球菌属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのブドウ球菌属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、ブドウ球菌属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、ブドウ球菌属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、ブドウ球菌属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もあり、抗生剤耐性に関与する遺伝子(例えば、femA及びfemB)に由来する場合もある。一部の実施形態では、ブドウ球菌属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。特定の実施形態では、ブドウ球菌属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。
一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、femABオペロンに由来する。femABオペロンは、ペプチドグリカン内の、ブドウ球菌によるペンタグリシンペプチド間架橋の形成に関与する、2つのほぼ同一な、約50kDaのタンパク質をコードする。これらの、染色体によりコードされるタンパク質は、メチシリン耐性のレベルに影響を及ぼす因子であり、必須のハウスキーピング遺伝子であると考えられる。femBは、graRともまた称し、メチシリン耐性の応答調節因子の2つの成分である、femA/Bオペロン内の1つの遺伝子である。femBが、アミノアシルトランスフェラーゼをコードするのに対し、femAは、femBの発現、したがって、メチシリン耐性の発現に必須の調節因子をコードする。
一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、femA遺伝子に由来する。例えば、特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GGT AAT GAATTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。「/i6diPr/」とは、dTと塩基対合すると、3つの水素結合を形成しうる修飾塩基である、2,6-ジアミノプリンを示すことに留意されたい。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の黄色ブドウ球菌の存在を検出する。femA遺伝子を増幅するのに有用である、代替的なフォワードプライマーは、5'-ACT GCT GTA CCT GTT ATG AAA GTG T-3'(配列番号85)、5'-GCT TGC TTA CTT ACT GCT GTA CCT G-3'(配列番号86)、5'-GCC ATA CAG TCA TTT CAC GCA AAC-3'(配列番号87)、5'-CCT GTG TTA CAA ATT CGT TAT CAC T-3'(配列番号88)、及び5'-ACC T/i6diPr/T CTC TGC TGG TTT CTT CTT-3'(配列番号89)を含む。femA遺伝子の一部を増幅するのに有用である、代替的なリバースプライマーは、5'-GCA TTA CCT GTA ATC TCG CCA TCA T-3'(配列番号90)、5'-AGC TTT TGA TTC TGA CGT ATC TTC C-3'(配列番号91)、5'-GAT CAG CGA AAG CTT TTG ATT CTG ACG T-3'(配列番号92)、及び5'-CAG CAT CTT C/i6diPr/G CAT CTT CTG TAA A-3'(配列番号93)を含む。
一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、femB遺伝子に由来する。例えば、他の特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の黄色ブドウ球菌の存在を検出する。一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌の標的核酸は、femA遺伝子及びfemB遺伝子の両方の全部又は一部を含む。
一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌のfemAの対照標的核酸は、配列番号50の核酸配列を含みうる。一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌のfemBの対照標的核酸は、配列番号51の核酸配列を含みうる。
エスケリキア属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、エスケリキア属種、例えば、大腸菌に特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、大腸菌の標的核酸は、下記で記載される、大腸菌に特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、大腸菌が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのエスケリキア属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、エスケリキア属種の標的核酸は、それらの各々が、全てのエスケリキア属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、エスケリキア属種菌が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、エスケリキア属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、エスケリキア属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もあり、抗生剤耐性に関与する遺伝子に由来する場合もある。一部の実施形態では、エスケリキア属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。特定の実施形態では、エスケリキア属種の標的核酸は、マルチコピープラスミドに由来しうる。特定の実施形態では、大腸菌の標的核酸は、yfcL遺伝子である。yfcL遺伝子は、大腸菌特異的なシャペロン-アッシャー型線毛遺伝子クラスター内にある(例えば、Wurpelら、PLoS One、8巻、e52835、2013を参照されたい)。Yfc型オペロンは、全ての被験株内に存在する。yfcLは、大腸菌内に高度に保存されており、全ての株内に存在し、配列情報も利用可能である。
例えば、一部の実施形態では、大腸菌のyfcLは、オリゴヌクレオチド配列5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)又は5'-CGA CGG TAT GGT TGA CCA TGC-3'(配列番号60)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)又は5'-GAC GCC TGC TGA AAC AGG TTT TCC-3'(配列番号62)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。特定の実施形態では、大腸菌のyfcLは、オリゴヌクレオチド配列5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)、5'-GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号107)、5'-TGC CAG TGA TGA TGA GTT GT-3'(配列番号108)、若しくは5'-GCC ACC TGA CAT TAG CCA TC-3'(配列番号109)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)若しくは5'-GGT GCA TAC GAC CGT TAG CCA GAG TC-3'(配列番号65)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の大腸菌の存在を検出する。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の大腸菌の存在を検出する。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号107)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の大腸菌の存在を検出する。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TGC CAG TGA TGA TGA GTT GT-3'(配列番号108)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の大腸菌の存在を検出する。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-GCC ACC TGA CAT TAG CCA TC-3'(配列番号109)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の大腸菌の存在を検出する。一部の実施形態では、5'側捕捉プローブ及び/又は3'側捕捉プローブを、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせる。
カンジダ属の標的核酸
一部の実施形態では、標的核酸は、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、及びカンジダ・トロピカリス)に特異的な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、カンジダ・アルビカンスの標的核酸は、カンジダ・アルビカンスに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、カンジダ・アルビカンス細胞が、試料中に存在したことを示すであろう。他の実施形態では、本発明の標的核酸は、全てのカンジダ属種に共通な配列エレメントを含みうる。例えば、一部の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、下記で記載されるように、それらの各々が、全てのカンジダ属種に対してユニバーサルである、フォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下で増幅することができる。試料中のこのような標的核酸の検出は、典型的に、カンジダ属種細胞が、試料中に存在したことを示すであろう。さらに他の実施形態では、これらの手法を組み合わせることができる。
一部の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、直鎖状染色体に由来する場合もあり、直鎖状又は環状プラスミド(例えば、シングルコピープラスミド、低コピープラスミド、又はマルチコピープラスミド)に由来する場合もある。一部の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、必須遺伝子座(例えば、必須ハウスキーピング遺伝子)に由来する場合もあり、毒力に関与する遺伝子座(例えば、毒力に不可欠の遺伝子)に由来する場合もある。一部の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、マルチコピー遺伝子座に由来しうる。例えば、一部の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、リボソームDNAオペロンに由来しうる。
特定の実施形態では、カンジダ属種の標的核酸は、オリゴヌクレオチド配列5'-GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC-3'(配列番号13)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG GT-3'(配列番号14)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。
変異体プライマー及びプローブ
一部の実施形態では、本発明は、上記で記載したプライマーのうちのいずれかとの、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)を有するプライマーを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明は、配列番号1、3、5、7、9、11、59、又は110のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一)であるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一)であるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを提供する。このようなプライマーは、本明細書で記載される本発明の方法のうちのいずれかにおいて使用することができる。
一部の実施形態では、本発明は、上記又は本明細書で記載されるプローブのうちのいずれかとの、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)を有するプローブを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明は、配列番号15、19、23、27、31、35、39、63、107、108、109、111、又は114のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一)であるオリゴヌクレオチド配列を含む5'側捕捉プローブを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号16、20、24、28、32、36、40、64、112、又は115のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一)であるオリゴヌクレオチド配列を含む3'側捕捉プローブを提供する。
このようなプローブは、本明細書で記載される本発明の方法のうちのいずれかにおいて使用することができる。
一部の実施形態では、先行するプライマー又はプローブのうちのいずれかは、1つ以上の修飾塩基、例えば、2,6-ジアミノプリン(本明細書では、「/i6diPr/」と略記する)、又は当技術分野で公知の他の修飾塩基を含みうる。
医学的状態
本発明の方法はまた、疾患及び他の医学的状態をモニタリングし、診断するのにも使用することができる。一部の実施形態では、本発明の方法を使用して、マルチプレックス化され、自動式であるが、試料の調製は伴わないシステムにおいて、疾患をモニタリングし、診断することができる。
本発明の方法及びシステムを使用して、対象における疾患の発症機序を同定及びモニタリングし、治療的介入を選択し、選択された処置の有効性をモニタリングすることができる。例えば、菌血症及び/又は敗血症を有するか、又はこれらの危険性がある患者に、本発明の方法及びシステムを使用して、感染性の病原体、病原体負荷を同定し、感染の状態を示す白血球カウント及び/又はバイオマーカーをモニタリングすることができる。病原体の識別を使用して、適切な治療を選択することができる。一部の実施形態では、方法は、感染性の疾患をモニタリング又は診断した後で、治療剤を投与するステップをさらに含みうる。また、治療的介入(例えば、特定の抗生剤)をモニタリングして、処置レジメンを、抗生剤の循環濃度及び病原体の負荷と相関させて、患者が、処置に対して応答することを確実にすることもできる。
本発明の方法及びシステムにより診断及び/又はモニタリングされうる例示的な疾患は、微生物病原体(例えば、細菌感染又は真菌感染)により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患、ライム病、血流感染(例えば、菌血症又は真菌血症)、肺炎、腹膜炎、骨髄炎、髄膜炎、膿胸、尿路感染、敗血症、敗血症性ショック、及び敗血症性関節炎)、及び微生物病原体により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患と類似の症状を伴って顕在化しうる疾患(例えば、SIRS)を含む。
例えば、本発明の方法及びシステムを使用して、以下の非限定的な病原体の例:アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ピティー、及びアシネトバクター・ノソコミアリス)、腸内細菌科種、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(耐性マーカーであるvanA/Bを伴うE.フェシウムを含む)及びエンテロコッカス・フェカリス)、クレブシエラ属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ(例えば、耐性マーカーであるKPCを伴うK.ニューモニエ)及びクレブシエラ・オキシトカ)、シュードモナス属種(例えば、緑膿菌)、ブドウ球菌属種(例えば、黄色ブドウ球菌(例えば、耐性マーカーであるmecAを伴う黄色ブドウ球菌)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌属種、及びコアグラーゼ陰性(CoNS)ブドウ球菌属種)、レンサ球菌属種(例えば、ストレプトコッカス・ミティス、肺炎レンサ球菌、B群溶血性レンサ球菌、ストレプトコッカス・アンギノースス、ウシレンサ球菌、G群溶血性レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サングイニス、及び化膿レンサ球菌)、エスケリキア属種(例えば、大腸菌)、ステノトロホモナス属種(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、プロテウス属種(例えば、プロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス)、セラチア属種(例えば、セラチア菌)、シトロバクター属種(例えば、シトロバクター・フロインディー及びシトロバクター・コセリ)、ヘモフィルス属種(例えば、インフルエンザ菌)、リステリア属種(例えば、リステリア・モノサイトゲネス)、ナイセリア属種(例えば、髄膜炎菌)、バクテロイデス属種(例えば、バクテロイデス・フラジリス)、バークホルデリア属種(例えば、バークホルデリア・セパシア)、カンピロバクター属(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリ)、クロストリジウム属種(例えば、ウェルシュ菌)、キンゲラ属種(例えば、キンゲラ・キンゲ)、モーガネラ属種(例えば、モーガネラ・モーガニー)、プレボテラ属種(例えば、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ・インターメディア、及びプレボテラ・メラニノゲニカ)、プロピオニバクテリウム属種(例えば、アクネ菌)、サルモネラ属種(例えば、サルモネラ菌)、赤痢菌属種(例えば、志賀赤痢菌及びフレキシネル赤痢菌)、及びエンテロバクター属種(例えば、エンテロバクター・アエロゲネス及びエンテロバクター・クロアカ)を含む細菌病原体、並びにカンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリス)及びアスペルギルス属種(例えば、アスペルギルス・フミガーツス)を含むがこれらに限定されない真菌病原体により引き起こされる疾患を診断及び/又はモニタリングすることができる。
アシネトバクター・バウマニ
アシネトバクター・バウマニは、系統発生的には、ガンマプロテオバクテリア(Gammaproteobacteria)綱、シュードモナス(Pseudomonadales)目、モラクセラ(Moraxellaceae)科、及びアシネトバクター属内に分類される。属内には、A.ルオフィイ(A. lwoffii)、A.ジュニイ(A. junii)、並びにA.バウマニ、A.カルコアセティクス(A. calcoaceticus)、A.ピティー(A. pitti)、及びA.ノソコミアリス(A. nosocomialis)を含む、近縁の群を含む、少なくとも18の公知の種がある。現在規定されているアシネトバクター属のメンバーは、DNAG/C含量を39%〜47%とする、グラム陰性、厳密に好気性、非発酵性、非選好性、非運動性、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性の細菌として特徴づけられる。
A.バウマニは、耐性の獲得により、抗生剤の使用に対して極度に適応性である。全ての公知の抗生剤に対する耐性株が報告されている。A.バウマニは、院内環境で肺炎を引き起こすが、また、中枢神経系、皮膚及び軟部組織、並びに骨に関与する感染も引き起こす。A.バウマニは、典型的に、全ての菌血症例のうちの約1.3%を引き起こす、集中治療室(ICU)関連作用物質である。しかし、A.バウマニによる敗血症例の死亡率を超えるのは、シュードモナス属及びカンジダ属による感染だけである(例えば、Pelegら、Clin. Microbiol. Rev. 21(3):538〜582、2008を参照されたい)。
エンテロコッカス属種
エンテロコッカス属種は、ヒト及び動物の、正常腸内微生物叢の一部であるが、また、重度の感染の一因となる、重要な病原体でもある。エンテロコッカス属種は、系統発生的に、エンテロコッカス属、エンテロコッカス(Enterococcaceae)科、ラクトバチルス(Lactobaciliales)目、バチルス(Bacilli)綱、及びフィルミクテス(Firmicutes)門(大半のグラム陽性種を含む)内に分類される。エンテロコッカス属は、20を超える種を含むが、ヒトにおいて臨床的感染を引き起こすのは、少数に限られる。抗生剤耐性が増大すると、エンテロコッカス属は、処置が困難でありうる、院内感染性病原体として認識される。
エンテロコッカス属種は、多くの環境内で生存及び増殖しうる、グラム陽性、耐久性、通性嫌気性の生物である。エンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウムは、ヒトから培養されたこの属の最蔓延種であり、臨床分離株のうちの90%超を占める。ヒト感染を引き起こすことが公知の他の腸球菌種は、E.アビウム(E. avium)、E.ガリナルム(E. gallinarum)、E.カセリフラブス(E. casseliflavus)、E.デューランス(E. durans)、E.ラフィノースス(E. raffinosus)、及びE.ムンディティー(E. mundtii)を含む。E.フェシウムは、最も蔓延するバンコマイシン耐性(VRE)エンテロコッカス属種を表す。
クレブシエラ・ニューモニエ
クレブシエラ・ニューモニエは、ラクトース発酵性腸内細菌科に属し、水中、土壌中、及び植物中に生息することが可能であり、ヒト及び動物に対して病原性である、桿菌様のグラム陰性ガンマプロテオバクテリアである。この種は、メチルレッド試験及びフォーゲス-プロスカウエル反応(MR-VP)により、表現型的に区別されうる、亜種ニューモニア(pneumonia)、オゼネ(ozaenae)、及びリノスクレロマティス(rhinoscleromatis)へと分けられる。亜種リノスクレロマティスは、上気道感染を引き起こし、大半は、熱帯気候に限定される。
緑膿菌
シュードモナス(Pseudomonadaceae)科のシュードモナス属の種は、運動性グラム陰性好気性細菌であり、典型的に、極性鞭毛を伴う、約2〜4μmの長さの膨満型桿菌である。緑膿菌は、外毒素A及びエンテロトキシンを含む、多種多様な細胞外毒素を産生しうる。他の物質、例えば、シアン化水素酸、タンパク質分解性酵素、毒性表面粘液、及び溶血性物質もまた、この種の病原性に寄与しうる。有害物質と組み合わされた毒素は、様々な異なる宿主内の、緑膿菌の高毒力の決定因子である。緑膿菌はまた、開放火傷にもたやすく定着することが可能であり、浮腫、並びに/又は創傷縁辺部における非火傷皮膚の変色、及び皮下脂肪内の緑色色素を伴う、感染、膿瘍、及び敗血症を引き起こす。緑膿菌はまた、外耳炎(swimmer's ear(otitis externa))とも関連しうる。他のシュードモナス属種は、日和見性でもあるが、感染の症例はまれである。
大腸菌
大腸菌は、腸内細菌科に属する、グラム陰性桿菌様細菌である。この細菌は、ヒト及び動物の消化管の微生物叢の通性常在菌であり、したがって、環境内に遍在し、夥多である。大腸菌は、入院を要求する臨床感染のうちの約17%を占め、黄色ブドウ球菌に次いで2番目である。大腸菌は、感染、例えば、肺炎、胆嚢炎、菌血症、胆管炎、肺炎、及び尿路感染を引き起こす。大腸菌はまた、新生児髄膜炎ともますます関連しており、これは、約8%の死亡率を有する。大腸菌は、大腸菌分離株の多数の抗原(>700の抗原型)又は血清型に反映される通り、系統発生的に多様である。このような抗原は、O、H、及びKの抗原分類に基づく。大腸菌及び赤痢菌属は、非常に近い近縁菌であり、いくつかの特徴、例えば、毒力、腸管侵襲性、及び毒性を共有する。大腸菌は、とりわけ、最も一般的な抗生剤に対して耐性であるが、フルオロキノロンに対しても耐性である、配列型ST131として公知である大腸菌の株の出現以来、抗生剤耐性の主要な焦点となっている。この株型は、介護施設、病院、長期療養施設において最も一般に見出され、血流感染の重症度において、重要な役割を果たしている。
黄色ブドウ球菌
黄色ブドウ球菌は、ブドウ球菌(Staphylococcaceae)科に属する、グラム陽性、カタラーゼ陽性の球菌である。黄色ブドウ球菌は、通例クラスターを形成する、直径約0.5〜1.5μm、非運動性、非胞子形成性、通性の嫌気性菌である。多くの株が、例えば、スーパー抗原トキシックショック症候群毒素(TSST-1)及び剥脱性毒素を含む、ブドウ球菌性エンテロトキシンを産生する。黄色ブドウ球菌は、ヒト微生物叢の一部であり、主に、鼻及び皮膚に見出される。個体のうちの約20%は、黄色ブドウ球菌の恒久的な保菌者であり、約60%は、間欠的な保菌者であり、約20%は、めったにそれを保有しない。黄色ブドウ球菌は、ヒトにおいて、自己限定性〜致死性の様々な疾患を引き起こしうる日和見性病原体であり、皮膚、軟部組織、及び院内感染の最も一般的な原因のうちの1つである。コミュニティー環境内の感染率は、増大しつつある。介護施設の入居者もまた、MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)を獲得する危険性が大きい。
処置(治療)
一部の実施形態では、方法は、診断の後で、治療剤を対象へと投与するステップをさらに含む。典型的に、特定の病原体の同定は、適切な治療剤の選択を誘導するであろう。
例えば、細菌感染(例えば、菌血症)に対して、治療は、抗生剤を含みうる。一部の場合には、抗生剤を、経口投与することができる。他の場合には、抗生剤を、静脈内投与することができる。本発明の方法において使用しうる、例示的で非限定的な抗生剤は、アクロソキサシン、アミフロキサシン、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アジスロマイシン、アズトレオナム、バロフロキサシン、ベンジルペニシリン、ビアペネム、ブロジモプリム、セファクロル、セファドロキシル、セファトリジン、セフカペン、セフジニル、セフェタメット、セフメタゾール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキサジン、セフタロリン、セフタジジム、セフチブテン、セフトビプロール、セフロキシム、セファレキシン、セファロニウム、セファロリジン、セファマンドール、セファゾリン、セフラジン、クロルキナルドール、クロルテトラサイクリン、シクラシリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、ダノフロキサシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジフロキサシン、ドリペネム、ドキソサイクリン、エノキサシン、エンロフロキサシン、エリスロマイシン、フレロキサシン、フロモキセフ、フルクロキサシリン、フルメキン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イソニアジド、イミペネム、カナマイシン、レボフロキサシン、リネゾリド、マンデル酸、メシリナム、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネチルミシン、ネトロマイシン、ニフイルトイノール、ニトロフラントイン、ニトロキソリン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パニペネム、ペフロキサシン、フェノキシメチルペニシリン、ピペミド酸、ピロミド酸、ピバンピシリン、ピブメシリナム、ポリミキシン-b、プルリフロキサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、スルバクタム、フルファベンズアミド、スルファシチン、スルファメトピラジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファソミジン、スルファチアゾール、テイコプラニン、テマフロキサシン、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チゲサイクリン、チニダゾール、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、バンコマイシン、及びこれらの薬学的に許容される塩又はエステルを含むがこれらに限定されない。
別の例では、真菌感染に対して、処置は、抗真菌剤を含みうる。例示的な抗真菌剤は、ポリエン(例えば、アムホテリシンB、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、及びリモシジン)、アゾール(例えば、イミダゾール、例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エベルコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、及びチオコナゾール;トリアゾール、例えば、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、及びボリコナゾール;並びにチアゾール、例えば、アバファンギン)、アリラミン(例えば、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、及びテルビナフィン)、エキノキャンディン(例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、及びミカファンギン)、及び安息香酸、シクロピロクスオラミン、5-フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、トルナフタート、アミノキャンディン、クロルダントイン、クロルフェネシン、ニフロキシム、ウンデシレン酸、クリスタルバイオレット、並びにこれらの薬学的に許容される塩又はエステルを含むがこれらに限定されない、他の抗真菌剤を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、処置法は、例えば、本発明の方法による、患者に由来する生物学的試料中に存在する病原体の検出及び/又は同定に基づき、処置を無症状性の患者に施すステップを含みうる。他の実施形態では、処置法は、本発明の方法による、患者に由来する生物学的試料中に存在する病原体の検出又は同定に基づき、処置を症状性の患者に施すステップを含みうる。
一部の実施形態では、患者に選択される処置は、本発明の方法による、病原体の検出及び/又は同定に基づく。当技術分野では、異なる病原体種に適切な処置が公知である。一例では、グラム陽性菌を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、バンコマイシンの投与を伴いうる。別の例では、グラム陰性菌を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、ピペラシリン-タゾバクタムの投与を伴いうる。別の例では、一部の実施形態では、アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ)を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、コリスチン、メロペネム、及び/又はゲンタマイシンの投与を伴いうる。別の例では、一部の実施形態では、クレブシエラ属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ)を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、メロペネムの投与を伴いうる。さらに別の例では、一部の実施形態では、シュードモナス属種(例えば、緑膿菌)を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、ピペラシリン-タゾバクタムの投与を伴いうる。さらなる例では、一部の実施形態では、エスケリキア属種(例えば、大腸菌)を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、メロペネムの投与を伴いうる。別の例では、一部の実施形態では、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム)を、患者に由来する生物学的試料中において検出する場合、処置法は、ダプトマイシンの投与を伴いうる。
アッセイ試薬
本明細書で記載される方法は、任意の適切な試薬、例えば、界面活性剤、緩衝液成分、添加剤、キレート剤などを含みうる。界面活性剤は、一般に、GAF Companyから、IGEPAL(登録商標)の商標名で市販されている界面活性剤を含む、多種多様な可溶性の非イオン性表面活性剤から選択することができる。液体の非イオン性界面活性剤であるIGEPAL(登録商標)は、ポリエチレングリコールp-イソオクチルフェニルエーテル化合物であり、多様な分子量呼称、例えば、IGEPAL(登録商標)CA720、IGEPAL(登録商標)CA630、及びIGEPAL(登録商標)CA890で入手可能である。他の適切な非イオン性界面活性剤は、TETRONIC(登録商標)909の商標名で、BASF Corporationから市販されている界面活性剤を含む。この材料は、一級ヒドロキシル基を末端とする、四官能性ブロックコポリマー界面活性剤である。適切な非イオン性界面活性剤はまた、ALPHONIC(登録商標)の商標名で、Vista Chemical Companyからも入手可能であり、このような材料は、多様な分子量の直鎖状一級アルコールのブレンドに由来する、非イオン性生体分解性物質であるエトキシレートである。界面活性剤はまた、ポロキサマー、例えば、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、例えば、SYNPERONIC(登録商標)PEシリーズ(ICI)、PLURONIC(登録商標)シリーズ(BASF)、Supronic、MONOLAN(登録商標)、PLURACARE(登録商標)、及びPLURODAC(登録商標)の商標名で入手可能なポロキサマー、ポリソルベート界面活性剤、例えば、TWEEN(登録商標)20(PEG-20ソルビタンモノラウレート)、並びにグリコール、例えば、エチレングリコール及びプロピレングリコールからも選択することができる。
このような非イオン性界面活性剤は、アッセイ反応に対して有害な作用を及ぼさずに、アッセイに適量の洗浄力をもたらすように選択することができる。特に、界面活性剤は、本発明の凝集アッセイの多様な成分間の非特異的相互作用を抑制する目的で、反応混合物中に組み入れることができる。非イオン性界面活性剤は典型的に、液体試料へと、0.01%(w/w)〜5%(w/w)の量であらかじめ添加する。
非イオン性界面活性剤を、これもまた、液体試料へと、0.01%(w/w)〜5%(w/w)の量であらかじめ添加された、1つ以上のタンパク質(例えば、アルブミン、魚類皮膚ゼラチン、リゾチーム、又はトランスフェリン)と組み合わせて使用することができる。
さらに、本発明のアッセイ、方法、及びカートリッジユニットは、さらなる適切な緩衝液成分(例えば、反応環境内に約7.8〜8.2のpHをもたらすように選択されるトリス塩基)、及びカチオンを除去するキレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EDTA二ナトリウム、クエン酸、酒石酸、グルクロン酸、糖酸、又はこれらの適切な塩)を含みうる。
試料の調製及び細胞の溶解
本発明の方法及びシステムは、試料の調製及び/又は細胞の溶解を伴いうる。例えば、生物学的試料中に存在する病原体は、標的核酸を増幅する前に溶解させることができる。生物学的試料(例えば、全血、尿、脳脊髄液、滑液、液体生検、皮膚生検、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、及び組織ホモジネート)中の病原体細胞を溶解させるのに適する溶解法は、例えば、機械的溶解(例えば、ビーズビーティング及び超音波処理)、熱溶解、及びアルカリによる溶解を含む。一部の実施形態では、ビーズビーティングは、ガラスビーズ(例えば、0.5mmのガラスビーズ)を生物学的試料へと添加して、混合物を形成し、混合物を撹拌することにより実施することができる。例として述べると、試料の調製及び細胞の溶解(例えば、ビーズビーティング)は、WO2012/054639で記載されている手法及び方法のうちのいずれかを使用して実施することができる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、全血試料中の、1つ以上の病原体関連解析物の検出を伴う。一部の実施形態では、方法は、赤血球(red blood cell)(赤血球(erythrocyte))の破壊を伴いうる。一部の実施形態では、赤血球の破壊は、赤血球溶解剤(すなわち、溶解緩衝液、等張性溶解剤、又は非イオン性洗浄液)を使用して実行することができる。本発明の方法において使用しうる赤血球溶解緩衝液は、限定なしに述べると、塩化アンモニウムの等張性溶液(任意選択で、炭酸緩衝液及び/又はEDTAを含む)及び低張性溶液を含む。等張性塩化アンモニウムを使用する、溶血の基礎的機構は、赤血球膜を通るアンモニアの拡散による。このアンモニアの流入は、ヒドロキシルイオンの細胞内濃度を増大させ、これは次に、CO2と反応して炭酸水素塩を形成する。赤血球は、アニオンチャネルを介して、過剰な炭酸水素塩を、血漿中に存在する塩化物と交換し、その後、細胞内の塩化アンモニウム濃度を増大させる。結果として生じる細胞の膨張は、最終的に、膜の完全性の喪失を引き起こす。
代替的に、赤血球溶解剤は、非イオン性洗浄液(例えば、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール(NP-40)、4-オクチルフェノールポリエトキシレート(TRITON(商標)X-100)、BRIJ(登録商標)58、又は類縁の非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物)の水溶液でありうる。赤血球溶解剤は、赤血球の少なくとも一部を破壊し、全血のうちのある特定の成分(例えば、ある特定の全血タンパク質)の大きな画分を、全血試料中に存在する白血球又は他の細胞(例えば、病原体細胞(例えば、細菌細胞及び/又は真菌細胞))から分離すること(例えば、遠心分離後の上清として)を可能とする。赤血球溶解及び遠心分離の後、結果として得られるペレットを、例えば、上記で記載した通りに溶解させることができる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、(a)対象に由来する全血試料を用意するステップ、(b)全血試料を赤血球溶解剤溶液と混合して、破壊赤血球を作製するステップ、(c)ステップ(b)に続き、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させて、抽出物を形成するステップ、(d)抽出物(白血球及び/又は病原体細胞を含みうる)の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップを含みうる。一部の実施形態では、方法は、溶解物中の1つ以上の標的核酸を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、全血の試料は、約0.5〜約10mLの全血、例えば、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、又は10mLの全血である。一部の実施形態では、方法は、ペレットを再懸濁させ、任意選択で、ステップ(c)を反復する前に、ペレットを洗浄するステップ(例えば、緩衝液、例えば、TE緩衝液で)を含みうる。一部の実施形態では、方法は、1、2、3、4、5回以上の洗浄ステップを含みうる。他の実施形態では、方法を、洗浄ステップを一切実施せずに実施する。一部の実施形態では、増幅するステップは、全血タンパク質、非標的核酸、又はこれらの両方の存在下でなされる。一部の実施形態では、増幅するステップは、0.5μg〜60μg(例えば、0.5μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、又は60μg)の対象DNAの存在下でなされうる。一部の実施形態では、対象DNAは、対象の白血球に由来する。
複合体試料からの核酸の増幅及び検出
いくつかの実施形態では、本発明の方法及びシステムは、1つ以上の核酸の増幅を伴う。増幅は、指数的又は直線的でありうる。標的又は鋳型核酸は、DNAの場合もあり、RNAの場合もある。このようにして増幅された配列は、「増幅領域」又は「単位複製配列」を形成する。プライマープローブは、特異的な鋳型核酸配列をターゲティングするように、当業者がたやすくデザインすることができる。ある特定の好ましい実施形態では、結果として得られる単位複製配列は、迅速なサイクリング、及びコピーの生成を可能とするように、短い。単位複製配列のサイズは、例えば、標的核酸を、非標的核酸から弁別する能力をもたらすように、必要に応じて変動させることができる。例えば、単位複製配列は、約1,000ヌクレオチド未満の長さでありうる。単位複製配列は、100〜500ヌクレオチドの長さ(例えば、100〜200、150〜250、300〜400、350〜450、又は400〜500ヌクレオチドの長さ)であることが望ましい。一部の実施形態では、1つを超える(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又は10を超える)標的核酸を、1回の反応で増幅することができる。他の実施形態では、単一の標的核酸を、1回の反応で増幅することができる。一部の実施形態では、本発明は、複合試料(例えば、全血)中において行われる、増幅ベースの核酸検出アッセイを提供する。
試料の調製は、典型的に、複合試料(例えば、体液及び組織ホモジネート)中に見出される、一般的なPCR阻害因子に対する耐性を除去するか、又はもたらすことを伴う。一般的な阻害因子は、表1(また、Wilson、Appl. Environ. Microbiol.、63:3741 (1997)も参照されたい)に列挙されている。表1中の「促進因子」とは、阻害を低減又は克服するのに使用しうる方法又は組成物を示す。阻害因子は、典型的に、細胞の溶解、分解の防止、若しくは標的核酸の封鎖、及び/又はポリメラーゼ活性の阻害により作用する。最も一般に利用されるポリメラーゼであるTaqは、反応物中の0.1%の血液の存在により阻害される。血液中で見出される、一般的な阻害因子(例えば、ヘモグロビン及び/又はフミン酸)に対して耐性である、突然変異体のTaqポリメラーゼが操作されている(Kermekchievら、Nucl. Acid. Res.、37(5):e40(2009))。製造元の推奨は、これらの突然変異が、最大で20%の血液からの直接的な増幅を可能とすることを示す。突然変異によりもたらされる耐性にもかかわらず、リアルタイムPCRによる正確な検出は、血液試料の存在下で観察される蛍光の消光に起因して、複雑である(Kermekchievら、Nucl. Acid. Res.、37:e40(2009))。
ポリメラーゼ連鎖反応による、DNA又はcDNAの増幅は、試みられて、信頼されている方法であるが、上記で論じた通り、ポリメラーゼは、一般に使用される抗凝固剤及びヘモグロビンを含むがこれらに限定されない、粗試料中に含有される薬剤により阻害される。最近、突然変異体のTaqポリメラーゼが、血液中及び土壌中で見出される、一般的な阻害因子に対する耐性を擁するように操作されている。現在入手可能なポリメラーゼ、例えば、HemoKlenTaq(商標)(New England BioLabs, Inc.、Ipswich、MA)、並びにOmniTaq(商標)及びOmniKlenTaq(商標)(DNA Polymerase Technology, Inc.、St. Louis、MO)は、それらが、最大で10%、20%、又は25%の全血の存在下で、生成物及び反応条件に応じて、DNAを増幅することを可能とする、突然変異体(例えば、N末端切断及び/又は点突然変異)のTaqポリメラーゼである(例えば、Kermekchievら、Nucl. Acids Res.、31:6139(2003)、及びKermekchievら、Nucl. Acid. Res.、37:e40(2009)を参照されたい。また、米国特許第7,462,475号を参照されたい)。加えて、PHUSION(登録商標)Blood Direct PCR Kits(Finnzymes Oy、Espoo、Finland)は、従来型のポリメラーゼ、例えば、Taq又はPfuに対して、典型的に阻害性である条件下で、増幅を可能とし、最大で約40%全血の存在下、ある特定の反応条件下で、DNAの増幅を可能とする、二重鎖DNA結合性ドメインを組み込むように操作された、固有の融合DNAポリメラーゼ酵素を含む。Wangら、Nucl. Acids Res.、32:1197(2004)を参照されたい。また、米国特許第5,352,778号及び同第5,500,363号を参照されたい。さらに、Kapa Blood PCR Mixes(Kapa Biosystems、Woburn、MA)は、ある特定の反応条件下で、反応容量の最大で約20%の全血の直接的な増幅を可能とする、遺伝子操作されたDNAポリメラーゼ酵素を提供する。これらのブレークスルーにもかかわらず、蛍光、吸光度、及び他の光ベースの方法は、血液の存在により消光される信号をもたらすので、既存の方法による、生成させた単位複製配列の、直接的で光学的な検出は可能ではない。Kermekchievら、Nucl. Acid. Res.、37:e40(2009)を参照されたい。
全血の様々な不純物及び成分は、ポリメラーゼ及びプライマーアニーリングに対して阻害性でありうる。これらの阻害因子は、偽陽性及び低感度の発生をもたらしうる。複合試料中の核酸を増幅及び検出する場合に、偽陽性及び低感度の発生を低減するためには、例えば、上記で記載した通り、全血試料により阻害されない熱安定性ポリメラーゼを用い、1つ以上の内部PCRアッセイ対照を組み入れることが望ましい(Rosenstrausら、J. Clin Microbiol.、36:191(1998)及びHoofarら、J. Clin. Microbiol.、42:1863(2004)を参照されたい)。
例えば、アッセイは、臨床検体の増幅及び検出の成功を確保するように、標的配列の領域と同一なプライマー結合性領域を含有する内部対照核酸を含みうる。一部の実施形態では、標的核酸及び内部対照は、各々が、内部対照を標的核酸から差別化する、固有のプローブ結合性領域を有するように選択することができる。内部対照は、任意選択で、例えば、全血臨床試料中の感染性生物を、安全且つ正確に決定及び同定するのに、処理陽性対照、処理陰性対照、及び試薬対照と組み合わせて利用される。内部対照は、検出される核酸標的と共に共増幅されるようにデザインされる阻害対照でありうる。内部阻害対照の増幅の失敗は、試薬の不良又は工程のエラーの証拠である。ユニバーサルプライマーは、標的配列及び内部対照配列を、同じ反応チューブ内で増幅するようにデザインすることができる。したがって、このフォーマットを使用すると、標的DNAは増幅されるが、内部対照は増幅されなければ、標的DNAは相対的に内部対照より多量に存在することが仮定され、内部対照の増幅は不要であるので、陽性結果は妥当である。他方、内部対照も標的も増幅されなければ、PCR反応の阻害が生じ、この特定の試料についての検査は、妥当ではないことが仮定される。本発明の方法において使用しうる、例示的で非限定的な内部対照核酸は、スイートオレンジ(Citrus sinensis)又はスクランブル化された黄色ブドウ球菌のfemA核酸配列に由来する内部対照配列を含む。
例えば、プラスミドpBR322へとクローニングされた、配列番号94の核酸配列を含む、スイートオレンジの内部対照核酸を、核酸配列5'-GGA AAT CTA ACG AGA GAG CAT GCT-3'(配列番号95)又は5'-GGA AAT CTA ACG AGA GAG CAT GC-3'(配列番号96)を含むフォワードプライマー、及び核酸配列5'-CGA TGC GTG ACA CCC AGG C-3'(配列番号97)又は5'-GAT GCG TGA CAC CCA GGC-3'(配列番号98)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-GAG ACG TTT TGG ATA CAT GTG AAA GAA GGC-3'(配列番号99)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-CGA TGG TTC ACG GGA TTC TGC AAT TC-3'(配列番号100)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の、スイートオレンジの内部対照核酸の存在を検出する。一部の実施形態では、5'側捕捉プローブ及び/又は3'側捕捉プローブを、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせる。
別の例では、プラスミドpBR322へとクローニングされた、配列番号101の核酸配列を含む、ランダム化された黄色ブドウ球菌の内部対照核酸を、核酸配列5'-GCA GCA ACA ACA GAT TCC-3'(配列番号102)を含むフォワードプライマー、及び核酸配列5'-GTA GCC GTT ATG TCC TGG TG-3'(配列番号103)を含むリバースプライマーの存在下で増幅することができる。一部の実施形態では、これらのプライマーを使用して生成される単位複製配列を、オリゴヌクレオチド配列5'-TCG AAC AAT GAA GAA CTG TAC ACA ACT TTC G-3'(配列番号104)を含む5'側捕捉プローブ、及び/又はオリゴヌクレオチド配列5'-GGT TTG TCA TGT TAT TGT ATG AGA AGC AAG-3'(配列番号105)を含む3'側捕捉プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出して、生物学的試料中の、ランダム化された黄色ブドウ球菌の内部対照核酸の存在を検出する。一部の実施形態では、5'側捕捉プローブ及び/又は3'側捕捉プローブを、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせる。
本発明のアッセイは、1つ以上の標的核酸を、アッセイ中に、検出限界の3倍〜5倍で組み入れた(例えば、各々を、1つ以上のカートリッジにより組み入れた)、1つ以上の陽性処理対照を含みうる。陽性処理対照の各々について測定されるT2は、標的核酸の存在を示す所定の閾値を上回らなければならない。陽性処理対照は、工程の各ステップ(例えば、溶解、PCR、及びT2の検出)における、全ての試薬の不良を検出することが可能であり、システムの品質管理に使用することができる。本発明のアッセイは、標的核酸非含有溶液(例えば、緩衝液単独)からなる、1つ以上の陰性処理対照を含みうる。陰性処理対照についてのT2測定値を、陰性結果を示す閾値を下回るものとする一方、内部対照について測定されるT2は、内部対照の陽性結果を示す判定閾値を上回る。陰性対照の目的は、キャリーオーバー汚染及び/又は試薬汚染を検出することである。本発明のアッセイは、1つ以上の試薬対照を含みうる。試薬対照は、反応のPCR段階における試薬不良(すなわち、マスターミックスの、PCRチューブへの不完全な導入)を検出するであろう。試薬対照はまた、T2検出の前における、試薬導入の大きな失敗も検出しうる。
一部の実施形態では、液体試料(全血、脳脊髄液、尿、滑液を含む)、及び組織生検ホモジネート(例えば、皮膚生検)でありうる、複合的な生物学的試料は、増幅反応中に、約5%、約10%、約20%、約25%、約30%、約25%、約40%、及び約45%以上の複合的な液体試料を使用して、直接増幅することができ、結果として得られる単位複製配列は、標的核酸配列と相補的なオリゴヌクレオチドに結合させた、コンジュゲート磁性粒子の添加時における、磁気共鳴(MR)緩和の測定値を使用して、増幅反応から直接検出することができる。代替的に、磁性粒子は、増幅の前に、試料へと添加することができる。したがって、複合的な汚染試料中における核酸増幅の使用、結果として得られる単位複製配列の、常磁性粒子とのハイブリダイゼーション、その後の磁性粒子ベースの検出システムを使用するハイブリダイズさせた磁性粒子コンジュゲート及び標的単位複製配列の直接的な検出の方法が提供される。特定の実施形態では、ハイブリダイズさせた磁性粒子コンジュゲート及び単位複製配列の直接的な検出は、MR緩和の測定値(例えば、T2、T1、T1/T2ハイブリッド、T2 *など)を介する。さらに、試料中の、元の核酸コピー数を定量化するための反応速度法(例えば、あらかじめ規定されたサイクル数におけるサンプリング及び核酸の検出、内因性の内部対照核酸の比較、外因性の、スパイクされた、相同な競合的対照核酸の使用)が提供される。
本明細書の以下で記載される例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)を使用する増幅に関するが、当技術分野では、核酸を増幅する他の多数の方法(例えば、等温方法、ローリングサークル方法など)も公知である。当業者は、これらの他の方法を、PCR法の代わりに、又はこれと併せて使用しうることを理解するであろう。例えば、Saiki、「Amplification of Genomic DNA」、PCR Protocols、Innisら編、Academic Press、San Diego、Calif.、13〜20頁(1990)、Wharamら、Nucleic Acids Res.、29:E54(2001)、Hafnerら、Biotechniques、30:852(2001)を参照されたい。本方法を伴う使用に適する、さらなる増幅法は、例えば、逆転写PCR(RT-PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写ベースの増幅システム(TAS)、転写媒介型増幅(TMA)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)法、鎖置換増幅(SDA)法、ループ媒介型等温増幅(LAMP)法、等温及びキメラプライマー誘発型核酸増幅(ICAN)法、並びにスマート増幅システム(SMAP)法を含む。当技術分野では、これらの方法並びに他の方法が周知であり、提供される、増幅された核酸の検出法を伴う使用に適応させることができる。
PCR法は、特異的な鋳型DNA配列の多くのコピーを作製する技法である。PCR工程については、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、及び同第4,965,188号において開示されている。鋳型DNAと相補的なプライマーの1つのセットをデザインし、プライマーに挟まれる領域を、複数の増幅サイクルを含む反応において、DNAポリメラーゼにより増幅する。各増幅サイクルは、初期の変性、及び、最大で50サイクルのアニーリング、鎖の延長(又は伸長)、及び鎖の分離(変性)を含む。反応の各サイクルでは、プライマーの間のDNA配列をコピーする。プライマーは、コピーされるDNAのほか、元の鋳型配列にも結合しうるので、コピーの総数は、時間と共に指数的に増大する。PCRは、Whelanら、Journal of Clinical Microbiology、33:556(1995)に従い実施することができる。当技術分野では、多様な改変PCR法が利用可能であり、周知である。当業者には、多様な改変、例えば、PCRを実施する前に、逆転写酵素を使用して、DNAをRNAから合成する「RT-PCR」法、並びに蛍光標識されたTaqMan(登録商標)プローブ及びTaq DNAポリメラーゼを使用して、特異的対立遺伝子だけを増幅及び検出する「TaqMan(登録商標)PCR」法が公知である。RT-PCR及びその変化形については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,804,383号、同第5,407,800号、同第5,322,770号、及び同第5,310,652号、並びにその中に記載される参考文献において記載されており、TaqMan(登録商標)PCR及び方法において使用される関連する試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,210,015号、同第5,876,930号、同第5,538,848号、同第6,030,787号、及び同第6,258,569号において記載されている。
一部の実施形態では、非対称PCRを実施して、二重鎖DNA鋳型の1つの鎖を優先的に増幅する。非対称PCRは典型的に、増幅でターゲティングされる鎖の、過剰量のプライマーの添加を伴う。例示的な非対称PCRの条件は、一本鎖の増幅を優先する、300nMの過剰量プライマー及び75nMの限定量プライマーである。他の実施形態では、400nMの過剰量プライマー及び100nMの限定量プライマーを使用して、一本鎖の増幅を優先することができる。
マルチプレックス化PCR反応を利用する実施形態を含む一部の実施形態では、ホットスタートのPCR条件を使用して、ミスプライミング、プライマー二量体の形成を低減し、収量を改善し、且つ/又はPCRの高特異度及び高感度を確実にすることができる。ホットスタートDNAポリメラーゼ(例えば、アプタマーベースの阻害因子、又は低温における活性を制限する突然変異を伴う、ホットスタートDNAポリメラーゼ)、並びにホットスタートdNTP(例えば、CLEANAMP(商標)dNTP、TriLink Biotechnologies)を含む、様々な手法を利用して、ホットスタートPCR条件を達成することができる。
一部の実施形態では、PCR反応は、約20サイクル〜約55サイクル以上(例えば、約20、25、30、35、40、45、50、又は55サイクル)を含みうる。
LCRとは、2つではなく、4つのプライマーを使用し、DNAの2つのセグメントをライゲーション又は接合するのに、酵素リガーゼを使用することを除き、PCRと類似のDNA増幅法である。増幅は、サーマルサイクラー(例えば、Abbott Labs、North Chicago、ILのLCx)において実施することができる。LCRは、例えば、Mooreら、Journal of Clinical Microbiology、36:1028(1998)に従い実施することができる。LCR法及び変化形については、例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第EP0320308号及び米国特許第5,427,930号において記載されている。
TAS法とは、標的RNAを特異的に増幅する方法であって、cDNA合成ステップ及びRNA転写ステップにより、転写物を鋳型RNAから得る方法である。cDNA合成ステップでは、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識される配列(すなわち、ポリメラーゼ結合性配列又はPBS)を、2ドメイン型オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される標的又はマーカー配列の下流のcDNAのコピーへと挿入する。第2のステップでは、RNAポリメラーゼを使用して、RNAの複数のコピーを、cDNA鋳型から合成する。DNA依存性RNA転写は、cDNA鋳型の各コピーにつき、10〜1000コピーを結果としてもたらしうるため、TASを使用する増幅は、少数のサイクルしか要求しない。TASは、Kwohら、PNAS、86:1173(1989)に従い実施することができる。TAS法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO1988/010315号において記載されている。
転写媒介型増幅(TMA)とは、RNAポリメラーゼによるRNA転写、及び逆転写酵素によるDNA転写を使用して、標的核酸に由来するRNA単位複製配列を生成する、転写ベースの等温増幅反応である。TMA法は、それらが、増幅サイクル1つ当たり100〜1000コピーの単位複製配列を作製するという点で、サイクル1つ当たり2コピーだけを作製するPCR又はLCR法と対比して有利である。TMAについては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,399,491号において記載されている。NASBAとは、標的RNAを、RNA又はDNA鋳型から特異的に増幅する、転写ベースの方法である。NASBAは、1つの温度で、単一の混合物中の核酸の連続的な増幅に使用される方法である。標的RNAと同一な配列を有するフォワードプライマー、及び3'側において標的RNAと相補的な配列を有するリバースプライマー、及び5'側においてT7 RNAポリメラーゼを認識するプロモーター配列を使用して、DNA依存性RNAポリメラーゼにより、転写物を鋳型RNAから得る。鋳型として得られる転写物を使用して、転写物をさらに合成する。この方法は、Heimら、Nucleic Acids Res.、26:2250(1998)に従い実施することができる。NASBA法については、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,130,238号において記載されている。
SDA法とは、制限酵素により生成される一本鎖ニックにより5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠く、鎖置換型のDNAポリメラーゼにより合成される鎖で置換されるDNA鎖を、次の複製の鋳型として使用して、標的DNAを増幅する等温核酸増幅法である。制限部位を含有するプライマーを鋳型とアニールさせ、次いで、増幅プライマーを5'側の隣接配列とアニールさせる(ニックを形成する)。増幅は、一定温度で誘発される。新たに合成されたDNA鎖に、制限酵素がニックを施し、ポリメラーゼ増幅は、新たに合成された鎖の置換を再開する。SDAは、Walkerら、PNAS、89:392(1992)に従い実施することができる。SDA法については、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第5,455,166号及び同第5,457,027号において記載されている。
LAMP法とは、合成されるDNAの3'端にループを常に形成し、プライマーをループ内でアニールさせ、標的DNAの特異的増幅を等温的に実施する等温増幅法である。LAMPは、Nagamineら、Clinical Chemistry.、47:1742(2001)に従い実施することができる。LAMP法については、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第6,410,278号、同第6,974,670号、及び同第7,175,985号において記載されている。
ICAN法とは、RNA-DNAを含むキメラプライマー、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、及びRNアーゼHを使用して、鎖置換反応、鋳型交換反応、及びニック導入反応により、標的DNAの特異的増幅を等温的に実施する等温増幅法である。ICANは、Mukaiら、J. Biochem.、142:273(2007)に従い実施することができる。ICAN法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,951,722号において記載されている。
SMAP(MITANI)法は、2種類のプライマーを含むプライマーセット、及び鋳型としてのDNA又はRNAを使用して、標的核酸を等温条件下で連続的に合成する方法である。プライマーセットに含まれる第1のプライマーは、その3'端領域内に、標的核酸配列の3'端領域内の配列(A)とハイブリダイズ可能な配列(Ac')を含むほか、上述の配列(Ac')の5'側に、上述の標的核酸配列内の、上述の配列(A)の5'側に存在する配列(B)と相補的な配列(Bc)とハイブリダイズ可能な配列(B')を含む。第2のプライマーは、その3'端領域内に、上述の標的核酸配列と相補的な配列の3'端領域内の配列(C)とハイブリダイズ可能な配列(Cc')を含むほか、上述の配列(Cc')の5'側の同一な鎖上で、互いとハイブリダイズ可能な、2つの核酸配列を含むループバック配列(D-Dc')を含む。SMAPは、Mitaniら、Nat. Methods、4(3):257(2007)に従い実施することができる。SMAP法については、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2006/0160084号、同第2007/0190531号、及び同第2009/0042197号において記載されている。
増幅反応は、特異的な種類の増幅産物、例えば、二本鎖、一本鎖、3'若しくは5'突出を伴う二本鎖、又は5'及び3'端上に化学的リガンドを伴う二本鎖である核酸をもたらすようにデザインすることができる。増幅されたPCR産物は、(i)増幅産物の、相補的なオリゴヌクレオチドに結合させた磁性粒子とのハイブリダイゼーションであって、核酸が、粒子のアグロメレーションを促進する粒子間繋留として用いられるように、増幅産物とハイブリダイズする、2つの異なるオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション、(ii)増幅産物のDNAをまず変性させなければならない、ハイブリダイゼーション媒介型検出、(iii)粒子が、増幅産物の5'及び3'突出とハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション媒介型検出、(iv)増幅産物の末端における、化学的又は生化学的リガンドへの、粒子の結合、例えば、ストレプトアビジンで官能化させた粒子の、ビオチンで官能化させた増幅産物への結合により検出することができる。
本発明のシステム及び方法を使用して、リアルタイムPCRを実施し、試料中に存在する標的核酸の量についての定量的情報をもたらすことができる(例えば、WO2012/054639の図52及び実施例18を参照されたい)。定量的リアルタイムPCRを行う方法は、文献に提示されている(例えば、RT-PCR Protocols、Methods in Molecular Biology、193巻、Joe O'Connell編、Totowa、NJ:Humana Press、2002、378頁、ISBN 0-89603-875-0を参照されたい)。WO2012/054639の実施例18は、全血試料のリアルタイムPCR解析のための本発明の方法の使用について記載している。
本発明のシステム及び方法を使用して、捕捉プローブで改変された磁性ナノ粒子及び磁性分離を使用して、不透明試料中、例えば、全血中で直接、リアルタイムPCRを実施することができる。リアルタイムPCRの使用は、PCR反応を開始した後で、反応チューブを開栓せずに、標的核酸の定量化を可能とする。
一手法では、ビオチン又はアビジンで標識されたプライマーを使用して、リアルタイムPCRを実施することができる。これらの標識は、磁性粒子上に、極めて短い結合時間を有しうる、対応する結合性部分を有するであろう。これは、二本鎖産物の生成を可能とし、粒子の結合時間の大幅な短縮を可能とし、全体のターンアラウンド時間を短縮する。結合化学反応は、可逆性であり、プライマーが、粒子に結合したままとなることを防止する。結合を逆行させるために、試料を加熱するか、又はpHを調整することができる。
別の手法では、リアルタイムPCRは、超常磁性粒子とハイブリダイズしうる突出を伴う二重鎖DNAの生成により達成することができる。加えて、LNA及び/又はフッ素化捕捉プローブは、ハイブリダイゼーション時間を短縮しうる。
さらに別の手法では、粒子は、単位複製配列に対する捕捉プローブの結合性部位が埋め込まれているヘアピンを有するようにデザインする。粒子を、より高い溶融温度へと加熱すれば、粒子上の捕捉プローブのヘアピンの結合性部位が曝露されて、標的への結合が可能となるであろう。
別の手法では、単位複製配列とハイブリダイズするプローブは、2つ(以上)の粒子を繋留している。反応は、5'エキソヌクレアーゼ活性を伴うポリメラーゼの存在下で行う結果として、粒子間繋留の切断、及びその後におけるT2の変化をもたらすであろう。ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性、及び選択したマトリックス(例えば、血液)との適合性を有するように選択する。この手法では、小型の粒子(例えば、30nmのCLIO)を使用して、標的とのハイブリダイゼーションに対する立体障害、又はその後の重合中の酵素による消化を低減することができる(例えば、Heidら、Genome Research、1996、6:986〜994を参照されたい)。
別の手法では、相補的な捕捉プローブを保有するように、2つの粒子集団を合成することができる。単位複製配列の非存在下で、捕捉プローブは、ハイブリダイズして、粒子のクラスター形成を促進する。単位複製配列の生成時に、単位複製配列は、競合し、ハイブリダイズし、捕捉プローブを置換し、粒子のクラスターの解離をもたらすことができる。方法は、ナノ粒子の存在下で行うこともでき、非存在下で行うこともできる。溶液中で遊離した粒子は、サーモサイクリングに起因して、クラスター形成及びクラスター解離するであろう(例えば、Tmは、95℃を下回りうるため)。粒子へと固定化された捕捉プローブのうちの1つに結合する単位複製配列のTmは、この結合相互作用が、粒子間の結合相互作用より好適となる(例えば、捕捉プローブ内の点突然変異を操作して、二重鎖を熱力学的に不安定化させることにより)ようにデザインすることができる。この実施形態では、粒子濃度は、例えば、低レベルで保つこともでき、高レベルで保つこともできる。
過去の研究は、場合によって、PCR反応物中の粒子の存在が、PCRを阻害しうることを示した。これらの阻害性粒子については、粒子が、チューブの側面(又は容器内の他の場所)へと引き寄せられて、PCR反応中に溶液外に保持されうることが想定される。方法を使用して、粒子を懸濁液へと放出し戻し、それらが、PCR産物とハイブリダイズすることを可能とし、次いで、それらを溶液外に引き戻すことができる。他の過去の研究は、粒子の具体的製剤が、PCR反応に対して阻害性ではなく、増幅中に溶液中に残りうることを示している。
ある特定の実施形態では、本発明は、NEB HemoKlenTaq(商標)、DNAP OmniKlenTaq(商標)、Kapa Biosystems全血用酵素、及びThermo-Fisher Finnzymes PHUSION(登録商標)酵素を含むがこれらに限定されない全血と適合性の酵素の使用を特色とする。
本発明はまた、定量的非対称PCRも特色とする。本発明のリアルタイムPCR法のうちのいずれかでは、方法は、以下のステップ:
1.超常磁性粒子を含有する、調製されたPCRマスターミックスへと、全血をアリコート分割するステップ、
2.第1のPCRサイクルの前に、PCRサイクリングが完了するまで、チューブを閉止するステップ、
3.チューブをサーマルサイクラーへとロードするステップ、
4.「n」サイクルの標準的なPCRサーマルサイクリングを行うステップ、
5.T2検出を行うステップ(正確な持続時間及びこれを検出するステップは、下記に記載される生化学法及び粒子デザイン法に応じて変動する)、並びに
6.初期標的濃度の正確な定量化に十分なT2のリーディングがなされるまで、ステップ4及び5を反復するステップ
を伴いうる。
上記の方法を、本明細書で記載される、凝集又は解離の検出についての以下の類型であって、表2で記載される類型を含む類型のうちのいずれかと共に使用することができる。
感度及び/又は特異度を改善する、種に特徴的な複数の単位複製配列の増幅
一部の実施形態では、本発明の方法は、種に特徴的な1つを超える単位複製配列の増幅及び検出を伴いうる。一部の実施形態では、種に特徴的な1つを超える標的核酸の増幅は、アッセイ中の、種に特徴的な単位複製配列の総量を増大させる(言い換えれば、アッセイ中の解析物の量を増大させる)。この増大は、例えば、種に特徴的な単一の単位複製配列の増幅及び検出を伴う方法と比較した、種の検出の感度及び/又は特異度の増大を可能としうる。一部の実施形態では、本発明の方法は、種に特徴的な2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の単位複製配列を増幅するステップを伴いうる。
一部の実施形態では、種は、微生物種である。一部の実施形態では、微生物種は、アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ピティー、及びアシネトバクター・ノソコミアリス)、腸内細菌科種、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(耐性マーカーであるvanA/Bを伴うE.フェシウムを含む)及びエンテロコッカス・フェカリス)、クレブシエラ属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ(例えば、耐性マーカーであるKPCを伴うK.ニューモニエ)及びクレブシエラ・オキシトカ)、シュードモナス属種(例えば、緑膿菌)、ブドウ球菌属種(例えば、黄色ブドウ球菌(例えば、耐性マーカーであるmecAを伴う黄色ブドウ球菌)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌属種、及びコアグラーゼ陰性(CoNS)ブドウ球菌属種)、レンサ球菌属種(例えば、ストレプトコッカス・ミティス、肺炎レンサ球菌、B群溶血性レンサ球菌、ストレプトコッカス・アンギノースス、ウシレンサ球菌、G群溶血性レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サングイニス、及び化膿レンサ球菌)、エスケリキア属種(例えば、大腸菌)、ステノトロホモナス属種(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、プロテウス属種(例えば、プロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス)、セラチア属種(例えば、セラチア菌)、シトロバクター属種(例えば、シトロバクター・フロインディー及びシトロバクター・コセリ)、ヘモフィルス属種(例えば、インフルエンザ菌)、リステリア属種(例えば、リステリア・モノサイトゲネス)、ナイセリア属種(例えば、髄膜炎菌)、バクテロイデス属種(例えば、バクテロイデス・フラジリス)、バークホルデリア属種(例えば、バークホルデリア・セパシア)、カンピロバクター属(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリ)、クロストリジウム属種(例えば、ウェルシュ菌)、キンゲラ属種(例えば、キンゲラ・キンゲ)、モーガネラ属種(例えば、モーガネラ・モーガニー)、プレボテラ属種(例えば、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ・インターメディア、及びプレボテラ・メラニノゲニカ)、プロピオニバクテリウム属種(例えば、アクネ菌)、サルモネラ属種(例えば、サルモネラ菌)、赤痢菌属種(例えば、志賀赤痢菌及びフレキシネル赤痢菌)、及びエンテロバクター属種(例えば、エンテロバクター・アエロゲネス及びエンテロバクター・クロアカ)を含む細菌病原体である。一部の実施形態では、微生物種は、真菌病原体、例えば、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリス)及びアスペルギルス属種(例えば、アスペルギルス・フミガーツス)である。一部の実施形態では、種は、黄色ブドウ球菌である。一部の実施形態では、種に由来する、複数(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10)のシングルコピー遺伝子座を増幅及び検出する。一部の実施形態では、種に由来する、2つのシングルコピー遺伝子座を増幅及び検出する。一部の実施形態では、種に由来する、複数のシングルコピー遺伝子座の増幅及び検出は、マルチコピー遺伝子座に由来する単位複製配列の検出を伴う方法と同等な検出感度を可能としうる。一部の実施形態では、微生物種から増幅された、複数のシングルコピー遺伝子座の検出を伴う方法は、液体試料中の約1〜10CFU/mL(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10CFU/mL)の微生物種を検出しうる。一部の実施形態では、微生物種から増幅された、複数のシングルコピー遺伝子座の検出を伴う方法は、微生物種が、液体試料中に、5CFU/mL(例えば、1、2、3、4、又は5CFU/mL)の液体試料以下の頻度で存在する場合に、少なくとも95%の正確な検出をもたらす。
本発明はまた、少なくとも3つの単位複製配列を、それらの各々が種に特徴的である、2つの標的核酸の増幅により作製する実施形態も提供する。例えば、一部の実施形態では、増幅される第1の標的核酸及び第2の標的核酸は、約50塩基対〜約1500塩基対(bp)、例えば、約50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、又は1500bpの範囲の距離だけ隔てられている(例えば、染色体上又はプラスミド上で)ことができる。一部の実施形態では、増幅される第1の標的核酸及び第2の標的核酸は、約50bp〜約1000bp(例えば、約50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、又は1000bp)の範囲の距離だけ隔てられている(例えば、染色体上又はプラスミド上で)ことができる。一部の実施形態では、増幅される第1の標的核酸及び第2の標的核酸は、約50bp〜約1500bp、約50bp〜約1400bp、約50bp〜約1300bp、約50bp〜約1200bp、約50bp〜約1100bp、約50bp〜約1000bp、約50bp〜約950bp、約50bp〜約900bp、約50bp〜約850bp、約50bp〜約800bp、約50bp〜約800bp、約50bp〜約750bp、約50bp〜約700bp、約50bp〜約650bp、約50bp〜約600bp、約50bp〜約550bp、約50bp〜約500bp、約50bp〜約500bp、約50bp〜約450bp、約50bp〜約400bp、約50bp〜約350bp、約50bp〜約300bp、約50bp〜約250bp、約50bp〜約200bp、約50bp〜約150bp、又は約50bp〜約100bpの範囲の距離だけ隔てられていることができる。一部の実施形態では、個々のプライマー対(各々が、フォワード及びリバースプライマーを有する)を使用する、第1及び第2の標的核酸の増幅は、第1の標的核酸を含む単位複製配列、第2の標的核酸を含む単位複製配列、並びに第1及び第2の標的核酸の両方を含有する単位複製配列の増幅をもたらしうる。これは、第3の単位複製配列が存在しない試料と比較した種の検出の感度の増大を結果としてもたらしうる。先行する実施形態のうちのいずれかでは、増幅は、非対称PCRによるものでありうる。
本発明は、種に特徴的な2つ以上の単位複製配列を検出するように、核酸プローブで修飾された磁性粒子を提供する。例えば、一部の実施形態では、磁性粒子は、磁性粒子が、2つ以上の単位複製配列の各々に作動可能に結合しうるように、各集団をプローブへとコンジュゲートさせた、2つの集団を含む。例えば、2つの標的核酸を増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を形成した実施形態では、それらの各々が、それらの表面上に捕捉プローブのミックスを有する粒子の対を使用することができる。一部の実施形態では、磁性粒子の第1の集団を、第1の単位複製配列の第1のセグメントに作動可能に結合する核酸プローブ、及び第2の単位複製配列の第1のセグメントに作動可能に結合する核酸プローブへとコンジュゲートさせることができ、磁性粒子の第2の集団を、第1の単位複製配列の第2のセグメントに作動可能に結合する核酸プローブ、及び第2の単位複製配列の第2のセグメントに作動可能に結合する核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。例えば、1つの粒子集団を、第1の単位複製配列に特異的な5'側捕捉プローブ、及び第2の単位複製配列に特異的な5'側捕捉プローブとコンジュゲートさせることができ、他の粒子集団を、第1の単位複製配列に特異的な3'側捕捉プローブ、及び第2の単位複製配列に特異的な3'側捕捉プローブとコンジュゲートさせることができる。
このような実施形態では、磁性粒子は、第1の単位複製配列の存在下で凝集することができ、第2の単位複製配列の存在下で凝集することができる。凝集は、両方の単位複製配列が存在する場合に、より大きな程度で生じうる。
一部の実施形態では、磁性粒子を、それらの各々が、顕著に異なる標的核酸のセグメントに作動可能に結合する、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、磁性粒子を、第1の核酸プローブが、第1の標的核酸に作動可能に結合し、第2の核酸プローブが、第2の標的核酸に作動可能に結合する、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。他の実施形態では、磁性粒子を、第1の標的核酸に作動可能に結合する第1の核酸プローブ、第2の標的核酸に作動可能に結合する第2の核酸プローブ、及び第3の標的核酸に作動可能に結合する第3の核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。さらに他の実施形態では、磁性粒子を、第1の標的核酸に作動可能に結合する第1の核酸プローブ、第2の標的核酸に作動可能に結合する第2の核酸プローブ、第3の標的核酸に作動可能に結合する第3の核酸プローブ、及び第4の標的核酸に作動可能に結合する第4の核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。さらに他の実施形態では、磁性粒子を、第1の標的核酸に作動可能に結合する第1の核酸プローブ、第2の標的核酸に作動可能に結合する第2の核酸プローブ、第3の標的核酸に作動可能に結合する第3の核酸プローブ、第4の標的核酸に作動可能に結合する第4の核酸プローブ、及び第5の標的核酸に作動可能に結合する第5の核酸プローブへとコンジュゲートさせることができる。
汚染の管理
解析ツールとしてのPCRの使用における、潜在的な1つの問題は、古い増幅産物で汚染された新たな反応物を有する危険性である。潜在的な汚染源は、a)交差汚染を結果としてもたらしうる、臨床検体中の多数の標的生物、b)既に解析された生物に由来し、検査室環境内に多数で存在しうるプラスミドクローン、及びc)検査室環境内の増幅産物の蓄積をもたらす、同じ標的配列の増幅の反復を含む。PCRの単位複製配列の一般的な蓄積源は、産物のエアゾール化である。典型的に、制御不能のエアゾール化が生じれば、単位複製配列は、検査室の試薬、器具、及び換気システムを汚染するであろう。これが生じると、全ての反応物は、陽性となり、汚染試料又は真の陽性試料からの増幅産物を識別することはできない。古い産物のこのキャリーオーバーを回避又は制御するように注意を払うことに加えて、好ましい実施形態は、キャリーオーバーについて点検するように、あらゆるPCR実験において、ブランクの基準反応物を含む。例えば、キャリーオーバー汚染は、とりわけ、TaqMan(登録商標)プローブ、MolBeacons、又は挿入染料を、検出機構として利用する場合、アガロースゲル上で、弱いバンド又は蛍光信号として目視可能となるであろう。さらに、陽性試料を組み入れることが好ましい。例として述べると、一部の実施形態では、WO2012/054639において記載されている手法及び方法のうちのいずれかを使用して、汚染の管理を実施する。一部の実施形態では、例えば、本発明の方法を実施するのに使用される、T2Dx(登録商標)デバイスの反応チューブ内で、漂白溶液を使用して、潜在的な単位複製配列を中和する。一部の実施形態では、汚染の管理は、例えば、カートリッジ構成要素のエチレンオキシド(EtO)処理の使用を含む。
典型的に、計装、及び増幅を経る試料の処理領域は、増幅前帯域及び増幅後帯域へと分けられる。これは、増幅の前における、単位複製配列による試料の汚染の可能性を最小化する。例えば、T2Dx(登録商標)装置のデザインは、増幅前の計装及び処理領域、並びに増幅後の計装及び処理領域を、単一の装置へと統合するようなデザインである。これは、下記の節で記載される通りに可能とされる。
システム
本発明は、本発明の方法を実行するシステムであって、WO2012/054639に記載されている通り、1つ以上のNMRユニット、MAAユニット、カートリッジユニット、及び撹拌ユニットを含みうるシステムを提供する。このようなシステムは、本発明の自動アッセイを実行するのに、他の構成要素、例えば、オリゴヌクレオチドを増幅するサーモサイクリングユニット、遠心分離機、液体試料をシステム内のユニットからユニットへと送達するロボットアーム、1つ以上のインキュベーションユニット、アッセイ試薬及び生物学的試料を組み合わせて液体試料を形成する流体導入ユニット(すなわち、ピペッティングデバイス)、データを保存し、データを処理し、1つ以上のあらかじめ設定されたプロトコールに従い、多様なユニットの作動化及び脱作動化を制御する、プログラム可能なプロセッサーを伴うコンピュータ、並びにあらかじめ充填されたカートリッジをシステムへと送達するカートリッジ挿入システムであって、任意選択で、試薬を同定するコンピュータへの命令、及びカートリッジと共に使用されるプロトコールを伴うカートリッジ挿入システムをさらに含みうる。WO2012/054639の図42は、本発明の例示的なシステムについて描示する。
本発明のシステムは、対象に由来する体液中に存在する解析物をハイスループット且つリアルタイムで検出するのに有効な手段をもたらしうる。検出法は、具体的な生物学的過程、生理学的状態、障害、又は障害の病期と関連する解析物の同定及び/又は定量化を含むがこれらに限定されない、多種多様な状況下で使用することができる。したがって、システムは、例えば、疾患の診断、親の同定及び法医学的同定、疾患の発症及び再発、処置に対する、集団ベースと対比した、個々の応答、並びに治療のモニタリングにおける、広範なスペクトルの有用性を有する。デバイス及びシステムは、個別化医療に向けた、柔軟なシステムをもたらしうる。本発明のシステムは、本明細書で記載される多種多様なアッセイを実施するシステムのプログラム可能なプロセッサーへの、プロトコール又は命令と共に、変化させるか、又は相互交換することができる。本発明のシステムは、デスクトップ又はより小型サイズの自動装置に含有される検査室環境の多くの利点をもたらす。
本発明のシステムは、同じ液体試料中に、広範な濃度範囲にわたり存在する解析物について、同時にアッセイするのに使用することもでき、単一の対象における、解析物の濃度及び/又はPD若しくはPKのマーカーの濃度の、ある期間にわたる変化率をモニタリングするのに使用することもでき、PD若しくはPKのマーカーの濃度について、それらが、薬物の濃度であろうと、それらの代謝物の濃度であろうと、傾向解析を実施するのに使用することもできる。したがって、対象の流体デバイス及びシステムを使用して生成されるデータは、対象における解析物の濃度についての傾向解析を実施するのに用いることができる。
例えば、対象(例えば、細菌病原体により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患を有するか、又はこれを有することが疑われる患者)に、様々な解析物、例えば、異なる組織から、所定の時点においてサンプリングされた解析物を検出するのに使用される、複数のカートリッジユニットを用意することができる。対象は、例えば、週の異なる日において、異なるカートリッジユニットを使用しうる。一部の実施形態では、カートリッジ上の識別子を認識し、システムコンピュータに、アッセイを行い、且つ/又はデータを処理する、特定のプロトコールを実行することを命令するように、システム上のソフトウェアをデザインする。システム上のプロトコールは、外部のインターフェース、例えば、USBドライブ若しくはイーサネット接続を介してアップデートすることもでき、一部の実施形態では、全プロトコールを、カートリッジへと添付されたバーコード内に記録することもできる。プロトコールは、必要に応じて、使用者に指示することにより、多様な入力について(すなわち、試料の希釈率、液体試料へともたらされる試薬の量の変化、インキュベーション時間若しくはMAA時間の変更、又はNMR緩和の収集パラメータの変更について)最適化することができる。
マルチプレックス化アッセイは、様々なシステムデザインを使用して実施することができる。例えば、マルチプレックス化アッセイは、以下の構成のうちのいずれかを使用して実施することができる。
(i)空間ベースの検出アレイを使用して、磁性粒子を、チューブの特定の領域へと方向付け(すなわち、凝集を伴わずに)、検出される特定の解析物に従い、粒子を異なる場所に固定化することができる。固定化された粒子は、固定化部位における緩和効果に対する、それらの局所的効果をモニタリングすることにより検出される。粒子は、流動内の重力分離(すなわち、大型の粒子ほど、重力に対して垂直で緩徐な流動に沿って迅速に沈殿して、異なる標的で標識された異なる磁性粒子サイズ集団について、粒子サイズに基づく空間的分離をもたらす)により空間的に分離することができる。代替的に、捕捉プローブを使用して、磁性粒子を、チューブの特定の領域に(すなわち、凝集を伴わずに)配置し、粒子を異なる場所(すなわち、官能化表面、フォーム、又はゲル上)に固定化することができる。任意選択で、アレイは、各コイルを、適切な粒子をその中に固定化した個別の検出器とする、複数のコイル及び磁石を伴うフロースルーシステムであり、解析物の存在下で、クラスター形成により信号の変化が生じて、解析物の存在を検出する。任意選択で、粒子を空間的に分離したら、コイルを試料にわたりスライドさせて、今や空間的に分離された粒子を読み取ることにより、マルチプレックス化アッセイ中の各個々の解析物を検出することができる。
(ii)試料を、多くの分枝間に物理的に分割し、各分枝内で、個別の信号を検出し、各分枝を、マルチプレックス化アッセイ中の個別の解析物を検出するように構成したマイクロ流体チューブ。
(iii)各ウェルが、それ自体のコイル及び磁石を有し、各ウェルを、マルチプレックス化アッセイ中の個別の解析物を検出するように構成した、96ウェルの(又はこれ未満若しくはこれを超える)アレイ。
(iv)1つの磁石の内側、又は複数のミニ磁石の内側に、複数の独立にアドレス可能なコイルを伴う、シッパー又はフロースルーデバイスであって、各読取りを、マルチプレックス化アッセイ中の個別の解析物を検出する個別の反応とする、逐次的な読取りに使用しうるデバイス。
(v)1つの磁石の内側、又は複数のミニ磁石の内側に、プレート上の、複数の独立にアドレス可能なウェルを伴う、シッパー又はフロースルーデバイスであって、各読取りを、マルチプレックス化アッセイ中の個別の解析物を検出する個別の反応とする、プレートを横断させうる片面コイルを使用する、逐次的な読取りに使用しうるデバイス。
(vi)同時に読み取られ、結果として、1つの緩和曲線をもたらし、次いで、これは双指数関数への当てはめを使用して当てはめられ、マルチプレックス化アレイについての個別の読取りをもたらす、2つのコンパートメントを含有するチューブ。
(vii)液体の各液滴が、個々に移動させられて、マルチプレックス化アレイについての読取りをもたらす、マイクロ流体システム。
(viii)磁性による分離及び再懸濁を使用する逐次的測定は、新規結合プローブ、又はそれらをオン及びオフにする能力を要求する。この方法であれば、オン/オフ機構の大半が、融解温度(高温では、ヘアピンループが弛緩し、二重鎖結合に変性が生じる)に基づき、ハイブリダイゼーションが異なる温度で生じるので、核酸解析物に使用されるであろう。
(ix)各々がそれらの中に乾燥粒子を装備した個々のキャピラリーは、1つの小アリコートの少容量の迅速なマルチプレックス化を可能とする。乾燥粒子を空間的に分離し、この空間的分離により、MR Readerが、各キャピラリーチューブを、独立に読み取ることを可能とする。
(x)ナノ粒子へとコンジュゲートさせた結合性部分を、領域及び解析物特異的粘性溶液を形成する、ゲル又は他の粘性材料中に入れる。試料をゲルと相互作用させた後、標的解析物は、ゲル中をたやすく拡散し、ゲル又は粘性溶液により保持されたナノ粒子上のコンジュゲート部分に特異的に結合しうるため、ゲル又は粘性溶液は、出発試料中の1つを超える解析物の空間的分離を増強する。任意選択で、記載される磁性支援型アグロメレーション法のうちの1つを介して増強された、特異的解析物のクラスター形成又は凝集、及び解析物特異的クラスターの検出は、特異的場所についてのNMRリーダーを使用することにより実施することができる。このようにして、ナノ粒子の空間的アレイを、例えば、2dアレイとしてデザインすることができる。
(xi)磁性粒子は、チューブ内の複数の場所へと、スポッティングし、乾燥させることができ、次いで、各場所を個別に測定することができる。例えば、1つの種類の粒子を表面へと結合させ、第2の粒子を溶液中に懸濁させると、これらのいずれもが、検出される解析物とハイブリダイズする。クラスターは、ハイブリダイゼーション反応が生じる表面であって、各表面が個別に検出可能な表面において形成されうる。
(xii)各々が、標的核酸のアレイの第1の部分とハイブリダイズするように構成された、核酸のスポッティングアレイを試料チューブ内で創出することができる。磁性粒子は、標的核酸の第2の部分とハイブリダイズするプローブと共にデザインすることができる。各場所は、個別に測定することができる。代替的に、任意の包括的ビーコン又は検出法を使用して、核酸アレイからの出力をもたらすこともできるであろう。
(xiii)標的のアレイを検出する、磁性粒子のアレイを、各々が、凝集物の形成を伴う、顕著に異なるNMR緩和シグネチャーをもたらすように構成された(例えば、サイズ又は緩和特性により)、単一の試料中に組み入れることができる。例えば、粒子の各々は、顕著に異なるT2緩和時間をもたらす(例えば、粒子の1つのセットは、10〜200ミリ秒を対象とし、第2のセットは、250〜500ミリ秒を対象とし、第3のセットは、550〜1100ミリ秒を対象とするなど)ように選択することができる。各々を、緩和率の個別のバンドとして測定することができる。
(xiv)多様なサイズの解析物若しくは磁性粒子、又は多様なサイズの凝集物を検出するのに、複数の解析物及び磁性粒子を伴う単一の試料は、磁界又は電界の存在下における分離(すなわち、解析物でコーティングされた磁性粒子の電気泳動による分離)を経、これにより、個別の磁性粒子及び/又は凝集物は、異なる時点において、検出器の部位に到達する。
(xv)検出チューブは、各々が検出用の異なるナノ粒子を含有する、2つ(以上)のチャンバーへと分けられうるであろう。チューブは、リーダーを使用して読み取ることができ、複数の指数関数曲線、例えば、A*exp(T2_1)+B*exp(T2_2)への当てはめを介して、定数であるA及びB、並びにT2_1及びT2_2の相対的サイズを参照することにより、各解析物の応答を決定することができるであろう。
(xvi)勾配磁界をシミングして、狭小な磁界を形成することができる。特異的場内のシムパルス又は他のRFベースのシミングを実施して、特異的領域内でパルスを発し、信号を受信することができる。このようにして、シム内のRFパルスの層別化を想定することができ、特異的シムからの特異的共鳴信号を受信しうるであろう。この方法は、勾配磁界のシミングに依拠するが、この場合、マルチプレックス化は、記載される他の方法のうちの1つに依拠して、これらの異なるシム内に存在する、異なるナノ粒子及びクラスターを得ることを含むであろう。したがって、磁界シムによりもたらされる1つの次元、及びナノ粒子の、1つを超える解析物への結合を変動させることによりもたらされる第2の次元の、2つの次元が存在するであろう。解析物を伴うクラスター形成時における、2つの顕著に異なるNMR緩和信号を有するナノ粒子を、マルチプレックス化アッセイにおいて利用することができる。この方法では、小型の粒子(30〜200nm)が、クラスター形成によるT2の低下を引き起こすのに対し、大型の粒子(>800nm)は、クラスター形成によるT2の増大を引き起こすことが観察される。反応アッセイは、標的の添加により、標的が平衡緩和信号を変化させるような、競合的反応としてデザインする。例えば、T2緩和時間が、短縮されれば、小型の粒子を伴う解析物のクラスターが形成される。他方、T2緩和が延長されれば、大型の粒子を伴う解析物のクラスターが形成される。おそらく、添加剤、例えば、トレハロース又はグルコース又はグリセロールにより、溶液の密度/粘性を変化させて、大型の粒子が溶液中に確実にとどまるようにすることが有用である。クラスター形成時に、そのT2信号が低下する特異的解析物に対する結合性部分を有する1つのナノ粒子を、クラスター形成時に、そのT2信号が増大する、第2の解析物に対する、第2の結合性部分を有する、第2のナノ粒子と組み合わせることができる。試料が、両方の解析物を有することが疑われ、クラスター形成反応が互いに相殺し合う可能性がある(クラスター形成の増大が、クラスター形成の低下を相殺する)場合は、解析の秩序化、すなわち、競合的結合剤を添加して、競合的結合を、したがって、試料中の目的の解析物の有無と関連するT2信号を検出することを想定しうるであろう。代替的に、このマルチプレックス化フォーマットにおいて、クラスター形成の増大が、クラスター形成の低下を相殺する場合は、試料中の解析物の有無又は濃度を同定するのに、異なる緩和パルス列又は緩和決定因子の使用を想定しうるであろう。
(xvii)粒子の沈殿測定。この方法では、粒子サイズが、解析物と結合した粒子が、溶液中で懸濁状態のままであるのに十分に小型となるように、核酸の異なる標的配列を捕捉するようにデザインされた複数種類の粒子をデザインする。粒子の第2のセット(必ずしも磁性特性を有さない大型の粒子)へとコンジュゲートさせた核酸配列と相補的であり、捕捉された標的DNA配列と相補的な配列を含有する「誘発」配列の逐次的添加を行う。ハイブリダイゼーションの後、標的DNA配列が存在する、例えば、プローブとコンジュゲートさせた磁性ナノ粒子が、標的解析物上の1つの特異的配列とアニールし、他の粒子が、標的核酸配列上の別の配列に結合すれば、クラスターが形成されるであろう。これらのクラスターは、沈殿するのに十分に大きいであろう(このステップは、遠心分離ステップを要求しうる)。同じ反応において、同時に、さらなる磁性粒子である、第2の核酸配列とアニールする第2の粒子セットであって、磁性ナノ粒子-解析物-第2の粒子クラスターの形成が沈殿しない、第2の粒子セットをデザインしうるであろう。このようにして、粒子の逐次的添加は、示差的信号伝達を結果としてもたらしうる。
(xvii)1つの可能な異なる検出法は、コンジュゲートナノ粒子-解析物間相互作用に最適化された、異なるRFコイルパルス列から発生する、位相分離信号を含む。これは、異なるRFパルス及び緩和信号の検出をマッピング及び差別化して、1つを超える解析物の有無を確認する能力を最適化する、アレイ内の複数のコイルにより達成しうることが最適である。マルチプレックス化はまた、ナノ粒子-解析物クラスター形成反応の固有の特徴、及びその後における試料中の水溶媒の検出、クラスターが、多様な「ポケット」を形成し、これらの協同的クラスターが、多様な多孔性を有する能力も利用しうる。例えば、多様な長さ又はコンフォメーション構造を有するリンカーを利用して、結合性部分を磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせることができる。このようにして、解析物の存在下で形成される、1つを超える種類のクラスターであって、ナノ粒子-解析物-ナノ粒子凝集物の形成を介して、溶媒水の異なる流動、したがって、緩和信号の差異をもたらす能力を有するクラスターをデザインしうるであろう。次いで、このようにして、2つ以上のリンカー/結合性部分をデザインすれば、同じ試料中の1つを超える解析物の検出が可能となるであろう。
(xviii)本発明の方法は、エマルジョン中の粒子を捕捉するフッ素化油性/水性混合物を含みうる。このデザインでは、1つの疎水性捕捉粒子セット及び水性捕捉セットを使用し、疎水性捕捉粒子セットを、疎水性環境下で、よりたやすく結合及び凝集するようにデザインするのに対し、水性捕捉粒子セットは、水性環境下で結合及び凝集するようにデザインする。次いで、疎水性又は水性粒子に結合する特異的解析物を有する解析物含有試料の導入、並びに、その後における、疎水性及び水性溶媒の両方を有する検出チューブ内の混合、結合、及びクラスター形成は、解析物の、水性又は疎水性相への物理的分離を結果としてもたらすであろう。緩和信号は、いずれかの溶液相中において検出しうるであろう。このようにしてデザインされた解析物及びナノ粒子が、疎水性/水性相を混合することにより創出されるエマルジョン中に、物理的に見出される場合、緩和曲線は、エマルジョン相中で識別可能であろう。検出チューブは、カプセルをMR検出器中で動かして、信号を読み取る能力を増強する、カプセル型デザインを有しうる。さらに、プローブの同一性を読み取る蛍光タグの使用を利用することができる、すなわち、同じ水性又は疎水性相中の2つの異なる解析物の場合、蛍光タグの添加は、解析物の識別の決定の一助となり得る。この方法は、記載される共鳴信号が、試料の質に依存しないため、試料中の他の材料からの標的解析物の単離又は精製が限定的な試料中では適する。さらに、これらのタグは、緩和測定に決して干渉しないため、蛍光タグは、典型的な蛍光の研究において通例添加されるより、はるかに高濃度で添加することができる。この方法では、特異的制限エンドヌクレアーゼ部位が、アニール区画内に位置するように、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチド捕捉プローブをデザインする。次いで、ナノ粒子-解析物クラスターを形成する試料とのハイブリダイゼーションの後、次いで緩和測定により基礎信号をもたらす。特異的制限エンドヌクレアーゼの検出チューブへの導入、及びインキュベーションは、制限消化が生じた後における、ナノ粒子/解析物クラスターの特異的低減を結果としてもたらすであろう。後続する緩和測定、信号パターン、及び制限酵素消化の後、標的を推定することができる。
(xix)組合せ法では、磁性ナノ粒子を、2つの個別の顕著に異なる結合性部分、すなわち、オリゴヌクレオチド及び抗体とコンジュゲートさせる。このナノ粒子は、その試料中に両方の種類の解析物を有する試料と共にインキュベートすると、ナノ粒子-解析物複合体を形成し、ベースラインのT2緩和信号が検出可能となるであろう。その後、既知の濃度の解析物のうちの1つの添加を添加して、試料に由来するこの特異的解析物により形成されるクラスター形成を低減することができる。既知の解析物を添加した後、後続のT2緩和信号を検出し、試料解析物の有無を推測することができる。さらに、試料中の解析物と競合して、クラスターを形成するように、第2の解析物を添加することができる。ここでもまた、後続のT2緩和信号の検出後、第2の試料解析物の有無を推測することができる。これを反復することができる。
大まかに述べれば、本発明の方法を利用するマルチプレックス化アッセイは、試料に由来する解析物と共にクラスターを発生させる、1つの非超常磁性ナノ粒子の使用が、アッセイ検出容器内の全体的なFe2+を低減し、ダイナミックレンジを拡張して、複数の反応を、同じ検出容器内で測定しうるようにデザインすることができる。
核酸検出のマルチプレックス化は、コンジュゲートさせた磁性ナノ粒子及び標的核酸解析物の、異なるハイブリダイゼーションの質を使用することができる。例えば、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせた捕捉プローブは、磁性ナノ粒子の、標的核酸配列とのアニーリングが、1つを超える核酸標的配列について異なるようにデザインすることができる。これらの異なるプローブ-標的配列のデザインの因子は、G-C含量(ハイブリッド体を形成する時間)、様々な塩濃度、ハイブリダイゼーション温度、及び/又はこれらの因子の組合せを含む。次いで、この方法は、多様な核酸をコンジュゲートさせた磁性ナノ粒子が、1つを超える標的核酸解析物を有することが疑われる試料と相互作用することを可能とするステップを伴うであろう。多様な処置、すなわち、加熱、塩の添加、ハイブリダイゼーションのタイミングの後で検出される緩和時間は、疑われるどの核酸配列が、試料中に存在するのか、非存在であるのかを推測することを可能とするであろう。
相補的な単位複製配列を使用して、1つの反応を遮断し、連続的なハイブリダイゼーションを可能とする。この方法では、ユニバーサルの増幅プライマーを使用して、出発試料中の1つを超える特異的核酸配列を増幅し、単位複製配列のプールを形成する。磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせた特異的オリゴヌクレオチドを試料へと添加し、緩和の測定を行う。次いで、試料を、オリゴヌクレオチド-解析物相互作用を融解させる温度へと曝露し、磁性ナノ粒子へと接合させていないオリゴヌクレオチドを添加して、磁性ナノ粒子に結合する任意の解析物を遠ざけるように競合させる。次いで、第2のオリゴヌクレオチドをコンジュゲートさせた第2の磁性ナノ粒子を添加して、第2の特異的標的核酸解析物によるクラスターを形成する。代替的に、方法は、第2の磁性ナノ粒子を添加する前に、第1の磁性ナノ粒子を反応容器から有効に隔離するステップ、すなわち、反応容器を磁界へと曝露して、粒子を、第2又は後続の反応に利用可能とならない領域へと移動させるステップを有しうるであろう。
上記のマルチプレックス化法の各々は、試料を凍結させて、拡散及びクラスター形成時間を緩徐化させ、これにより、緩和時間の測定値を変更するステップを利用しうる。方法の拡散及びクラスター形成の緩徐化は、1つを超える緩和時間を分離及び検出する能力を増強しうる。上記のマルチプレックス化法の各々は、コンジュゲートさせたナノ粒子の逐次的添加に続く、各添加の後における緩和の検出を使用しうる。各逐次的添加の後で、その後における緩和のベースラインが、最後の添加からの新たなベースラインとなり、緩和時間を、試料中の解析物の有無又は解析物の濃度と相関させる一助とするのに使用することができる。
一部の実施形態では、マルチプレックス化法は、捕捉プローブの隠蔽を伴いうる。このマルチプレックス化法では、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチドを、粒子の表面上の二次構造又は相補的なプローブが、当初、反応容器内のハイブリダイゼーションに対して、配列を隠蔽するか、又は覆うようにデザインする。次いで、これらの隠蔽されたハイブリダイゼーション配列を、アッセイ中に、試料容器内で、空間的又は時間的に曝露するか、又は露出させる。例えば、上述の通り、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズするのに、塩、温度、及び時間の影響を受けうる。したがって、この方法の一形態では、磁性ナノ粒子へとコンジュゲートさせたオリゴヌクレオチドプローブ上の二次又は相補的構造を低減するか、又は弛緩させて、次いで標的の核酸試料とハイブリダイズするように、配列を曝露するか、又は露出させることができる。さらに、化合物、例えば、DMSOを使用して、二次構造を低減するか、又は弛緩させうるであろう。オリゴヌクレオチドをコンジュゲートさせたナノ粒子の、標的解析物とのハイブリダイゼーションのために、配列を選択的に露出させるか、又は曝露する別の方法は、制限エンドヌクレアーゼ部位を有するステムループ構造をデザインすることであり、その後における、制限エンドヌクレアーゼによる消化は、ステムループ構造を弛緩させ、ハイブリダイゼーションが生じることを可能とするであろう。代替的に、ステムループ構造の化学的切断、一方の端部の放出は、配列を遊離させ、次いで、標的核酸配列とハイブリダイズさせうるであろう。
標的核酸を検出するように、マルチプレックス化されたアレイを構成する場合、アッセイは、異なる単位複製配列を生成させ、次いで、異なる反応物を逐次的に検出するようにマルチプレックス化されたPCRを含みうる。
マルチプレックス化アッセイは、任意選択で、二分検索により標的を準備して、要求されるアッセイの数を低減する論理的アレイを含む(例えば、グラム陽性又は陰性は、一方の群又は他方の群だけについて行われる、異なる種ベースの検査をもたらす)。
本発明のシステムは、体液試料から検出される解析物に関わらず、様々なアッセイを行いうる。使用されるカートリッジユニットの識別に依存するプロトコールは、システムコンピュータ上に保存することができる。一部の実施形態では、カートリッジユニットは、システムコンピュータにより検出されるか、若しくは読み取られる識別子(ID)、又はカード上のバーコード(1D又は2D)を有し、次いで、これは、アッセイに特異的であるか、又は患者若しくは対象に特異的な情報であって、解析情報と共に追跡又はアクセスされる必要がある情報をもたらす。所望の場合、カートリッジユニットの識別子を使用して、システムコンピュータ上に保存されたプロトコールを選択するか、又はカートリッジユニット内の多様なアッセイ試薬の場所を同定する。システム上で実行されるプロトコールは、行われる特定のアッセイ、及び実施される検出法を含むがこれらに限定されない、プロトコールを実施するシステムのコントローラーへの命令を含みうる。システムによりアッセイを実施したら、生物学的試料中の解析物を示すデータを生成し、通信アセンブリーへと送信し、ここで、データを、限定なしに述べると、試料中の解析物濃度の計算を含む処理用の外部デバイスへと転送することもでき、システムコンピュータにより処理し、結果を、ディスプレイのリードアウトに提示することもできる。
例えば、識別子は、カートリッジユニットを挿入すると、バーコードリーダー(又は別の種類の検出器)により読み取られうる、一連の黒白線によるバーコード識別子でありうる。他の識別子、例えば、カートリッジユニット上に配置することができ、システムコンピュータにより検出されるか、又は読み取られうる、一連の英数字値、色、隆起、RFID、又は任意の他の識別子を使用することができる。検出器はまた、光を反映し、特定のカートリッジユニットの同一性を決定するように、システムコンピュータにより測定される識別子と相互作用しうる光を発するLEDでもありうる。一部の実施形態では、システムは、カートリッジユニット、又は情報をシステムコンピュータへと転送する検出器と共に、保存又は記憶デバイスを含む。
したがって、本発明のシステムは、異なるアッセイを実行する作動プログラム、及び(i)作動プログラムへと、あらかじめプログラムされた、どのアッセイを利用していたかについて報告するか、(ii)作動プログラムへと、カートリッジの構成を報告するか、(iii)作動システムに、アッセイを実行するステップの順序を通知するか、(iv)システムに、あらかじめプログラムされた、どのルーチンを利用するかを通知するか、(v)ある特定のアッセイ変数に関して、使用者からの入力を指示するか、(vi)患者識別番号(患者識別番号はまた、血液試料を保有するVACUTAINER(登録商標)上にも含有されうる)を記録するか、(vii)ある特定のカートリッジ情報(例えば、ロット番号、較正データ、カートリッジ上のアッセイ、解析データ範囲、有効期限、保存要件、許容可能な試料詳細)を記録するか、又は(viii)作動プログラムへと、アッセイのアップグレード若しくは改訂(すなわち、アッセイの新たなバージョンが、カートリッジアップグレードだけで生じ、より大規模で、より高価なシステムには至らないようなアップグレード又は改訂)について報告するようにコードされたカートリッジを含みうる。
本発明のシステムは、ロボットアームに接着するように構成された、1つ以上の流体導入ユニット(例えば、WO2012/054639の図43A〜43Cを参照されたい)を含みうる。流体導入ユニットは、ピペット、例えば、空気置換、液戻り、又はシリンジピペットでありうる。例えば、流体導入ユニットは、システムコンピュータのプログラム可能なプロセッサーと連絡したモーターをさらに含むことが可能であり、モーターは、プログラム可能なプロセッサーからのプロトコールに基づき、複数のヘッドを動かしうる。したがって、システムのプログラム可能なプロセッサーは、命令又はコマンドを含むことが可能であり、閉空間からピストンを引き抜く(液体を引き入れるのに)か、又は閉空間へとピストンを押し入れる(液体を押し出すのに)ことにより、液体試料を導入する命令に従い、流体導入ユニットを作動させうる。動かす空気の容量及び動かす速度の両方は、例えば、プログラム可能なプロセッサーにより、正確に制御することができる。試料(又は試薬)の、希釈液(又は他の試薬)との混合は、混合される成分を共通のチューブへと吸引し、次いで、組み合わされた液体容量の著明な画分を、往復するように繰り返しチップ中に吸引することにより達成することができる。乾燥させた試薬の、チューブへの溶解も、同様の形で行うことができる。
システムは、液体試料を加熱し、且つ/又はアッセイ温度を制御する、1つ以上のインキュベーションユニットを含みうる。アッセイ反応のインキュベーションステップにおいて、熱を使用して、反応を促進し、インキュベーションステップに必要な持続時間を短縮することができる。システムは、所定の時間にわたり、所定の温度で液体試料を受容するように構成されたヒーティングブロックを含みうる。ヒーティングブロックは、複数の試料を受容するように構成することができる。
システム温度は、注意深く調節することができる。例えば、システムは、撹拌により温度制御された空気を使用して、所定の温度(例えば、37℃)に保たれたケーシングを含む。ユニットの各々からの廃熱は、空気への伝導及び対流により、単純なエンクロージャにより受動的に散逸されうる廃熱を超えるであろう。廃熱をなくすために、システムは、断熱床により隔てられた2つのコンパートメントを含みうる。上側コンパートメントが、液体試料の操作及び測定に必要とされる構成要素部分を含むのに対し、下側コンパートメントは、個々のユニットの発熱エレメント(例えば、遠心分離機のモーター、撹拌ユニットのモーター、分離ユニットの各々の電子回路、及びインキュベーションユニットのヒーティングブロック)を含む。次いで、下床は換気され、強制された空気冷却を使用して、システムから熱を逃がす。例えば、WO2012/054639の図44A及び44Bを参照されたい。
MRユニットは、より緊密に制御された温度(例えば、±0.1℃)を要求する場合があるので、任意選択で、所定の温度で加熱された空気を吹き込む、別個のケーシングを含みうる。ケーシングは、液体試料を挿入し、取り出し、加熱された空気を逃がす開口部を含みうる。例えば、WO2012/054639の図45A及び45Bを参照されたい。他の温度制御法もまた、用いることができる。
カートリッジユニット
本発明は、1つ以上のカートリッジユニットを伴いうる方法及びシステムであって、アッセイ試薬及び消耗品の全てをシステム上に取り付ける簡便法をもたらす方法及びシステムを提供する。例えば、特殊な機能を実施するように、システムをカスタマイズすることもでき、例えば、その中にカスタマイズされた磁性粒子を含有したマイクロウェルアレイを含有する交換型カートリッジユニットを介して、1つを超える機能を実施するように、システムを適応させることもできる。システムは、磁性粒子をあらかじめロードされたウェルアレイを含有する置換型及び/又は交換型カートリッジを含むことが可能であり、特定の解析物を検出し、且つ/又は濃度を測定するようにデザインすることができる。代替的に、システムは、各々が、異なる解析物を検出し、且つ/又は濃度を測定するようにデザインされた、異なるカートリッジと共に使用可能な場合もあり、所与のアッセイに応じた、試薬及び検出の、個別のカートリッジモジュールにより構成される場合もある。カートリッジは、システム内の他のユニット(例えば、磁性支援型アグロメレーションユニット又はNMRユニット)へと導入される液体試料を調製するのに、筐体への挿入及び筐体からの駆出を容易とするサイズでありうる。カートリッジユニット自体は、潜在的に、操作ステーションのほか、MRリーダー(複数可)とも、直接インターフェース接続されうる。カートリッジユニットは、試薬モジュールとは独立して滅菌されうる注入モジュールを有するモジュラーカートリッジでありうる。
生物学的試料、例えば、血液試料を操作するには、カートリッジデザインの多数の競合的要件であって、交差汚染及び偽陽性検査結果を防止する、注入モジュールの滅菌性に対する必要、並びに照射のような標準的な末端滅菌法を使用して容易に滅菌することができないパッケージ内に試薬を組み入れる必要を含む競合的要件が存在する。試料をアリコート分割する注入モジュールは、無蓋のVACUTAINER(登録商標)チューブとインターフェース接続され、例えば、病原体を検出するアッセイを実施するのに使用しうる、2つの試料容量をアリコート分割するようにデザインすることができる(WO2012/054639の図7D〜7Fを参照されたい)。VACUTAINER(登録商標)は、部分的又は完全な充填を可能とする。注入モジュールは、一体に超音波溶接され、第2の試料ウェルへと溢流する、第1のウェルへの流路を形成することを可能とする、チャネルのネットワークを形成するようにフォイルシーリングされた、2つの硬質のプラスチック部分を有する。軟質のVACUTAINER(登録商標)シール部分は、VACUTAINER(登録商標)のシーリングに使用され、試料流動のためのポート、及び換気ポートを含む。VACUTAINER(登録商標)にロードし、反転させたら、流動抵抗を凌駕するために、ある程度の静水圧が必要となる。試料を試料ウェルから取り出すたびに、ウェルは、VACUTAINER(登録商標)からの流動で再補充されるであろう。
モジュラーカートリッジは、ある特定のアッセイ中に、交差汚染を管理する簡単な手段であって、複数の検出アリコートへの、増幅(例えば、PCR)産物の分配を含むがこれに限定されない手段をもたらしうる。加えて、モジュラーカートリッジは、自動式流体分注にも適合性であることが可能であり、試薬を、極めて小容量で、長時間(1年間を超える)にわたり保持する方式をもたらす。最後に、これらの試薬のあらかじめの分注は、濃度及び容量の精度を、製造工程が設定することを可能とし、要求しうるピペッティング精度がはるかに低いので、より簡便なポイントオブケア用の装置をもたらす。
本発明のモジュラーカートリッジは、パッケージングすることができ、必要な場合は、個別に滅菌しうるモジュールへと分離されたカートリッジである。それらはまた、例えば、試薬モジュールは、冷凍を要求するが、検出モジュールは、これを要求しない場合、個別に操作及び保存することもできる。WO2012/054639の図6は、注入モジュール、試薬モジュール、及び検出モジュールを併せてスナップで取り付けた、代表的なカートリッジを示す。この実施形態では、注入モジュールは、滅菌パッケージ内に別個にパッケージングされ、試薬及び検出モジュールは、あらかじめアセンブルされ、併せてパッケージングされることになろう。
保存中に、試薬モジュールは、冷凍庫内で保存しうるのに対し、注入モジュールは、乾燥保存により保存しうるであろう。これは、多くのアッセイを保存するのに極めてわずかな冷凍庫又は冷凍室空間しか要求されないという、さらなる利点をもたらす。使用時において、操作者は、検出モジュールを検索し、パッケージ開け、アッセイにより要求される場合は、滅菌法を潜在的に使用して、皮膚微生物叢による汚染を防止することになろう。次いで、WO2012/054639の図7Aにおいて示される通り、VACUTAINER(登録商標)チューブの蓋を外し、反転させた注入モジュールを、チューブへと取り付ける。このモジュールは、WO2012/054639の図7B及び7Cにおいて示される通り、単一の描画ツールを使用して、容易に成形可能となるようにデザインされており、カートリッジの上部及び底部は、汚染を防止し、また、チャネルも閉じるように、フォイルでシーリングされている。注入モジュールを使用して、チューブを再シーリングしたら、アセンブリーを正しい面が上になるように向け、カートリッジの残余部分へと、スナップで取り付ける。注入区画は、2〜6mlの間の血液を伴う試料チューブの使用を可能とする溢流を伴うウェルを含み、システムの自動化に、一定の深さのインターフェースを依然としてもたらす。注入区画は、WO2012/054639の図8に示される溢流によりこれを達成するが、この場合、サンプリングウェルを溢流する血液は、カートリッジ本体だけへと流れ込み、汚染を防止する。
WO2012/054639の図9A〜9Cは、正確にピペッティングされた小容量の試薬を保存する手段を示す。試薬は、WO2012/054639の図9Cに示されているピペットチップに保持される。これらは、製造自動化により充填され、次いで、断面図である、WO2012/054639の図9Bに示されている、ぴったり合うウェル内で、それらのチップをシーリングするように、カートリッジへと取り付けられる。最後に、フォイルシールを、チップの後面に貼付して、完全な水蒸気気密シールを施す。また、前述のフォイルの代わりに、又はこれに加えて、操作者により剥がされるシールで、全モジュールをシーリングすることも可能である。このモジュールがまた、装置により使用される、空の反応容器及びピペットチップの保存ももたらす一方、検出モジュールは、最終的な測定を行うのに装置により使用される有蓋の200μl PCRバイアルの保存をもたらす。
WO2012/054639の図10〜13Cは、例えば、増幅後(例えば、PCR)産物をピペッティングする間の汚染の管理をもたらすデザインである、カートリッジの検出モジュールについての代替的な実施形態を示す。これは、DNA増幅(例えば、PCR)によりもたらされる10億倍の増幅が、交差汚染及び偽陽性の大きな危険性を提示するため、要求される。しかし、低頻度の解析物が増幅され、分配されて、別個に検出又は同定されうるため、この混合物を、安全にアリコート分割しうることが望ましい。このアリコート分割の作業中に、カートリッジのこの部分が、汚染の管理の一助となる3つの方式がある。
第1に、WO2012/054639の図10A及び10Bにおいて示される通り、カートリッジは、導入作業を実施するための凹部ウェルを含有する。第2に、WO2012/054639の図11において示される通り、マシンは、このウェルを通り、且つ、ウェル底部の穴を通って、カートリッジへと至る気流をもたらす。ウェルの深さは、ピペットチップを気流内に保持し、エアゾールの漏出を防止するような深さである。WO2012/054639の図12は、検出チューブの底部、及び気流を確認するのに使用される2つの穴を示す、検出モジュールの底面図について描示する。液体エアゾールを捕捉し、これがマシンに流入することを防止する、任意選択のフィルターを挿入することができる。このフィルターはまた、空気の漏出は許容するが、液体の漏出は許容しない、GORE-TEX(登録商標)のような疎水性材料のシートでもありうる。最後に、WO2012/054639の図13A〜13Cにおいて示される通り、各200μlチューブ上に、特殊なシールキャップがあり、次いで、各ピペットチップが容器に進入するときに、シールを破る。アリコート分割するのに使用されるピペットチップは、とにかくこのウェル内に保存し、これにより、チップが、制御された気流領域を決して離れないようにすることを可能にすることが想定される。
代替的に、モジュラーカートリッジを、マルチプレックス化アッセイ用にデザインする。マルチプレックス化アッセイにおける難題は、1つのカートリッジ上に、適合しないアッセイ要件(すなわち、異なるインキュベーション時間及び/又は温度)を有する複数のアッセイを組み合わせることである。WO2012/054639の図14A〜14Cに描示されるカートリッジフォーマットは、アッセイ要件が大幅に異なる、異なるアッセイの組合せを可能とする。カートリッジは、2つの主要な構成要素:(i)完全なアッセイパネル(例えば、下記で記載されるパネル)に要求される、個々の試薬の全てを含有する試薬モジュール(すなわち、試薬ストリップ部分)、及び(ii)検出モジュールを特色とする。一部の実施形態では、カートリッジは、2〜24以上の病原体(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24以上の病原体)を検出するように構成することができる。検出モジュールは、インキュベーションを完遂するカートリッジの部分だけを含有し、必要に応じて、単一のアッセイを保有する場合もあり、いくつかのアッセイを保有する場合もある。WO2012/054639の図14Bに描示される検出モジュールは、単一のアッセイに、対照としての第1の検出チャンバー、及び試料用の第2の検出チャンバーの、2つの検出チャンバーを含む。このカートリッジフォーマットは、試薬及びさらなる検出モジュールを含むことにより、さらなるアッセイを追加しうるという点で、拡張可能である。
モジュールの作動は、使用者が、カートリッジの全部又は一部を装置へと挿入するときに始まる。装置は、アッセイの作動を実施し、アッセイを、個別の検出チャンバーへとアリコート分割する。次いで、これらの個々の検出チャンバーは、試薬ストリップ及び互いから取り外され、システム内を個別に進む。試薬モジュールは、分離及び廃棄されるため、可能な最小の試料単位が、装置内を移動し、内部装置空間を保つ。各アッセイを、その固有の単位に分割することにより、各マルチプレックス化アッセイが、他のアッセイから物理的に取り出され、各試料が個々に操られるので、異なるインキュベーション時間及び温度が可能となる。
本発明のカートリッジユニットは、1つ以上の磁性粒子の集団であって、液体懸濁液又は使用の前に復元される乾燥磁性粒子としての集団を含みうる。例えば、本発明のカートリッジユニットは、1×106〜1×1013個の磁性粒子(例えば、1×106〜1×108、1×107〜1×109、1×108〜1×1010、1×109〜1×1011、1×1010〜1×1012、1×1011〜1×1013、又は1×107〜5×108個の磁性粒子)を含むコンパートメントであって、単一の液体試料をアッセイするコンパートメントを含みうる。
パネル
本発明の方法、システム、及びカートリッジは、病原体の所定のパネルを検出するように構成することができる。一部の実施形態では、パネルは、以下:アシネトバクター属種(例えば、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・ピティー、及びアシネトバクター・ノソコミアリス)、腸内細菌科種、エンテロコッカス属種(例えば、エンテロコッカス・フェシウム(耐性マーカーであるvanA/Bを伴うE.フェシウムを含む)及びエンテロコッカス・フェカリス)、クレブシエラ属種(例えば、クレブシエラ・ニューモニエ(例えば、耐性マーカーであるKPCを伴うK.ニューモニエを含む)及びクレブシエラ・オキシトカ)、シュードモナス属種(例えば、緑膿菌)、ブドウ球菌属種(例えば、黄色ブドウ球菌(例えば、耐性マーカーであるmecAを伴う黄色ブドウ球菌)、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌属種、及びコアグラーゼ陰性(CoNS)ブドウ球菌属種を含む)、レンサ球菌属種(例えば、ストレプトコッカス・ミティス、肺炎レンサ球菌、B群溶血性レンサ球菌、ストレプトコッカス・アンギノースス、ウシレンサ球菌、G群溶血性レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サングイニス、及び化膿レンサ球菌)、エスケリキア属種(例えば、大腸菌)、ステノトロホモナス属種(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、プロテウス属種(例えば、プロテウス・ミラビリス及びプロテウス・ブルガリス)、セラチア属種(例えば、セラチア菌)、シトロバクター属種(例えば、シトロバクター・フロインディー及びシトロバクター・コセリ)、ヘモフィルス属種(例えば、インフルエンザ菌)、リステリア属種(例えば、リステリア・モノサイトゲネス)、ナイセリア属種(例えば、髄膜炎菌)、バクテロイデス属種(例えば、バクテロイデス・フラジリス)、バークホルデリア属種(例えば、バークホルデリア・セパシア)、カンピロバクター属(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリ)、クロストリジウム属種(例えば、ウェルシュ菌)、キンゲラ属種(例えば、キンゲラ・キンゲ)、モーガネラ属種(例えば、モーガネラ・モーガニー)、プレボテラ属種(例えば、プレボテラ・ブッケ、プレボテラ・インターメディア、及びプレボテラ・メラニノゲニカ)、プロピオニバクテリウム属種(例えば、アクネ菌)、サルモネラ属種(例えば、サルモネラ菌)、赤痢菌属種(例えば、志賀赤痢菌及びフレキシネル赤痢菌)、及びエンテロバクター属種(例えば、エンテロバクター・アエロゲネス及びエンテロバクター・クロアカ)から選択される1〜18の間(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18)の病原体を個々に検出するように構成された細菌病原体パネルでありうる。一部の実施形態では、真菌病原体、例えば、カンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリス)及びアスペルギルス属種(例えば、アスペルギルス・フミガーツス)を検出するように、細菌病原体パネルをさらに構成する。一部の実施形態では、カンジダ属種(カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリスを含む)を検出するように、細菌病原体パネルをさらに構成する。属の複数の種を検出する場合、種は、個々の標的核酸を使用して検出することもでき、種の全てに対してユニバーサルである標的核酸、例えば、ユニバーサルプライマーを使用して増幅される標的核酸を使用して検出することもできる。
一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つ)を個々に検出するように、パネルを構成することができる。
例えば、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及びエンテロコッカス・フェシウムを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及びエンテロコッカス・フェカリスを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・フェカリスを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、緑膿菌及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、緑膿菌及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、大腸菌及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
別の例では、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、及びエンテロコッカス・フェカリスを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
別の例では、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及びクレブシエラ・ニューモニエを個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
なおさらなる例では、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
別のさらなる例では、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び大腸菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。一部の実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
特定の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。他の特定の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を個々に検出するように、パネルを構成する。
一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、及びエンテロバクター属種のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、又は9つ)を個々に検出するように、パネルを構成することができる。例えば、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、及びエンテロバクター属種を個々に検出するように、パネルを構成することができる。
一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダ属種(例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・デュブリニエンシス、及びカンジダ・トロピカリス)のうちの1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は8つ)を個々に検出するように、パネルを構成することができる。例えば、一部の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダ属種を個々に検出するように、パネルを構成する。他の実施形態では、アシネトバクター・バウマニ、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びカンジダ属種を個々に検出するように、パネルを構成する。
上記の実施形態のうちのいずれかでは、汎細菌マーカーを検出するように、パネルを構成することができる。上記のパネルのうちのいずれかでは、解析物は、核酸(例えば、上記で記載した通りの増幅された標的核酸)、又はポリペプチド(例えば、病原体に由来するポリペプチド、又は宿主対象により産生される病原体特異的抗体、例えば、IgM若しくはIgG抗体)でありうる。一部の実施形態では、複数の解析物(例えば、複数の単位複製配列)を使用して、病原体を検出する。上記のパネルのうちのいずれかでは、生物学的試料は、全血、尿、脳脊髄液、呼吸器分泌物、又は組織試料(例えば、創傷試料)でありうる。
以下の実施例は、当業者に、本明細書で記載されるデバイス、システム、及び方法を、どのようにして実施、作製、及び査定するかについての、完全な開示及び記載を提示するように明示され、本発明を純粋に例示することを意図するものであり、本発明者らが、それらの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
[実施例1]
全血中の病原体を検出するパネル
図1Aは、本発明の、例示的で非限定的な標的生物及びマーカーのリストを示す。図1B〜1Eは、微生物病原体(例えば、細菌感染又は真菌感染)により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患、ライム病、血流感染(例えば、菌血症又は真菌血症)、肺炎、腹膜炎、骨髄炎、髄膜炎、膿胸、尿路感染、敗血症、敗血症性ショック、及び敗血症性関節炎)、及び微生物病原体により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患と類似の症状を伴って顕在化しうる疾患(例えば、SIRS)の診断及び処置に有用な病原体の例示的なパネルを示す。
例えば、図1Bに示されるパネルで選択される6つの細菌種は、抗微生物剤耐性病原体の大多数を占める。過去の研究は、院内感染のうちの70%を超えるものが、黄色ブドウ球菌、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、及びA.バウマニに起因することを決定している。Centers for Disease Control and Prevention(CDC)により行われた別の調査は、米国における経験的治療で最も高頻度に利用される抗菌剤が、レボフロキサシン、バンコマイシン、セフォタキシム、及びピペラシリン/タゾバクタムであることを見出した。これらの薬剤のうちのいずれも、図1Bに示されるパネル内の病原体のために選ぶべき薬物であるとは考えられない。さらに、これらの生物は、広域スペクトルの抗微生物治療中の患者における、ブレークスルー感染の最も高頻度の原因である。したがって、これらの著明な臨床因子は、菌血症罹患率を低減し、死亡率を低下させ、米国内の患者及び病院に影響を与える経済費用を軽減するために、医療市場における、図1Bのパネル内の病原体を、迅速且つ正確に検出することができるアッセイに対する必要を裏書きする。別の例では、図1Eに示されるパネルで選択された6つの細菌種は、不適切な経験的処置を施される可能性が最も高い種の約50%をカバーする。図1Eに示されるパネルはまた、最高の血流感染死亡率と関連する種も含む。
本実施例で記載される標的及びパネルの検出は、微生物病原体(例えば、細菌感染又は真菌感染)により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患、ライム病、血流感染(例えば、菌血症又は真菌血症)、肺炎、腹膜炎、骨髄炎、髄膜炎、膿胸、尿路感染、敗血症、敗血症性ショック、及び敗血症性関節炎)、及び微生物病原体により引き起こされるか、又はこれと関連する疾患と類似の症状を伴って顕在化しうる疾患(例えば、SIRS)についての、迅速且つ正確な鑑別診断を可能とする。これらの状態のうちの1つと符合する症状を提示する患者を、パネルのうちの1つについて調べることができ、これは、例えば、下記で記載されるT2Dx(登録商標)装置を使用して、マルチプレックス化アッセイにおいて実施することができる。次いで、全血試料中に存在する抗菌剤の検出及び同定を使用して、最適化された治療コースを決定することができる。
[実施例2]
病原体に由来する複数の単位複製配列の増幅及び検出による、病原体の検出感度の改善
パネルアッセイの開発中には、23ITS5 rRNA遺伝子座の一部を増幅し、結果として得られる単位複製配列を検出することによる黄色ブドウ球菌の検出について、比較的高い偽陽性率が観察された。これは、黄色ブドウ球菌の近縁菌、例えば、ヒトの皮膚上でよく見られる、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)、S.ワルネリ(S. warnei)、S.ホミニス(S. hominis)などの、増幅された、相同な23ITS5標的に対する弁別的ハイブリダイゼーションの欠如に起因する可能性が高かった。
シングルコピーfemB遺伝子を、黄色ブドウ球菌の検出の特異性を増大させるように、マルチコピー23ITS5S標的を置きかえる、シングルコピー標的として、まず選び出した。しかし、最大で約25%の偽陰性結果をもたらす、高頻度のドロップアウトが生じ、検出感度は、マルチコピー標的を検出する場合ほど高くはなかった。黄色ブドウ球菌の検出の感度及び頑健さをさらに改善するために、この種から合成される産物を、2倍だけ増大(共合成産物に起因する、理論的な化学量論的増大)させるための同時的な増幅に、別の特異的なシングルコピー標的を選び出した。本実施例で使用されるプライマー対を下記に示す(「dAP」=2,6-ジアミノプリン):
femAフォワード:5'-ACC T/dAP/T CTC TGC TGG TTT CTT CTT-3'(配列番号53)
femAリバース:5'-CAG CAT CTT C/dAP/A GCA TCT TCT GTA AA-3'(配列番号54)
femBフォワード:5'-GTT T/dAP/C TAT TCG AAT CGT GGT CCA GT-3'(配列番号55)
femBリバース:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)。
ハイブリダイゼーションベースの粒子アグロメレーション及びT2磁気共鳴(T2MR)による検出のために、各々がfemAの単位複製配列とハイブリダイズするプローブ、及びfemBの単位複製配列に結合するプローブを保有する、磁性粒子(「スクランブル化」磁性粒子対ともまた称する)の2つの集団を生成させた。1つの粒子集団を、femAに特異的な5'側捕捉プローブ(5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'、配列番号35)及びfemBに特異的な5'側捕捉プローブ(5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'、配列番号39)とコンジュゲートさせた。他の粒子集団を、femAに特異的な3'側捕捉プローブ(5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'、配列番号36)及びfemBに特異的な3'側捕捉プローブ(5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'、配列番号40)とコンジュゲートさせた。
粒子は、架橋時に、異なるプローブ比(すなわち、femA:Bプローブ=1:1、2:1、又は1:2)で生成させ、対照のfemA又はfemB単位複製配列オリゴマーとハイブリダイズさせた。これらのオリゴマーは、5'側捕捉プローブの5'端から、3'側捕捉プローブの3'端へと増幅された一本鎖標的(非対称PCRにおいて、プライマーを過剰に伸長させることにより増幅される鎖)を表す。図2A〜2Cは、3つ比の各々の存在下でコンジュゲートさせた粒子についてのオリゴマー滴定を示す。各プローブ比は、平均T2値の検出可能な増大をもたらしたが、1:1のプローブ濃度比を有する粒子は、2:1の比と比較して、最も安定的な検出プロファイルを示した(図2A〜2C)。
さらなる黄色ブドウ球菌特異的プライマー対の、感度に対する影響について査定した。両方の単位複製配列を、いずれのPCR産物に対するプローブも保有するスクランブル化磁性粒子対により検出しうるという条件で、両方のプライマー対を使用する同時的な増幅が、単一のプライマー対を使用する増幅と比較して、2倍の量の単位複製配列をもたらしたなら、アッセイの感度は増大するはずである。この手法の妥当性について調べるため、まず、femA及びfemBに対する対照オリゴマーで、粒子に対するチャレンジを行った。同等の濃度の両方のオリゴマー(femA+femBオリゴ)の、上記で記載したスクランブル化femA/B磁性粒子対を含有するハイブリダイゼーション物への添加は、femA又はfemBを単独で添加したハイブリダイゼーションと比較して、T2信号の60〜70%の増大を結果としてもたらした(図3A)。ハイブリダイゼーションは、62℃で30分間にわたりハイブリダイズさせる、15μlのスクランブル化femA/B磁性粒子+15μlのオリゴマーミックスを使用して実施した。
femA及びfemBの単位複製配列の両方の増幅が、黄色ブドウ球菌細胞の検出感度の改善を結果としてもたらしたかどうかについて調べるために、6プレックスPCRアッセイ(A.バウマニ、E.フェカリス/E.フェシウム、K.ニューモニエ、緑膿菌、黄色ブドウ球菌-femB、及び内部対照プライマー)を、7プレックスアッセイ(6プレックスと同じであるが、黄色ブドウ球菌-femAプライマーを加えた)と比較するPCR/T2MR組合せアッセイ、及びスクランブル化femA/B磁性粒子対による検出を実施した。驚くべきことに、黄色ブドウ球菌の検出感度の増大は、7プレックスアッセイにおけるPCR産物を、スクランブル化femA/B磁性粒子対(図3Bの4列目と対比した2列目)により検出した場合に限り観察されたわけではなく、また、femB特異的磁性粒子(5'側捕捉プローブ又は3'側捕捉プローブを、それらの表面へとコンジュゲートさせた、磁性粒子の2つのプール)を検出に使用した場合(図3Bの3列目と対比した1列目)にも観察された。
理論に束縛されることを望まずに述べると、この予測外の結果は、単位複製配列/プライマー部位を越えた、鎖合成の部分的なランスルーにより、femAフォワード及びfemBリバースプライマーの間の、>790ntの全区間がカバーされたことにより説明することができる。femA及びfemBフォワードプライマーの両方とも、非対称産物(一本鎖の下側鎖)の合成を容易とするように、femA及びfemBリバースプライマーと比較して、4分の1の濃度で存在した。両方のプライマーが、femBリバースの結合部位を越えて伸長する場合、両方のリバースプライマーは、結果として得られる産物を伸長させ、ついには、femA若しくはfemBの下側鎖産物、又はfemA及びfemBの両方を含有する下側鎖産物を含有する、過剰量の一本鎖産物を創出しうる(図4)。
[実施例3]
診断用細菌パネルを検出する7プレックスPCR/T2MRアッセイ
図1Bに示される微生物種のパネルを、ヒト全血中、2〜4CFU/mLの検出限界(LOD)で直接検出する、迅速、正確、且つ、再現可能な分子診断検査を開発した。この診断法は、迅速で、自動化(例えば、完全自動システム)に適し、臨床医に、複雑な生物学的検体内の複数のヒト病原体を検出して、菌血症、敗血症、及び他の疾患を診断及び処置する機会をもたらす。
アッセイの一部の実施形態は、PCR阻害についての対照となる内部対照(IC)の任意選択の検出を含む。IC鋳型及びプライマー(それぞれ、配列番号13及び14である、汎カンジダ属/フォワード及びリバース)を、下記に記載するマルチプレックスプライマーミックスへと添加して、それらの性能について調べた。過剰に増幅される内部対照の配列は、5'-GGC ATG CCT GTT TGA GCG TCC TGC ATC ATA CTG AAA TAG ATC CTT CGA CAA CCT CGG TAC ACT GGG AAC AAG GCC TCA AAC ATT GAT GCT CGA CTA CAC GTA GGG CAATGC GTC TTG CTA GAA GCG AAA TCT GTG GCT TGC TAG TGC AAG CTG GTC GGC GTA TTA TTC CAA CCC GCT GAA CTT AAG CAT ATC AAT AAG CA-3'(配列番号106)である。内部対照鋳型は、一般に利用可能なプラスミドであるpBR322へとクローニングされた、配列番号106の核酸配列を含む。これらのプライマーの添加は、パネルの標的の全てについての検出感度に対して影響を及ぼさなかった。他のIC鋳型及びプライマーもまた、使用することができる。
全血マルチプレックス化PCR
約2.0mLの全血を、100μLのTRAX赤血球溶解緩衝液(すなわち、ノニルフェノキシ-ポリエトキシルエタノール(NP-40)及び4-オクチルフェノールポリエトキシレート(Triton-X100)の混合物)と組み合わせ、約5分間にわたりインキュベートした。試料を、6000gで5分間にわたり遠心分離し、結果として得られる上清を、除去及び廃棄した。ペレットを洗浄するために、ペレットを、pH8.0のトリスEDTA(TE)緩衝液200μLと混合し、ボルテクシングにかけた。試料を、6000gで5分間にわたり、再度遠心分離し、結果として得られる上清を、除去及び廃棄した。洗浄ステップの後、ペレットを、1500コピーの阻害対照(内部対照)を含有する100μLのTE緩衝液と混合し、激しく撹拌しながら、1mmのタングステンカーバイドビーズ(代替的なビーズビーティング法は、0.65mmの高密度ZrO2+HfO2及びY2O3ビーズ(Glen Mills、NJ)を、5〜10分間にわたり使用するか、又は0.8mmの高密度ZrO2ビーズを、5〜15分間にわたり使用することを含む)を使用するビーズビーティングにかけた。試料を、再度遠心分離した。
次いで、50μLの結果として得られる溶解物を、表3に示されるPCRプライマーのほか、200mMのdNTP、4mMの塩化マグネシウム、トリシン緩衝液、及び5%のグリセロールを含有する、30μLの非対称PCRマスターミックスへと添加した。結果として得られる混合物を、95℃で5分間にわたり変性させ、次いで、遠心分離した。ホットスタート及び全血に適合性の熱安定性DNAポリメラーゼ並びにdNTPを含む、20μLの混合物を添加した(代替的に、ホットスタート適合性dNTP、例えば、CLEANAMP(商標)(TriLink)を、全血適合性DNAポリメラーゼと共に使用することができる)。次に、サーモサイクリングは、以下のサイクルパラメータ:95℃で5分間にわたる熱変性、95℃で30秒間にわたる熱変性ステップ、61℃で20秒間にわたるアニーリングステップ(59℃〜61℃の温度もまた使用しうる)、及び68℃で30秒間にわたる延伸ステップからなる50サイクル、並びに68℃で10分間にわたる、最終的な伸長を使用して行った。
表4は、例えば、図1Bに示したパネルについてのマルチプレックス化アッセイで、病原体特異的単位複製配列を増幅するのに使用しうる、プライマーの別のパネルを示す。カンジダ属種のフォワード及びリバースプライマーを、内部対照配列の任意選択の検出に使用することができる。使用しうる代替的なA.バウマニのフォワードプライマーは、5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)のオリゴヌクレオチド配列を含みうる。
ハイブリダイゼーション誘導型アグロメレーションアッセイ
結果として得られる増幅反応物15マイクロリットルを、0.2mLの薄壁型PCRチューブへとアリコート分割し、リン酸ナトリウムハイブリダイゼーション緩衝液(4×SSPE)中、反応1回当たり0.2mMの鉄の最終鉄濃度で、オリゴヌクレオチド誘導体化ナノ粒子の対と共にインキュベートした。ハイブリダイゼーション反応物を、95℃で3分間にわたりインキュベートするのに続き、1000rpmの撹拌速度に設定した、振盪式インキュベーター(Vortemp、LabNet International)内、60℃で30分間にわたりインキュベートした。次いで、ハイブリダイズさせた試料を、37℃のヒーティングブロックに入れて、3分間にわたり、温度を、MRリーダーの温度と平衡化させた。次いで、各試料を、5秒間にわたるボルテクシングステップ(3000rpm)にかけ、T2を測定するのに、MRリーダーへと挿入した。表5は、表示の種を検出するのに使用されるプローブの、単位複製配列に特異的な部分の核酸配列を示す。使用しうる代替的なE.フェシウムの5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含みうる。使用しうる代替的なE.フェシウムの3'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の3'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含みうる。プローブはまた、5'又は3'端における、磁性粒子へのコンジュゲーションを可能とするリンカー配列も含む。リンカー配列を含むプローブの核酸配列を、表6に示す。使用しうる代替的なE.フェシウムの5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列/5AmMC12/ttt ttt ttt AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT(配列番号113)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列/5AmMC12/ttt ttt ttt TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG(配列番号116)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の3'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列:GGA TAG ACG TAA GCC CAA GCtt ttt ttt t/3AmMO/(配列番号117)を含みうる。
黄色ブドウ球菌のfemA及びfemB単位複製配列の検出は、実施例2で記載した「スクランブル化」磁性粒子対を使用して実施した。残りの種の単位複製配列の検出は、磁性粒子対を、5'又は3'側捕捉プローブを保有する対の各メンバーと共に使用して実施した。
上記で記載したワークフロー以外のワークフローを使用することができる。1つのワークフローでは、全てのPCR成分を含む50μLの反応ミックスを、50μLの血液溶解物と混合し、PCRを実施し、磁性粒子のハイブリダイゼーションの前に、試料を遠心分離する。第2のワークフローでは、50μLの血液溶解物を、95℃で、5分間にわたり変性させ、室温へと冷却する。20μLのDNAポリメラーゼ及びdNTPを添加し、試料を遠心分離し、酵素以外の全ての成分(例えば、MgCl2、トリシン緩衝液、及びグリセロール)を含む30μLのPCRマスターミックスを添加し、PCRを実施して、標的核酸を増幅し、次いで、磁性粒子とのハイブリダイゼーションを、遠心分離を先行させずに実施する。第3のワークフローでは、50μLの血液溶解物を、DNAポリメラーゼ以外の全ての成分を含む30μLのPCR反応ミックスへと添加する。この試料を、95℃で5分間にわたり変性させ、室温へと冷却する。次いで、試料を遠心分離し、20μLのDNAポリメラーゼ及びdNTPを添加し、PCRを実施し、磁性粒子とのハイブリダイゼーションを、遠心分離を先行させずに実施する。第4のワークフローでは、50μLの血液溶解物を、95℃で、5分間にわたり変性させ、室温へと冷却する。DNAポリメラーゼを含む全てのPCR成分を含む、50μLのPCR反応ミックスを添加し、試料を遠心分離し、DNAを実施し、磁性粒子とのハイブリダイゼーションを、遠心分離を先行させずに実施する。
[実施例4]
7プレックス細菌パネルアッセイによる包含及び除外
包含
実施例3で記載した、7プレックス構成の、及び6プレックス構成(femAフォワード及びリバースプライマーを欠く)のアッセイについて、A.バウマニ、E.フェシウム、E.フェカリス、K.ニューモニエ、及び緑膿菌の5つの株の各々、並びに6つの黄色ブドウ球菌株のそれぞれから単離されたスパイクDNAの存在下で調べて、その解析感度を決定した。株を表7にまとめる。6プレックス構成、すなわち、PCR反応物中に、femB特異的プライマーが存在する構成を使用して、黄色ブドウ球菌株について調べたことに留意されたい。全ての株は、American Type Culture Collection(ATCC、VA)から、凍結乾燥細胞ペレットとして入手し、ゲノムDNAは、GenElute(商標)キット(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を使用して抽出した。ゲノムDNAの濃度は、NANODROP(登録商標)1000装置を使用して決定し、標的領域のコピー数は、コピー計算機を使用して推定した。包含試験は、ゲノムDNAを、陰性の全血溶解物中に、5ゲノム当量(cp)及び反応1回(n=4)当たり10cpでスパイクすることにより実施した。PCRを、MJ Reasearch Tetrad PTC-225サーマルサイクラー上で実施し、T2の検出は、実施例3で記載した構成を有する、種特異的磁性ナノ粒子ミックスを使用して実施した。
7プレックス(黄色ブドウ球菌の場合、6プレックス)のパネルアッセイは、LoDレベルで、又はその近くで、パネル内の全ての被験標的種株に特異的である(図5A〜5F)。5ゲノム当量の黄色ブドウ球菌株であるFRP DNAの場合のT2MR信号の欠如は、決定されたDNA濃度が、予測DNA濃度より低いことに起因すると考えられる。
除外
解析的特異性又は除外研究を実施して、パネル内の種の一部と系統発生的に類縁の生物(具体的には、A.バウマニ及び黄色ブドウ球菌)の潜在的な交差反応性について評価した。試験は、コンピュータによる解析(例えば、プライマー及びプローブについての、Genbank番号及びwgsデータベースに照らした相同性検索)に基づき、可能な交差反応性が示唆された種だけについて実施した。試験は、各々が、アシネトバクター属種及びS.ワルネリに由来する、3つの類縁の株を含んだ。また、K.ニューモニエ、例えば、エンテロバクター属種、大腸菌(4株)、及びアエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)(2株)のある特定の近縁菌についても調べた。上記の包含についての節で記載した通り、株は、American Type Culture Collection(ATCC、VA)から、凍結乾燥試料として入手し、gDNAを単離した。被験除外株を、表8に列挙する。ゲノムDNAは、A.ハイドロフィラ株であるATCC35654を除き、ATCCから入手した(DNAは、上記で記載した通り、細胞ペレットから単離した)。
除外試験は、アシネトバクター属及びブドウ球菌属種株について、ゲノムDNAを、陰性全血溶解物中、高コピー数(反応1回あたり1×104及び1×105ゲノム当量)でスパイクし、大腸菌及びA.ハイドロフィラ株について、反応1回(n=4)当たり1×106コピーでスパイクすることにより実施した。T2MR信号は、全血溶解物へとスパイクされる標的を大過剰量とした場合であってもなお、被験除外株のいずれからも検出不可能であった(図6A〜C)。
まとめると、実施例3で記載した、マルチプレックス細菌のパネルアッセイは、パネルの各構成要素について、個々の種内の株を検出することは可能であるが、近縁種は検出しない。
[実施例5]
健常血液中の、7プレックス細菌パネルアッセイの検出限界(LoD)
実施例3で記載した、7プレックスPCR/8-T2MR細菌パネルアッセイ構成(femA及びfemBの単位複製配列の両方の増幅を含む)のLoDは、細胞を、健常及び非健常血液検体(実施例6を参照されたい)へとスパイクすることにより決定した。全てのスパイク実験は、指数増殖期で増殖しつつある細菌種から調製される細胞ビュレットから開始した。12%(最終濃度v/v)のグリセロールを添加した後で、ビュレットを、-80℃で凍結及び保存した。LoD研究で使用した株から単離したDNAを、包含研究で使用した(実施例4を参照されたい)。株は、アシネトバクター・バウマニ2208(ATCC 19606)、エンテロコッカス・フェシウムTEX16(ATCC BAA-472)、エンテロコッカス・フェカリスV583(ATCC 70080)、クレブシエラ・ニューモニエART 2008133(ATCC 6908)、緑膿菌PAO1-LAC(ATCC 47085)、及び黄色ブドウ球菌TCH959(ATCC BAA-1718)であった。
健常血液を1例のドナーから得、バルク中で、スパイクを行った。全てのLoDデータは、グラム陰性及びグラム陽性パネル種を組み合わせ、以下:A.バウマニ及び黄色ブドウ球菌、緑膿菌及びE.フェシウム、K.ニューモニエ及びE.フェカリスの通りに組み合わせることにより、二重スパイクとして決定した。2つの目標LoDである、3CFU/mL又は5CFU/mLでスパイクした血液を調製し、2名の操作者により独立に調べた。1つの細胞スパイクを調製するために、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)中に0.3CFU/μL又は0.5CFU/μLの目標濃度へと希釈した。2つの種を、上記で概観した通りに、各々、全血中の最終目標の3CFU/mL又は5CFU/mLまでスパイクした。次いで、各スパイク濃度の、1.75mLずつのアリコートを、0.65mmの白色ビーズ(ZrO2+HfO2及びY2O3、Glen Mills、NJ)スコップ1杯及び0.1mlの溶解溶液で満たした溶解チューブへと分配(スパイクレベル及び操作者1名当たりのN=20)した。次いで、手作業によるアッセイを、2名の独立の操作者であって、各々が、二重スパイク1つ当たり20例ずつの試料を処理する2名の操作者、及び2つの異なるスパイクレベルにより、並行して実施した。
7プレックスPCR増幅及びT2MRの検出を、実施例3で記載した方法に従い実施した。
正確なスパイク濃度は、100μlずつの各最終細胞希釈液を、TSB寒天プレートへと、並行して播種することにより決定した。コロニーは、37℃で、24〜36時間にわたるインキュベーションの後でカウントした。3及び5CFU/mLの目標LoD以下のスパイクだけを、妥当であるとみなした。図7に示す通り、各種について、最終1mL当たり4CFU以下を目標とするスパイク濃度のうちの少なくとも1つがヒットした。
図8は、2つのスパイクレベルで、2名の操作者の各々により実施された、全てのアッセイについてまとめる。20例のブランクのシリーズ(細胞をスパイクしていない)もまた、組み入れた。75ミリ秒の閾値を上回る平均T2信号を、真の陽性としてカウントした。内部対照信号は、実施されたアッセイの全てにおいて検出(実施されたのべ140のアッセイ中、100%のIC検出)されたので、全てのアッセイを、妥当であるとカウントした。
1つのアッセイシリーズ(目標である3CFU/mLの黄色ブドウ球菌、操作者1)を除き、全てのアッセイが、20例中少なくとも17例の陽性を有した(95%の信頼性)。合計で、アシネトバクター・バウマニについて、約18%の偽陽性(FP)が観察された。これは、手作業によるアッセイの実行から導入された汚染(すなわち、操作者が、共生菌を導入した)ではなく、試薬により導入された汚染に起因する可能性が高い。アシネトバクター・バウマニの18%のFP率と異なり、組み合わされた他の全ての種は、2%を下回るFPであった。一般に、ICを含む、全ての種について、ベースラインに対する、少なくとも10倍の、高い信号対ノイズ比が達成された。
結論:手作業による操作を使用する、実施例3に記載した方法は、細胞を、健常血液へと二重スパイクすること(人為的血液検体)により決定される、2〜4CFU/mLの感度を有する。感度を、図9にまとめる。このアッセイはまた、T2Dx(登録商標)装置を使用する自動化にも適する(図11を参照されたい)。
[実施例6]
凍結させた患者廃棄検体に対する7プレックス細菌パネルアッセイの性能
本実施例では、本発明者らは、図1Bに示したパネルの6つの細菌種のうちの1つについて、BC陽性である検体についてアッセイした。凍結させた廃棄検体を、いくつかの共同研究施設で回収し、T2 Biosystemsへと送付し、そこで、それらを、実施例3で記載した7プレックス細菌パネルアッセイにおける査定に使用するまで、-80℃で保存した。検体は、廃棄データベースに入力した種IDに従い選択した。この研究では、合計74例の廃棄検体について解析した。A.バウマニによる敗血症発生率の低さに起因して、これらの中で、3例のA.バウマニ陽性血液試料しか存在しなかった。したがって、「アシネトバクター属種」として同定された、さらなる試料を、4のパネルに組み入れた。他の全ての種についてのBC陽性検体は、以下の数:6例のエンテロコッカス・フェシウム、9例のエンテロコッカス・フェカリス、12例のクレブシエラ・ニューモニエ、11例の緑膿菌、及び13例の黄色ブドウ球菌で存在した。BCにより同定される通り、いくつかの検体には、複数の種が存在した。この研究では、患者ごとに、初回の採血だけを組み入れた。加えて、また、除外種(すなわち、7プレックス細菌パネルアッセイにより検出されることが予測されない)について陽性である、21例の検体も、解析に組み入れた。図10は、それらのBC結果、並びに7プレックス細菌パネルアッセイの結果と併せて解析された検体を示す。
少なくとも1つの細菌パネルアッセイ種について、BC陽性である53例の検体のうち、34例は、両方のアッセイで、一致する結果(74%の一致)を有していた。4例のBC陽性A.バウマニ検体について調べ、これらのうちの1例は、7プレックス細菌パネルアッセイ(#15-039)において試験したところ陰性であった。回収施設により提供されたBC種別データについて検討したところ、「A.バウマニ/ヘモリティクス(A. haemolyticus)」の曖昧な表示が示された。このアシネトバクター属種は、7プレックス細菌パネルアッセイの除外種であるので、種が実際にA.ヘモリティクスであったなら、これは、陰性結果を説明するであろう。
15例の検体は、7プレックス細菌パネルアッセイにおいて、BCにより検出されなかったさらなるパネル細菌(橙色のフィールドに示される)について試験したところ、T2MR陽性であった。これらは、試薬及び操作により導入された偽陽性でありうるため、A.バウマニ及び緑膿菌の陽性は、このカウントに含まれなかった(実施例5及び6を参照されたい)。生の試薬が、環境内で一般的であり、「純粋」と標識された試薬、及び水と共に調製された検体を汚染することが公知の2つの種である、A.バウマニ及び緑膿菌で汚染された可能性が極めて高い(例えば、Woykeら、PloS One、6(10):e26161(2011)、Grahnら、FEMS Microbiol. Lett.、219(1):87〜91(2003)を参照されたい)。
最後に、パネルのメンバーについてBC陰性であった22例の選択された検体のうち、18はまた、7プレックス細菌パネルアッセイにおけるT2MRによっても陰性である(81%の一致)。3例は、K.ニューモニエについて試験したところ陽性であり、1例は、E.フェカリスについて試験したところ陽性であった。
結論として述べると、手作業により実施された、実施例3で記載した7プレックス細菌パネルアッセイは、BC結果との高レベルの一致を示した。さらに、7プレックス細菌パネルアッセイはまた、BCによっては検出されなかった、潜在的な共感染も検出した。この検出は、より正確な診断を可能とし、2つの環境的汚染菌である、A.バウマニ及び緑膿菌を、解析から除外する場合であっても重要である。
[実施例7]
A.バウマニ、E.フェシウム、K.ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌を迅速且つ高感度に検出する細菌パネルアッセイ
ヒト全血中、1〜3CFU/mLの検出限界(LOD)で直接、図1Eに示した微生物種のパネルを検出する、迅速、正確、且つ再現可能な分子診断検査を開発した。この診断法は、迅速であり、自動化(例えば、完全自動システム、例えば、T2Dx(登録商標)装置における)に適し、臨床医に、複雑な生物学的検体中において、複数のヒト病原体を検出して、菌血症、敗血症、及び他の疾患を診断及び処置する機会をもたらす。
表9は、図1Eに示されるパネルについて、病原体特異的単位複製配列の増幅に使用しうるプライマーを示す。使用しうる代替的なA.バウマニのフォワードプライマーは、5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)のオリゴヌクレオチド配列を含みうる。表10は、表9に示されるプライマー対を使用して生成される単位複製配列の検出に使用されるプローブの、単位複製配列に特異的な部分の核酸配列を示す。プローブはまた、5'又は3'端における、磁性粒子へのコンジュゲーションを可能とするリンカー配列も含む。使用しうる大腸菌の代替的な5'側捕捉プローブは、5'-GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号107)、5'-TGC CAG TGA TGA TGA GTT GT-3'(配列番号108)、又は5'-GCC ACC TGA CAT TAG CCA TC-3'(配列番号109)を含む。使用しうる代替的なE.フェシウムの5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含みうる。使用しうる代替的なE.フェシウムの3'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の5'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含みうる。使用しうる代替的な緑膿菌の3'側捕捉プローブは、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含みうる。プローブを、実施例3及び国際特許出願公開第WO2012/054639号に記載される磁性粒子へとコンジュゲートさせた。アッセイの一部の実施形態は、PCR阻害についての対照となる内部対照(IC)の任意選択の検出を含む。本実施例では、オレンジ(スイートオレンジ)のIC鋳型(プラスミドであるpBR322へとクローニングされた、配列番号94の核酸配列を含む)を使用した。オレンジのIC鋳型を、配列番号95又は配列番号96の配列を有するフォワードプライマー、及び配列番号96又は配列番号97の配列を有するリバースプライマーで増幅した。結果として得られる単位複製配列は、オリゴヌクレオチド配列5'-GAG ACG TTT TGG ATA CAT GTG AAA GAA GGC-3'(配列番号99)を含む5'側捕捉プローブ、及びオリゴヌクレオチド配列5' CGA TGG TTC ACG GGA TTC TGC AAT TC-3'(配列番号100)を含む3'側捕捉プローブを使用して検出した。
このアッセイで記載される細菌パネルアッセイの性能を評価するために、各病原体を全血へと、規定の力価で、個別にスパイクすることにより、各病原体についてスパイクされた全血試料を作製した。検出限界研究に使用されるスパイク実験では、全ての検体は、標的生物の各々について、対数中期に採取された細胞培養物を使用して調製した。濃縮懸濁液を、目標濃度へと希釈し、健常又は非健常血液試料に由来する、K2EDTAで処置された全血へとスパイクした。全てのCFU/mL濃度は、希釈接種物の並行的播種を介して確認した。接種物希釈液は、30〜300の最終CFUカウントが予測されるように、TSA(トリプチカーゼソイ寒天)又はYPD(酵母抽出物ペプトンデキストロース寒天)上に播種した。次いで、最終CFUカウントを、播種された総容量で除し、播種された総容量を乗じ、スパイク容量を乗じて、最終的なCFU/mLを人為的検体へと割り当てた。
アッセイを実施するために、2mLのスパイクされた全血を溶解チューブへと添加し、ピペッティングすることにより、溶解洗浄液と混合し、約5分間にわたりインキュベートした。チューブを、6000gで、5分間にわたり遠心分離し、上清を除去した。150μLの内部対照を添加し、混合した。チューブを、6000gで、5分間にわたり遠心分離し、上清を除去した。100μLの内部対照を添加し、試料を、1mmのタングステンカーバイドビーズを使用して、3200rpmで、5分間にわたり、ビーズビーティングした。次いで、チューブを、6000gで、2分間にわたり遠心分離した。溶解物を混合し、50μLを、上記(例えば、表7)で記載したPCR緩衝液及びPCRプライマーを含有する、30μLの反応ミックスへと添加した。この試料を、95℃で5分間にわたり変性させるのに続き、25℃へと冷却した。試料を、8000gで5分間にわたり遠心分離し、20μLの製剤化された酵素(ホットスタートの好熱性DNAポリメラーゼ及びdNTPを含む)を添加した。サーモサイクリングは、以下のサイクルパラメータ:95℃における初期変性、95℃で20秒間にわたる変性ステップ、58℃で30秒間にわたるアニーリングステップ、68℃で30秒間にわたる伸長ステップに続いて、68℃で3〜10分間にわたる最終的な伸長からなる46サイクルを使用して行った。各磁性粒子のハイブリダイゼーションミックスを、吸引及び分注の前にボルテクシングした。磁性粒子のハイブリダイゼーションミックス15μLを、各表示の検出チューブへと添加した。希釈された単位複製配列の上清15μLを、磁性粒子のハイブリダイゼーションミックスを含有するチューブへと添加し、試料を、62℃で30分間にわたりハイブリダイズさせる。T2MRの検出は、実施例3及び国際特許出願公開第WO2012/054639号で記載される通りに実施した。全てのステップが、完全自動式であり、アッセイ処理が完了した後で、カートリッジ上の全ての液体を除染する漂白剤が自動で添加されることを除き、T2Dx(登録商標)装置上の自動アッセイ試験は、手作業によるアッセイと同じアッセイワークフローに従った。
T2MRは、全ての細菌標的について、高解析感度及び高特異性を裏付けた。健常血液へとスパイクされた標的細菌種について、1CFU/mLという低値の検出限界(LoD)(95%陽性、n=20)を観察した。全ての被験細菌種のLoDを、≧95%の検出率を結果としてもたらす細胞濃度(CFU/mL)により決定し、結果を、表11に示す。
予備実験では、T2Dx(登録商標)装置に対する最適化は、手作業によるアッセイ時に測定される検出限界以下の各標的病原体について調べることを伴った。現在まで実施されているこの試験による凝集物データを、表12に示す。示される通り、LoDは、手作業によるアッセイについて観察されるLoD以上であった。
本実施例で記載されるアッセイ及び血液培養を使用して、T2MRの比較を実施した。この実験では、血液を培養するのに採取された検体と同じ日に、EDTA VACUTAINER(登録商標)チューブ内で採取された血液検体廃棄物を、臨床血液検査室から得た。患者の血液培養転帰が、黄色ブドウ球菌について血液培養陽性であれば、血液試料を、T2MRに選択した。T2MRを使用して、黄色ブドウ球菌の存在について測定するように、上記の手順に従い、検体をランした。T2MR及び血液培養の間の陽性一致パーセント(PPA)は、T2MR陽性試料の数を、血液培養陽性試料の数で除することにより計算した。信頼区間の上限及び下限(UCL及びLCL)は、データセットについての95%信頼区間に基づき計算した。総じて、T2MRは、33例の試料中30例を、陽性として検出した。これより、90%のPPAが、PPAについての98%のUCL、PPAについてのLCLで、算出された。3例の偽陰性は、妥当なIC信号をもたらしたことから、黄色ブドウ球菌チャネルについての陰性信号は、阻害により引き起こされたのではないことが裏付けられる。
結論として述べると、本実施例で記載される細菌パネルアッセイは、臨床的に意義がある濃度において、高感度で、その標的病原体を検出する。さらに、パネルアッセイは、3〜5時間で結果をもたらす。この感度及び結果までの時間は、細菌病原体について、患者の血液試料から直接医療診断法によって達成されたことはなかった。細菌パネルアッセイ種は、陽性血液培養物に由来し、真の感染と関連する、55%を超える種をカバーし、高比率の有病率、死亡率、及び不適切な経験的治療の総合的関連性に基づき、具体的に選択された。標準的な経験的治療慣行と組み合わせれば、本実施例で記載される細菌パネルアッセイ、及びT2Candida(登録商標)(T2 Biosystems、Lexington、MA)パネルのカバレッジは、臨床症状から数時間以内に、適切な治療を受ける症状性患者のうちの95%を結果としてカバーするであろう。
配列表
表13は、本出願で記載される配列の一覧を示す。「/i6diPr/」は、2,6-ジアミノプリンを示す。「/5AmMC12/」は、5'側アミノ修飾基のC12を示し、「/3AmMO/」は、3'側アミノ修飾基を示す。
他の実施形態
本発明について、その具体的実施形態との関連で記載してきたが、さらなる改変が可能であることが理解され、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、且つ、本開示からのこのような逸脱であって、本発明が関する技術分野内の、公知又は通例の慣行内に収まる逸脱を含め、本発明の任意の変化、使用、又は適応を対象とすることが意図され、本明細書の前出で明示され、特許請求の範囲で後述される、不可欠の特色へ適用されうる。
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。

Claims (125)

  1. 液体試料中のアシネトバクター・バウマニ(A.バウマニ)細胞の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中のA.バウマニの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、A.バウマニの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、A.バウマニ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  2. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、A.バウマニの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、A.バウマニの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
  3. 第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む、請求項2に記載の方法。
  4. 液体試料中のエンテロコッカス属種の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中のエンテロコッカス属の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、エンテロコッカス属の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、エンテロコッカス属種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  5. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項4に記載の方法。
  6. 種が、エンテロコッカス・フェシウムであり、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む、請求項5に記載の方法。
  7. 種が、エンテロコッカス・フェカリスであり、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む、請求項5に記載の方法。
  8. 液体試料中のクレブシエラ・ニューモニエ(K.ニューモニエ)細胞の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中のK.ニューモニエの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、K.ニューモニエの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、K.ニューモニエ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  9. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項8に記載の方法。
  10. 第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む、請求項9に記載の方法。
  11. 液体試料中の緑膿菌細胞の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中の緑膿菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、緑膿菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、緑膿菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  12. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項11に記載の方法。
  13. 第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む、請求項12に記載の方法。
  14. 液体試料中の大腸菌細胞の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中の大腸菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、大腸菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、大腸菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  15. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項14に記載の方法。
  16. 第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む、請求項15に記載の方法。
  17. 液体試料中の黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
    (b)溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対又は第2のプライマー対の存在下で増幅して、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップであって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含むステップ、
    (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
    (g)ステップ(f)の結果に基づき、黄色ブドウ球菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  18. 磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項17に記載の方法。
  19. ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む、請求項18に記載の方法。
  20. ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む、請求項18に記載の方法。
  21. ステップ(b)が、第1の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅して、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成すること、及び第2の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅して、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成することを含み、ステップ(g)が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列及び第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を検出することを含む、請求項17に記載の方法。
  22. 磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
    第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
    第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
    磁性粒子が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
    請求項21に記載の方法。
  23. 第1のプローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2のプローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3のプローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4のプローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項22に記載の方法。
  24. ステップ(b)が、少なくとも第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 第3の単位複製配列が、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第1の領域、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第2の領域、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第3の領域、及び配列番号40のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第4の領域を含む、請求項24に記載の方法。
  26. 第3の単位複製配列が、第1の単位複製配列のヌクレオチド配列及び第2の単位複製配列のヌクレオチド配列を含む、請求項24又は請求項25に記載の方法。
  27. 第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 方法のステップ(a)〜(g)を、3時間以内に完了する、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度のA.バウマニ、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、又は黄色ブドウ球菌を検出することが可能である、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 3CFU/mLの濃度を検出することが可能である、請求項29に記載の方法。
  31. 1CFU/mLの濃度を検出することが可能である、請求項30に記載の方法。
  32. 液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 液体試料が、全血である、請求項32に記載の方法。
  34. ステップ(a)が、対象に由来する全血試料中の赤血球を溶解させること、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成すること、上清の一部又は全部を廃棄すること、任意選択で、ペレットを洗浄すること、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成することを含む、請求項33に記載の方法。
  35. ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 液体試料中の種の存在を検出する方法であって、
    (a)液体試料中の、第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含む溶液を形成するステップであって、各標的核酸が、検出される種に特徴的であるステップ、
    (b)磁性粒子を液体試料へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、第1の単位複製配列又は第2の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
    (c)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
    (d)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
    (e)ステップ(d)に続き、信号を測定するステップ、並びに
    (f)ステップ(e)の結果に基づき、種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
    を含む方法。
  37. 種が、植物種、哺乳動物種、又は微生物種である、請求項36に記載の方法。
  38. 種が、微生物種である、請求項37に記載の方法。
  39. 第1の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第1のプライマー対の存在下で増幅し、第2の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第2のプライマー対の存在下で増幅する、請求項36から38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
    第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
    第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
    磁性粒子が、第1の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
    請求項36から39のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップ(a)が、第3の単位複製配列を増幅することをさらに含み、第3の単位複製配列が、第1の標的核酸の核酸配列及び第2の標的核酸の核酸配列を含む核酸配列を含む、請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
  42. 第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、染色体又はプラスミド上に位置する、請求項41に記載の方法。
  43. 第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、約10〜約1000塩基対の間だけ隔てられている、請求項41又は42に記載の方法。
  44. 第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、請求項41から43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、請求項37から44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 液体試料中の3CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、請求項45に記載の方法。
  47. 液体試料中の1CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、請求項46に記載の方法。
  48. 方法のステップ(a)〜(f)を、3時間以内に完了する、請求項36から47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 微生物種が、A.バウマニ、E.フェカリス、E.フェシウム、K.ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌から選択される、請求項37から48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、請求項36から49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 液体試料が、全血である、請求項50に記載の方法。
  52. ステップ(a)の前に、対象に由来する全血試料を用意するステップ、全血試料中の赤血球を溶解させるステップ、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成するステップ、上清の一部又は全部を廃棄するステップ、任意選択で、ペレットを洗浄するステップ、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップをさらに含む、請求項51に記載の方法。
  53. ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、請求項36から52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 磁性粒子が、700nm〜950nmの平均直径を有する、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法。
  55. 磁性粒子が、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
  56. 磁性粒子が、実質的に単分散である、請求項1から55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する、請求項1から56のいずれか一項に記載の方法。
  58. (a)(i)A.バウマニの標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)A.バウマニの標的核酸を増幅することにより生成させた、A.バウマニの単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  59. (a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  60. エンテロコッカス属の標的核酸が、エンテロコッカス・フェシウムの標的核酸である、請求項59に記載の組成物。
  61. (a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  62. エンテロコッカス属の標的核酸が、エンテロコッカス・フェカリスの標的核酸である、請求項61に記載の組成物。
  63. (a)(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成させた、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  64. (a)(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、緑膿菌の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  65. (a)(i)大腸菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)大腸菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、大腸菌の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  66. (a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  67. (a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
    オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  68. (a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
    (ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、
    第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子
    を含む組成物。
  69. (a)(i)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を含有することが疑われ、各標的核酸が、微生物種に特徴的であるか、又は
    (ii)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅することにより生成させた、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含有する
    液体試料、並びに
    (b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、それらの表面へとコンジュゲートさせた結合性部分を有し、
    第1の単位複製配列に作動可能に結合して、凝集物を形成することが可能であり、第2の単位複製配列に結合して、凝集物を形成することが可能である磁性粒子
    を含む組成物。
  70. 磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
    第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
    第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動する、
    請求項69に記載の組成物。
  71. 磁性粒子が、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する、請求項58から70のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
    (a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、
    (b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
    (c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、以下:
    (i)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーを含む、A.バウマニの標的核酸を増幅するプライマー対、
    (ii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーを含む、エンテロコッカス属の標的核酸を増幅するプライマー対、
    (iii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーを含む、K.ニューモニエの標的核酸を増幅するプライマー対、
    (iv)オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーを含む、緑膿菌の標的核酸を増幅するプライマー対、
    (v)オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーを含む、大腸菌の標的核酸を増幅するプライマー対、並びに/又は
    (vi)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅する、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対であり、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含む、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対
    から選択される、1つ以上のプライマー対を使用して、その中の標的の細菌核酸を増幅して、増幅溶解物溶液を形成するステップ
    を含む方法により作製される増幅溶解物溶液。
  73. ステップ(c)の増幅することが、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含む、請求項72に記載の増幅溶解物溶液。
  74. ステップ(c)の増幅することが、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含む、請求項72に記載の増幅溶解物溶液。
  75. ステップ(c)の増幅することが、2つの黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対及び第2のプライマー対の存在下で増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を生成させることを含む、請求項72から74のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  76. ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらし、第3の単位複製配列の核酸配列が、第1の単位複製配列の核酸配列及び第2の単位複製配列の核酸配列を含む、請求項75に記載の増幅溶解物溶液。
  77. 前記全血試料中の10CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項72から76のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  78. 前記全血試料中の5CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項77に記載の増幅溶解物溶液。
  79. 前記全血試料中の3CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項78に記載の増幅溶解物溶液。
  80. 前記全血試料中の1CFU/mLの細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項79に記載の増幅溶解物溶液。
  81. 全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
    (a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、
    (b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
    (c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、その中の2つ以上の標的の細菌核酸を増幅して、2つ以上の細菌の単位複製配列を含む増幅溶解物溶液を形成するステップであって、前記全血試料中の10CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分であるステップ
    を含む方法により作製される増幅溶解物溶液。
  82. ステップ(a)が、先行する洗浄ステップを伴わずに、ペレットを再懸濁させることを含む、請求項72から81のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  83. ステップ(a)が、ペレットを再懸濁させる前に、洗浄ステップを含む、請求項72から81のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  84. 2つ以上の標的の細菌核酸が、単一の細菌病原体に特徴的である、請求項81から83のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  85. ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす、請求項81から84のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  86. 第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、請求項85に記載の増幅溶解物溶液。
  87. 前記全血試料中の約10CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項72から86のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
  88. 前記全血試料中の約5CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項87に記載の増幅溶解物溶液。
  89. 前記全血試料中の約3CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項88に記載の増幅溶解物溶液。
  90. 前記全血試料中の約1CFU/mLの細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、請求項89に記載の増幅溶解物溶液。
  91. (a)(i)赤血球を溶解させ、(ii)試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、(iii)上清の一部又は全部を廃棄し、(iv)洗浄せずに、残余の細胞を溶解させて、抽出物を形成することにより調製される、細菌病原体を含有することが疑われる全血試料からの抽出物の一部、
    (b)配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、
    (c)配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマー、
    (d)熱安定性ポリメラーゼ、並びに
    (e)デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、及びマグネシウム
    を含む組成物。
  92. フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項91に記載の組成物。
  93. フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項92に記載の組成物。
  94. フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項92に記載の組成物。
  95. リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項91から94のいずれか一項に記載の組成物。
  96. リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項95に記載の組成物。
  97. リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項95に記載の組成物。
  98. 複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、以下:
    (a)請求項58に記載の組成物を含む第1のウェル、
    (b)請求項59に記載の組成物を含む第2のウェル、
    (c)請求項61に記載の組成物を含む第3のウェル、
    (d)請求項63に記載の組成物を含む第4のウェル、
    (e)請求項64に記載の組成物を含む第5のウェル、
    (f)請求項68に記載の組成物を含む第6のウェル
    のうちの1つ以上を含む着脱式カートリッジ。
  99. 複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、以下:
    (a)請求項58に記載の組成物を含む第1のウェル、
    (b)請求項59に記載の組成物を含む第2のウェル、
    (c)請求項65に記載の組成物を含む第3のウェル、
    (d)請求項63に記載の組成物を含む第4のウェル、
    (e)請求項64に記載の組成物を含む第5のウェル、
    (f)請求項68に記載の組成物を含む第6のウェル
    のうちの1つ以上を含む着脱式カートリッジ。
  100. (a)〜(f)を含む、請求項98又は99に記載の着脱式カートリッジ。
  101. 1つ以上のアッセイ試薬を保持する、複数の試薬モジュールを保持する、1つ以上のチャンバーをさらに含む、請求項98から100のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
  102. 細胞を溶解させるビーズを含むチャンバーをさらに含む、請求項98から101のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
  103. ポリメラーゼを含むチャンバーをさらに含む、請求項98から102のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
  104. 1つ以上のプライマーを含むチャンバーをさらに含む、請求項98から103のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
  105. 1つ以上のプライマーが、配列番号1〜14、59、61、及び110から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項104に記載の着脱式カートリッジ。
  106. 対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
    請求項1から35又は54から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、
    液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ
    を含む方法。
  107. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む、請求項106に記載の方法。
  108. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む、請求項107に記載の方法。
  109. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む、請求項108に記載の方法。
  110. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む、請求項109に記載の方法。
  111. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む、請求項110に記載の方法。
  112. エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである、請求項106から111のいずれか一項に記載の方法。
  113. エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウムである、請求項112に記載の方法。
  114. 対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
    請求項37から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、
    液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ
    を含む方法。
  115. 対象における血流感染又は敗血症を処置する方法であって、
    請求項1から35又は54から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、及び
    血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップ
    を含む方法。
  116. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む、請求項115に記載の方法。
  117. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む、請求項116に記載の方法。
  118. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む、請求項117に記載の方法。
  119. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む、請求項118に記載の方法。
  120. A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む、請求項117に記載の方法。
  121. エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである、請求項115から120のいずれか一項に記載の方法。
  122. エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウムである、請求項119に記載の方法。
  123. 対象における血流感染又は敗血症を処置する方法であって、
    請求項37から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、及び
    血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップ
    を含む方法。
  124. 血流感染が、菌血症である、請求項107から123のいずれか一項に記載の方法。
  125. 対象が、ヒトである、請求項106から124のいずれか一項に記載の方法。
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