CN110499234A - 念珠菌检测设备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种念珠菌检测装置及检测方法，包括离心机、聚合酶链式反应仪、磁共振检测系统、念珠菌磁性纳米探针、探针盛放装置和传送装置，全血试样由所述传送装置送至离心机旋转离心处理，再由传送装置送至聚合酶链式反应仪进行聚合酶链式反应，全血试样经过旋转离心处理和聚合酶链式反应后与所述念珠菌磁性纳米探针混合，之后由传送装置将混合液体送至磁共振检测系统进行T2弛豫时间测量，根据所述T2弛豫时间检测念珠菌是否存在，并确定念珠菌的种类。本发明可以实现灵敏、快速的念珠菌检测。
Description
技术领域
本发明涉及医疗设备领域，具体地说是一种念珠菌检测设备及检测方法。
背景技术
近年来由于广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用，导管、插管、化疗及介入治疗、器官移植等新诊疗技术的广泛开展，加上肿瘤、移植、糖尿病、艾滋病等高危人群的逐年增多，念珠菌病的发病率呈明显上升趋势，已成为目前最常见的深部真菌病，其中念珠菌血症是最常见的血流感染之一，病死率可达40％，显著高于细菌引起的血流感染，且治疗疗程长，医疗费用巨大。
念珠菌血症早期诊断、早期治疗预后较好，但临床初期症状不明显，早期诊断困难，延误诊断或播散性感染预后不良。研究表明，在12小时内开始针对性的抗真菌治疗可以将病死率从40％降低至11％，念珠菌血症发展成败血症后，每延迟一个小时治疗，病死率将提高7.6％。在缺乏依据的情况下，加用抗真菌药物会增加治疗成本和不良反应的风险，因而念珠菌的早期快速分型具有重要的临床意义，早期将念珠菌鉴定到种的水平对指导用药有很大的帮助。
念珠菌检测主要包括形态学方法、免疫学检测、血液培养和分子生物学检查等。其中血液培养是判断念珠菌血症的金标准，需要从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。传统手工血培养方法一般孵育7天，自动化血培养系统的标准血培养周期为5天。血培养是诊断菌血症和真菌血症的基本而重要的方法，血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义，但是血培养法仅有50％左右的阳性率，检测灵敏度低，且检测周期也长，不能满足临床的快速、准确检测之需求。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述现有技术存在的灵敏度低、检测时间长等问题，提供一种灵敏、快速的念珠菌检测设备及检测方法。
本发明的技术解决方案是，提供一种念珠菌检测设备，包括离心机、聚合酶链式反应仪、磁共振检测系统、念珠菌磁性纳米探针、探针盛放装置和传送装置，全血试样由所述传送装置送至离心机旋转离心处理，再由传送装置送至聚合酶链式反应仪进行聚合酶链式反应，全血试样经过旋转离心处理和聚合酶链式反应后与所述念珠菌磁性纳米探针混合，之后由传送装置将混合液体送至磁共振检测系统进行T2弛豫时间测量，根据所述T2弛豫时间检测念珠菌是否存在，并确定念珠菌的种类。
所述念珠菌磁性纳米探针包含具有缀合到磁性粒子表面的第一探针和第二探针，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段，第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体，显著增大分析物的T2弛豫时间；所述磁共振检测系统使用在念珠菌与念珠菌磁性纳米探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后对所述混合液体测量T2弛豫时间，以判断T2弛豫时间是否发生变化。
可选的，在聚合酶链式反应正向引物和反向引物存在下对待检测的核酸进行扩增，寡核苷酸探针分别与聚合酶链式反应产物的5’和3’端的嵌套序列互补，杂交到扩增子的5’端的捕获探针被3’胺化，杂交到扩增子的3’端的捕获探针被5’胺化，所述正向引物包含寡核苷酸序列5’—GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC—3’，所述反向引物包含寡核苷酸序列5’—GCT TAT TGA TAT GCT TAA CAG CGG GT—3’。
可选的，所述念珠菌属物种是白色念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAAAC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA。
可选的，所述念珠菌属物种是热带念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AAA GTT ATG AAA TAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列ACC CGG GGG TTT GAG GGA GAAA。
可选的，所述念珠菌属物种是近平滑念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT。
可选的，所述全血试样上贴有二维码，所述念珠菌检测设备还包括二维码扫描模块，所述二维码扫描模块对所述全血试样进行二维码扫描，将该全血试样与二维码进行特定化设置和绑定。
可选的，所述磁共振检测系统为小型自屏蔽永磁磁共振系统，不需要额外的磁场屏蔽。
可选的，所述念珠菌检测设备还包括5G通信模块，念珠菌检测设备通过5G通信模块与实验室信息系统连接，检测结果通过5G通信模块实时传输至实验室信息系统。
本发明还提供了一种念珠菌检测方法，包括以下步骤：
1)扫描全血试样上标注的二维码；
2)在全血试样中添加一定量的低渗裂解液，并进行旋转离心，再除去上清液；
3)添加TE缓冲液和酸洗玻璃珠，在一定转速下涡旋一段时间以实现裂解；
4)取一定量裂解物加入聚合酶链式反应混合液，进行聚合酶链式反应；
5)取经过聚合酶链式反应的扩增试样，添加一定量的磁性纳米粒子混合液，孵育一段时间；
6)用磁共振检测系统测量步骤5)处理后的试样的T2弛豫时间；
念珠菌磁性纳米粒子平均直径为800nm，每个粒子的T2弛豫率为1010mM-1s-1，所述磁共振检测系统使用在念珠菌—纳米粒子探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后将分析物与纳米粒子混合，再次测量样本的T2弛豫时间以确定T2弛豫时间是否发生变化，基线测量确保正确的纳米粒子浓度和一致的化学计量；与白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌相对应的磁性纳米探针T2弛豫时间的基线值分别为40ms、45ms和37ms，在检测灵敏度为3CFU/ml时，白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌与相应磁性纳米探针混合样本的T2弛豫时间分别为485ms、610ms和565ms。
采用以上结构和方法，本发明与现有技术相比，具有以下优点：念珠菌可在全血中被直接检测，因而无需对分析物进行纯化，减少了在样品制备和纯化过程中变异的发生，与传统的血培养方法相比，检测时间大大缩短；与现有技术检测方法要求的100-1000CFU/mL相比较，本发明有更低的检测下限，可达到5CFU/mL；T2弛豫时间的测量可以实现念珠菌浓度的定量测量。
附图说明
图1为念珠菌检测设备示意图；
图2为念珠菌检测流程图。
图中所示，1、离心机，2、聚合酶链式反应仪，3、磁共振检测系统，4、传送装置，5、进样装置，6、屏幕，7、二维码扫描模块。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅仅限于这些实施例。
本发明涵盖任何在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明了具体的细节，而对本领域技术人员来说没有这些细节的描述也可以完全理解本发明。
如图1所示，示意了本发明的念珠菌检测设备的原理结构，包括离心机1、聚合酶链式反应仪2、磁共振检测系统3、念珠菌磁性纳米探针、探针盛放装置和传送装置4，全血试样由所述传送装置4送至离心机1旋转离心处理，再由传送装置4送至聚合酶链式反应仪2进行聚合酶链式反应，全血试样经过旋转离心处理和聚合酶链式反应后与所述念珠菌磁性纳米探针混合，之后由传送装置4将混合液体送至磁共振检测系统3进行T2弛豫时间测量，根据所述T2弛豫时间检测念珠菌是否存在，并确定念珠菌的种类。
在聚合酶链式反应正向引物和反向引物存在下对待检测的核酸进行扩增，寡核苷酸探针分别与聚合酶链式反应产物的5’和3’端的嵌套序列互补，杂交到扩增子的5’端的捕获探针被3’胺化，杂交到扩增子的3’端的捕获探针被5’胺化，所述正向引物包含寡核苷酸序列5’—GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC—3’，所述反向引物包含寡核苷酸序列5’—GCTTAT TGA TAT GCT TAA CAG CGG GT—3’。
所述念珠菌属物种是白色念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA。
所述念珠菌属物种是热带念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AAA GTT ATG AAA TAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列ACC CGG GGG TTT GAG GGA GAA A。
所述念珠菌属物种是近平滑念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT。
所述全血试样上贴有二维码，所述念珠菌检测设备还包括二维码扫描模块7，所述二维码扫描模块7对所述全血试样进行二维码扫描，将该全血试样与二维码进行特定化设置和绑定。在所述念珠菌检测设备外侧面上设有屏幕6，屏幕6与所述二维码扫描模块7位于同一面，便于在扫描时，同时关注屏幕显示。屏幕6用于显示各种数据。
所述磁共振检测系统3为小型自屏蔽永磁磁共振系统，不需要额外的磁场屏蔽。
所述念珠菌检测设备还包括5G通信模块，念珠菌检测设备通过5G通信模块与实验室信息系统连接，检测结果通过5G通信模块实时传输至实验室信息系统。
所述磁共振检测系统使用在念珠菌与念珠菌磁性纳米探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后对所述混合液体测量T2弛豫时间，以判断T2弛豫时间是否发生变化。
念珠菌检测的具体参数和步骤如下：
(1)扫描全血试样上的二维码。
(2)取800μL全血试样，向试管中添加1mL红细胞裂解液，在6000g下旋转离心5分钟，除去上清液。
(3)添加100μL TE缓冲液，添加120mg酸洗玻璃珠，在3000rpm下涡旋3分钟以裂解。
(4)取50μL裂解物加入聚合酶链式反应混合液，进行聚合酶链式反应。
(5)取10μL扩增试样，添加5μL磁性纳米粒子混合液，孵育30分钟。
(6)用磁共振检测系统测量试样的T2弛豫时间。
聚合酶链式反应混合液组成如下表所示：
聚合酶链式反应条件如下：
根据一个实施例，通用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物设计成与5.8S和26S rRNA序列互补，该序列扩增念珠菌基因组的ITS2区域。根据引物设计原则，利用Primer5.0设计引物。寡核苷酸探针分别与PCR产物的5’和3’端的嵌套序列互补，杂交到扩增子的5’端的捕获探针被3’胺化，杂交到扩增子的3’端的捕获探针被5’胺化。PCR引物和3种念珠菌的捕获探针示例如下表所示。
PCR引物和捕获探针
根据一个实施例，所述念珠菌检测设备可以与体检管理系统集成，所检测的数据和结果，既能在设备本地存储，又能实时上传到体检管理系统，设备所生成的检查报告既能在本地打印，又能在体检管理系统客户端与所有体检结果一起打印。
所述磁共振系统为小型自屏蔽永磁磁共振系统，不需要额外的磁场屏蔽。
根据一个实施例，念珠菌磁性纳米粒子平均直径为800nm，每个粒子的T2弛豫率为1010mM-1s-1，所述磁共振检测系统使用在念珠菌—纳米粒子探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后将分析物与纳米粒子混合，再次测量样本的T2弛豫时间以确定T2弛豫时间是否发生变化，基线测量确保正确的纳米粒子浓度和一致的化学计量。
根据一个实施例，与白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌相对应的磁性纳米探针T2弛豫时间的基线值分别为40ms、45ms和37ms，在检测灵敏度为3CFU/ml时，白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌与相应磁性纳米探针混合样本的T2弛豫时间分别为485ms、610ms和565ms。血样中不存在念珠菌时，T2弛豫时间处于较低水平，血样中存在念珠菌时，念珠菌与磁性纳米探针结合显著提高T2弛豫时间，根据T2弛豫时间的大小可以判断是否存在念珠菌和分辨念珠菌是哪一类。
所述念珠菌检测设备包括5G通信模块，念珠菌检测设备与实验室信息系统连接，检测结果通过5G通信实时传输至实验室信息系统。
虽然以上将实施例分开说明和阐述，但涉及部分共通之技术，在本领域普通技术人员看来，可以在实施例之间进行替换和整合，涉及其中一个实施例未明确记载的内容，则可参考有记载的另一个实施例。
以上仅就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化。总之，凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种念珠菌检测设备，其特征在于：包括离心机、聚合酶链式反应仪、磁共振检测系统、念珠菌磁性纳米探针、探针盛放装置和传送装置，全血试样由所述传送装置送至离心机旋转离心处理，再由传送装置送至聚合酶链式反应仪进行聚合酶链式反应，全血试样经过旋转离心处理和聚合酶链式反应后与所述念珠菌磁性纳米探针混合，之后由传送装置将混合液体送至磁共振检测系统进行T2弛豫时间测量，根据所述T2弛豫时间检测念珠菌是否存在，并确定念珠菌的种类。
2.如权利要求1所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述念珠菌磁性纳米探针包含具有缀合到磁性粒子表面的第一探针和第二探针，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段，第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体，显著增大分析物的T2弛豫时间；所述磁共振检测系统使用在念珠菌与念珠菌磁性纳米探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后对所述混合液体测量T2弛豫时间，以判断T2弛豫时间是否发生变化。
3.如权利要求2所述的念珠菌检测设备，其特征在于：在聚合酶链式反应正向引物和反向引物存在下对待检测的核酸进行扩增，寡核苷酸探针分别与聚合酶链式反应产物的5’和3’端的嵌套序列互补，杂交到扩增子的5’端的捕获探针被3’胺化，杂交到扩增子的3’端的捕获探针被5’胺化，所述正向引物包含寡核苷酸序列5’—GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC—3’，所述反向引物包含寡核苷酸序列5’—GCT TAT TGA TAT GCT TAA CAG CGG GT—3’。
4.如权利要求3所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述念珠菌属物种是白色念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列ACC CAG CGG TTT GAG GGAGAA AC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列AAA GTT TGA AGA TATACG TGG TGG ACG TTA。
5.如权利要求3所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述念珠菌属物种是热带念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AAA GTT ATG AAA TAA ATTGTG GTG GCC ACT AGC，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列ACC CGGGGG TTT GAG GGA GAAA。
6.如权利要求3所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述念珠菌属物种是近平滑念珠菌，所述念珠菌磁性纳米探针的第一探针包含寡核苷酸序列AGT CCT ACC TGA TTT GAGGTC GAA，所述念珠菌磁性纳米探针的第二探针包含寡核苷酸序列CCG AGG GTT TGA GGGAGA AAT。
7.如权利要求1所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述全血试样上贴有二维码，所述念珠菌检测设备还包括二维码扫描模块，所述二维码扫描模块对所述全血试样进行二维码扫描，将该全血试样与二维码进行特定化设置和绑定。
8.如权利要求7所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述磁共振检测系统为小型自屏蔽永磁磁共振系统，不需要额外的磁场屏蔽。
9.如权利要求7所述的念珠菌检测设备，其特征在于：所述念珠菌检测设备还包括5G通信模块，念珠菌检测设备通过5G通信模块与实验室信息系统连接，检测结果通过5G通信模块实时传输至实验室信息系统。
10.一种念珠菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)扫描全血试样上标注的二维码；
2)在全血试样中添加一定量的低渗裂解液，并进行旋转离心，再除去上清液；
3)添加TE缓冲液和酸洗玻璃珠，在一定转速下涡旋一段时间以实现裂解；
4)取一定量裂解物加入聚合酶链式反应混合液，进行聚合酶链式反应；
5)取经过聚合酶链式反应的扩增试样，添加一定量的磁性纳米粒子混合液，孵育一段时间；
6)用磁共振检测系统测量步骤5)处理后的试样的T2弛豫时间；
念珠菌磁性纳米粒子平均直径为800nm，每个粒子的T2弛豫率为1010mM-1s-1，所述磁共振检测系统使用在念珠菌—纳米粒子探针结合之前的纳米粒子溶液来测量T2弛豫时间的基线值，然后将分析物与纳米粒子混合，再次测量样本的T2弛豫时间以确定T2弛豫时间是否发生变化，基线测量确保正确的纳米粒子浓度和一致的化学计量；与白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌相对应的磁性纳米探针T2弛豫时间的基线值分别为40ms、45ms和37ms，在检测灵敏度为3CFU/ml时，白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌与相应磁性纳米探针混合样本的T2弛豫时间分别为485ms、610ms和565ms。
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