CN104059204B - 表面阳离子磁性聚合物微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面阳离子磁性聚合物微球，是先将磁性金属氧化物纳米粒子包埋入微米级交联型聚苯乙烯微球中，制得单分散的微米级磁性聚合物微球；再在引发剂、表面活性剂存在下，使氨基功能单体苄乙基三甲基氯化铵与苯乙烯在微米级磁性聚合物微球的表面共聚制得；通过调节苯乙烯与苄乙基三甲基氯化铵的比例，所得微球可以高效地结合50‑1000bp的小片段DNA，可作为血浆游离小片段DNA的提取试剂应用，并可进一步制备血浆游离小片段DNA提取试剂盒，通过优化试剂盒中其它试剂的组分，可以高效地从血浆中提取分离微量游离小片段DNA，提取得率高，重复性好，操作简便，成本低廉，可以用于自动化操作平台，有利于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于材料制备和DNA提取技术领域，涉及一种表面阳离子磁性聚合物微球及其制备方法，以及该微球在血浆游离小片段DNA提取方面的应用。
背景技术
血中游离DNA简称循环核酸(circulating nucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。这类DNA片段通常小于1000bp，且浓度很低(多在1-100ng/ml范围内)，主要存在于血清及血浆中。例如癌症患者血液中带有病变基因突变位点的游离DNA片段以及母血中的少量来源于胎儿的游离DNA片段。这类DNA片段在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。其具体医学应用大致包括以下方面：1)用于产前诊断；2)用于免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察；3)用于肿瘤相关分析。在上述三类应用中，其在肿瘤分析中的价值尤为重要。
但是，由于血中游离DNA片段小，浓度低，在提取过程中容易丢失，因此，其提取方法需要有高的提取效率和稳定的得率才能满足临床检测需求。传统的DNA提取方法如酚-氯仿DNA抽提法成本低，但操作繁琐，耗时，所使用的有机溶剂对人体伤害大，提取效率低，重复性差，不适于血浆微量游离DNA的提取。有文献采用硅柱吸附法，利用DNA分子在一定盐浓度下能与硅柱可逆吸附来提取血浆游离DNA，该方法能有效去除样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但其对小片段DNA的提取效率较低，且成本较高，需要高速离心，不适合临床常规使用。也有文献采用表面修饰的二氧化硅磁珠来提取血浆游离DNA，该方法操作简便快速，获得的DNA纯度高，产量大，对血浆游离DNA的提取效率优于前两种方法，但在提取效率和稳定性方面还有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表面阳离子磁性聚合物微球及其制备方法，以及该微球在微量小片段DNA提取方面的应用。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：先将磁性金属氧化物纳米粒子包埋入微米级交联型聚苯乙烯微球中，制得单分散的微米级磁性聚合物微球；再在引发剂、表面活性剂存在下，使苄乙基三甲基氯化铵与苯乙烯在微米级磁性聚合物微球的表面共聚，形成表面阳离子磁性聚合物微球。
进一步，所述表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法包括以下步骤：
A.将磁性金属氧化物纳米粒子用水分散至浓度为10～50mg/ml，调节pH值至9～12，得磁性金属氧化物纳米粒子分散液，备用；将水和有机溶剂按比例混合，再在氮气保护条件下，加入一定量的新蒸苯乙烯、偶氮二异丁基脒盐酸盐和丙烯酸羟乙酯，搅拌升温至40～55℃，加入前述磁性金属氧化物纳米粒子分散液，保温反应1.5～3小时，调节pH值至4～5，再升温至50～72℃反应4小时；反应结束后，将反应液冷却至室温，离心，弃上清液，沉淀物加入乙醇，超声分散，离心，弃上清液，沉淀物50℃真空干燥，获得单分散的微米级磁性聚合物微球；所述水、有机溶剂、新蒸苯乙烯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、丙烯酸羟乙酯的重量比为2～3:5～6:10～20:1～2:1～5；所述新蒸苯乙烯与磁性金属氧化物纳米粒子的摩尔比为1:2～10；
B.在引发剂、表面活性剂存在下，将相当于引发剂和表面活性剂总重量5～25％的微米级磁性聚合物微球与苄乙基三甲基氯化铵按摩尔比为1:2～5均匀混合，在60～80℃预聚5～40分钟后，加入分散剂，在80～95℃之间采用阶段升温的方式聚合6～14小时，最后经洗涤、干燥，得到表面阳离子磁性聚合物微球。
进一步，步骤A中，所述磁性金属氧化物纳米粒子为Fe3O4、Fe2O3、CoFe2O4和MnFe2O4中的任一种或多种混合；所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙醇。
进一步，步骤B中，所述引发剂为无机过氧化物引发剂或有机偶氮类引发剂；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙烯醇中的任一种或多种混合；所述分散剂为十二烷基硫酸钠和/或十二烷基苯磺酸钠。
进一步，所述无机过氧化物引发剂为过硫酸钠、过硫酸钾和过硫酸铵中的任一种或多种混合；所述有机偶氮类引发剂为偶氮二异丁腈和/或偶氮二异戊腈。
2.采用所述制备方法制得的表面阳离子磁性聚合物微球。
3.所述表面阳离子磁性聚合物微球作为血浆游离小片段DNA提取试剂的应用，所述小片段DNA为50-1000bp的DNA。
4.包含所述表面阳离子磁性聚合物微球的血浆游离小片段DNA提取试剂盒。
进一步，所述血浆游离小片段DNA提取试剂盒还包含裂解液、漂洗液和洗脱液；所述裂解液的组分为3-6M异硫氰酸胍，0.2-2vol％Triton-100，5-20mM、pH8.5Tris-HCl，3-6M尿素，5-20vol％异丙醇和0.1-1mM EDTA；所述漂洗液包含漂洗液A和漂洗液B，所述漂洗液A的组分为4-8M盐酸胍，1-10mM EDTA，1-10mM、pH8.5Tris-HCl和20-60vol％无水乙醇，所述漂洗液B为85vol％乙醇；所述洗脱液为1-10mM、pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述裂解液的组分为3.45M异硫氰酸胍，1vol％Triton-100，10mM、pH8.5Tris-HCl，4.5M尿素，15vol％异丙醇和1mM EDTA；所述漂洗液A的组分为4M盐酸胍，1mM EDTA，10mM、pH8.5Tris-HCl和55vol％无水乙醇；所述洗脱液为10mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液。
5.利用所述试剂盒提取血浆游离小片段DNA的方法，包括以下步骤：
a.向血浆样品中加入裂解液，震荡，再加入表面阳离子磁性聚合物微球，混匀，室温静置使DNA吸附在表面阳离子磁性聚合物微球的表面，获得包含吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球的液态混合物；
b.在外加磁场作用下使步骤a所得液态混合物中吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球与液体分离，获得吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球；
c.将步骤b所得吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球依次用漂洗液A和漂洗液B洗涤；
d.向步骤c洗涤后的吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球中加入洗脱液，混匀，室温静置使DNA从表面阳离子磁性聚合物微球表面溶出，再在外加磁场作用下使表面阳离子磁性聚合物微球与液体分离，即获得血浆游离小片段DNA溶液。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种表面阳离子磁性聚合物微球，通过调节苯乙烯与苄乙基三甲基氯化铵的比例，使该微球可以高效地结合50-1000bp的小片段DNA，可作为血浆游离小片段DNA的提取试剂应用，并可进一步制备血浆游离小片段DNA提取试剂盒，通过优化试剂盒中其它试剂的组分，可以高效地从血浆中提取分离微量游离小片段DNA。与现有的血浆游离小片段DNA提取试剂相比，本发明的表面阳离子磁性聚合物微球设计巧妙，提取得率高，重复性好，操作简便，成本低廉，可以用于自动化操作平台，有利于大规模推广应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为表面阳离子磁性聚合物微球的制备示意图。
图2为ACTB基因荧光扩增图。
图3为EGFR基因荧光扩增图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
图1为表面阳离子磁性聚合物微球的制备示意图。如图所示，本发明先将磁性金属氧化物纳米粒子(如超顺磁性氧化铁纳米粒子等)包埋入微米级交联型聚苯乙烯微球(PS)中，形成单分散的磁性聚合物微球(Magnetic Polymer Microspheres，MPM)；再用氨基功能单体(如苄乙基三甲基氯化铵等)与苯乙烯(St)在MPM表面共聚形成富含氨基的高分子层，即制得表面阳离子磁性聚合物微球，其表面带正电荷，可通过静电作用结合带负电荷的核酸分子。在此基础上，通过调节氨基功能单体与苯乙烯的比例，可以获得偏向性吸附小片段DNA的表面阳离子磁性聚合物微球，提高小片段DNA的提取效率。
实施例1、表面阳离子磁性聚合物微球的制备
将超顺磁性氧化铁纳米粒子用水分散至浓度为30mg/ml，调节pH值至10，得超顺磁性氧化铁纳米粒子分散液，备用；在100ml三口烧瓶中，加入去离子水10ml和甲醇30ml，混合，再在氮气保护条件下，加入新蒸苯乙烯5ml、偶氮二异丁基脒盐酸盐(v-50)0.25g和丙烯酸羟乙酯0.5ml，搅拌升温至50℃，加入前述超顺磁性氧化铁纳米粒子分散液(苯乙烯与超顺磁性氧化铁纳米粒子的摩尔比为5)，保温反应2小时，调节pH值至4.5，再升温至65℃反应4小时；反应结束后，将反应液自然冷却至室温，离心，弃上清液，沉淀物加入乙醇，超声分散，离心，弃上清液，沉淀物50℃真空干燥，获得单分散的微米级磁性聚合物微球；
在引发剂(过硫酸钠)、表面活性剂(十二烷基硫酸钠)存在下，将相当于引发剂和表面活性剂总重量15％的微米级磁性聚合物微球与苄乙基三甲基氯化铵按摩尔比为1:3均匀混合，在70℃预聚20分钟后，加入分散剂(十二烷基硫酸钠)，在80～95℃之间采用阶段升温的方式聚合10小时，最后经洗涤、干燥，得到表面阳离子磁性聚合物微球。
实施例2、表面阳离子磁性聚合物微球的制备
将磁性CoFe2O4纳米粒子用水分散至浓度为50mg/ml，调节pH值至12，得磁性CoFe2O4纳米粒子分散液，备用；在100ml三口烧瓶中，加入去离子水12ml和乙醇28ml，混合，再在氮气保护条件下，加入新蒸苯乙烯7ml、偶氮二异丁基脒盐酸盐(v-50)0.5g和丙烯酸羟乙酯1.0ml，搅拌升温至55℃，加入前述磁性CoFe2O4纳米粒子分散液，保温反应3小时，调节pH值至5，再升温至72℃反应4小时；反应结束后，将反应液自然冷却至室温，离心，弃上清液，沉淀物加入乙醇，超声分散，离心，弃上清液，沉淀物50℃真空干燥，获得单分散的微米级磁性聚合物微球；
在引发剂(偶氮二异丁腈)、表面活性剂(聚乙烯基吡咯烷酮)存在下，将相当于引发剂和表面活性剂总重量25％的微米级磁性聚合物微球与苄乙基三甲基氯化铵按摩尔比为1:5均匀混合，在80℃预聚5分钟后，加入分散剂(十二烷基苯磺酸钠)，在80～95℃之间采用阶段升温的方式聚合14小时，最后经洗涤、干燥，得到表面阳离子磁性聚合物微球。
实施例3、表面阳离子磁性聚合物微球的制备
将磁性MnFe2O4纳米粒子用水分散至浓度为10mg/ml，调节pH值至9，得磁性MnFe2O4纳米粒子分散液，备用；在100ml三口烧瓶中，加入去离子水15ml和丙醇25ml，混合，再在氮气保护条件下，加入新蒸苯乙烯10ml、偶氮二异丁基脒盐酸盐(v-50)1g和丙烯酸羟乙酯2.5ml，搅拌升温至40℃，加入前述磁性MnFe2O4纳米粒子分散液，保温反应1.5小时，调节pH值至4，再升温至50℃反应4小时；反应结束后，将反应液自然冷却至室温，离心，弃上清液，沉淀物加入乙醇，超声分散，离心，弃上清液，沉淀物50℃真空干燥，获得单分散的微米级磁性聚合物微球；
在引发剂(偶氮二异戊腈)、表面活性剂(聚乙烯醇)存在下，将相当于引发剂和表面活性剂总重量5％的微米级磁性聚合物微球与苄乙基三甲基氯化铵按摩尔比为1:2均匀混合，在60℃预聚40分钟后，加入分散剂(十二烷基苯磺酸钠)，在80～95℃之间采用阶段升温的方式聚合6小时，最后经洗涤、干燥，得到表面阳离子磁性聚合物微球。
实施例4、血浆游离小片段DNA提取试剂盒的制备
血浆游离小片段DNA提取试剂盒包含以下组成：
1)表面阳离子磁性聚合物微球
2)裂解液：其组分为3.45M异硫氰酸胍，1vol％Triton-100，10mM、pH＝8.5Tris-HCl，4.5M尿素，15vol％异丙醇和1mM EDTA。
3)漂洗液：包括漂洗液A和漂洗液B；其中漂洗液A的组分为4M盐酸胍，1mM EDTA、10mM、pH8.5Tris-HCl和55vol％无水乙醇；漂洗液B为85vol％乙醇。
4)洗脱液：10mM、pH8.5Tris-HCl缓冲液。
实施例5、血浆游离小片段DNA提取试剂盒对不同长度DNA片段的提取效率比较
取22支样品管，向每支样品管中各加入200uL血浆样本，再分别向不同样品管中加入不同片段大小的DNA标准品(如表1所示)；然后每支样品管加入600uL裂解液，斡旋震荡1分钟，再加入10uL实施例1制备的表面阳离子磁性聚合物微球，斡旋震荡混匀，室温静置2分钟，置磁力架上放置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液A，斡旋震荡混匀，室温静置1分钟，置磁力架上放置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液B，室温静置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液B，室温静置1分钟，弃上清，室温静置5分钟，加入50uL洗脱液，斡旋震荡混匀，室温静置5分钟，置磁力架上放置1分钟，收集上清，用Qubit2.0荧光定量仪(invitrogen公司)进行定量检测。
表1不同样品管中加入的DNA片段大小及用量
| 样品管编号 | DNA片段大小(bp) | 加入量(ng) |
| 1,2 | 50 | 500 |
| 3,4 | 100 | 500 |
| 5,6 | 150 | 500 |
| 7,8 | 200 | 500 |
| 9,10 | 300 | 500 |
| 11,12 | 400 | 500 |
| 13,14 | 500 | 500 |
| 15,16 | 750 | 500 |
| 17,18 | 1000 | 500 |
| 19,20 | 1500 | 500 |
| 21,22 | 2000 | 500 |
结果见表2，浓度低至5-8ng/uL的50-1000bp的DNA片段的平均回收率为52％～81％，而大于2000bp的DNA片段的平均回收率只有11.8％，说明本发明的表面阳离子磁性聚合物微球可偏向性地吸附50-1000bp的小片段DNA，适用于50-1000bp的血浆微量游离小片段DNA的提取。
表2不同长度DNA片段的回收率比较
实施例6、不同血浆游离小片段DNA提取试剂盒对血浆游离小片段DNA的提取得率比较
取4种血浆样品，分别编号1-4，将每种血浆样品平均分为4份，每份500uL，其中2份使用Blood DNA Mini Kit(Qiagen公司)提取血浆游离小片段DNA，按照试剂盒说明书操作；另2份使用本发明的血浆游离小片段DNA提取试剂盒提取血浆游离小片段DNA，具体步骤如下：向500uL血浆中加入600uL裂解液，斡旋震荡1分钟，再加入10uL实施例1制备的表面阳离子磁性聚合物微球，斡旋震荡混匀，室温静置2分钟，置磁力架上放置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液A，斡旋震荡混匀，室温静置1分钟，置磁力架上放置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液B，室温静置1分钟，弃上清，沉淀加入500uL漂洗液B，室温静置1分钟，弃上清，室温静置5分钟，加入50uL洗脱液，斡旋震荡混匀，室温静置5分钟，置磁力架上放置1分钟，收集上清。
上述采用不同试剂盒提取出的DNA均按照以下方法扩增人ACTB基因或EGFR基因：
扩增人ACTB基因的引物：ACTB-Forward：5’-GAGAAGATGACCCAGGTGAGTG-3’(SEQ IDNo.1)；ACTB-Reverse：5’-TCCTACGGAAAACGGCAGA-3’(SEQ ID No.2)；
扩增人EGFR基因的引物：EGFR21-Forword：5’-ACTTGGAGGACCGTCGCTT-3’(SEQ IDNo.3)；EGFR21-Reverse：5’-TGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC-3’(SEQ ID No.4)。
荧光定量PCR体系(20uL)：10×缓冲液(不含Mg2+)2uL，25mM MgCl22uL，l0mMdNTP0.5uL，10μΜ上游引物0.5uL，10μΜ下游引物0.5uL，Evagreen1uL，Taq酶0.2uL，DNA2uL，ddH2O补足到20uL。
荧光定量PCR程序：第一阶段预变性阶段：95℃5min；第二阶段PCR扩增阶段(50个循环)：95℃10s，60℃15s，72℃25s(收集荧光)；第三阶段熔解过程：95℃1min，40℃1min，65℃1s，95℃(检测荧光25次)；第四阶段冷却过程：40℃10s。
图2为ACTB基因荧光扩增图。图3为EGFR基因荧光扩增图。表3为采用不同试剂盒从不同血浆样品提取出的DNA中扩增ACTB基因的结果。表4为采用不同试剂盒从不同血浆样品提取出的DNA中扩增EGFR基因的结果。从表中数据可以看出，本发明试剂盒提取外周血中游离小片段DNA的的得率高于Qiagen公司的Blood DNA Mini Kit。
表3从不同血浆样品提取出的DNA中扩增ACTB基因的结果
| 血浆样品编号 | 试剂盒 | CT值 | 血浆样品编号 | 试剂盒 | CT值 |
| 1 | Qiagen | 32.68 | 1 | 本发明 | 28.68 |
| 1 | Qiagen | 33.07 | 1 | 本发明 | 28.64 |
| 2 | Qiagen | 31.18 | 2 | 本发明 | 29.14 |
| 2 | Qiagen | 31.10 | 2 | 本发明 | 28.10 |
| 3 | Qiagen | 31.02 | 3 | 本发明 | 29.63 |
| 3 | Qiagen | 31.02 | 3 | 本发明 | 29.10 |
| 4 | Qiagen | 31.98 | 4 | 本发明 | 30.57 |
| 4 | Qiagen | 32.23 | 4 | 本发明 | 28.22 |
表4从不同血浆样品提取出的DNA中扩增EGFR基因的结果
| 血浆样品编号 | 试剂盒 | CT值 | 血浆样品编号 | 试剂盒 | CT值 |
| 1 | Qiagen | 34.27 | 1 | 本发明 | 30.25 |
| 1 | Qiagen | 34.81 | 1 | 本发明 | 29.93 |
| 2 | Qiagen | 31.79 | 2 | 本发明 | 30.16 |
| 2 | Qiagen | 31.75 | 2 | 本发明 | 27.81 |
| 3 | Qiagen | 31.78 | 3 | 本发明 | 29.89 |
| 3 | Qiagen | 31.79 | 3 | 本发明 | 30.12 |
| 4 | Qiagen | 36.36 | 4 | 本发明 | 31.45 |
| 4 | Qiagen | 33.22 | 4 | 本发明 | 28.10 |
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A. 将磁性金属氧化物纳米粒子用水分散至浓度为10~50 mg/ml，调节pH值至9~12，得磁性金属氧化物纳米粒子分散液，备用；将水和有机溶剂按比例混合，再在氮气保护条件下，加入一定量的新蒸苯乙烯、偶氮二异丁基脒盐酸盐和丙烯酸羟乙酯，搅拌升温至40~55℃，加入前述磁性金属氧化物纳米粒子分散液，保温反应1.5~3小时，调节pH值至4~5，再升温至50~72℃反应4小时；反应结束后，将反应液冷却至室温，离心，弃上清液，沉淀物加入乙醇，超声分散，离心，弃上清液，沉淀物50℃真空干燥，获得单分散的微米级磁性聚合物微球；所述与有机溶剂按比例混合的水、有机溶剂、新蒸苯乙烯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、丙烯酸羟乙酯的重量体积比例为10mL：30 mL：5 mL：0.25g：0.5 mL、12 mL：28 mL：7 mL：0.5g：1.0 mL或15 mL：25 mL：10 mL：1g：2.5 mL；所述新蒸苯乙烯与磁性金属氧化物纳米粒子的摩尔比为5: 1；
B. 在引发剂、表面活性剂存在下，将相当于引发剂和表面活性剂总重量5~25%的微米级磁性聚合物微球与苄乙基三甲基氯化铵按摩尔比为1:2~5均匀混合，在60~80℃预聚5~40分钟后，加入分散剂，在80~95℃之间采用阶段升温的方式聚合6~14小时，最后经洗涤、干燥，得到表面阳离子磁性聚合物微球。
2.如权利要求1所述的表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述磁性金属氧化物纳米粒子为Fe3O4、Fe2O3、CoFe2O4和MnFe2O4中的任一种或多种混合；所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙醇。
3.如权利要求1所述的表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述引发剂为无机过氧化物引发剂或有机偶氮类引发剂；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙烯醇中的任一种或多种混合；所述分散剂为十二烷基硫酸钠和/或十二烷基苯磺酸钠。
4.如权利要求3所述的表面阳离子磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述无机过氧化物引发剂为过硫酸钠、过硫酸钾和过硫酸铵中的任一种或多种混合；所述有机偶氮类引发剂为偶氮二异丁腈和/或偶氮二异戊腈。
5.采用权利要求1至4任一项所述制备方法制得的表面阳离子磁性聚合物微球。
6.权利要求5所述表面阳离子磁性聚合物微球作为血浆游离小片段DNA提取试剂的应用，所述小片段DNA为50-1000bp的DNA。
7.包含权利要求5所述表面阳离子磁性聚合物微球的血浆游离小片段DNA提取试剂盒。
8.如权利要求7所述的血浆游离小片段DNA提取试剂盒，其特征在于，还包含裂解液、漂洗液和洗脱液；所述裂解液的组分为3-6M 异硫氰酸胍，0.2-2vol% Triton-100，5-20mM、pH8.5 Tris-HCl，3-6M 尿素，5-20vol%异丙醇和0.1-1mM EDTA；所述漂洗液包含漂洗液A和漂洗液B，所述漂洗液A的组分为4-8M 盐酸胍，1-10mM EDTA，1-10mM、pH8.5 Tris-HCl和20-60vol%无水乙醇，所述漂洗液B为85vol%乙醇；所述洗脱液为1-10mM、pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液。
9.利用权利要求8所述试剂盒提取血浆游离小片段DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 向血浆样品中加入裂解液，震荡，再加入表面阳离子磁性聚合物微球，混匀，室温静置使DNA吸附在表面阳离子磁性聚合物微球的表面，获得包含吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球的液态混合物；
b. 在外加磁场作用下使步骤a所得液态混合物中吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球与液体分离，获得吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球；
c. 将步骤b所得吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球依次用漂洗液A和漂洗液B洗涤；
d. 向步骤c洗涤后的吸附有DNA的表面阳离子磁性聚合物微球中加入洗脱液，混匀，室温静置使DNA从表面阳离子磁性聚合物微球表面溶出，再在外加磁场作用下使表面阳离子磁性聚合物微球与液体分离，即获得血浆游离小片段DNA溶液。
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| CN201410175110.1A CN104059204B (zh) | 2014-04-28 | 2014-04-28 | 表面阳离子磁性聚合物微球及其制备方法和应用 |
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