CN110106170B - 一种全血dna提取用纳米生物磁珠的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于全血DNA提取的纳米生物磁珠的制备方法，属于生物工程领域；其制备过程包含以下步骤：步骤1：纳米四氧化三铁颗粒制备；步骤2：将磁性纳米Fe3O4颗粒沉积在聚苯乙烯微球上；步骤3：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭。所制备出的磁珠，其粒径均一，磁响应性能强，用于全血DNA提取可以得到高质量的DNA样本，尤其在去除样本中的无机盐杂质方面表现优异。

Description

一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及纳米生物磁珠，具体地，涉及一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法。
背景技术
随着DNA提取技术的不断完善和发展，磁珠法提取技术慢慢兴起，作为提取的核心材料生物纳米磁珠逐渐被人们所熟知。因为DNA提取是所有后续研究的第一步，所以DNA提取的效率和效果直接影响后续的研究。生物纳米磁珠是由磁性材料与高分子材料通过化学或物理方法复合 而成的一种具有众多优异性能的功能材料。
生物纳米磁珠作为近年发展起来的一种新型磁性材料，不但具有纳米效应，即表面 效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和体积效应，还具有磁学性质，如超顺磁性与高磁化率等特性。其应用已经从传统的技术领域发展到高新技术领域，从单纯的磁学范围扩展到与磁学相关的交叉学科领域。以核酸分离领域应用最为广泛。
生物纳米磁珠虽然在生物医药领域应用日益广泛，但仍然存在一定的问题：国外品牌的生物纳米磁珠在生物领域使用较为成熟，但其价格较高，以毫升计价，通常是国产的5~6倍，国产磁珠由于不能掌握制作磁珠的核心制备技术，制备的纳米磁珠颗粒尺寸有一定尺寸分布 ，并且生物相容性差，而且，还存在分散性差、改性过程中强磁性难以保持和功能化程度偏低等缺点。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
步骤一：纳米四氧化三铁颗粒制备
分别配制浓度均为0.05～5mol/L的Fe3+盐溶液和Fe2+盐溶液，按照Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.3～2.2混合，通入惰性气体除氧30min；加入表面活性剂，调整反应体系温度至60～70℃，得混合液；向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至PH值为10～11，保持70～80℃反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、体积百分比浓度为50%乙醇及去离子水洗涤沉淀物数次至中性；-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
步骤二：将超顺磁性Fe3O4纳米颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
取10～200g聚苯乙烯微球，分散在5L乙醇水溶液中，超声搅拌3～15h，保持温度不低于50℃；加入表面活性剂100～300ml，加入步骤一所得到的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒10～200g，降低温度至20℃以下并保持1～3h；磁分离出沉淀，向沉淀中加入稀盐酸，搅拌2～5h，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒；
步骤三：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将100-1000ml纯水加热到50-80℃，超声搅拌状态下加入10-50g聚乙烯醇和100-500ul表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，调节PH到3-5；添加步骤二所得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒100～1000g，添加分散剂，超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入戊二醛，保持温度继续搅拌3h，得到纳米生物磁珠；将所得纳米生物磁珠用体积百分比浓度为40%～80%的乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存。
作为对上述方案的进一步优化，所述惰性气体为氩气。
作为对上述方案的进一步优化，所述分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。
作为对上述方案的进一步优化，所述表面活性剂为曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油(以玉米胚芽油为好)、月桂醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯（3）醚（AEO-3）中的一种或几种的混合物。
作为对上述方案的进一步优化，所述聚苯乙烯微球的粒径为500nm-10um。
作为对上述方案的进一步优化，所述聚乙烯醇分子量大小为1600-3500、聚合度为80-99。
作为对上述方案的进一步优化，所述超声功率不低于1200W。
有益效果：
采用本发明所述制备方法制备纳米生物磁珠，其工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产；制得的核酸提取用纳米生物磁珠，其为多层核壳结构，粒径均一，磁响应性能强，分散性、悬浮性优异，并能与核酸特异性结合，用于全血DNA提取可以得到高质量的DNA样本，尤其在去除样本中的无机盐杂质方面表现优异，得到的DNA纯度OD260/OA230比值主要在2.0以上，从而可以满足测序需要。
附图说明
图1是通过实施例1得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的粒径测试图；
图2是通过实施例1得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的Zeta测试图；
图3是通过实施例2得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的粒径测试图；
图4是通过实施例2得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的Zeta测试图；
图5是通过实施例3得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的粒径测试图；
图6是通过实施例3得到的全血DNA提取用纳米生物磁珠的Zeta测试图。
具体实施方式
一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
步骤1：纳米四氧化三铁颗粒制备
分别配制浓度为0.05～5mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.3～2.2混合，通入惰性气体除氧30min，如氩气；加入表面活性剂，调整反应体系温度60～70℃；向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10～11，保持70～80℃反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为20～400nm，饱和磁化强度较高为62.4～79.4emu/g；
步骤2：将磁性纳米Fe3O4颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
取10～200g聚苯乙烯微球，粒径为500nm-10um，分散在5L乙醇水溶液中，超声搅拌3～15h，保持温度不低于50℃；
提高转速至1500r/min，加入表面活性剂100～300ml，加入步骤1中得到的纳米四氧化三铁颗粒10～200g，降低温度至20℃以下，并保持1～3h；
磁分离后，沉淀中加入0.1～0.3M稀盐酸，搅拌2～5h，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒；
步骤3：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将100-1000ml纯水加热到50-80℃，超声搅拌状态下加入10-50gPVA，100-500ul表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，200-1000r/min，调节PH到3-5。
向上述混合溶液中添加步骤2得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒100～1000g，添加1/3～1/6分散剂，1200W～2500W超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入1/5～1/10戊二醛，保持温度继续搅拌3h。
将上述得到的磁性颗粒用40%～80%乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存。
进一步地，上述分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。
上述表面活性剂为曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油(以玉米胚芽油为好)、月桂醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯（3）醚（AEO-3）中的一种或几种的混合物。
所述聚苯乙烯微球粒径为500nm-10um，优选500nm-2um
所述聚乙烯醇分子量大小为1600-3500，优选1700-2500；聚合度为80-99，优选90-95
所述超声功率不低于1200W，优选不低于1500W。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：纳米四氧化三铁颗粒制备
分别配制浓度为2mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为2:1混合，通入氩气除氧30min；加入曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油的混合物作为表面活性剂，调整反应体系温度至70℃，得混合液；向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10.5，保持70℃反应3h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-20℃冷冻干燥36h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中将所得超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100～200nm，饱和磁化强度较高为66emu/g；
步骤2：将超顺磁性Fe3O4纳米颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
取100g聚苯乙烯微球，粒径为500nm-800nm，分散在5L乙醇水溶液中，超声搅拌5h，保持温度70℃；
提高转速至1500r/min，加入曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油的混合物作为表面活性剂200ml，加入步骤1中得到的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒200g，降低温度至20℃，并保持3h；
磁分离后，沉淀中加入0.2M稀盐酸，搅拌3h，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，-20℃冷冻干燥48h，得到Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒；
步骤3：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将1000ml纯水加热到50℃，超声搅拌状态下加入30gPVA，500ul上述表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，800r/min，调节PH到4.5。
向上述混合溶液中添加步骤2得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒1000g，添加1/4柠檬酸三钠与十六烷基溴化铵的混合物作为分散剂， 2500W超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入1/10戊二醛，保持温度继续搅拌3h，得到纳米生物磁珠。
将上述得到的得到纳米生物磁珠颗粒用60%乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存。
得到的纳米生物磁珠颗粒粒径数据见图1，由图1可以看出，粒径分布较窄，粒度更均一；得到的纳米生物磁珠颗粒Zeta数据见图2，由图2可以看出，电导率都在50uS/cm以下，且Zeta电位绝对值大于50，使得磁珠悬浮性与分散性较好。
实施例2
一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：纳米四氧化三铁颗粒制备
同实施例1
步骤2：将磁性纳米Fe3O4颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
取150g聚苯乙烯微球，粒径为600nm-900nm，分散在5L乙醇水溶液中，超声搅拌5h，保持温度70℃；
提高转速至1500r/min，加入壬基酚聚氧乙烯醚、植物油(以玉米胚芽油为好)、月桂醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯（3）醚（AEO-3）的混合物作为表面活性剂150ml，加入步骤1中得到的纳米四氧化三铁颗粒200g，降低温度至20℃，并保持3h；
磁分离后，沉淀中加入0.2M稀盐酸，搅拌3h，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，-20℃冷冻干燥48h，得到Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒；
步骤3：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将1000ml纯水加热到70℃，超声搅拌状态下加入40gPVA，400ul上述表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，800r/min，调节PH到4.5。
向上述混合溶液中添加步骤2得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒1000g，添加1/4柠檬酸三钠与十六烷基溴化铵的混合物作为分散剂， 2500W超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入1/10戊二醛，保持温度继续搅拌3h，得到纳米生物磁珠。
将上述得到的得到纳米生物磁珠颗粒用60%乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存。
得到的纳米生物磁珠颗粒粒径数据见图3，由图3可以看出，粒径分布较窄，粒度更均一；得到的纳米生物磁珠颗粒Zeta数据见图4，由图4可以看出，电导率都在50uS/cm以下，且Zeta电位绝对值大于50，使得磁珠悬浮性与分散性较好。
实施例3
一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：纳米四氧化三铁颗粒制备
分别配制浓度为1mol/L的Fe3+和2mol/L的Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5混合，通入氮气30min；加入曲拉通、月桂醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯（3）醚（AEO-3）的混合物作为表面活性剂，调整反应体系温度70℃；向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10.5，保持70℃反应3h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-20℃冷冻干燥48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为20～150nm，饱和磁化强度较高为63emu/g；
步骤2：将磁性纳米Fe3O4颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
同实施例2
步骤3：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将500ml纯水加热到80℃，超声搅拌状态下加入30gPVA，200ul曲拉通、月桂醇硫酸钠的混合物作为表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，800r/min，调节PH到4.5。
向上述混合溶液中添加步骤2得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒1000g，添加1/5柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵的混合物作为分散剂，2500W超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入1/10戊二醛，保持温度继续搅拌3h，得到纳米生物磁珠。
将上述得到的得到纳米生物磁珠颗粒用70%乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存。
得到的纳米生物磁珠颗粒粒径数据见图5，由图5可以看出，粒径分布较窄，粒度更均一；得到的纳米生物磁珠颗粒Zeta数据见图6，由图6可以看出，电导率都在50uS/cm以下，且Zeta电位绝对值大于50，使得磁珠悬浮性与分散性较好。
采用本发明所述制备方法制备的纳米生物磁珠，粒径在600nm-3um，优选700nm-1300nm； zeta为-20- -70，优选-50 - -70；所述纳米生物磁珠半沉降时间超过30min，优选超过60min；所述纳米生物磁珠磁饱和强度为40-100emu/g，优选60-80emu/g；制备的所述磁珠用于全血DNA提取，得到的DNA纯度OD260/OA230不低于1.3，特别是多数不低于1.8，特别是对于90%以上的新鲜血样，比值能够不低于2.0。特别是对于存放1年以上的血样，该比值70%不低于2.0。
利用本发明实施例得到的全血提取用纳米生物磁珠用于全血DNA提取，具体步骤如下所示：
1) 在1.5 ml EP管中加入25 μl裂解液B。
2) 加入200 μl抗凝全血样品。
3) 加入300 μl 裂解液AQ，漩涡振荡混合均匀，70℃水浴30分钟。
4) 将EP管从温育设备中取出，加入上述示例磁珠 10 μl，加入结合液300 μl；室温下颠倒混5分钟。然后将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
5) 移去磁力架，加入800 μl洗涤液A，振荡混匀2分钟，磁分离。
6) 加入500 μl洗涤液S，振荡混匀2分钟，磁分离。
7) 重复第6步骤一遍。
8) 打开管盖，在室温下干燥5分钟。
9) 加入50-100 μl 洗脱液，轻弹EP管使磁珠全部浸润在液体中，70℃水浴5-10分钟，隔2-3分钟轻摇EP管混匀。
10) 将EP管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的EP管，即得到基因组DNA。
11) 微量核酸蛋白测定仪检测，检测结果如下表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，得到的DNA纯度OD260/OA230比值主要在2.0以上，从而可以满足测序需要，得到的核酸适用于进行标本库建设、测序、质谱等后续检测需要。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
步骤一：纳米四氧化三铁颗粒制备
分别配制浓度均为0.05～5mol/L的Fe3+盐溶液和Fe2+盐溶液，按照Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.3～2.2混合，通入惰性气体除氧30min；加入表面活性剂，调整反应体系温度至60～70℃，得混合液；向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至PH值为10～11，保持70～80℃反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、体积百分比浓度为50%乙醇及去离子水洗涤沉淀物数次至中性；-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
步骤二：将超顺磁性Fe3O4纳米颗粒沉积在聚苯乙烯微球上
取10～200g聚苯乙烯微球，分散在5L乙醇水溶液中，超声搅拌3～15h，保持温度不低于50℃；加入表面活性剂100～300ml，加入步骤一所得到的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒10～200g，降低温度至20℃以下并保持1～3h；磁分离出沉淀，向沉淀中加入稀盐酸，搅拌2～5h，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，-10～-20℃冷冻干燥24～48h，得到Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒；
步骤三：表面包被聚乙烯醇，并用戊二醛进行封闭
将100-1000ml纯水加热到50-80℃，超声搅拌状态下加入10-50g聚乙烯醇和100-500ul表面活性剂，升温到85℃，直至溶解，调节PH到3-5；添加步骤二所得到的Fe3O4@苯乙烯磁性纳米颗粒100～1000g，添加分散剂，超声搅拌，并逐渐降低温度至50℃，加入戊二醛，保持温度继续搅拌3h，得到纳米生物磁珠；将所得纳米生物磁珠用体积百分比浓度为40%～80%的乙醇洗涤，然后用超纯水洗涤至溶液呈中性，最后用超纯水分散保存；
步骤三中，所述聚乙烯醇分子量大小为1600-3500、聚合度为80-99；
步骤二和步骤三中，所述超声功率不低于1200W；
步骤一、步骤二和步骤三中，所述表面活性剂为曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油、月桂醇硫酸钠、AEO-3中的一种或几种的混合物。
2.如权利要求1所述的一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其特征在于：步骤一所述惰性气体为氩气。
3.如权利要求1所述的一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。
4.如权利要求1所述的一种全血DNA提取用纳米生物磁珠的制备方法，其特征在于：所述聚苯乙烯微球的粒径为500nm-10um。
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