JP2005083904A

JP2005083904A - 磁性粒子

Info

Publication number: JP2005083904A
Application number: JP2003316542A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Katayose; 聡片寄; Ichiro Ozaki; 一郎尾崎; Mitsuhiro Murata; 充弘村田
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2003-09-09
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2005-03-31

Abstract

【課題】核酸の非特異吸着が少なく、核酸抽出や遺伝子検査に用いられる磁性粒子として優れている粒子を得る。
【解決手段】磁性粒子であって少なくともその表面が核酸に対して低吸着性の材料で形成されていることを特徴とする磁性粒子。
【選択図】なし

Description

本発明は、生化学・医学分野での核酸抽出や遺伝子検査に用いられる磁性粒子に関する。

磁性粒子は、微生物やウイルス、細胞などの核酸抽出や遺伝子検査などにおいて核酸抽出試薬や診断薬（以下、遺伝子試薬という）のための捕捉あるいは反応固相として用いられている。このような遺伝子試薬においては、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ等のプローブが磁性粒子上に固定化され、サンプル中の微生物、ウイルス、細胞、核酸などの検査対象がプローブを介して磁性粒子上に捕捉される。続いて、必要に応じ核酸抽出などの操作が行われた後、得られた検査対象中の核酸（以下、検査対象核酸）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅検査などで検出したり、蛍光物質や酵素で標識された第二プローブによって検出したりする。近年、疾病の早期発見などの目的のため検査の高感度化が求められており、検査の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子を用いた遺伝子試薬においても感度向上のため、一個の検査対象を捕捉・検出するための技術開発が行われている。

これらの技術の発展により理論上は一個の検査対象の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因のひとつとして、磁性粒子表面への核酸の非特異的な吸着があげられる。例えば理論上一個の検査対象を捕捉・検出可能な技術であっても、得られた核酸が磁性粒子表面に非特異的に吸着してしまえば検出は不可能となる場合がある。このようなことから磁性粒子表面への核酸の非特異的な吸着の抑制が強く求められている。

従来、このような非特異吸着の抑制法として、キャリアと呼ばれるサケ精子などから抽出したＤＮＡを遺伝子試薬に添加する方法がとられてきた。しかし、キャリアの非特異吸着効果が十分得られない場合や、生体物質であるキャリアの品質安定性の問題、キャリアと検査対象核酸の交差反応といった問題点があり、非特異吸着の抑制法としては十分なものではなかった。

特開平11-174057公報

特開2000-304749公報特開2001-272406公報

本発明は、このような従来の問題点を解決するために、核酸に対して低吸着性表面をもつ磁性粒子により検査対象核酸の磁性粒子へ非特異吸着を抑制し、従来に比較して高感度の検査対象の捕捉・検査を可能とする磁性粒子の提供を目的とするものである。

すなわち本発明は、磁性粒子であって少なくともその表面が核酸に対して低吸着性の材料で形成されていることを特徴とする磁性粒子である。

本発明の磁性粒子において、少なくともその表面が核酸に対して低吸着性の材料を得るためには、磁性粒子の表面を非イオン性および／またはアニオン性の親水性のポリマーで被覆することにより達成される。磁性粒子表面への核酸の非特異吸着は、疎水結合とイオン結合がその重要な役割を果たしており、粒子表面の非イオン性および／またはアニオン性ポリマーによる親水化によって非特異吸着を大幅に低減できる。
本発明の免疫検査用磁性粒子において、基材となる磁性粒子には特に制限は無く、特公平０５−１０８０８や特開平７−８２３０１、特表平２−５０１７８５３などの方法で製造した粒子が利用可能であるが、好ましくは磁性粒子が核粒子の表面にＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成された母粒子に重合により該磁性体層上にポリマー層を形成する磁性粒子を用いることが出来る。磁性粒子の表面に非イオン性および／またはアニオン性の親水性ポリマーを導入する方法としては、磁性粒子の存在下で、非イオン性および／またはアニオン性の親水性モノマーおよびその他の共重合性モノマーを液体中で重合を行う方法をあげることができる。
すなわち、磁性粒子の存在下で、主原料としての非イオン性および／またはアニオン性の親水性モノマーおよび必要に応じて官能基を有する共重合性モノマーや他の共重合性モノマー、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加し、液体中で重合を行う。非イオン性および／またはアニオン性の親水性モノマーとしては、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリオキシアルキレン（Ｃ２−Ｃ４）基含有（メタ）アクリレート、エポキシ基含有（メタ）アクリレート、ホスホリルコリン類似基含有単量体；イソプレンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、α-メチルスチレンスルホン酸、スルホエチルアクリレート、スルホン化ジシクロペンタジエンなどのスルホン酸単量体をあげることができる。官能基を有する共重合性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物をあげることができる。他の共重合性モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどをあげることができる。

本発明の磁性粒子において、検査対象核酸の非特異吸着が完全に抑制されることが理想であるが、現実には核酸増幅検査の感度に比較して十分低いレベルの核酸吸着であればよく、通常、非特異吸着量が１０コピー／ｍｇ粒子以下であれば問題はない。

本発明の磁性粒子の実際の使用に当たって磁性粒子にプローブを結合させる方法としては、物理吸着法または化学結合法をあげることができるが、安定的な使用のためには通常一次プローブを磁性粒子表面の官能基と化学的に結合させる。この方法としては、例えば粒子表面のカルボキシル基とプローブのアミノ基を反応させる場合はカルボジイミド等の縮合剤を使用することができる。また、エポキシ基などの活性基を粒子表面に導入した場合は、プローブと粒子を混合するだけで、プローブの化学的な結合が達成できる。

本発明の磁性粒子は核酸の非特異吸着が少ないため、核酸抽出や遺伝子検査に用いられる磁性粒子として優れていることがわかる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナルオブポリマーサイエンスポリマーレターエディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍｅｒＬｅｔｔｅｒＥｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に下記核粒子を作製した。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。

核粒子；メチルメタクリレート／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
(平均粒子径１．５μｍＣＶ値２．２％)
２．核粒子への磁性体の被覆（磁性体層の形成）
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を５ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度100m/秒（16200rpm）で３分間処理した。
３．母粒子の表面のコーティング重合（コーティングポリマー層の形成）
磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。

磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてスチレン８ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン７ｇ、スチレンスルホン酸０．７ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。

磁性粒子（Spherotech社、粒径２〜２.９μm）３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてスチレン６ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン６ｇ、グリシジルメタクリレート６ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。次に、この粒子10gを100mLの10mM HClに分散し、50℃で8時間転倒混和して粒子表面のエポキシ基を開環させた。磁気精製にて、液性が中性になるまで粒子分散液を蒸留水に置換した。得られた粒子の粒径は２．６μm、粒子比重は１．３ｇ／ｃｍ^３であった。
比較例１
実施例１で2−ヒドロキシエチルメタクリレートを用いなかった以外は全て実施例１の方法に基づいて実施した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。
比較例２

磁性粒子（Spherotech社、粒径２〜２.９μm）を用いた。粒径は２．５μm、粒子比重は１．３ｇ／ｃｍ^３であった。
核酸吸着の評価
ＨＢＶが存在する血漿から、スマイテストＥＸＲ＆Ｄ（ゲノムサイエンス社）を用いて、ＨＢＶ−ＤＮＡの抽出を行った。得られたＨＢＶ−ＤＮＡを１０００コピー/ｍＬとなるよう純水に溶解しその１００μL（１００コピー）を実施例１〜３および比較例１〜２の磁性粒子1ｍｇに、加えて攪拌し、室温で１０分放置した。磁気分離法により磁性粒子を除去し、上清中のＨＢＶ−ＤＮＡ量を定量ＰＣＲ法により定量した。結果を図１に示す。

実施例および比較例で測定した核酸数を示すグラフ。

Claims

磁性粒子であって少なくともその表面が核酸に対して低吸着性の材料で形成されていることを特徴とする磁性粒子。
粒子表面にプローブと化学結合可能な官能基を有し、核酸の吸着量が１０コピー／ｍｇ粒子以下である請求項１に記載の磁性粒子。
磁性粒子が核粒子の表面にＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成され、該磁性体層上にさらにポリマー層を有するものである請求項１または２に記載の磁性粒子。