JP4273315B2

JP4273315B2 - 免疫測定用粒子および免疫測定法

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Publication number: JP4273315B2
Application number: JP2003295138A
Authority: JP
Inventors: 一郎尾崎; 幹雄日方; 可君范; 郁乃比嘉; 充弘村田
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2023-08-19
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Description

本発明は、生化学・医薬品分野での免疫測定用粒子および該粒子を用いた免疫測定法に関する。

免疫測定法、特に酵素免疫測定法においては、簡便にＢ／Ｆ分離を行う方法として、粒径の小さい磁性粒子を採用する方法が提案された。この方法としては、例えばマグネタイトを核としてシランを被覆した粒径が１．０〜１０．０μｍの粒子を用いる免疫測定法（特開昭５５−１４１６７０号及び同５０−１２２９９７号）及び磁性金属酸化物を核としてシランを被覆した粒径が０．１〜１．５μｍの粒子を用いる免疫測定法（特開昭６０−１５４６号）が知られている。また、有機物を核としてシランを被覆した粒径が０．２〜３μｍの粒子を用いる免疫測定法（特開平３−１１５８６２号）が知られている。

また、特開平７−９２１６８号には、核が有機高分子であり、表層に特定金属を特定の組成比率とする混晶フェライトの層を形成した平均粒径が０．０３〜１０μｍの混晶フェライト被覆粒子を免疫測定用粒子とすることが開示されているが、シグナル強度およびＳ／Ｎ比ともに充分ではなかった。

特開平７−９２１６８公報

本発明は、シグナル強度およびＳ／Ｎ比がともに充分と高い免疫測定用粒子を提供することを目的とするものである。

本発明の核粒子の表面にＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含む磁性体層を有し、さらに該磁性体層上にポリマー層を有する粒子の表面に抗原または抗体が結合されてなることを特徴とする免疫測定用粒子を提供するものである。

本発明で使用する核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、免疫測定用粒子の使用目的などによって適宜選択することができる。

有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。

上述した特定範囲の平均粒子径を有する核粒子としてのポリマー粒子は、例えば上記のビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることもできる。均一な粒子径を有する核粒子の作製法としては、特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナルオブポリマーサイエンスポリマーレターエディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍｅｒＬｅｔｔｅｒＥｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２号、同６１−２１５６０３号、同６１−２１５６０４号）によって容易に製造することができる。

本発明で使用する核粒子の平均粒子径は、０．４〜２００μｍ、好ましくは０．８〜１００μｍ、さらに好ましくは１．０〜５０μｍである。核粒子のＣＶ（ＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＶａｒｉａｔｉｏｎ）値は、２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。核粒子の平均粒子径が１μｍ未満では、たとえば粒子の高速撹拌による衝突エネルギーが不十分で磁性体微粒子の吸着が困難になる。一方、核粒子の平均粒子径が２００μｍを超えると、微粒子としての特性が失われてしまう。また、ＣＶ値が上記範囲をはずれると、得られる磁性体複合粒子の粒子径の均一性が不十分となる。

本発明において核粒子の材質は、複合化の際の加工性、軽量性の観点からポリマーなどの有機物質が好ましい。なお、本発明における平均粒子径および粒子径分布は、電子顕微鏡写真上にて１００個の粒子の粒子径を無作意に測定して求めたものである。

本発明で使用する磁性体層を構成する磁性体微粒子としては、酸化鉄系の物質が代表的であり、ＭｎＦｅ_２Ｏ_４（Ｍｎ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ_０．５Ｆｅ_０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ_３Ｏ_４で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ_２Ｏ_３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４のいずれか一方を含むことが必要である。

本発明で使用する磁性体微粒子の平均粒子径は、好ましくは核粒子の平均粒子径の１／５以下であり、より好ましくは１／１０以下であり、さらに好ましくは１／２０以下である。磁性体微粒子の平均粒子径が核粒子の平均粒子径の１／５を超えると核粒子表面に均一かつ十分な厚みを持った被覆層を形成することができにくい。

本発明での核粒子と磁性体微粒子との比（核粒子：磁性体微粒子）は、重量比で９５：５〜２０：８０が好ましい。磁性体微粒子がこの範囲の量より少ないと、複合化効果が少なくなる。磁性体微粒子がこの範囲の量より多いと、核粒子の対する量が過剰となり、複合化されない磁性体微粒子が多くなる。

本発明で使用する磁性体微粒子は、核粒子と後工程で使用する単量体モノマーとの親和性、相溶性との観点から表面が疎水化されたものが望ましい。磁性体微粒子の表面の疎水化処理方法としては、磁性体微粒子と極めて親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する化合物を磁性体微粒子に接触させて結合させる方法を挙げることができる。このような親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する化合物としては、シランカップリング剤に代表されるシラン化合物を挙げることができる。
シラン化合物により磁性体微粒子を疎水化することによって、薬品耐性、特にアルカリ耐性に優れ、診断薬として使用中に磁性体微粒子が核粒子から剥離し磁気性能が低下する問題、あるいは脱離した磁性体微粒子が診断薬反応液中に浮遊する事により生じる汚染物混入を効果的に防止することができる。
本発明においては、疎水化された磁性体微粒子が、たとえばトルエンに良好に分散することができる場合に、十分に疎水化されているということができる。

シランカップリング剤に代表されるシラン化合物としては、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス（β−メトキシエトキシ）シラン、β−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、ドデシルトリクロロシラン、ヘキシルトリクロロシラン、メチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシランなどがある。

これらのシラン化合物を磁性体微粒子に結合させる方法としては、例えば、磁性体微粒子と、シラン化合物とを水などの無機媒質またはアルコール、エーテル、ケトン、エステルなどの有機媒質中で混合し、撹拌しながら加熱した後、磁性体微粒子をデカンテーションなどにより分離して減圧乾燥により無機媒質または有機媒質を除去する手段を挙げることができる。また、磁性体微粒子とシラン化合物とを直接混合し加熱させて両者を結合させてもよい。これらの手段において、加熱温度は通常３０〜１００℃であり、加熱温度は０．５〜２時間程度である。また、シラン化合物の使用量は、磁性体微粒子の表面積によって適宜定められているが、通常磁性体微粒子１００重量部に対して１〜５０重量部、好ましくは２〜３０重量部である。

本発明において核粒子の表面に磁性体微粒子の被覆する磁性体層を形成するには、先ず核粒子と磁性体微粒子とを混合し、核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させる。本発明で述べる物理的吸着法とは、化学反応を伴わない吸着法、結合法を指すものである。

核粒子の表面に磁性体微粒子を吸着させるには、物理的に強い力を外部から加えることにより複合化を実現させる方法も有効である。例えば乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザーなど高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。
効率よくかつ強固に複合化を実施するには物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ/秒以上、より好ましくは３０ｍ/秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ/秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が15m/秒より低いと、被覆層を形成する十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
本発明において、核粒子の表面に形成された磁性体層の厚さは０．００５〜２０μｍ、好ましくは０．０１〜５μｍであり、厚みは均一であることが好ましい。磁性体層の厚さが、０．００５μｍより小さい場合、磁性体含有量が小さくなり、充分な磁気分離性が得られず、２０μｍを超える場合は、磁性体層の強度が低下し、磁性体層がこわれるおそれがある。
また、核粒子の表面は完全に磁性体層で被覆されていることが好ましく、核粒子表面の少なくとも９０％以上は磁性体層で被覆されていることが必要である。

次に、上記のようにして製造された母粒子の表面に形成するポリマー層（以下、「第１コーティングポリマー層」ともいう）について述べる。

かかるポリマー層は、母粒子の存在下で、主原料としての共重合性モノマーと、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加され液体中で重合を行うことにより形成される。このようにポリマー層を重合によって形成することにより、当該ポリマー層の表面に所望の官能基を導入することができるなど、表面加工性にすぐれる。

ポリマー層の成分としては特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル、アクロレインなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。

また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノアクリレート、グリセロールモノメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、連鎖数２〜４０のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、スチレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびそのナトリウム塩、イソプレンスルホン酸およびそのナトリウム塩などの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。

重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面での重合でなく、磁性体被覆粒子を含まない疎水性重合重合モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。

油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物などを挙げることができる。

水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、2-2アゾビス（2-アミノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤もあげられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は0.01〜8重量％の範囲が好適に用いられる。

乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等、を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば反応性陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、ラテムルＳ−１８０Ａ（花王（株）製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成（株）製）、アクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業（株）製）などを挙げることができる。

また、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンＲＳ−２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ−２０（旭電化工業（株）製）などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。

ポリマー層の形成におけるモノマーの重合系への添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。

また、ポリマー層形成後、エチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルのアルカリ加水分解、ビニルエステルのアルカリけん化などの方法により官能基を改変することも可能である。

本発明において、ポリマー層の厚さは０．００５〜２０μｍ、好ましくは０．０１〜５μｍである。また、ポリマー層は磁性体層を完全に被覆していることが好ましい。

上記のようにポリマー層を形成した粒子は、そのまま免疫測定用粒子として用いることが可能であるが、さらに免疫測定用粒子として好適な粒子表面を形成するために、コーティングポリマー層に、再度ポリマー層を形成することも可能である（以下、再度形成されたポリマー層を「第２コーティングポリマー層という）。この場合、第１コーティングポリマー層は、磁性体層を被覆することを主目的とし、第２コーティングポリマー層は、免疫測定用粒子として好適な粒子表面を形成するための官能基導入を主目的とできるので、それぞれのポリマー層の形成を最適な条件で行うことが可能であり、免疫測定用粒子の製造法として好ましい。

第２コーティングポリマー層の形成方法は、第１コーティングポリマー層の形成方法と基本的には同様に行なうことができ、第１コーティングポリマー層が形成された粒子の存在下で、主原料としての共重合性モノマーと、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加され液体中で重合を行うことにより形成される。

第２コーティングポリマー層の成分としては特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。

油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物が挙げられる。

乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等、を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、ラテムルＳ−１８０Ａ（花王（株）製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成（株）製）、アクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業（株）製）などの反応性?イオン界面活性剤を挙げることができる。

第２コーティングポリマー層の形成におけるモノマーの重合系への添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。

また、第２コーティングポリマー層を形成した後、エチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルのアルカリ加水分解、ビニルエステルのアルカリけん化などの方法により官能基を改変することも可能である。

本発明において、第２コーティングポリマー層の厚さは、第１コーティングポリマー層に比較して薄くすることが可能であり、０．００５〜５μｍ、好ましくは０．００５〜１μｍである。

次いで、粒子表面に抗原または抗体を結合する。使用する抗体としては薬剤例えばテオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸；低分子ホルモンとして、例えばサイロキシン、エストロゲン、エストラジオール；癌マーカーとして、例えばＣＥＡ、ＡＦＰ；ウイルス抗原として、例えばＨＩＶ、ＡＴＬＡ、ＨＢＶ；高分子ホルモンとして、例えばＴＳＨ、インスリン；サイトカインとして、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６；各種グロスファクター、例えばＥＧＦ、ＰＤＧＦ；更に前記ウイルスの適当なＤＮＡ、ＲＮＡなどに対する抗体である。また、使用する抗原としては、ウイルス、例えばＨＩＶ、ＡＴＬＡ、ＨＢＶ；前記のウイルスのＤＮＡ；高分子ホルモン、例えばインスリン、ＴＳＨなどである。
抗原又は抗体を粒子に結合する方法としては、物理吸着法又は化学結合法を採用することができる。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記粒子と抗原あるいは抗体とを反応させることにより行うものである。この反応に使用する緩衝溶液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液などである。反応は、両者を室温にて混合することにより容易に進行し、目的物を得ることができる。又、化学結合法は、ペプチド結合法におけるカルボジイミド法を採用することができる。

本発明における免疫測定法としては、放射免疫測定法、酵素免疫測定法を採用することができる。これらの測定法は、標識を用いる免疫測定法であって、サンドイッチ法あるいは競合法により、目的とする抗原あるいは抗体を測定することができる。

本発明における酵素免疫測定法は、例えば免疫測定用粒子と酵素標識抗体と検体とを、１分〜３時間反応させ行うものである。実施の際の反応温度は４℃〜４０℃であり、好ましくは２５℃〜３８℃である。未反応酵素標識抗体を洗浄後、固相に結合した抗体結合酵素の量を酵素基質を加え活性を測定することにより検体のリガンドの量を定量することができる。

本方法において用いることのできる酵素は、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどである。

この際基質は、用いる酵素に適したものを用いることはいうまでもなく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ₂ Ｏ₂ （パーオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート、３−（２'−ピロ−トリシクロ［３．３．１．１^3,7 ］デカン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−ｏ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−ｏ−ガラクトース、３−（２'−スピロアダマンタン）−４−（３−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）（β−ガラクトシダーゼ用）などを使用することができる。

又、免疫測定法の放射免疫測定法は上記酵素標識のかわりに ¹²⁵Ｉなどの放射同位元素を標識し、行うものである。放射能を測定する以外は、操作は前記酵素免疫測定法の場合と全く同じである。

又、本発明の測定法は、イソルミノールやアクリジンエステルなどをラベルした化学発光測定法、フルオッセンやロードダミンをラベルした蛍光免疫測定法で行うこともできる。この際、ラベル体の標識は活性化エステル法やイソシアネート法を採用することにより容易に行うことができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナルオブポリマーサイエンスポリマーレターエディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍｅｒＬｅｔｔｅｒＥｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に以下の粒子を作製した。核粒子１〜５は平均粒子径、ＣＶ値とも本願発明の範囲内のものであり、核粒子６はＣＶ値が本願発明の範囲より大きく、かつ不均一な粒子である。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。

核粒子１；メチルメタクリレート／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
(平均粒子径１．５μｍＣＶ値２．２％)
核粒子２；スチレン／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
(平均粒子径３.０μｍＣＶ値２．３％)
２．核粒子への磁性体の被覆（磁性体層の形成）
被覆方法１；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を４ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度100m/秒（16200rpm）で３分間処理した。

被覆方法２；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。この界面活性剤を除去すべく、大量の２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液で磁性体を洗浄し、ついで蒸留水で余剰のＮａＯＨを取り除いて乾燥させた。次に、この乾燥磁性体１０ｇにイソブチルトリメトキシシラン１００ｇを添加し、５０℃において８時間混合させて表面の疎水化処理を行い、磁性体を得た。この磁性体を回収し乾燥させた。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。

ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を４ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０が他（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ/秒（１６２００ｒｐｍ）で３分間処理した。

３．母粒子の表面のコーティング重合（コーティングポリマー層の形成）
実施例１（表面コーティング重合１）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ、メタクリル酸３．７５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。

実施例２（表面コーティング重合２）；
表面コーティング重合１のシクロヘキシルメタクリレートをスチレンとした以外は全て表面コーティング重合１の方法に基づいて実施した。

比較例１（重合により磁性体層およびコーティングポリマー層を同時に形成する方法）；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、得られた超常磁性体粉体４．８ｇを０．５％ラウリル硫酸ナトリウム４２０ｇに分散させ、さらにスチレン４．２ｇを添加しイカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下５５℃で１時間撹拌した。この混合物に過硫酸カリウム８ｇと０．５％ラウリル硫酸ナトリウム５６０ｇに分散させた核粒子１３０ｇを添加した。さらに６時間後にスチレン４．２ｇと過硫酸カリウム７ｇを添加しさらに１５時間撹拌した。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。得られた粒子５ｇ（固形分）を０．５％ラウリル硫酸ナトリウム１５０ｇに分散させ、スチレン２ｇ、メタクリル酸１ｇ過硫酸カリウム１ｇを添加しイカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下５５℃で４時間撹拌した。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
比較例２重合により磁性体層およびコーティングポリマー層を同時に形成する方法）；
比較例１で核粒子として核粒子２を使用した以外は、比較例１の方法に基づき実施した。

実施例１〜２よび比較例１〜２；
上記の核粒子の作製方法、核粒子への磁性体の被覆方法、磁性体被覆粒子の表面コーティング重合方法を表１（実施例）および表２（比較例）に示すとおり組み合わせて診断薬用粒子を製造した。得られた粒子につき以下の評価を行った。

評価１；磁気捕捉率の評価
得られた診断薬用粒子を分散媒である水に分散させ、1重量％の試験液が得られるよう調整した。この試験液の１ｍｌをエッペンドルフチューブに入れ、撹拌後に横方向から４０００ガウスの磁気を１分間かけた場合の磁気捕捉率を測定した。結果を表1に示す。

評価２；免疫診断用粒子としての評価
実施例１〜２および比較例で得られた診断薬用粒子の１００ｍｇを１０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）５ｍLに分散させ、これに水溶性カルボジイミド５ｍｇを加えた。室温で30分間反応させた後、上清を除去し、抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液（１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を１０ｍL加え、室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。2時間後、この粒子を０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）で4回洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）で粒子濃度が０．５重量％となるように再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合磁性粒子（免疫測定用粒子）とした。

この免疫測定用粒子１０μLに０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含むサンプル５０μLを加えて攪拌し、室温で10分放置した。磁気分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。

次に、アルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μL加えて攪拌し、室温で１０分放置した。これを前述の磁気分離法により洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定した。各種抗原濃度でのシグナル強度を図1に、抗原濃度１０００ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬとのシグナル強度比（Ｓ／Ｎ比）を図２に示す。

結果１；磁気捕捉率の評価結果
実施例の診断薬用粒子は、いずれも磁気捕捉率が９９重量％以上であった。これは粒径分布が狭く磁気応答性が均一であることが理由として挙げられる。

一方、比較例の診断薬用粒子は、いずれも磁気捕捉率９９重量％以上が得られなかった。比較例１，２においては診断薬用粒子の粒径分布が広く磁気応答性が不均一であることが理由としてあげられる。

結果２；免疫診断用粒子としての評価結果
本発明の免疫測定用粒子は、図１および図２に示すとおり、比較例の粒子にくらべて高いシグナル強度と、約２倍のＳ／Ｎ比を示し高感度であることがわかる。

本発明の免疫測定用粒子と比較例の粒子のシグナル強度を示す図である。本発明の免疫測定用粒子と比較例の粒子のＳ／Ｎ比を示す図である。

Claims

核粒子の表面に磁性体層を有し、さらに該磁性体層上にポリマー層を有する粒子の表面に抗原または抗体が結合されてなり、
前記磁性体層は、Ｆｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方からなる磁性体微粒子を物理的に前記核粒子の表面に吸着させて複合化され、該磁性体微粒子はトルエンに分散するように疎水化されてなる、免疫測定用粒子。
請求項１において、前記磁性体層の厚さが０．００５〜２０μｍである免疫測定用粒子。
請求項１または２において、前記ポリマー層の厚さが０．００５〜２０μｍである免疫測定用粒子。
請求項１ないし３のいずれかに記載の免疫測定用粒子を用いることを特徴とする免疫測定法。