JP6935644B2 - 磁性体複合粒子およびその製造方法、並びに免疫測定用粒子 - Google Patents
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Description
近年では、臨床検査における迅速な測定や分析が要求される用途において、測定時間の短縮のため、抗体を担持した担体であって磁性が付加されたものを用い、標的物質を捕捉した後に外部から磁気を与えることで、前記磁性付加担体を迅速に回収し、標的物質を回収する方法が検討されている。
一方、本発明者らは特許文献2において、磁性を付加した固定担体として、無機酸化物またはポリマーを有するコア粒子の表面に外殻層を配し、当該外殻層にマグネタイト粒子とケイ酸ナトリウムとを共存させることで、体積平均粒径が10〜500nm、数平均粒径のCV値が8%以下、且つ、25℃における飽和磁化が15emu/g以上である磁性体内包粒子を開示した。
しかしながら本発明者らのさらなる研究によると、当該磁性体内包粒子は、磁気を用いた試料液からの分離回収の際に時間を要する場合がある。
そして、この構成を有した磁性体複合粒子であれば、外部からの磁場の印加により、粒子を効率よく分離回収することが出来る。また、電解質を含む試料溶液中であっても、分散安定性に優れるので、免疫測定の際にも効率よく標的物質を分離回収できるようになるので好ましい。
無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
前記外殻は、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とポリエチレングリコールを含有して成り、
動的光散乱法により測定される前記磁性体複合粒子の平均粒子径を、純水中(d0mM)、塩化ナトリウム水溶液5mM中(d5mM)、塩化ナトリウム水溶液10mM中(d10mM)で比較したとき、
(d5mM)/(d0mM)の値が3.5以下、且つ、(d10mM)/(d0mM)の値が3.5以下を示す磁性体複合粒子である。
第2の発明は、
前記外殻には、さらにシランカップリング剤が含有されている第1の発明に記載の磁性体複合粒子。
第3の発明は、
前記外殻に含有される磁性ナノ粒子が、マグネタイトまたはγ酸化鉄である第1または第2の発明に記載の磁性体複合粒子である。
第4の発明は、
球形または略球形の形状を有する第1から第3の発明のいずれかに記載の磁性体複合粒子である。
第5の発明は、
飽和磁化の値が、30Am2/kg以上200Am2/kg以下である第1から第4の発明のいずれかに記載の磁性体複合粒子である。
第6の発明は、
前記核粒子がポリマーである第1から第5の発明のいずれかに記載の磁性体複合粒子である。
第7の発明は、
第1から第6の発明のいずれかに記載の磁性体複合粒子の外殻に、抗体が存在している免疫測定用粒子である。
第8の発明は、
磁性ナノ粒子の懸濁液を作製する工程と、
無機酸化物またはポリマーを含み、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径の値が20nm以上200nm以下である核粒子を作製する工程と、
前記磁性ナノ粒子の懸濁液へ前記核粒子を添加し、磁性ナノ粒子吸着核粒子の懸濁液を得る工程と、
ケイ素化合物の水溶液を前記磁性ナノ粒子吸着核粒子の懸濁液へ添加し、前記核粒子の表面に前記磁性ナノ粒子と前記ケイ素化合物とを含む外殻が設けられた磁性体複合粒子の懸濁液を作製する工程と、
前記磁性体複合粒子の懸濁液を撹拌した後にポリエチレングリコールを添加して、前記外殻にポリエチレングリコールを含有させる工程を有する磁性体複合粒子の製造方法である。
第9の発明は、
前記ケイ素化合物がシリコンアルコキシドである第8の発明に記載の磁性体複合粒子の製造方法である。
第10の発明は、
前記ケイ素化合物の水溶液は、さらにシランカップリング剤を含む第8または第9の発明に記載の磁性体複合粒子の製造方法である。
無機酸化物またはポリマーを含有する核粒子の表面に磁性ナノ粒子と、ケイ素化合物と、高分子とを含有する外殻を設けた、コアシェル構造を有する磁性体複合粒子とすることで上述の課題を解決した。まず、図面を参照しながら本発明に係る磁性体複合粒子について説明する。
本発明に係る磁性体複合粒子1は、中心部に核粒子11があり当該核粒子11の表面に磁性ナノ粒子12が吸着している。さらに、核粒子11はケイ素化合物の層13で被覆されている。そして、当該ケイ素化合物の層13は磁性ナノ粒子12を含有して外殻14を構成している。
ここで、1.磁性ナノ粒子、2.核粒子、3.ケイ素化合物の層、4.磁性体複合粒子、5.磁性体複合粒子の合成、6.磁性体複合粒子の外殻の形成、の順で説明する。
磁性ナノ粒子12は、マグネタイト(Fe3O4)またはγ酸化鉄で形成されており、その平均粒子径は5nm以上50nm以下であることが好ましい。
そして磁性ナノ粒子12の飽和磁化の値は、0.1Am2/kg以上200Am2/kg以下、より好ましくは120Am2/kg以下、より一層好ましくは80Am2/kg以下であるのがよい。これは飽和磁化の値が0.1Am2/kg以上であれば磁性体複合粒子1へ十分な磁場応答性を与えることが出来、200Am2/kg以下であれば残留磁化による磁性体複合粒子1の凝集という事態を回避できるからである。
また、磁性体複合粒子1における磁性ナノ粒子12の担持量は、0.095質量%以上95質量%以下であることが好ましい。これは担持量が0.095質量%以上あれば、磁性体複合粒子1の磁場応答速度を担保することが出来、95質量%以下であれば磁性体複合粒子1の密度が過大にならず、試料液への分散性を担保出来ることによる。
核粒子11は、無機酸化物またはポリマーを含んで構成されている。当該核粒子の体積平均粒子径としては、20nm以上200nm以下であることが好ましい。ポリマーとしてはポリメチルメタクリレート(本発明において「PMMA」と記載する場合がある。)、ポリスチレン(本発明において「PSt」と記載する場合がある。)が例示できる。
無機酸化物としては、シリカ、タルク、カオリン石、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウムなどが例示できる。
ケイ素化合物の層13は、例えば、テトラエチルオルトシリケート(Si(OC2H5)4)(本発明において「TEOS」と記載する場合がある。)のようなシリコンアルコキシドから生成されたケイ素化合物であるケイ素酸化物の重合体にて構成されていることが好ましい。さらに、当該ケイ素化合物の層13は、例えば、3−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン(本発明において「MPTMS」と記載する場合がある。)といったシランカップリング剤も含み、2種類以上のケイ素化合物原料を用いて重合されていることがさらに好ましい。これは、分子内に重合性官能基を導入し、かつ、抗体の足場となる水酸基(−OH)を導入できるからである。
シランカップリング剤の量が0.001mol/m3以上あれば、シランカップリング剤としての効果が発揮され、1kmol/m3以下であれば、シランカップリング剤分子同士の自己縮合を回避できるからである。
磁性体複合粒子1は、球形または略球形の形状を有することが好ましいが、その体積平均粒子径は、例えば、磁性体複合粒子1の透過型電子顕微鏡像からノギス等で計測し、算出することができる。本発明において、透過型電子顕微鏡像から算出した体積平均粒子径を(dTEM)と記載する。
尚、「磁性体複合粒子1は、球形または略球形の形状を有する」とは、当該磁性体複合粒子の断面が円形または略円形であり、当該断面におけるアスペクト比が、例えば1.3以下であることをいう。
試料液中において、本発明に係る磁性体複合粒子1は、単独で分散している場合もあるが、2個以上の複数の粒子が凝集している場合もある。図2は、磁性体複合粒子1が、例えば3個凝集している状態の模式的な断面図である。
(dDLS)/(dTEM)の値が2以下であるとは、試料液中において一体のものとして存在する粒子径と本来の体積平均粒子径とがほぼ同じ、または極めて近似していることを示す。すなわち、磁性体複合粒子は、凝集せずに単分散に近い形態を担保したまま試料液中で存在していることになる。このことから、磁性体複合粒子1は試料液中において分散安定性に優れているということが出来る。
本発明に係る磁性体複合粒子の合成について、1)磁性ナノ粒子の合成、2)核粒子の合成、3)磁性ナノ粒子吸着核粒子の合成、4)磁性体複合粒子の合成、の順に説明する。
磁性ナノ粒子は、いわゆる共沈法と呼ばれる方法で合成した。この手法は、Fe2+とFe3+とを1:2の割合で含む混合溶液に、塩基性の溶液を添加するだけで、マグネタイトの磁性ナノ粒子が生成する合成法である。一方、γ酸化鉄(マグヘマイト)は、例えば、上述の方法にて得られたマグネタイトを大気中にて乾燥させた後、低温(350℃程度)にて加熱酸化することによって得られる。
さらに、生成した磁性ナノ粒子の表面に正電荷を与えて、分散安定化させるため、カップリング剤の添加による表面修飾を行うことも好ましい。
尚、磁性ナノ粒子を構成する物質の結晶構造は、例えば上述した液をプレパラート上に塗布し自然乾燥させた後に、X線回折を用いて分析することに拠り同定することが出来る。
体積平均粒子径50nm程度の核粒子の素材として、StモノマーとMMAモノマーとの混合物へ過硫酸カリウムや過硫酸アンモニウムを添加して重合させ、重合粒子を作製することが出来る。
また、体積平均粒子径100nm程度の核粒子の素材として、MMAモノマーを用いたソープフリー乳化重合法により、PMMAの重合粒子を作製することが出来る。
さらに生成した重合粒子の表面に、磁性ナノ粒子との親和性を高め、また、反応の基点となり得る官能基を導入することを目的として、重合開始後に重合性シランカップリング剤MPTMSを添加し共重合させ、体積平均粒子径50nm程度から100nm程度の核粒子が得られる。
磁性ナノ粒子吸着核粒子は、磁性ナノ粒子と核粒子とを振とう撹拌して混合することで得られる。
磁性体複合粒子の合成は、磁性ナノ粒子吸着核粒子の分散液から磁性ナノ粒子吸着核粒子を採取し、ケイ素化合物液と混合し、得られた懸濁液を振とう撹拌する。
本発明に係る磁性体複合粒子の外殻の形成について、1)前処理、2)含有させる高分子、3)高分子を含有させる効果、の順に説明する。
上記、「5.磁性体複合粒子の合成、4)磁性体複合粒子の合成欄」にて説明した、磁性体複合粒子を含む懸濁液へ特定種の高分子を添加することで実施できる。
このとき当該欄で説明した、磁性ナノ粒子吸着核粒子とケイ素化合物液との混合時から、高分子添加前に振とう撹拌時間、即ち熟成時間を十分にとることが好ましい。具体的な熟成時間は添加する高分子の種類にも拠るが、5時間以上が好ましく、さらに好ましくは12時間以上、最も好ましくは18時間以上である。さらには、生産性を考えて熟成時間の上限を考える。
これは、高分子添加前の熟成時間を十分にとることにより、添加する高分子が、外殻を構成しているケイ素化合物層の内部に吸収され過ぎてしまうことを抑制出来るからである。
含有させる高分子としては多様なものが考えられるが、本発明に係る磁性体複合粒子は、生体への適応を目的としていること、電解液中においても分散安定性に優れていることを求められる観点からポリエーテル類が好ましく、特に取扱いおよび入手が容易なことから、ポリエチレングリコール(本発明において「PEG」と記載する場合がある。)が好ましい。
本発明に係る磁性体複合粒子の外殻へ高分子を含有させることにより表面修飾は、当該磁性体複合粒子を電解質含有溶液中へ分散した際に、粒子間の凝集発生を抑制するという効果が発揮される 詳細は、実施例欄にて説明するが、本発明に係る粒子の外殻部分に高分子導入を施した磁性体複合粒子を濃度10モル/Lの電解質含有溶液に分散させた場合、凝集の程度は平均2.0〜3.2個であるのに対し、高分子導入を施していない磁性体複合粒子の場合、凝集の程度は平均4.7個となる。
さらに、外殻への高分子導入有無による磁性体複合粒子のゼータ電位については、外殻へ高分子を導入したものは水中でのゼータ電位と、電解液中でのゼータ電位とには差違が見られない。一方で、高分子を導入しないものの場合には、絶対値の数値が小さく変化し、凝集が進みやすい状態になっていることが確認できる。
実施例1においては、まず、体積平均粒子径192.5nmのポリマー粒子を核粒子とし、その表面に形成された外殻に磁性ナノ粒子としてFe3O4ナノ粒子、ケイ素化合物としてTEOSおよびMPTMSを含む磁性体複合粒子を合成し、さらにPEGをその外殻へ導入し、実施例1に係る磁性体複合粒子を得、その特性を評価した。
以下、実施例1に係る磁性体複合粒子について、1.磁性ナノ粒子の合成、2.核粒子の合成、3.磁性ナノ粒子吸着核粒子の合成、4.磁性体複合粒子の合成、5.PEGの磁性体複合粒子外殻への導入、6.磁性体複合粒子の特性評価、の順に説明する。
本発明の実施例1に係る磁性ナノ粒子の合成について、1)磁性ナノ粒子の原料、2)磁性ナノ粒子の合成、の順に説明する。
実施例1に係る磁性ナノ粒子であるFe3O4ナノ粒子のFe源の一つとしてFeCl2(高純度化学研究所製、純度99.9%)を準備した。また、もう一つのFe源としてFeCl3(和光純薬工業製)を準備した。
そして、当該磁性ナノ粒子の分散安定剤および正電荷付与の為のカップリング剤としてN−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N,−トリメチルアンモニウムクロリド(GELEST Inc.製、50%メタノール溶液)(本発明において「TSA」と記載する場合がある。)を準備した。
また、当該磁性ナノ粒子を合成する際のpH調整剤としてアンモニア水(和光純薬工業製、試薬特級25質量%水溶液)を準備した。
さらに、当該磁性ナノ粒子を合成する際の反応溶媒として電気抵抗値18.2MΩcmの脱イオン水を準備した。
反応容器として内径7.5cm、高さ15cmのセパラブルフラスコを用いた。攪拌機として翼径5cm、傾斜角45°の4枚ピッチパドルを用い、攪拌速度は300rpmとした。
反応容器へアンモニア水11.7cm3を投入し、反応開始とした。反応開始から30秒後にTSA2.1cm3を投入して3時間撹拌を継続した。
本発明の実施例1に係る核粒子の合成について、1)核粒子の原料、2)核粒子の合成、の順に説明する。
実施例1に係る核粒子を形成するモノマーとして、メチルメタアクリレート(MMA)(和光純薬工業製、試薬特級、純度98%)を準備した。
また、陰イオン活性剤としてオクタデシル硫酸ナトリウム(SOS)(Ward Hill社 MA、米国)を準備した。
その際、当該MMAに含有される重合禁止剤のヒドロキノンを除去するため、当該St、MMAを、重合禁止剤除去剤(Aldrich社製)を充填したガラス製カラムを通過させた。
反応には内容積110cm3の円筒形密閉式ガラス反応器を用い、撹拌はマグネチックスターラーを使用した。
まず反応器へ脱イオン水を投入し30分間窒素バブリングした後、窒素フローへ切り替えた。ここへ、MMAおよびNaSSを添加して20分間撹拌し、KPSを添加して重合を開始した。撹拌を継続しながら65℃、2時間の重合反応を行って核粒子を含む懸濁液を得た。このとき、重合開始40分後にMPTMSを添加した。
容積50cm3の遠沈管へ「2.核粒子の合成」で合成した核粒子および「1.磁性ナノ粒子の合成」で合成した実施例1に係る磁性ナノ粒子の懸濁液を加え、振とう撹拌を1分間行って磁性ナノ粒子吸着核粒子を合成した。
このとき、懸濁液の容量は20cm3とした。
得られた磁性ナノ粒子吸着核粒子の懸濁液を(同条件にて)遠心分離した。得られた磁性ナノ粒子吸着核粒子を採取し、さらに水を添加し、1.5時間の超音波分散を行って懸濁液を得た。ここへエタノール、25%アンモニア水0.41cm3、TEOS、MPTMSの順に添加して、室温24時間の振とう撹拌を行い、磁性ナノ粒子吸着核粒子へケイ素化合物層を設けた。
このとき、磁性ナノ粒子吸着核粒子は0.12容量%、TEOSは5mol/m3、MPTMSは5mol/m3、水は3〜9kmol/m3、アンモニアは0.3mol/m3とした。
「4.磁性体複合粒子の合成」で合成した、磁性ナノ粒子吸着核粒子にケイ素化合物層を設けた磁性体複合粒子の懸濁液を、TEOS、MPTMSの添加時から6時間、撹拌を継続して熟成させた。
この懸濁液へ1mモル/Lの濃度となるように表面修飾としてPEGを添加し、当該PEG添加時から6時間、撹拌を継続して熟成させ、磁性体複合粒子の外殻へのPEGの導入操作を行い、外殻に高分子が含有された磁性体複合粒子を含む懸濁液を得た。
得られた実施例1に係る外殻に高分子が含有された磁性体複合粒子の純水中における(dDLS)を、後述する動的光散乱光度計によって測定した。本発明において、純水中における(dDLS)を、「(d0mM)」とする。
実施例1に係る表面修飾を行った磁性体複合粒子の懸濁液における磁性体複合粒子の(d0mM)測定を動的光散乱光度計によって行った。
具体的には、実施例1に係る表面修飾を行った磁性体複合粒子の懸濁液を希釈して、磁性体複合粒子の濃度を0.001容量%に調整し(d0mM)測定用の懸濁液試料を得、ここへ超音波を100分間照射した試料を動的光散乱光度計(大塚電子製、ELSZ−2)へ装填し、(d0mM)を測定した。
また、前記沈殿物を、室温条件下において濃度10mmol/Lの塩化ナトリウム水溶液中へ再分散させた後、(dDLS)を動的光散乱光度計によって測定した(この値を「(d10mM)」とする)。
実施例1の操作のうち、ケイ素化合物を添加した後の熟成時間を18時間とした以外は同様にして、実施例2にかかる磁性体複合粒子の懸濁液を得て、それを同様に測定した。得られた結果を表1にあわせて示す。
実施例1の操作のうち、添加するPEGの濃度を3mmol/Lとした以外は同様にして、実施例3にかかる磁性体複合粒子の懸濁液を得て、それを同様に測定した。得られた結果を表1にあわせて示す。
実施例2の操作のうち、添加するPEGの濃度を3mmol/Lとした以外は同様にして、実施例4にかかる磁性体複合粒子の懸濁液を得て、それを同様に測定した。得られた結果を表1にあわせて示す。
実施例1の操作のうち、添加するPEGの濃度を5mmol/Lとした以外は同様にして、実施例5にかかる磁性体複合粒子の懸濁液を得て、それを同様に測定した。得られた結果を表1にあわせて示す。
実施例2の操作のうち、添加するPEGの濃度を5mmol/Lとした以外は同様にして、実施例6にかかる磁性体複合粒子の懸濁液を得て、それを同様に測定した。得られた結果を表1にあわせて示す。
実施例1の「5.PEGの外殻への導入」欄に記載の「磁性ナノ粒子吸着核粒子へケイ素化合物層を設けた磁性体複合粒子の懸濁液」において撹拌を継続せず、PEGも添加せずに、そのまま比較例1に係る磁性体複合粒子とした。
得られた比較例1に係る磁性体複合粒子に対し、実施例1と同様の特性評価を行った。
実施例1〜6および比較例1の(d0mM)の値より、外殻に高分子を含有させた実施例1〜6に係る磁性体複合粒子の(dDLS)は、外殻に高分子を含有していない比較例1に係る磁性体複合粒子の(dDLS)と同等か、またはより大きくなることが判明した。この傾向は、表面に含有させる時の処理濃度が3mモル/Lのときに顕著であった。
特に、比較例1に係る磁性体複合粒子では平均4.7個の磁性体複合粒子が凝集を起こしていることが判明した。
これに対し、実施例1〜6に係る磁性体複合粒子では平均2.0〜3.2個の磁性体複合粒子が凝集を起こしていることが判明し、外殻に高分子を含有させたことにより凝集が大きく抑制されていることが判明した。
11.核粒子
12.磁性ナノ粒子
13.ケイ素化合物の層
14.外殻
Claims (10)
- 無機酸化物またはポリマーを含む核粒子の表面に外殻が形成されている磁性体複合粒子であって、
前記外殻は、磁性ナノ粒子とケイ素化合物とポリエチレングリコールを含有して成り、
動的光散乱法により測定される前記磁性体複合粒子の平均粒子径を、純水中(d0mM)、塩化ナトリウム水溶液5mM中(d5mM)、塩化ナトリウム水溶液10mM中(d10mM)で比較したとき、
(d5mM)/(d0mM)の値が3.5以下、且つ、(d10mM)/(d0mM)の値が3.5以下を示す磁性体複合粒子。 - 前記外殻には、さらにシランカップリング剤が含有されている請求項1に記載の磁性体複合粒子。
- 前記外殻に含有される磁性ナノ粒子が、マグネタイトまたはγ酸化鉄である請求項1または2に記載の磁性体複合粒子。
- 球形または略球形の形状を有する請求項1から3のいずれかに記載の磁性体複合粒子。
- 飽和磁化の値が、30Am2/kg以上200Am2/kg以下である請求項1から4のいずれかに記載の磁性体複合粒子。
- 前記核粒子がポリマーである請求項1から5のいずれかに記載の磁性体複合粒子。
- 請求項1から6のいずれかに記載の磁性体複合粒子の外殻に、抗体が存在している免疫測定用粒子。
- 磁性ナノ粒子の懸濁液を作製する工程と、
無機酸化物またはポリマーを含み、透過型電子顕微鏡像から測定される体積平均粒子径の値が20nm以上200nm以下である核粒子を作製する工程と、
前記磁性ナノ粒子の懸濁液へ前記核粒子を添加し、磁性ナノ粒子吸着核粒子の懸濁液を得る工程と、
ケイ素化合物の水溶液を前記磁性ナノ粒子吸着核粒子の懸濁液へ添加し、前記核粒子の表面に前記磁性ナノ粒子と前記ケイ素化合物とを含む外殻が設けられた磁性体複合粒子の懸濁液を作製する工程と、
前記磁性体複合粒子の懸濁液を撹拌した後にポリエチレングリコールを添加して、前記外殻にポリエチレングリコールを含有させる工程を有する磁性体複合粒子の製造方法。 - 前記ケイ素化合物がシリコンアルコキシドである請求項8に記載の磁性体複合粒子の製造方法。
- 前記ケイ素化合物の水溶液は、さらにシランカップリング剤を含む請求項8または9に記載の磁性体複合粒子の製造方法。
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