WO2024075559A1 - 核酸抽出方法、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ｐｃｒ検査キット - Google Patents

核酸抽出方法、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ｐｃｒ検査キット Download PDF

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WO2024075559A1
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nucleic acid
antibody
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formula
copolymer
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PCT/JP2023/034639
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French (fr)
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充宏 荏原
アーメッドナビル アーメッドエルセイト トルバ
エルサイエド シハ ガマル
アブデル－ファタ アブデル－バキ ハッサン アイマン
Original Assignee
国立研究開発法人物質・材料研究機構
エジプシャン リバー リサーチ インスティテュート アンド ホスピタル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • This disclosure relates to a nucleic acid extraction method, a nucleic acid amplification method, a nucleic acid extraction kit, and a PCR testing kit.
  • Biological diagnostics, testing, and analytical procedures require the detection of nucleic acids contained in cells and/or virus particles contained in a biological sample (e.g., a swab, etc.).
  • a biological sample e.g., a swab, etc.
  • pretreatment involves the separation, concentration, and purification of nucleic acids from the target substance (such as a virus specimen) contained in the sample.
  • sample here refers to cells and/or virus particles, etc., contained in a biological sample that contain the nucleic acid to be extracted.
  • PCR tests carried out to isolate and identify SARS-CoV-2 infection
  • pretreatment for reverse transcription and amplification of viral RNA may involve treatment with protease and/or sample preparation using carrier nucleic acid and/or concentration of nucleic acid (e.g., Patent Document 1).
  • treatment with protease requires expensive reagents, complicated experimental procedures, and a certain amount of time. For this reason, treatment with protease, etc. can become a bottleneck in PCR testing. In addition, inventory management of the many different pretreatment reagents used in treatment with protease, etc. is cumbersome, and the reagents are expensive, which increases testing costs.
  • the objective of the present disclosure is to provide a nucleic acid extraction method that can easily extract nucleic acids contained in a sample even in the absence of protease, and even without concentration using a carrier nucleic acid.
  • it is to provide a nucleic acid extraction method that can purify and concentrate a sample for nucleic acid extraction in one step.
  • it is to provide a nucleic acid amplification method, a nucleic acid extraction kit, and a PCR test kit.
  • nucleic acid extraction method of the present disclosure is a nucleic acid extraction method comprising: preparing, in the absence of a protease, a mixed solution containing at least one specimen selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions, a copolymer including a repeating unit represented by the following formula 1 and a repeating unit represented by the following formula 2, an antibody that binds to the specimen, and an antibody-linker complex obtained by binding, via an amide bond, a linker represented by the following formula 3, to generate an antibody-copolymer conjugate; and heating the mixed solution to aggregate the antibody-copolymer conjugate, thereby extracting nucleic acid contained in the specimen.
  • X 1 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • X 2 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • L 2 represents a divalent group
  • R 1 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, -OR 5 , -NO 2 , -CN, -S(O) 2 R 5 , an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group having 6 to 24 carbon atoms; multiple R 1s may be the same or different, and two or more of them may be bonded to each other to form a ring;
  • R 5 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group
  • L3 represents a divalent hydrocarbon group which may have a heteroatom.
  • nucleic acid extraction kit of the present disclosure is a nucleic acid extraction kit used for extracting nucleic acid from at least one specimen selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions in the absence of a protease, the nucleic acid extraction kit comprising: a first agent containing a copolymer including a repeating unit represented by the following formula 1 and a repeating unit represented by the following formula 2; and a second agent containing an antibody-linker complex obtained by binding, via an amide bond, an antibody that binds to the specimen and a linker represented by the following formula (3):
  • X 1 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • X 2 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • L 2 represents a divalent group
  • R 1 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, -OR 5 , -NO 2 , -CN, -S(O) 2 R 5 , an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group having 6 to 24 carbon atoms; multiple R 1s may be the same or different, and two or more of them may be bonded to each other to form a ring;
  • R 5 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group
  • L3 represents a divalent hydrocarbon group which may have a heteroatom.
  • the present disclosure provides a nucleic acid extraction method that can easily extract nucleic acids contained in a sample even in the absence of protease, and even without concentration using a carrier nucleic acid.
  • the present disclosure provides a nucleic acid extraction method that can purify and concentrate a sample for nucleic acid extraction in one step.
  • the present disclosure also provides a nucleic acid amplification method, a nucleic acid extraction kit, and a PCR test kit.
  • FIG. 1 is a flow chart showing the procedure of the nucleic acid extraction method of the present invention.
  • 1 shows the results of quantification by real-time PCR using nucleic acids extracted by the method of Comparative Example 1 and the method of Reference Example 1.
  • 1 shows the results of quantification by real-time PCR using nucleic acids extracted by the method of Comparative Example 1 and the method of Example 1.
  • the first embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is a nucleic acid extraction method comprising: preparing a mixture containing at least one specimen selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions in the absence of a protease; a copolymer containing a repeating unit represented by formula 1 described below and a repeating unit represented by formula 2 described below; an antibody that binds to the specimen; and an antibody-linker complex obtained by binding a linker represented by formula 3 described below via an amide bond; generating an antibody-copolymer conjugate; and heating the mixture to aggregate the antibody-copolymer conjugate and extract the nucleic acid contained in the specimen.
  • the antibody-copolymer conjugate is water-soluble and has a lower critical solution temperature (LCST) due to the copolymer structure, and therefore its solubility in water decreases upon heating, making it prone to precipitation and aggregation.
  • the analyte (antigen) is specifically recognized and bound by the antibody through antigen-antibody interaction, and when heated in this state, the analyte is agglutinated and concentrated while bound to the conjugate.
  • the target nucleic acid can be easily extracted even from a sample with a low concentration of antigen and/or without performing pretreatment using a protease.
  • the second embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is the nucleic acid extraction method of the first embodiment, in which the content of the repeating units represented by the formula 2 described below is 1.0 to 30.0 mol % when the total repeating units of the copolymer are taken as 100 mol %.
  • the repeating unit (unit 2) represented by formula 2 has two functions in the copolymer (and antibody-copolymer conjugate). One is a function as a binding site with the antibody, and the other is a function of adjusting the LCST. Regarding the former, unit 2 has one site (click reaction site) containing a cyclic alkyne (alkynylene group). Therefore, it can be easily bonded to the azide of the linker of formula 3 by click reaction. As will be described later, the linker of formula 3 can bind to an antibody. Therefore, unit 2 has a function of binding and fixing the antibody to the copolymer via the linker. In addition, in the latter case, the unit 2 is more hydrophobic than the unit 1. Therefore, by increasing the content of the unit 2 in the copolymer, the LCST can be adjusted to a lower temperature.
  • the LCST of a copolymer having a repeating unit content of 1.0 to 30.0 mol% represented by formula 2 can be easily adjusted to room temperature to 40°C. In addition, the amount of antibody bound is sufficient for practical use. According to the nucleic acid extraction method of the second embodiment, since the LCST is low, it is easier (for example, by simply heating at body temperature) to aggregate the antibody-copolymer conjugate bound to the antigen, and to extract nucleic acid.
  • the third embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is the nucleic acid extraction method of the first or second embodiment, in which the repeating unit represented by formula 2 is at least one type of repeating unit selected from the group consisting of the repeating unit represented by formula 4 described below and the repeating unit represented by formula 5 described below.
  • unit 2 has two functions.
  • unit 2 is a unit represented by formula 4 or formula 5
  • the hydrophobicity can be adjusted more appropriately, and as a result, the LCST can be adjusted to a more easily manageable range (room temperature to 40°C).
  • binding to the linker to which the antibody is immobilized is also made easier, and as a result, the convenience and efficiency of the nucleic acid extraction method are improved.
  • the fourth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is the nucleic acid extraction method of any one of the first to third embodiments, further comprising the copolymer containing a repeating unit represented by formula 6 described below.
  • the repeating unit (unit 6) represented by formula 6 is more hydrophilic than unit 2. Therefore, unit 6 has the effect of adjusting the LCST of the copolymer (and antibody-copolymer conjugate) to a higher temperature. Therefore, even when the content of unit 2 is high, the LCST is easily adjusted to a more manageable range (room temperature to 40°C). Therefore, it is easy to achieve a higher level of both antigen binding and ease of handling (convenience).
  • the fifth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is the nucleic acid extraction method of any one of the first to fourth embodiments, in which the content of the repeating units represented by formula 2 is 2.0 to 30.0 mol % when the total repeating units of the copolymer are taken as 100 mol %.
  • nucleic acid extraction method of the fifth embodiment allows nucleic acid to be extracted more reliably and easily.
  • the sixth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is a nucleic acid extraction method according to any one of the first to fifth embodiments, in which the number average molecular weight of the copolymer is 5,000 to 50,000.
  • the number average molecular weight of the copolymer is 5,000 or more, better concentration efficiency is likely to be obtained (in other words, better temperature responsiveness is likely to be obtained), while when it is 50,000 or less, it is easier to form a conjugate with an antibody, or the antigen-antibody reaction is more likely to proceed.
  • the nucleic acid extraction method of the sixth embodiment using an antibody-copolymer conjugate based on the above copolymer the antibody-copolymer conjugate is more likely to bind to an antigen, and nucleic acid can be extracted more efficiently.
  • the seventh embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is any one of the first to sixth nucleic acid extraction methods, in which the molar ratio (copolymer/antibody) of the content of the copolymer to the content of the antibody contained in the antibody-linker complex in the mixed solution is 0.5 to 30.0.
  • the copolymer and the antibody-linker complex are easily and reliably bonded by a click reaction.
  • the copolymer itself has an LCST similar to that of the antibody-copolymer conjugate. Therefore, even if the content of the copolymer in the mixed liquid is less than that of the antibody-linker complex, the copolymer that is not involved in the bond with the antibody-linker complex can contribute to aggregation due to temperature change (heating) and extraction of nucleic acid.
  • the lower limit of the numerical range of copolymer/antibody is preferably 1.0 or more, and more preferably 2.0 or more. The preferred form of the numerical range of copolymer/antibody will be described later.
  • An eighth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is any one of the first to seventh nucleic acid extraction methods, in which the antibody-copolymer conjugate includes a repeating unit represented by formula 1, which will be described later, and a repeating unit represented by formula 7, which will be described later.
  • the copolymer is typically obtained by binding an antibody-linker complex to a copolymer having unit 5.
  • Unit 7 based on unit 5 has the function of adjusting the LCST to an easy-to-handle temperature (room temperature to 40°C). Therefore, according to the eighth embodiment of the nucleic acid extraction method using the antibody-copolymer conjugate, the antibody-copolymer conjugate to which an antigen is bound (or not) and the copolymer can be more easily aggregated and precipitated, making it easier to extract nucleic acid.
  • the ninth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is any one of the first to eighth nucleic acid extraction methods, in which the heating is performed by heating the mixture to a temperature of 20 to 40°C.
  • the mixture can be heated to 20-40°C by, for example, using the body heat of a laboratory technician to warm the container containing the mixture.
  • nucleic acids can be easily extracted without using any heating equipment or the like.
  • the tenth embodiment of the nucleic acid extraction method disclosed herein is any one of the first to ninth nucleic acid extraction methods, in which the sample is a membrane structure having a lipid bilayer.
  • nucleic acid can be extracted simply by preparing a mixture containing the specimen, a copolymer, and an antibody-linker complex in the absence of protease to produce an antibody-copolymer conjugate, and then heating the mixture to aggregate the antibody-copolymer conjugate (and the copolymer, if contained in the mixture) (as described below).
  • the target nucleic acid can be extracted more easily with a very simple procedure and without using many reagents, compared to conventional methods.
  • An eleventh embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is a nucleic acid extraction method according to the first to ninth embodiments, in which the sample is an enveloped virus.
  • nucleic acid extraction method disclosed herein when used with an enveloped virus sample, can extract the target nucleic acid more easily than conventional methods, with a much simpler procedure and without using many reagents.
  • the twelfth embodiment of the nucleic acid extraction method of the present disclosure is a nucleic acid extraction method according to the first to ninth embodiments, in which the sample is the SARS-CoV-2 virus.
  • nucleic acid extraction method disclosed herein when used with SARS-CoV-2 as a sample, can more easily extract the target nucleic acid than conventional methods, with a much simpler procedure and without using many reagents.
  • a first embodiment of the nucleic acid amplification method of the present disclosure is a nucleic acid amplification method that includes extracting the nucleic acid from the sample using any one of the nucleic acid extraction methods 1 to 12, and amplifying the extracted nucleic acid by polymerase chain reaction.
  • the nucleic acid amplification method of the first embodiment includes a step of extracting nucleic acid by the above-mentioned nucleic acid extraction method, which reduces the labor required for the entire process and requires fewer reagents and less equipment than conventional methods.
  • the first embodiment of the nucleic acid extraction kit of the present disclosure is a nucleic acid extraction kit used for extracting nucleic acid from at least one specimen selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions in the absence of protease, and includes a first agent containing a copolymer containing a repeating unit represented by formula 1 described below and a repeating unit represented by formula 2 described below, and a second agent containing an antibody that binds to the specimen and an antibody-linker complex obtained by binding the linker represented by formula (3) above via an amide bond.
  • the nucleic acid extraction kit of the first embodiment contains a first agent containing a copolymer and a second agent containing an antibody-linker complex, and by mixing these when necessary, an antibody-copolymer conjugate can be produced. Since the first and second agents are separate, the kit has high storage stability, and the operation required for use is simple, requiring only mixing. Using the nucleic acid extraction kit of the first embodiment, nucleic acids can be extracted in the absence of protein enzymes and with simple operations.
  • the PCR (Polymerase Chain Reaction) test kit disclosed herein is a PCR test kit that includes a first embodiment of a nucleic acid extraction kit.
  • the PCR test kit described above makes it possible to easily extract nucleic acid from specimens contained in biological samples, etc., in the absence of proteolytic enzymes, and further amplify the nucleic acid. By using this PCR test kit, it is possible to significantly reduce the time and costs required for PCR testing.
  • a numerical range expressed using “to” means a range that includes the numerical values before and after "to” as the lower and upper limits.
  • substituents when there are a plurality of substituents or linking groups, etc., represented by a specific symbol (hereinafter, referred to as "substituents, etc.”), or when a plurality of substituents, etc. are simultaneously specified, it means that the respective substituents, etc. may be the same or different from each other. This also applies to the specification of the number of substituents, etc. Furthermore, unless otherwise specified, when a plurality of substituents or the like are adjacent (particularly adjacent), they may be linked to each other or condensed to form a ring.
  • the groups may further have a substituent within a range that does not impair the intended effect. This also applies to compounds not specified as substituted or unsubstituted.
  • virion refers to a virus particle of an infectious virus. Infectious viruses can replicate in the cells of bacteria, plants, and animals, including humans (collectively referred to as "hosts"). In one form, a virion is a metabolically inactive infectious agent with a diameter of 20-300 nm, and contains a nucleic acid (RNA or DNA) core and a protein coat. Additionally, enveloped viruses, which have an envelope containing a lipid bilayer, are also included above.
  • Infectious viruses include, for example, influenza viruses (avian influenza virus, equine influenza virus, swine influenza virus, canine influenza virus, feline influenza virus, and human influenza virus), human immunodeficiency virus (HIV), flaviviruses (e.g., hepatitis virus, dengue virus, and Zika virus), human papillomavirus (HPV), bovine papillomavirus, herpes viruses (e.g., HSV-I, HSV-II, CMV, and VZV), rhinoviruses, and coronaviruses (e.g., SAR, S-CoV-2, SARS coronavirus, and MERS coronavirus, etc.), enterovirus, polyomavirus, respiratory syncytial virus (RSV), hepatitis B virus, hepatitis C virus, rotavirus, measles virus, mumps virus, rubella virus, chickenpox virus, human metapneumovirus, Ebola
  • extracellular vesicles refers to particle-like structures that are released from cells into the extracellular environment by any mechanism.
  • Extracellular vesicles include exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies.
  • Extracellular vesicles may contain proteins, nucleic acids, lipids, and other molecules derived from their host cells, and nucleic acid-containing extracellular vesicles are preferred as specimens in the present nucleic acid detection method.
  • the extracellular vesicles may be derived from various cells, such as red blood cells, white blood cells, cancer cells, stem cells, dendritic cells, and macrophages.
  • cell refers to either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and is not particularly limited. Examples include bacteria, archaea, yeast, plant cells, insect cells, and animal cells (e.g., human cells, non-human cells, non-mammalian vertebrate cells, and invertebrate cells, etc.).
  • the "specimen” in this specification is at least one selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions, and is preferably a virion.
  • the specimen is preferably a membrane structure having a lipid bilayer (such as a cell, a vesicle, a liposome, or an enveloped virus), more preferably an enveloped virus, and even more preferably the SARS-CoV-2 virus.
  • the specimen may be contained in a sample obtained by culture or the like, or may be contained in a biological sample collected from animals including humans, plants, and the like.
  • samples obtained from humans may be samples from the lower respiratory tract, such as sputum, tracheal aspirate, and bronchoalveolar lavage fluid; nasopharyngeal swabs, such as nasopharyngeal swabs and throat swabs; saliva; serum; whole blood; urine; stool; autopsy tissue, etc.
  • antibody and the antibody residue represented by “Ab” refer to an immunoglobulin molecule, or a portion (fragment) thereof, that has the ability to bind to an epitope of an antigen molecule.
  • Antibody also includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), and antibody fragments.
  • nucleic acid refers to DNA (deoxyribonucleic acid) molecules and RNA molecules, and may be single-stranded or double-stranded.
  • protease refers to an enzyme that has the function of recognizing a specific site in the amino acid sequence constituting a protein, cleaving the bond, and decomposing the protein into amino acids or peptides. Protease is also called “protease” or "proteinase”. Examples of protease include, but are not limited to, proteases used for the extraction and/or purification of nucleic acids. In the extraction of nucleic acids, non-specific proteases such as proteinase K (EC 3.4.21.64, etc.), protease (pronase), trypsin, and subtilisin have been used in many cases.
  • nucleic acid extraction methods performed in the "presence" of a protease are known to those skilled in the art and include those described in JP 2004-215676 A, JP 2006-087394 A, JP 2006-061041 A, JP 2011-525806 A, WO 2017/200249, and WO 2017/200249.
  • carrier nucleic acid refers to a compound that, when added to a sample, has the function of improving the efficiency of nucleic acid extraction from a specimen, and examples thereof include polyadenylic acid (homopolymer), etc.
  • carrier nucleic acid is often used when nucleic acid extraction is performed from a pathogen and/or a sample containing a low concentration of nucleic acid.
  • nucleic acid extraction kits such as the "QIAamp Viral RNA Mini Kit," already contain carrier RNA.
  • nucleic acid extraction method includes preparing a mixture containing at least one specimen (hereinafter also simply referred to as "specimen") selected from the group consisting of cells, extracellular vesicles, and virions in the absence of a protease (and further without using a carrier nucleic acid), a copolymer (hereinafter also referred to as “specific copolymer”) containing a repeating unit represented by formula 1 described below and a repeating unit represented by formula 2 described below, an antibody that binds to the specimen, and an antibody-linker complex obtained by binding a linker represented by formula 3 described below via an amide bond to generate an antibody-copolymer conjugate, and heating the mixture to aggregate the antibody-copolymer conjugate, thereby extracting nucleic acid contained in the specimen.
  • specimen hereinafter also simply referred to as "specimen”
  • specific copolymer containing a repeating unit represented by formula 1 described below and a repeating unit represented by formula 2 described below
  • Step S1> 1 is a flow diagram showing the procedure of the present nucleic acid extraction method.
  • step S1 a mixed solution containing a specimen, a specific copolymer, and an antibody-linker complex is prepared to produce an antibody-copolymer conjugate.
  • impurities with a protease, but of course, this may be done.
  • the specific copolymer has a repeating unit represented by formula 1 (hereinafter also referred to as “unit 1”) described below, and a repeating unit represented by formula 2 (hereinafter also referred to as "unit 2”) described below.
  • a polymer composed of unit 1 alone exhibits a temperature responsiveness with respect to water of an LCST (Lower Critical Solution Temperature) of 32°C.
  • the specific copolymer containing unit 1 has temperature responsiveness.
  • unit 2 has one site (click reaction site) containing a cyclic alkyne (alkynylene group) per repeating unit, and can be easily conjugated by binding to an azide group in the linker described below through a click reaction. That is, the specific copolymer having both the unit 1 and the unit 2 has both the function of bonding with a linker through a click reaction and the function of changing its solubility in water when heated (specifically, the solubility decreases and the copolymer aggregates).
  • the linker represented by the formula 3 described below has an azide group and an active ester group in the molecule.
  • the active ester means a carboxylic acid derivative that can react with an amino group.
  • the linker has an N-hydroxysuccinimide group as the active ester group.
  • the linker has an N-hydroxysuccinimide group and can bind to an amino group in the antibody to form a conjugate (antibody-linker conjugate).
  • the click reaction site of the specific copolymer reacts with the azide group of the antibody-linker complex to produce an antibody-copolymer conjugate.
  • the specific copolymer is a copolymer containing a repeating unit (unit 1) represented by the following formula 1 and a repeating unit (unit 2) represented by the following formula 2.
  • Unit 1 A polymer constituted solely by the unit 1 exhibits temperature responsiveness to water with a LCST (Lower Critical Solution Temperature) of 32° C.
  • the specific copolymer has temperature responsiveness by including the unit 1. Specifically, the solubility in water changes with temperature change.
  • the content of unit 1 contained in the specific copolymer is not particularly limited, and is typically preferably 1 to 99 mol% when the total repeating units are taken as 100 mol%.
  • the content of unit 1 in the specific copolymer is preferably more than 50 mol%, more preferably 60 mol% or more, and preferably 97 mol% or less.
  • the content of unit 1 in the specific copolymer is preferably 1 to 99 mol%, more than 50 mol% to 99 mol%, 60 to 99 mol%, 1 to 97 mol%, more than 50 mol% to 97 mol%, or 60 to 97 mol%.
  • X1 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. From the viewpoint of providing the specific copolymer with more sensitive temperature responsiveness, X1 is preferably a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • unit 1 is a unit based on a monomer represented by the following formula 1'.
  • X1 has the same meaning as X1 in formula 1, and the preferred embodiments are also the same.
  • the monomer represented by formula 1' may be synthesized, for example, by a known method, for example, a method described in the synthesis examples described later, or a commercially available product may be used.
  • Unit 2 The specific copolymer has unit 2 represented by formula 2.
  • Unit 2 has one site (click reaction site) containing a cyclic alkyne (alkynylene group) per repeating unit, and can be bonded to an azide group of a linker described below by a click reaction to easily form a complex. If the linker and the antibody are bonded in advance, the protein can be immobilized to the specific copolymer via the linker. That is, an antibody-copolymer conjugate can be prepared.
  • the conjugates produced undergo aggregation and precipitation at or above the LCST due to the temperature responsiveness of the specific copolymer, which can be used to concentrate the corresponding antigen and extract and concentrate the nucleic acid released with it.
  • the content of unit 2 in the specific copolymer is not particularly limited, but is typically preferably 1 to 99 mol % when the total amount of repeating units in the specific copolymer is taken as 100 mol %.
  • the content is preferably 1.0 mol % or more, more preferably 2.0 mol % or more, and is preferably 30 mol % or less, more preferably 20 mol % or less.
  • the content of unit 2 in the specific copolymer is preferably 1.0 to 99.0 mol%, 2.0 to 99.0 mol%, 1.0 to 30.0 mol%, 2.0 to 30.0 mol%, 1.0 to 20.0 mol%, or 2.0 to 20.0 mol%.
  • Unit 2 typically has higher hydrophobicity than unit 1 or other repeating units described later. Therefore, by increasing the content of unit 2 in the specific polymer, the LCST can be made lower. Furthermore, the greater the content of unit 2, the easier it is to introduce the antibody.
  • the content of unit 2 is preferably 1.0 mol % or more, more preferably 2.0 mol % or more, preferably 30 mol % or less, more preferably 20 mol % or less. From the viewpoint of adjusting the LCST by 20 to 40° C., the content is preferably 1.0 to 30.0 mol %, 1.0 to 20.0 mol %, 2.0 to 30.0 mol %, or 2.0 to 20.0 mol %.
  • X2 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. From the viewpoint of providing the specific copolymer with more sensitive temperature responsiveness, X2 is preferably a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • L2 represents a divalent group.
  • the divalent group is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O-, -NR A - (R A is a hydrogen atom or a monovalent substituent), a linear, branched or cyclic aliphatic hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, a monocyclic or fused ring aromatic hydrocarbon group having 6 to 20 carbon atoms, and a combination thereof.
  • one group selected from the group consisting of -O-, -C(O)-, -NR A -, linear alkylene groups having 1 to 10 carbon atoms, and combinations thereof is more preferable, at least one group selected from the group consisting of -O-, -C(O)-, -NR A -, and linear alkylene groups having 1 to 10 carbon atoms is even more preferable, and -O-, -C(O)-, or -NH- is particularly preferable.
  • R 1 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, -OR 5 , -NO 2 , -CN, -S(O) 2 R 5 , an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group having 6 to 24 carbon atoms, two or more R 1s may be bonded to each other to form a ring, and R 5 represents a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 24 carbon atoms, and a (hetero)aryl group having 6 to 24 carbon atoms.
  • Z represents a group selected from the group consisting of C(R 1 ) 2 , O, S, and NR 1.
  • R x represents a single bond, an alkylene group (1 to 24 carbon atoms), an alkenylene group (2 to 24 carbon atoms), an alkynylene group (2 to 24 carbon atoms), or an arylene group (6 to 24 carbon atoms) which may have a heteroatom.
  • a′ is an integer of 0 to 8
  • a′′ is an integer of 0 to 8
  • the sum of a′ and a′′ is less than 10.
  • the unit 2 is preferably a unit represented by the following formula 2a .
  • X2 , L2 , R1 , a', and a" have the same meanings as the symbols in formula 2, and the same applies to the preferred embodiments.
  • Z represents CR1 or a nitrogen atom, and a2 is a number equal to or less than a'+a".
  • R1 has the same meaning as R1 in formula 2, and the same applies to the preferred embodiments.
  • unit 2 preferably has, for example, a structure (click reaction site) represented by the following formula C.
  • the unit 2 preferably has a structure represented by the above formula C as a bonding site (monovalent group) at the position of "*". Note that * in the monovalent group represented by formula C bonds to the wavy line portion in the following formula.
  • X 2 and L 2 have the same meanings as the groups represented by the same symbols in formula (2), and the preferred embodiments are also the same.
  • the unit 2 is preferably at least one type selected from the group consisting of units represented by the following formulae:
  • L21 represents a divalent group and has the same meaning as L2 in formula 2, and the preferred embodiments are also the same.
  • X2 has the same meaning as X2 in formula 2, and the preferred embodiments are also the same.
  • unit 2 is preferably unit 4 or unit 5 represented by the following formula 4 or 5.
  • X 2 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • L 4 represents one group selected from the group consisting of -O-, -S-, and -NR B -, R B represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and n represents an integer of 1 to 10
  • L 2 represents a divalent group, and the preferred form is the same as the divalent group of L 2 in formula 2.
  • the method for synthesizing unit 2 is not particularly limited, and any known synthesis method can be used, but a method for obtaining unit 2 by binding a precursor compound to unit 2' represented by the following formula 2' is preferred, since it allows for easier obtaining of unit 2.
  • R C is a reactive substituent, specifically, hydroxy group, amino group, carboxy group, glycidyl group, epoxy group, glycidyl ether group, mercapto group, hydroxysuccinimide ester, maleimide, etc., and is preferably a hydroxy group.
  • X2 has the same meaning as X2 in formulas 4 and 5.
  • the precursor compound for example, a compound having a click reaction site and a group capable of reacting with the above R C may be used, and a commercially available product may be used, or a compound synthesized by a known method may be used.
  • the specific copolymer can be more easily synthesized by using a precursor compound having a structure (click reaction site) represented by the above formula C and a carboxy group.
  • the click reaction site is difluorinated cyclooctyne
  • the method described in Schemes 1 and 2 of J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 34, 11486-11493 can be used to synthesize the precursor compound.
  • the click reaction site is dibenzoazacyclooctyne
  • the method described in Scheme 1 of Chemical Communications (2010), 46(1), 97-99 can be used.
  • unit 2' is unit 6 represented by the following formula 6, because unit 2 can be obtained more easily.
  • the precursor compound to be used is typically a precursor compound having a carboxy group and a structure represented by formula C.
  • the LCST can be adjusted to the higher temperature side. Since unit 6 is more hydrophilic than other repeating units, the LCST can be adjusted to the higher temperature side by increasing the content of unit 6.
  • X6 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. From the viewpoint of providing the copolymer with more sensitive temperature responsiveness, a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is preferable, and a hydrogen atom or a methyl group is more preferable.
  • the content of unit 6 in the specific copolymer is not particularly limited, but is preferably 0 to 15 mol % when the total repeating units of the specific copolymer is taken as 100 mol %.
  • the molecular weight of the specific copolymer is not particularly limited, but typically, the number average molecular weight is preferably 2,000 to 100,000, more preferably 5,000 to 50,000, and even more preferably 10,000 to 30,000.
  • the number average molecular weight is 5,000 or more, better concentration efficiency is likely to be obtained (in other words, better temperature responsiveness is likely to be obtained), whereas when the number average molecular weight is 50,000 or less, a conjugate with an antibody is likely to be formed, or an antigen-antibody reaction is likely to proceed.
  • the number average molecular weight is preferably 15,000 or more, and more preferably 20,000 or more, in that better concentration efficiency can be obtained when an antibody-copolymer conjugate produced from the obtained specific copolymer is used.
  • antibodies are often highly hydrophilic, and in such cases, a copolymer with better concentration efficiency is required.
  • the number average molecular weight of the copolymer is within the above numerical range, it is easy to obtain good concentration efficiency.
  • the molecular weight of the specific polymer is preferably 2000 to 100,000, 5000 to 50,000, 10,000 to 30,000, 15,000 to 100,000, 15,000 to 50,000, 15,000 to 30,000, 20,000 to 100,000, 20,000 to 50,000, or 20,000 to 30,000.
  • the specific copolymer may have a repeating unit other than the above.
  • the method for producing the specific copolymer is not particularly limited, but from the viewpoint of more simply producing the specific copolymer, it is preferable that the method includes the following steps (1) and (2) in this order.
  • Step (1) A step of copolymerizing monomers represented by the following formula 1' and formula 3' to obtain a copolymer (a precursor of a specific copolymer).
  • X 1 and X 2 have the same meanings as X 1 in formula 1 and X 2 in formula 2', respectively, and the preferred embodiments are also the same.
  • the method for copolymerizing the above monomers is not particularly limited, and it is preferable to use a living polymerization method such as a living radical polymerization method, a living anionic polymerization method, or a living cationic polymerization method.
  • a living radical polymerization method is preferable from the viewpoint of more easily obtaining a copolymer (or a precursor thereof).
  • the living radical polymerization method is based on the use of heat, light, and metal catalysts to quickly establish equilibrium between a small amount of growing radical (free radical) species and a large amount of dormant species in the propagation reaction, and various forms of living radical polymerization have been proposed.
  • ATRP method atom transfer radical polymerization method
  • RAFT method reversible addition fragmentation chain transfer method
  • NMP method nitroxide mediated polymerization method
  • the RAFT method is a method in which a chain transfer agent with a high chain transfer constant, called a RAFT agent, is added to a normal radical polymerization system to polymerize vinyl monomers.
  • RAFT agent a chain transfer agent with a high chain transfer constant
  • Thioesters can be used as RAFT agents.
  • the amount of RAFT agent can be appropriately selected depending on the molecular weight of the desired copolymer. That is, since the RAFT agent is bonded to the terminal of each copolymer, for example, if the desired copolymer is a 100-mer copolymer, 0.1 to 3 mol % of the agent should be used per 100 mol % of the monomer.
  • the radical polymerization initiator used in the RAFT polymerization is not particularly limited, and may be appropriately selected from among known initiators such as azo compounds, peroxides, and redox initiators.
  • azo compounds examples include 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN), 2,2'-azobis 2,4-dimethylvaleronitrile, 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride, and 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid).
  • AIBN 2,2'-azobisisobutyronitrile
  • 2,2'-azobis 2,4-dimethylvaleronitrile 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride
  • 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid
  • the polymerization initiator is preferably used at 0.1 to 50 mol% per mole of the RAFT agent.
  • the reaction temperature in the RAFT method is determined by the radical polymerization initiator used, but is generally carried out at 40°C to 150°C. Polymerization is often carried out under atmospheric pressure, but polymerization under pressure is also possible.
  • the RAFT method can be carried out in the absence of a solvent, but can also be carried out in the presence of a solvent. There are no particular limitations on the solvent used, and any known solvent can be used, if necessary.
  • the reaction can also be carried out in water, and the reaction can also proceed by emulsion polymerization.
  • the emulsifiers used in this case can be nonionic emulsifiers, cationic emulsifiers, and anionic emulsifiers that can be used in general emulsion polymerization.
  • Step (2) A step of reacting the obtained copolymer (precursor) with a precursor compound represented by formula 10 to obtain a specific copolymer.
  • Z is a group containing a click reaction site (e.g., a cyclic alkyne), and is preferably a group selected from the groups represented by formula C already described.
  • * indicates the bonding position with L10 .
  • L 10 represents a divalent group and has the same meaning as L 2 in formula 2, and the preferred embodiments are also the same.
  • the desired specific copolymer is synthesized by forming (condensing) an ester bond between the hydroxy group of the copolymer (precursor) and the carboxy group of the precursor compound represented by formula 10.
  • the method for forming the ester bond is not particularly limited, but an example is a method in which a copolymer (precursor) and a precursor compound are subjected to a condensation reaction in the presence of a condensing agent, a catalyst, and a solvent at 0 to 150°C (preferably 0 to 100°C) for 30 minutes to 24 hours.
  • Condensation agents that can be used include triphenyl phosphite, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, N,N'-carbonyldiimidazole, dimethoxy-1,3,5-triazinylmethylmorpholinium, O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate, O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate, and (2,3-dihydro-2-thioxo-3-benzoxazolyl)diphenylphosphonate.
  • N,N'-dicyclohexylcarbodiimide is preferred.
  • N,N-dimethyl-4-aminopyridine or the like can be used as the catalyst, and dichloromethane or the like can be used as the solvent.
  • the antibody-linker conjugate is a compound obtained by binding an antibody that binds to an analyte and a linker represented by the following formula 3 via an amide bond.
  • L3 represents a divalent hydrocarbon group which may have a heteroatom.
  • the divalent hydrocarbon group is not particularly limited, but is preferably a (poly)oxyalkylene group (the alkylene group preferably has 1 to 6 carbon atoms) or a linear, branched or cyclic hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, and more preferably a polyoxyalkylene group.
  • the number of repeats of the polyoxyalkylene group is preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 8.
  • the linker represented by formula 3 has an N-hydroxysuccinimidyl ester (NHS ester) and can form an amide bond with a primary amine (e.g., a lysine residue) of a protein. In other words, it bonds with -NH2 of an antibody to form a complex.
  • the linker has an azide group and bonds with an alkynylene group (click reaction site) of a specific copolymer to form a triazole ring.
  • the method for preparing the antibody-linker complex is not particularly limited, but the linker represented by formula 3 may be dissolved in an organic solvent (e.g., an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide) and added to a solution in which the antibody is dispersed in a buffer solution containing a buffering agent (e.g., a carbonate buffer solution) as necessary.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 1 to 20°C, and more preferably 1 to 10°C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is preferably 1 to 24 hours.
  • the ratio of the antibody and the linker to be added during production of the antibody-linker conjugate is not particularly limited, but the ratio of the amount of active ester groups in the linker to the amount of amino groups in the antibody (molar ratio, active ester groups/amino groups) is preferably 0.1 to 500.
  • the amount of the linker added per mole of the antibody is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 5,000 moles, more preferably 1 to 2,000 moles, and even more preferably 50 to 200 moles.
  • the antibody used is not particularly limited as long as it binds to the specimen (or to a protein contained in the specimen) and has a primary amino group.
  • the antibody may be directed against the S (Spike) protein or the N (Nucleocapsid) protein.
  • the antibody may also be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a multispecific antibody, or an antibody fragment.
  • the antibody-copolymer conjugate is formed by binding a click reaction site of a specific copolymer with an azide group of an antibody-linker complex to form a triazole ring structure.
  • Examples of the antibody-copolymer conjugate include compounds having repeating units represented by the following formulas 1 and 7.
  • X1 has the same meaning as X1 in the specific copolymer, and the preferred embodiments are also the same.
  • X2 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and has the same meaning as X2 in formula 2, and the preferred embodiments are also the same.
  • L2 represents a divalent group and has the same meaning as L2 in formula 2, and the same is also applicable to preferred embodiments.
  • L3 represents a divalent hydrocarbon group which may have a heteroatom and has the same meaning as L3 in formula 3, and the same is also applicable to preferred embodiments.
  • Ab represents an antibody residue, that is, an amide bond is formed between the primary amine of the antibody and the NHS ester of the linker, and the antibody is immobilized to the specific copolymer via the linker.
  • the antibody and unit 7 are bound in a one-to-one relationship, but the antibody-copolymer conjugate is not limited to the above embodiment, and may have a structure in which multiple primary amines in the antibody are bound to alkynylene groups in the specific copolymer via linkers, i.e., a cross-linked structure centered on the antibody molecule.
  • the antibody-copolymer conjugate may also contain unit 2 represented by formula 2 in addition to the repeating units described above. In other words, it may contain unreacted unit 2.
  • unit 2 represented by formula 2 in addition to the repeating units described above. In other words, it may contain unreacted unit 2.
  • the molecules of the specific copolymer are smaller than the molecules of the antibody, even if the specific copolymer has multiple binding sites, it may be difficult for the antibody to bind to each of the binding sites on the specific copolymer. In this case, unreacted unit 2 may remain in the antibody-copolymer conjugate.
  • the ratio of antibody to specific copolymer is not particularly limited, but in one embodiment, 0.1 to 50 moles of specific copolymer per mole of antibody is preferred.
  • the antibody-copolymer conjugate may also contain other units (unit 5) that the specific copolymer may contain, and the preferred range of the content of each unit is the same as the preferred range of the unit in the specific copolymer.
  • the antibody is not particularly limited and any known antibody can be used. Among them, an anti-SARS-CoV-2 antibody is preferable, and for example, an anti-SARS-CoV-2 (COVID19) nucleocapsid (protein) antibody and an anti-SARS-CoV-2 spike (protein) antibody are more preferable.
  • an anti-SARS-CoV-2 antibody is preferable, and for example, an anti-SARS-CoV-2 (COVID19) nucleocapsid (protein) antibody and an anti-SARS-CoV-2 spike (protein) antibody are more preferable.
  • the molar content ratio of the specific copolymer content to the antibody content in the antibody-copolymer conjugate is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100.0, 0.5 to 70.0, 0.5 to 50.0, 0.5 to 30.0, 1.0 to 50.0, 1.0 to 40.0, 2.0 to 100.0, 2.0 to 50.0, 5.0 to 100.0, 5.0 to 50.0, 10.0 to 100.0, 10.0 to 50.0, or 10.0 to 30.0.
  • the method for producing the antibody-copolymer conjugate is not particularly limited, but the specific copolymer and the antibody-linker complex may be mixed and stirred in water containing a buffering agent as necessary.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 1 to 20°C, and more preferably 4 to 10°C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is preferably 1 to 24 hours.
  • the method for preparing the mixture in step S1 is not particularly limited, but may include a method of mixing a biological sample, an antibody-linker conjugate, and a specific copolymer.
  • a biological sample When the biological sample is in liquid form, other components may be added to the biological sample.
  • the order in which the antibody-linker conjugate and the specific copolymer are added is not particularly limited, and the antibody-linker conjugate may be added followed by the specific copolymer, or the specific copolymer may be added followed by the antibody-linker conjugate, or the antibody-linker conjugate and the specific copolymer may be added at the same time.
  • the amount of antibody-specific copolymer conjugate added to a biological sample is not particularly limited, but for example, the amount of antibody-specific copolymer conjugate added per 1 mg of specimen (antigen protein) is preferably 0.1 mg or more, more preferably 0.5 mg or more, and even more preferably 1.0 mg or more. There is no particular upper limit, but generally, 5.0 mg or less is preferred. More specifically, the amount of antibody-specific copolymer conjugate added is preferably 0.1 to 10.0 mg per 1 mL of a liquid medium containing a specimen (eg, containing saliva, etc.).
  • the amount of antibody-specific copolymer conjugate added to a biological sample is preferably 0.1 to 5.0 mg, 0.5 to 5.0 mg, or 1.0 to 5.0 mg per 1 mg of specimen (antigen protein).
  • a specific copolymer in a free state (one that has not formed a conjugate with the antibody) may be further added to the mixture.
  • the response to heat can be made more sensitive, and the sample can be concentrated more efficiently.
  • the amount of the specific copolymer added but when the molar content of the specific copolymer contained in the antibody-copolymer conjugate is taken as 1, it is preferably 0.1 to 20 times.
  • the specimen contained in the mixture is not particularly limited, but may be provided from a biological sample.
  • a biological sample containing the specimen may be added directly to the mixture.
  • biological samples contain many contaminants, and in general nucleic acid extraction often involves treatment with proteolytic enzymes or the like to inactivate or digest these contaminants.
  • the sample is captured by the antibody-copolymer conjugate and can be easily separated from contaminants in step S2 described below, so that nucleic acid extraction can be performed with sufficient efficiency without treatment with protease or the like.
  • step S2 the mixture containing the specimen and the antibody-copolymer conjugate obtained in step S1 is heated to aggregate the antibody-copolymer conjugate that has captured the specimen, and the nucleic acid contained in the specimen is extracted. At this time, it is not necessary to add a carrier nucleic acid, but it may be added.
  • the heating temperature may be appropriately adjusted depending on the LCST of the specific copolymer, but is preferably 20 to 40°C.
  • nucleic acids contained in a sample can be extracted even in the absence of protease, and even without using a carrier nucleic acid.
  • the mechanism behind this is not entirely clear, but it is speculated that this is because the sample is captured by the interaction between the antibody and the antibody-specific copolymer conjugate, and by agglutinating this, it is possible to separate impurities and concentrate the sample at the same time.
  • nucleic acids contained in a sample can be extracted by a simple procedure. Specifically, the antibody-specific copolymer conjugate that has captured the specimen is heated to cause it to aggregate, and the solid content is collected by centrifugation or the like, thereby simultaneously removing impurities and concentrating the specimen. Thereafter, the nucleic acid contained in the specimen may be released from the collected solid content by a known method. Examples of such a method include, but are not limited to, a method using a nucleic acid-binding solid phase carrier such as silica particles and a chaotropic agent (J. Clin. Microbiol., vol. 28 No. 3, p. 495-503 (1990)).
  • a nucleic acid-binding solid phase carrier such as silica particles and a chaotropic agent
  • nucleic acids are adsorbed onto a nucleic acid-binding solid phase carrier in the presence of a chaotropic agent, the carrier is then washed with a washing solution, and the nucleic acids are eluted from the carrier with water or a low-salt buffer.
  • a chaotropic agent a chaotropic agent
  • the nucleic acid extracted by the present nucleic acid extraction method can be subjected to nucleic acid amplification.
  • Methods for amplifying DNA extracted from samples include methods that involve a thermal denaturation step of double-stranded DNA, such as PCR (Polymerase chain reaction) and LCR (Ligase chain reaction); LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), SDA (Strand displacement amplification), Isothermal amplification methods that do not include a thermal denaturation step of double-stranded DNA, such as ICAN (Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMAP (Smart amplification process), and 3SR (Self-sustained sequence replication), can be used.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • LCR Low-mediated isothermal amplification
  • SDA Strand displacement amplification
  • Isothermal amplification methods that do not include a thermal denaturation step of double-stranded DNA, such as ICAN (Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), SMAP (Smart amplification process
  • Methods that can be used to amplify RNA extracted from a sample include TMA (Transcription Mediated Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), and TRCR (Transcription-reverse transcription concerted reaction).
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • TRCR Transcription-reverse transcription concerted reaction
  • nucleic acid amplification method includes extracting nucleic acid from a specimen using the above-mentioned nucleic acid extraction method, and amplifying the extracted nucleic acid using polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • a reverse transcription reaction can be carried out to synthesize DNA complementary to the extracted RNA before amplifying the DNA using PCR.
  • the method of reverse transcription reaction is publicly known, and the reaction temperature is the temperature at which the heat-resistant reverse transcriptase is active, and in one embodiment, 35 to 90°C is preferable.
  • the time for the reverse transcription reaction can be set appropriately taking into account the chain length of the cDNA to be synthesized, etc.
  • the extraction of RNA from the sample, the reverse transcription reaction, and the amplification reaction of the target nucleic acid may be carried out sequentially or continuously (in one step).
  • a heat-stable reverse transcriptase and a heat-stable DNA polymerase As the heat-stable DNA polymerase, various polymerases that can be used for PCR can be used. It is also possible to use a heat-stable DNA polymerase that has heat-stable reverse transcriptase activity.
  • a primer pair for amplifying a target region of cDNA can also be used.
  • one of the primers may also be used as a primer for reverse transcription in a reverse transcription reaction.
  • multiple types of primer pairs may be used in combination. According to the present nucleic acid amplification method, nucleic acid extraction can be performed by a simple procedure without using protease, thus eliminating the bottleneck and enabling nucleic acid amplification to be performed quickly.
  • nucleic acid extraction kit is a nucleic acid extraction kit used for extracting nucleic acid from a sample in the absence of a protease, and includes a first agent containing a specific copolymer and a second agent containing an antibody-linker complex.
  • the first agent is, for example, configured to include a container and a specific polymer contained in the container, and may be a solid (for example, powder) containing the specific polymer, or may be a liquid. When the first agent is a liquid, it may be in a form containing the specific polymer and water (aqueous solution containing a buffering agent).
  • the second agent may, for example, comprise a container and an antibody-linker conjugate contained in the container.
  • the second agent may be in a liquid form, and may be in a form that comprises the antibody-linker conjugate and a buffer solution (e.g., phosphate buffered saline, PBS).
  • a buffer solution e.g., phosphate buffered saline, PBS.
  • the content of the antibody-linker conjugate in the second agent is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 10,000 ⁇ g/mL.
  • An antibody-copolymer conjugate can be produced by mixing the first agent and the second agent.
  • the mixing ratio of the first agent and the second agent is not particularly limited, but is preferably adjusted so that the ratio of the molar content of the specific copolymer contained in the first agent to the molar content of the antibody (bound to the linker) contained in the second agent (antibody/specific copolymer) is 1 to 200, more preferably 10 to 50.
  • the amount of each agent may be adjusted so that the antibody/specific copolymer falls within the above-mentioned numerical range when the total amount of the first agent and the total amount of the second agent contained in this nucleic acid extraction kit are mixed.
  • a mixed solution containing the first agent, the second agent, and a specimen is prepared, an antibody-copolymer conjugate is produced, and then the mixture is heated to concentrate and extract the nucleic acid contained in the specimen.
  • the specimen is an RNA virus
  • the first agent and the second agent are added to saliva or the like containing the RNA virus to react with each other, and then the mixture is heated, whereby the RNA virus captured by the antibody-copolymer conjugate aggregates and precipitates together with the antibody-copolymer conjugate.
  • This is then subjected to solid-liquid separation to remove impurities (liquid phase) and concentrate the specimen.
  • RNA is then extracted from the concentrated specimen.
  • the present nucleic acid extraction kit allows nucleic acid to be extracted in the absence of proteases and with simple operations. Furthermore, even from biological samples containing a small amount of analytes (e.g., RNA viruses), the antibody-copolymer conjugate has the functions of capturing and agglutinating the analyte, allowing efficient nucleic acid extraction.
  • analytes e.g., RNA viruses
  • PCR test kit The embodiment of the PCR test kit is not particularly limited as long as it includes the above-mentioned nucleic acid extraction kit.
  • the other components may include a reverse transcriptase for cDNA synthesis, a probe for real-time detection, an intercalator, a buffer, deoxyribonucleotides such as dNTP, a surfactant, salts, and a primer.
  • dNTP deoxyribonucleotides
  • surfactant e.g., a surfactant, salts, and a primer.
  • primer Several of these ingredients may be mixed together to provide a premix.
  • nucleic acids can be easily extracted from specimens contained in biological samples, etc., in the absence of proteolytic enzymes, and then amplified.
  • the time and costs required for PCR testing can be significantly reduced.
  • P(NIPAAm-co-HIPAAm) As a polymer that serves as a precursor compound of the specific copolymer, "P(NIPAAm-co-HIPAAm)" was synthesized by the following procedure. P(NIPAAm-co-HIPAAm) was synthesized by RAFT polymerization of HIPAAm and NIPAAm (see the scheme below for the structure) as shown in the following scheme: A solution containing 1.89 g of NIPAAm, 0.11 g of HIPAAm, 1.31 mg of AIBN, 12.7 mg of CDT (Cyanomethyl Dodecyl Trithiocarbonate), and 17.6 ml of ethanol was stirred at 20°C for 20 hours, evaporated, and dried in vacuum.
  • P(NIPAAm-co-HIPAAm-co-SAKIPAAm) As a specific polymer, P(NIPAAm-co-HIPAAm-co-SAKIPAAm) was synthesized. As shown in the scheme below, dibenzylcyclooctynoic acid (DBCO-Acid) having a click reaction site was introduced to the hydroxy group of HIPAAm by dehydration condensation to obtain a clickable responsive polymer P (NIPAAm-co-HIPAAm-co-SAKIPAAm).
  • DBCO-Acid dibenzylcyclooctynoic acid having a click reaction site
  • the number average molecular weight of the obtained P(NIPAAm-co-HIPAAm-co-SAKIPAAm) was 2.01 ⁇ 10 4 and the LCST was about 30° C.
  • the notation "NIPAAm” in P(NIPAAm-co-HIPAAm-co-SAKIPAAm) means a unit based on NIPAAm, and corresponds to the unit represented by formula 1.
  • HIPAAm which corresponds to the unit represented by formula 6.
  • SAKIPAAm which corresponds to the unit represented by formula 2.
  • Azido-PEG4-NHS ester (Azido-ethylene glycol (EG4)-NHS ester, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) powder was dissolved in DMSO (10 mg/ml, dimethyl sulfoxide).
  • anti-COVID-19 monoclonal antibody >95%, manufactured by MyBioSource
  • anti-COVID-19 antibody anti-Viral COVID 19 Nucleocapsid (NP) Humanized Coronavirus Monoclonal Antibody
  • SARS-CoV-2 Spike Protein (S1-NTD) Antibody #56996 was dispersed in a carbonate buffer (pH 8.6) and stirred at 4°C for 5 hours to synthesize an antibody-linker complex.
  • the antibody/linker ratio was 1:100.
  • the inclusion criteria for the above study were as follows: -Age 18 or older -Willing and able to provide written informed consent. - Those who have tested positive for COVID-19 by PCR or antigen test, those who have tested negative, or those who are suspected of being positive. The exclusion criteria are as follows: - Those under 18 years of age - Those who do not agree to informed consent
  • Example 1 Using the synthesized specific copolymer and the antibody-linker conjugate, viral RNA was extracted from biological samples in the absence of proteolytic enzymes. The procedure is as follows.
  • LT lysis tube
  • Step 2 Further, 250 ⁇ L of ethanol (96-100%) was added thereto. After vortexing for approximately 15 seconds, the mixture was incubated at room temperature (15-25° C.) for 5 minutes, and then centrifuged to remove droplets.
  • the lysate was then transferred to a QIAamp MinElute column and centrifuged at 6000 xg for >1 min. Next, the washing tube containing the filtrate was discarded, 500 ⁇ L of "Buffer AW1 (Qiagen)" was added, and the tube was centrifuged at 6000 ⁇ g for 1 minute or more. Next, the washing tube containing the filtrate was discarded, 500 ⁇ L of "Buffer AW2 (Qiagen)” was added, and the tube was centrifuged at 6000 ⁇ g for 1 minute or more.
  • the wash tube containing the filtrate was then discarded, 500 ⁇ L of ethanol (96-100%) was added, and the column was centrifuged at 6000 ⁇ g for at least 1 minute.
  • the wash tube containing the filtrate was then discarded, and the QIAamp MinElute column was transferred to a clean 2 ml wash tube (WT).
  • the column was centrifuged at approximately 20,000 x g for 3 minutes to dry the membrane.
  • the QIAamp MinElute column was then transferred to a new 2 ml wash tube (WT). The lid was then opened and the column was incubated at 56°C for 3 minutes to completely dry the membrane.
  • the QIAamp MinElute column was then transferred to an elution tube (ET) and the filtrate was discarded.
  • 20-150 ⁇ L of Buffer AVE (Qiagen) was then added to the center of the membrane and incubated at room temperature for 5 minutes. The column was then centrifuged at approximately 20,000 x g for 1 minute or more.
  • RNA extracted using the above procedure was subjected to RT-PCR (PCR with Reverse Transcription) testing.
  • cDNA was synthesized using "SARS-CoV-2/SARS-CoV Multiplex (DNA-Technology)” and quantified using "DTlite Real-Time PCR (DNA-Technology).”
  • the thermal cycler program and other settings were all in accordance with the manual for the above kit.
  • RNA was extracted from the same biological sample as in Example 1 using a protease without using a specific copolymer or an antibody-linker complex. The detailed procedure was the same as that in Example 1, except that (Procedure 1) was as follows.
  • step 2 were the same as in Example 1.
  • step 2 were the same as in Example 1.
  • FIG. 2 shows the quantitative results of real-time PCR ("SLAN-96P Real-Time PCR System") using nucleic acids extracted by the method of Comparative Example 1 and the method of Reference Example 1. From the results in FIG. 2 , it was revealed that the quantitative result in Reference Example 1 using the specific copolymer and the antibody-linker conjugate was about 1.5 times the quantitative result in Comparative Example 1, and the analyte was concentrated by the specific copolymer and the antibody-linker conjugate.
  • Figure 3 shows the quantitative results obtained by real-time PCR using nucleic acids extracted by the method of Comparative Example 1 and the method of Example 1.
  • the quantitative results obtained by Example 1 were approximately 30 times higher than those obtained by Comparative Example 1.
  • the results in Figure 3 demonstrate that the target nucleic acid can be detected with sufficient sensitivity without the use of proteolytic enzymes and carrier nucleic acids.

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Abstract

【課題】　タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体と、後述する式１で表される繰り返し単位、及び、下記式２で表される繰り返し単位を含む共重合体と、上記検体に結合する抗体、及び、下記式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体と、を含む混合液を調製し、抗体－共重合体コンジュゲートを生成させることと、上記混合液を加熱し、抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、上記検体に内包される核酸を抽出することを含む、核酸抽出方法によれば、タンパク質分解酵素の不存在下でも、更には、キャリア核酸による濃縮を行わなくても、検体に内包される核酸を容易に抽出できる。

Description

核酸抽出方法、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ＰＣＲ検査キット
　本開示は、核酸抽出方法、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ＰＣＲ検査キットに関する。
　生物学的な診断、検査、及び、分析操作では、生物学的試料（例えばスワブ等）に含まれる細胞、及び／又は、ウィルス粒子に含まれる核酸の検出が必要となる。一般に、このような検査では、前処理として、試料に含まれる対象物（ウィルス等の検体）からの核酸の分離濃縮・精製が実施されている。
　試料中における核酸は、夾雑物等との複雑な会合物を形成していることがあり、濃縮・精製には、タンパク質分解酵素による夾雑物の消化、及び、ポリアデニル酸等の「キャリア核酸」による収量増加（以下「濃縮」ともいう）等が必要となる場合が多かった。特に、検体濃度が低い場合にその傾向が顕著だった。なお、ここでの「検体」は、抽出対象となる核酸を有し、生物学的試料に含まれる細胞、及び／又は、ウィルス粒子等を意味する。
　例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の分離同定のために実施されるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による検査（以下「ＰＣＲ検査」ともいう）では、ウィルスＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）の逆転写・増幅のための前処理として、タンパク質分解酵素による処理、及び／又は、キャリア核酸による検体、及び／又は、核酸の濃縮が行われることがあった（例えば、特許文献１）。
特開２００４－２１５６７６号公報
　タンパク質分解酵素による試料の処理、キャリア核酸添加による濃縮（以下、「タンパク質分解酵素等による処理」ともいう）には高価な試薬、複雑な実験操作、そして、所定の時間を必要とする。そのため、タンパク質分解酵素等による処理が、ＰＣＲ検査のボトルネックとなることがある。また、タンパク質分解酵素等による処理に使用する多種の前処理試薬の在庫管理が煩雑な点、試薬が高価な点で検査コストの増大を招いたりしていた。
　本開示の課題は、タンパク質分解酵素の不存在下でも、更には、キャリア核酸による濃縮を行わなくても、検体に内包される核酸を容易に抽出できる、核酸抽出方法の提供である。言い換えれば、核酸抽出のための検体の精製・濃縮をワンステップで実施できる、核酸抽出方法の提供である。また、本開示の課題は、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ＰＣＲ検査キットの提供である。
　本開示の核酸抽出方法の実施形態の一つは、タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体と、下記式１で表される繰り返し単位、及び、下記式２で表される繰り返し単位を含む共重合体と、上記検体に結合する抗体、及び、下記式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体と、を含む混合液を調製し、抗体－共重合体コンジュゲートを生成させることと、上記混合液を加熱し、抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、上記検体に内包される核酸を抽出することを含む、核酸抽出方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
　式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、Ｌ２は、２価の基を表し、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、複数あるＲ１は、それぞれ同一でも異なってもよく、その２個以上が互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～２４個のアルキル基、及び、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択され、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　式３中、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表す。
　また、本開示の核酸抽出キットの実施形態の一つは、タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出キットであって、下記式１で表される繰り返し単位、及び、下記式２で表される繰り返し単位を含む共重合体を含む第１剤と、上記検体に結合する抗体、及び、下記式（３）で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体を含む第２剤と、を備える、核酸抽出キットである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
　式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、Ｌ２は、２価の基を表し、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、複数あるＲ１は、それぞれ同一でも異なってもよく、その２個以上が互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数が１～２４個のアルキル基、及び、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択され、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　式３中、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表す。
　本開示は、タンパク質分解酵素の不存在下でも、更には、キャリア核酸による濃縮を行わなくても、検体に内包される核酸を容易に抽出できる、核酸抽出方法を提供する。言い換えれば、核酸抽出のための検体の精製・濃縮をワンステップで実施できる、核酸抽出方法を提供する。また、本開示は、核酸増幅方法、核酸抽出キット、及び、ＰＣＲ検査キットも提供する。
本発明の核酸抽出方法の手順を示すフロー図である。 比較例１の方法、及び、参考例１の方法により抽出された核酸によるリアルタイムＰＣＲ法による定量結果である。 比較例１の方法、及び、実施例１の方法により抽出された核酸によるリアルタイムＰＣＲ法による定量結果である。
　本開示の核酸抽出方法の第１の実施形態は、タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体と、後述する式１で表される繰り返し単位、及び、後述する式２で表される繰り返し単位を含む共重合体と、上記検体に結合する抗体、及び、後述する式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体と、を含む混合液を調製し、抗体－共重合体コンジュゲートを生成させることと、上記混合液を加熱し、抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、上記検体に内包される核酸を抽出することを含む、核酸抽出方法である。
　上記抗体－共重合体コンジュゲートは、共重合体の構造に由来して、水溶性を備えると共に、ＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有する。そのため、加熱により水への溶解性が低下し、沈殿、凝集しやすい。
　検体（抗原）は、抗原－抗体相互作用により、抗体によって特異的に認識、結合され、その状態で加熱されると、コンジュ―ゲートに結合された状態で検体は凝集、濃縮される。
　第１の実施形態の核酸抽出方法によれば、抗原の濃度が薄い試料からであっても、及び／又は、タンパク質分解酵素を用いた前処理を行わなくても、簡単に目的とする核酸が抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第２の実施形態は、第１の実施形態の核酸抽出方法において、上記共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、後述する式２で表される前記繰り返し単位の含有量が、１．０～３０．０モル％である、核酸抽出方法である。
　式２で表される繰り返し単位（単位２）は、共重合体（及び抗体－共重合体コンジュゲート）において２つの機能を有する。１つは、抗体との結合部位としての機能であり、もう１つは、ＬＣＳＴの調整機能である。前者について、単位２は、環状アルキン（アルキニレン基）を含む部位（クリック反応部位）を１つ有する。そのため、式３のリンカーが有するアジドとクリック反応により容易に結合し得る。後述するが、式３のリンカーは、抗体と結合し得る。従って、単位２は、リンカーを介して、共重合体に抗体を結合させて固定する機能を有する。
　また、後者について、単位２は、単位１と比較して疎水性が高い。そのため、共重合体中の単位２の含有量を増加させると、ＬＣＳＴを低温側に調整し得る。
　式２で表される繰り返し単位の含有量が１．０～３０．０モル％である共重合体は、ＬＣＳＴが室温～４０℃に調整されやすい。また、抗体の結合量も実用上十分である。第２の実施形態の核酸抽出方法によれば、ＬＣＳＴが低いため、より簡単に（例えば、体温で温めたりするだけで）抗原を結合させた抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、核酸を抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第３の実施形態は、第１又は第２の実施形態の核酸抽出方法において、上記式２で表される上記繰り返し単位が、後述する式４で表される繰り返し単位、及び、後述する式５で表される繰り返し単位からなる群より選択される少なくとも１種の繰り返し単位である、核酸抽出方法である。
　上述のとおり、単位２は２つの機能を有している。単位２が、式４、及び、式５で表される単位であると、疎水性がより適切に調整されやすく、結果として、ＬＣＳＴがより扱いやすい範囲（室温～４０℃）に調整されやすい。また、抗体が固定されたリンカーとの結合もより容易となり、結果として、核酸抽出方法の利便性と効率とがより向上する。
　本開示の核酸抽出方法の第４の実施形態は、第１～第３のいずれかの実施形態の核酸抽出方法において、更に、上記共重合体が、後述する式６で表される繰り返し単位を含む、核酸抽出方法である。
　式６で表される繰り返し単位（単位６）は、単位２と比較して親水性がより高い。そのため、単位６は、共重合体（及び抗体－共重合体コンジュゲート）のＬＣＳＴをより高温側に調整する効果を有する。そのため、単位２の含有量が多い場合でも、ＬＣＳＴがより扱いやすい範囲（室温～４０℃）に調整されやすい。そのため、抗原への結合性と、扱いさすさ（利便性）とが、より高いレベルで両立されやすい。
　本開示の核酸抽出方法の第５の実施形態は、第１～第４のいずれかの実施形態の核酸抽出方法において、上記共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、前記式２で表される前記繰り返し単位の含有量が、２．０～３０．０モル％である、核酸抽出方法である。
　上記上重合体、及び、抗体－共重合体コンジュゲートは、抗原への結合性と、扱いさすさ（利便性）とをより高いレベルで両立する。その結果、第５の実施形態の核酸抽出方法によれば、より確実かつより容易に核酸が抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第６の実施形態は、第１～第５のいずれかの実施形態の核酸抽出方法において、上記共重合体の数平均分子量が、５０００～５００００である、核酸抽出方法である。
　共重合体の数平均分子量が５０００以上であると、より優れた濃縮効率が得られやすく（言い換えれば、より優れた温度応答性が得られやすく）、一方で、５００００以下であると、抗体とのコンジュゲートを形成しやすく、又は、抗原－抗体反応がより進行しやすい。結果として、上記共重合体に基づく抗体－共重合体コンジュ―ゲートを用いる第６の実施形態の核酸抽出方法は、抗体－共重合体コンジュ―ゲートがより抗原を結合させやすく、かつ、より効率的に核酸が抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第７の実施形態は、第１～第６のいずれかの核酸抽出方法において、上記混合液中における上記抗体－リンカー複合体が含有する上記抗体の含有量に対する、上記共重合体の含有量のモル基準の比（共重合体／抗体）が、０．５～３０．０である、核酸抽出方法である。
　共重合体と抗体－リンカー複合体とは、クリック反応によって容易かつ確実に結合する。また、共重合体は、抗体－共重合体コンジュゲートと同様のＬＣＳＴを、それ自体で有する。そのため、抗体－リンカー複合体と比較して、共重合体の含有量が混合液中においてより少ない場合でも、抗体－リンカー複合体との結合に関与しない共重合体は、温度変化（加熱）による凝集、核酸の抽出に寄与し得る。この観点では、共重合体／抗体の数値範囲における下限値が、１．０以上であることが好ましく、２．０以上であることがより好ましい。共重合体／抗体の数値範囲の好適形態については後述する。
　本開示の核酸抽出方法の第８の実施形態は、第１～第７のいずれかの核酸抽出方法において、上記抗体－共重合体コンジュゲートが、後述する式１で表される繰り返し単位、及び、後述する式７で表される繰り返し単位を含む、核酸抽出方法である。
　上記共重合体は、典型的には、単位５を有する共重合体に抗体－リンカー複合体を結合させて得られる。単位５に基づく単位７は、ＬＣＳＴを扱いやすい温度（室温～４０℃）に調整する機能を有する。従って、上記抗体－共重合体コンジュゲートを用いる第８の実施形態の核酸抽出方法によれば、抗原が結合された（又はされていない）抗体－共重合体コンジュゲート、及び、共重合体をより容易に凝集、沈殿させ、より容易に核酸を抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第９の実施形態は、第１～第８のいずれかの核酸抽出方法において、上記加熱が、上記混合液の温度を２０～４０℃に加熱することである、核酸抽出方法である。
　混合液の２０～４０℃への加熱は、例えば、混合液が収容された容器を検査技師の体温で温めることでも実現できる。第９の実施形態の核酸抽出方法によれば、加熱用の機器等を用いなくとも、容易に核酸が抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第１０の実施形態は、第１～第９のいずれかの核酸抽出方法において、上記検体が脂質二重層を有する膜構造体である核酸抽出方法である。
　検体が脂質二重層を備え、その内部に収容された核酸が抽出対象である場合、タンパク質分解酵素の不存在下で、検体と、共重合体と、抗体－リンカー複合体とを含む混合液を調製して抗体－共重合体コンジュゲートを生成し、これを加熱して、抗体－共重合体コンジュゲート（及び、混合液に含まれる場合には共重合体）を凝集させるだけで、核酸が抽出され得ることが、実験的に確かめられている（後述のとおり）。第１０の実施形態の核酸抽出方法によれば、従来と比較して、非常に簡便な手順で、多くの試薬を用いることなく、目的とする核酸をより容易に抽出できる。
　本開示の核酸抽出方法の第１１の実施形態は、第１～第９の実施形態の核酸抽出方法において、上記検体がエンベロープウイルスである、核酸抽出方法である。
　本開示の核酸抽出方法は、エンベロープウィルスを検体とする場合に、従来と比較して、非常に簡便な手順で、多くの試薬を用いることなく、目的とする核酸をより容易に抽出できることが実験的に確かめられている。
　本開示の核酸抽出方法の第１２の実施形態は、第１～９の実施形態の核酸抽出方法において、上記検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、核酸抽出方法である。
　本開示の核酸抽出方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検体とする場合に、従来と比較して、非常に簡便な手順で、多くの試薬を用いることなく、目的とする核酸をより容易に抽出できることが実験的に確かめられている。
　本開示の核酸増幅方法の第１の実施形態は、第１～１２のいずれかの核酸抽出方法を用いて、上記検体から上記核酸を抽出することと、上記抽出された核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することと、を含む、核酸増幅方法である。
　第１の実施形態の核酸増幅方法は、核酸の抽出を上述の核酸抽出方法により行う工程を含むため、工程の全体が省力化されるとともに、従来法と比較して、使用される試薬も少なく、かつ、使用すべき機器も少ない。
　本開示の核酸抽出キットの第１の実施形態は、タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出キットであって、後述する式１で表される繰り返し単位、及び、後述する式２で表される繰り返し単位を含む共重合体を含む第１剤と、上記検体に結合する抗体、及び、上記式（３）で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体を含む第２剤と、を備える、核酸抽出キットである。
　第１の実施形態の核酸抽出キットによれば、共重合体を含む第１剤と、抗体－リンカー複合体とを含む第２剤とを含むため、これを必要時に混合することで、抗体－共重合体コンジュゲートが作製できる。第１剤と第２剤とが分けられているため、保存性が高く、使用時の操作も混合のみであるから、容易である。　第１の実施形態の核酸抽出キットを用いると、タンパク質酵素の不存在下で、かつ、簡単な操作で核酸を抽出できる。
　本開示のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）検査キットは、核酸抽出キットの第１の実施形態を含むＰＣＲ検査キットである。
　上記ＰＣＲ検査キットによれば、タンパク質分解酵素の不存在下で、生物学的試料等に含まれる検体から、簡単に核酸を抽出でき、更に、これを増幅することができる。本ＰＣＲ検査キットを用いることで、ＰＣＲ検査にかかる時間、及び、必要なコストを大幅に削減することができる。
　以下、核酸抽出方法等について非限定的な実施形態に基づいて詳細に説明する。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　また、本明細書において、特定の符号で表示された置換基、若しくは、連結基等（以下、置換基等という）が複数あるとき、又は、複数の置換基等を同時に規定するときには、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよいことを意味する。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。
　また、特に断らない限り、複数の置換基等が近接（特に隣接）するときには、それらが互いに連結したり縮環したりして環を形成していてもよい。
　また、本明細書において置換・無置換を明記していない置換基等については、目的とする効果を損なわない範囲で、その基にさらに置換基を有していてもよい。これは置換・無置換を明記していない化合物についても同様である。
　本明細書において、「ビリオン」とは、感染性ウィルスのウィルス粒子を意味する。感染性ウィルスは、細菌、植物、及び、ヒトを含む動物（以上をあわせて「宿主」ともいう）の細胞で複製される得る。ビリオンは、一形態として、直径２０～３００ｎｍで代謝的に不活性な感染病原体であり、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）コアと、タンパク質外被とを含む。更に、脂質二重層を含むエンベロープを有するエンベロープウィルスも、上記に含まれる。
　感染性ウィルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス（トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、及び、ヒトインフルエンザウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス、及び、ジカウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシパピローマウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、及び、ＶＺＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳコロナウイルス、及び、ＭＥＲＳコロナウイルス等）、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス等）、ブタ流行性下痢、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、及び、口蹄疫ウイルス等が挙げられる。
　本明細書において「細胞外小胞」とは、任意の機序によって、細胞から細胞外環境へと放出される粒子様構造体を意味する。「細胞外小胞」には、エクソソーム、マイクロベシクル、及び、アポトーシス小体等が含まれる。細胞外小胞には、その宿主細胞に由来するタンパク質、核酸、脂質、及び、他の分子が含まれることがあり、本核酸検出方法における検体としては、核酸を含む細胞外小胞が好ましい。なお、細胞外小胞は、様々な細胞、例えば赤血球、白血球、がん細胞、幹細胞、樹状細胞、及び、マクロファージ等に由来してよい。
　本明細書において「細胞」とは、原核細胞、又は、真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、及び、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、及び、無脊椎動物細胞等）等が挙げられる。
　本明細書における「検体」は、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種であり、ビリオンが好ましい。また、検体は、脂質二重層を有する膜構造体（細胞、ベシクル、リポソーム、エンベロープウィルス等）であることが好ましく、エンベロープウイルスであることがより好ましく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであることが更に好ましい。
　検体は、培養等によって取得された試料に含まれるものであっても、ヒトを含む動物、及び、植物等から採取された、生物学的試料に含まれるものであってもよい。
　例えば、ヒトから取得される試料としては、喀痰、気管吸引液、及び、気管支肺胞洗浄液等の下気道由来試料；上咽頭ぬぐい液、及び、咽頭ぬぐい液等の鼻咽頭ぬぐい液；唾液；血清；全血；尿；便；剖検組織等であってよい。
　本明細書において「抗体」、及び、「Ａｂ」で表される抗体残基は、抗原分子のエピトープに結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、又は、その一部（断片）を意味する。また「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、抗体断片を含む。
　本明細書において「核酸」は、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）分子、及び、ＲＮＡ分子を意味し、一本鎖でも、二本鎖でもよい。
　本明細書において「タンパク質分解酵素」とは、タンパク質を構成するアミノ酸配列の特定部位を認識して、その結合を切断し、アミノ酸、又は、ペプチドへと分解する機能を有する酵素を意味する。タンパク質分解酵素は、「プロテアーゼ」、及び、「プロテイナーゼ」とも呼ばれる。
　タンパク質分解酵素としては、特に限定されないが、核酸の抽出、及び／又は、精製のために使用されるタンパク質分解酵素が挙げられる。核酸の抽出においては、従来、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４等）、プロテアーゼ（プロナーゼ）、トリプシン、及び、ズブチリシン等の非特異的タンパク質分解酵素が使用されることが多い。
　タンパク質分解酵素の「存在下」で行う核酸抽出方法（言い換えれば、タンパク質分解酵素を用いた核酸抽出方法）としては、特開２００４－２１５６７６号公報、特開２００６－０８７３９４号公報、特開２００６－０６１０４１号公報、特表２０１１－５２５８０６号公報、国際公開２０１７／２００２４９号、及び、国際公開２０１７／２００２４９号等が挙げられ、当業者にとって公知である。
　「タンパク質分解酵素の不存在下で」とは、タンパク質分解酵素を使用しない環境下（抽出反応系）で行われることを意味する。典型的には、タンパク質分解酵素を意図的に使用することなく、核酸抽出が実施されることを意味する。これは、非意図的に、例えば、検体に由来して、抽出反応系にタンパク質分解酵素が混入することを妨げるものではないが、抽出反応系にタンパク質分解酵素が含まれないことが好ましい。
　本明細書において「キャリア核酸」とは、試料に添加すると、検体からの核酸抽出効率を向上する機能を有する化合物を意味し、例えば、ポリアデニル酸（ホモポリマー）等が挙げられる。一般に、病原体、及び／又は、試料に含まれる核酸濃度が低いサンプルから、核酸抽出を行う場合に、キャリア核酸が使用されることが多い。
　市販の核酸抽出キット、例えば、「ＱＩＡａｍｐ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ」等には、キャリアＲＮＡがすでに含まれている。
［核酸抽出方法］
　核酸抽出方法の実施形態（以下、「本核酸抽出方法」ともいう。）は、タンパク質分解酵素の不存在下で、（更には、キャリア核酸を使用せずに）細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体（以下、単に「検体」ともいう。）と、後述する式１で表される繰り返し単位、及び、後述する式２で表される繰り返し単位を含む共重合体（以下、「特定共重合体」ともいう。）と、検体に結合する抗体、及び、後述する式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体と、を含む混合液を調製し、抗体－共重合体コンジュゲートを生成させることと、上記混合液を加熱し、抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、検体に内包される核酸を抽出することを含む。
＜ステップＳ１＞
　図１は、本核酸抽出方法の手順を示すフロー図である。まず、ステップＳ１として、検体と、特定共重合体と、抗体－リンカー複合体とを含む混合液を調製し、抗体－共重合体コンジュゲートを生成する。この際、タンパク質分解酵素による夾雑物の処理を行う必要はないが、もちろん、それを行ってもよい。
　詳細は後述するが、特定共重合体は、後述する式１で表される繰り返し単位（以下「単位１」ともいう。）と、後述する式２で表される繰り返し単位（以下「単位２」ともいう。）とを有する。単位１は、それ単独で構成される重合体が水に対してＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が３２℃の温度応答性を示す。単位１を含む特定共重合体は、温度応答性を有する。
　更に、単位２は、繰り返し単位の１つにつき、環状アルキン（アルキニレン基）を含む部位（クリック反応部位）を１つ有し、後述するリンカーが有するアジド基とクリック反応により結合し、容易に複合化し得る。
　すなわち、単位１と単位２とを併せ持つ特定共重合体は、リンカーとクリック反応により結合する機能と、加熱により水への溶解性が変化する（具体的には、溶解性が低下して凝集する）機能とを併せ持つ。
　一方、後述する式３で表されるリンカーは、分子内にアジド基を有し、かつ、活性エステル基を有する。活性エステルとは、アミノ基と反応させることができるカルボン酸誘導体を意味する。リンカーは、活性エステル基として、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基を有する。
　リンカーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基を有するため、抗体が有するアミノ基と結合して複合体（抗体－リンカー複合体）を形成し得る。
　本ステップでは、上記特徴を有する特定共重合体と、抗体－リンカー複合体とを含む混合液中で、特定共重合体のクリック反応部位と、抗体－リンカー複合体のアジド基とが反応し、抗体－共重合体コンジュゲートが生成される。
（特定共重合体）
　特定共重合体は、下記式１で表される繰り返し単位（単位１）、及び、下記式２で表される繰り返し単位（単位２）を含む共重合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
・単位１
　単位１は、それ単独で構成される重合体が水に対してＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が３２℃の温度応答性を示す。単位１を含むことによって、特定共重合体は温度応答性を有する。具体的には、温度変化により水への溶解性が変化する。
　特定共重合体に含まれる単位１の含有量としては特に制限されず、全繰り返し単位を１００モル％としたとき、典型的には、１～９９モル％が好ましい。なかでも、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点、及び／又は、ＬＣＳＴを、核酸抽出の操作上、扱いやすい温度範囲に制御しやすい（具体的には、ＬＣＳＴが室温～４０℃程度になりやすい）観点で、特定共重合体中における単位１の含有量は５０モル％を超えることが好ましく、６０モル％以上がより好ましく、９７モル％以下が好ましい。
　特定共重合体中における単位１の含有量は、１～９９モル％；５０モル％を超えて、９９モル％以下；６０～９９モル％；１～９７モル％；５０モル％を超えて、９７モル％以下；又は、６０～９７モル％が好ましい。
　式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
　特に制限されないが、単位１は、以下の式１′で表される単量体（モノマー）に基づく単位であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　式１′中、Ｘ１は、式１中のＸ１と同義であり、好適形態も同様である。式１′で表される単量体は、例えば、公知の方法、例えば、後述する合成例に記載の方法により合成してもよいし、市販品を用いてもよい。
・単位２
　特定共重合体は、式２で表される単位２を有する。単位２は、繰り返し単位の１つにつき、環状アルキン（アルキニレン基）を含む部位（クリック反応部位）を１つ有し、後述するリンカーが有するアジド基とクリック反応により結合し、容易に複合体を形成し得る。リンカーと抗体とを予め結合させておけば、リンカーを介してタンパク質を特定共重合体に固定できる。すなわち、抗体－共重合体コンジュゲートを作製できる。
　作製されるコンジュゲートは、特定共重合体に由来する温度応答性により、ＬＣＳＴ又はこれ以上の温度で凝集、沈殿を起こす。これを利用することで、対応する抗原を濃縮し、これに伴って放出される核酸を抽出・濃縮できる。
　特定共重合体中における単位２の含有量としては特に制限されないが、特定共重合体が有する全繰り返し単位を１００モル％としたとき、典型的には、１～９９モル％が好ましい。
　なかでも、より優れた本発明の効果が得られる点では、１．０モル％以上が好ましく、２．０モル％以上がより好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
　特定共重合体中における単位２の含有量は、１．０～９９．０モル％、２．０～９９．０モル％、１．０～３０．０モル％、２．０～３０．０モル％、１．０～２０．０モル％、又は、２．０～２０．０モル％が好ましい。
　単位２は、典型的には、単位１、又は、後述する他の繰り返し単位と比較して疎水性がより高い。したがって、特定重合体における単位２の含有量を増加させることによって、ＬＣＳＴをより低温化することができる。
　また、単位２の含有量が多いほど、抗体がより導入されやすい。一方で、ＬＣＳＴを２０～４０℃調整する観点では、単位２の含有量は、１．０モル％以上が好ましく、２．０モル％以上がより好ましく、３０モル％以下が好ましく、２０モル％以下がより好ましい。
　ＬＣＳＴを２０～４０℃調整する観点では、１．０～３０．０モル％、１．０～２０．０モル％、２．０～３０．０モル％、又は、２．０～２０．０モル％が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、特定共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
　式２中、Ｌ２は、２価の基を表す。２価の基としては特に制限されないが、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＡ－（ＲＡは水素原子又は１価の置換基）、炭素数が１～２０個の直鎖状、分枝鎖状、又は、環状の脂肪族炭化水素基、炭素数が６～２０個の単環、又は、縮合環の芳香族炭化水素基、及び、これらを組合せた基からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
　なかでも、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲＡ－、炭素数が１～１０の直鎖状のアルキレン基、及び、これらを組合せた基からなる群より選択される１種の基がより好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲＡ－、及び、炭素数が１～１０の直鎖状のアルキレン基からなる群より選択される少なくとも１種の基が更に好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、又は、－ＮＨ－が特に好ましい。
　式２中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、２つ以上のＲ１は互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン原子、及び、炭素数１～２４個のアルキル基、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択される基を表す。なお、複数あるＲ１は互いに同一でも異なってもよい。
　式２中、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択される基を表す。なお、Ｚに、Ｌ２で表される２価の基が結合する場合、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、又は、ＮＲ１が有する水素原子、ハロゲン原子、又は、炭素原子の１つが除かれた基である。より具体的には、＝Ｃ（Ｒ１）ＲＸ－Ｌ２－で表される構造、又は、＝Ｎ－Ｒｘ－Ｌ２－で表される構造である。ここで、ＲＸは、単結合、又は、アルキレン基（炭素数１～２４）、アルケニレン基（炭素数２～２４）、アルキニレン基（炭素数２～２４）、又は、ヘテロ原子を有してもよいアリーレン基（炭素数６～２４）を表す。
　式２中、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である。
　より優れた本発明の効果が得られる点で、単位２は、以下の式２ａで表される単位が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　式２ａ中、Ｘ２、Ｌ２、Ｒ１、ａ′、及び、ａ″は式２中の各記号と同義であり、好適形態も同様である。式２ａ中、Ｚは、ＣＲ１、又は、窒素原子を表し、ａ２は、ａ′＋ａ″以下の数である。なお、Ｒ１は、式２中のＲ１と同義であり、好適形態も同様である。
　単位２は、Ｌ２との結合部位を「＊」としたとき、例えば、以下の式Ｃで表される構造（クリック反応部位）を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　単位２は、「＊」の位置で結合される部位（１価の基）として、上記式Ｃで表される構造を有することが好ましい。なお、式Ｃで表される１価の基における＊が、以下の式における波線部分に結合する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　なお、上記式中、Ｘ２、及び、Ｌ２は式（２）における同記号が表す基と同義であり、好適形態も同様である。
　より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点では、単位２は、以下の式で表される単位からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
　なお、下記式中、Ｌ２１は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｘ２は、式２中のＸ２と同義であり、好適形態も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　なかでも、より優れた本発明の効果を有する共重合体が得られる観点で、単位２は、以下の式４又は５で表される単位４又は単位５が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　式４、及び、式５中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式４中、Ｌ４は－Ｏ－、－Ｓ－、及び、－ＮＲＢ－からなる群より選択される１種の基であり、ＲＢは、水素原子、又は、炭素数が１～６個のアルキル基を表し、ｎは１～１０の整数を表し、式５中、Ｌ２は、２価の基を表し、好適形態は、式２中のＬ２の２価の基と同様である。
　単位２の合成方法としては特に制限されず、公知の合成方法が使用できるが、より簡便に単位２を得ることができる点で、以下の式２′で表される単位２′に前駆体化合物を結合させて、単位２を得る方法が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　式２′中、ＲＣは反応性置換基であり、具体的には、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、グリシジル基、エポキシ基、グリシジルエーテル基、メルカプト基、ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び、マレイミド等が挙げられ、ヒドロキシ基が好ましい。Ｘ２は、式４、５におけるＸ２と同義である。
　前駆体化合物としては、例えば、クリック反応部位と、上記ＲＣと反応し得る基とを有する化合物を用いればよく、市販品を用いることもできるし、公知の方法で合成して用いることもできる。なかでも、上述の式Ｃで表される構造（クリック反応部位）と、カルボキシ基とを有する前駆体化合物を用いると、より簡便に、特定共重合体を合成できる。
　前駆体化合物の合成方法は、例えば、クリック反応部位が二フッ素化シクロオクチンであれば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，３４，１１４８６－１１４９３のスキーム１及び２に記載されている方法が使用できる。また、クリック反応部位がジベンゾアザシクロオクチンであれば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１０），４６（１），９７－９９のスキーム１に記載された方法が使用できる。
　また、クリック反応部位であるＢＣＮ（ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎｙｎｅ）、及び、ＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）等に、アミノ基、ヒドロキシ基、及び、カルボキシ基等の置換基が付加されたものや、マレイミド、及び、ヒドロキシスクシンイミドエステル化されたものが市販されており、前駆体化合物としては、これらを用いることもできる。
　なかでも、より簡便に単位２が得られる点で、単位２′は、以下の式６で表される単位６であることが好ましい。この場合、前駆体化合物としては、典型的には、カルボキシ基と、式Ｃで表される構造とを有する前駆体化合物を用いればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　なお、特定共重合体を合成する際に、未反応の単位６がある場合、言い換えれば、特定共重合体が、単位１、単位２、及び、単位６を含む場合、ＬＣＳＴを高温側に調整することができる。単位６は、他の繰り返し単位と比較して親水性が高いため、単位６の含有量を増加させることで、ＬＣＳＴを高温側へと調整することができる。
　上記式６中、Ｘ６は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、共重合体がより敏感な温度応答性を有する観点で、水素原子、又は、炭素数が１～４個の直鎖状のアルキル基が好ましく、水素原子、又は、メチル基がより好ましい。
　特定共重合体における単位６の含有量としては特に制限されないが、特定共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、０～１５モル％が好ましい。
　特定共重合体の分子量としては特に制限されないが、典型的には、数平均分子量として２０００～１０００００が好ましく、５０００～５００００がより好ましく、１００００～３００００が更に好ましい。
　数平均分子量が５０００以上であると、より優れた濃縮効率が得られやすく（言い換えれば、より優れた温度応答性が得られやすく）、一方で、５００００以下であると、抗体とのコンジュゲートを形成しやすく、又は、抗原－抗体反応がより進行しやすい。
　なかでも、得られる特定共重合体によって作製した抗体－共重合体コンジュゲートを用いたとき、より優れた濃縮効率が得られる点で、数平均分子量が、１５０００以上であることが好ましく、２００００以上であることがより好ましい。一般に抗体は親水性が高いことが多く、そのような場合には、より優れた濃縮効率を有する共重合体が必要であるが、上記共重合体の数平均分子量が上記数値範囲内であると、優れた濃縮効率が得られやすい。
　以上により、特定重合体の分子量としては、２０００～１０００００、５０００～５００００、１００００～３００００、１５０００～１０００００、１５０００～５００００、１５０００～３００００、２００００～１０００００、２００００～５００００、又は、２００００～３００００が好ましい。
（その他の単位）
　特定共重合体は、上記以外の繰り返し単位を有していてもよい。上記以外の繰り返し単位としては、例えば、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４６℃）、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５６℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５９℃）、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４４℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、及び、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）等に基づく繰り返し単位が挙げられる。
（特定共重合体の製造方法）
　特定共重合体の製造方法としては、特に制限されないが、より簡便に特定共重合体を製造できる観点で、以下の工程（１）、及び、工程（２）をこの順に有することが好ましい。
　工程（１）：以下の式１′、及び、式３′で表される単量体を共重合させて、共重合体（特定共重合体の前駆体）を得る工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記式１′、及び、３′中、Ｘ１、及び、Ｘ２はそれぞれ、式１中のＸ１、及び、式２′中のＸ２のそれぞれと同義であり、好適形態も同様である。
　上記単量体を共重合させる方法は特に制限されず、リビングラジカル重合法、リビングアニオン重合法、及び、リビングカチオン重合法等のリビング重合法を用いることが好ましい。なかでも、より簡便に共重合体（又はその前駆体）が得られる観点では、リビングラジカル重合法が好ましい。
　リビングラジカル重合法は、熱、光、及び、金属触媒等を作用させ、成長反応における少量の成長ラジカル（フリーラジカル）種と多量の休止（ドーマント）種の素早い平衡を確立させる事に基づいており、種々の形式のリビングラジカル重合が提案されている。
　例えば、ドーマントとしてハロゲン化アルキルを用いるＡＴＲＰ法（原子移動ラジカル重合法）、チオエステルを用いるＲＡＦＴ法（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、アルコキシアミンを用いるＮＭＰ法（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）等がある。
　ＲＡＦＴ法は、通常のラジカル重合の系にＲＡＦＴ剤と呼ばれる高い連鎖移動定数を有する連鎖移動剤を添加してビニル系モノマーを重合させる方法である。ＲＡＦＴ剤としては、チオエステルを使用することができる。
　ＲＡＦＴ剤の量は、目的とする共重合体の分子量によって適宜選択できる。すなわち、各共重合体の末端にＲＡＦＴ剤が結合するため、例えば、１００量体の共重合体を目的物とする場合、単量体１００モル％に対して、０．１～３モル％使用すればよい。
　ＲＡＦＴ重合に使用するラジカル重合開始剤は特に制限されず、アゾ化合物、パーオキサイド、及び、レドックス型開始剤等の公知の開始剤の中から適宜選択されればよい。
　アゾ化合物の例としては２，２′－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２′－アゾビス２，４－ジメチルバレロニトリル、２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、及び、４，４′－アゾビス（４－シアノ吉草酸）が挙げられる。
　重合開始剤は一般にＲＡＦＴ剤の１モルに対して、０．１～５０モル％が好ましい。ＲＡＦＴ法の反応温度は、用いるラジカル重合開始剤によって決まるが、一般的に４０℃～１５０℃で行われることが多い。大気圧下での重合が多いが、加圧下でも重合は可能である。
　ＲＡＦＴ法は、溶媒不存在下で行うことができるが、溶媒の存在下でも行うことができる。必要に応じて使用する溶媒としては特に限定されず、公知の溶媒が使用できる。また、水中でも反応を行うことは可能であり、乳化重合でも反応は進行する。その際に使用する乳化剤は、一般的な乳化重合に使用可能なノニオン性乳化剤、カチオン性乳化剤、及び、アニオン性乳化剤が使用できる。
　工程（２）：得られた共重合体（の前駆体）と、式１０で表される前駆体化合物とを反応させて、特定共重合体を得る工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　式１０中、Ｚは、クリック反応部位（例えば環状アルキン）を含む基であり、すでに説明した式Ｃで表される基から選択される基であることが好ましい。なお、式Ｃ中、＊はＬ１０との結合位置とする。
　また、Ｌ１０は２価の基を表し、式２中のＬ２と同義であり、好適形態も同様である。
　共重合体（前駆体）が有するヒドロキシ基と、式１０で表される前駆体化合物が有するカルボキシ基とによって、エステル結合を形成する（縮合させる）ことにより、所望の特定共重合体が合成される。
　エステル結合を形成する方法としては特に制限されないが、例えば、共重合体（前駆体）と前駆体化合物とを、縮合剤、触媒、及び溶媒の存在下で、０～１５０℃（好ましくは０～１００℃）において、３０分～２４時間、縮合反応させる方法が挙げられる。
　縮合剤としては、トリフェニルホスファイト、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ′－カルボニルジイミダゾール、ジメトキシ－１，３，５－トリアジニルメチルモルホリニウム、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、及び、（２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－３－ベンゾオキサゾリル）ホスホン酸ジフェニル等を用いることができ、なかでも、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましく、この場合、触媒としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン等を用いることができ、溶媒としてはジクロロメタン等を用いることができる。
（抗体－リンカー複合体）
　抗体－リンカー複合体は、検体に結合する抗体、及び、下記式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　式３中、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表す。
　２価の炭化水素基としては特に限定されないが、（ポリ）オキシアルキレン基（アルキレン基の炭素数は１～６個が好ましい）、及び、炭素数が１～２０個の直鎖状、分枝鎖状、又は、環状の炭化水素基等が好ましく、ポリオキシアルキレン基がより好ましい。なお、ポリオキシアルキレン基の繰り返し数は、２～１０が好ましく、２～８がより好ましい。
　式３で表されるリンカーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）を有し、タンパク質の第一級アミン（例えば、リジン残基）とアミド結合を形成できる。すなわち、抗体が有する－ＮＨ２と結合して複合体を形成する。一方、リンカーは、アジド基を有しており、特定共重合体が有するアルキニレン基（クリック反応部位）と結合し、トリアゾール環を形成する。
　抗体－リンカー複合体の作製方法は特に限定されないが、式３で表されるリンカーを有機溶媒等（例えば、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒）に溶解させ、必要に応じて緩衝化剤を含む緩衝液（例えば、炭酸緩衝液等）に抗体を分散させた溶液に添加すればよい。反応温度は特に限定されないが、１～２０℃が好ましく、１～１０℃がより好ましい。反応時間は特に限定されないが、１～２４時間が好ましい。
　抗体－リンカー複合体の製造時における抗体とリンカーとの添加比率は特に限定されないが、抗体が有するアミノ基の含有量に対する、リンカーが有する活性エステル基の物質量基準の比（モル比、活性エステル基／アミノ基）が、０．１～５００が好ましい。
　また、抗体の１モルに対するリンカーの添加量は特に制限れないが、０．０１～５０００モルが好ましく、１～２０００モルがより好ましく、５０～２００モルが更に好ましい。
　使用する抗体は、検体（が有するタンパク質）に結合するものであって、第一級アミノ基を有るものであれば特に限定されない。例えば、検体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである場合、抗体は、Ｓ（Ｓｐｉｋｅ）タンパクに対するものでも、Ｎ（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）タンパクに対するものでもよい。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、及び、抗体断片のいずれであってもよい。
（抗体－共重合体コンジュゲート）
　抗体－共重合体コンジュゲートは、特定共重合体が有するクリック反応部位と、抗体－リンカー複合体が有するアジド基とを結合させてトリアゾール環構造を形成させたものである。
　抗体－共重合体コンジュゲートとしては、例えば、以下の式１、及び、式７で表される繰り返し単位を有する化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　式１中、Ｘ１は、特定共重合体が有するＸ１と同義であり、好適形態も同様である。また、式７中、Ｘ２は、水素原子、又は、炭素数１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中におけるＸ２と同義であり、好適形態も同様である。
　また、Ｌ２は２価の基を表し、式２中におけるＬ２と同義であり、好適形態も同様である。また、Ｌ３はヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表し、式３中のＬ３と同義であり、好適形態も同様である。
　また、Ａｂは抗体残基を表す。すなわち、抗体の第一級アミンとリンカーのＮＨＳエステルによってアミド結合が形成され、抗体がリンカーを介して特定共重合体に固定された状態を表している。
　なお、上記形態では、抗体と単位７とが１対１で結合しているが、抗体－共重合体コンジュゲートとしては上記形態に制限されず、抗体が有する複数の第一級アミンが、それぞれリンカーを介して特定共重合体が有するアルキニレン基と結合した状態、すなわち、抗体分子を中心とした架橋構造様の構造が形成されていてもよい。
　また、抗体－共重合体コンジュゲートは、上記の繰り返し単位以外にも、式２で表される単位２を含んでいてもよい。すなわち、未反応の単位２を含んでいてもよい。一形態として、特定共重合体の分子は、抗体の分子と比較して小さいため、特定共重合体が複数の結合サイトを有していたとしても、その特定共重合体に対し、結合サイトごとに抗体が結合することが難しい場合もある。この場合、抗体－共重合体コンジュゲートには、未反応の単位２が残存してもよい。
　抗体と特定共重合体との比は特に制限されないが、一形態として、抗体の１モルに対して、特定共重合体の０．１～５０モルが好ましい。
　また、抗体－共重合体コンジュゲートは、特定共重合体が含んでもよい他の単位（単位５）等を含んでいてもよく、各単位の含有量の好適範囲は、特定共重合体における当該単位の好適範囲と同様である。
　抗体としては特に制限されず、公知の抗体を使用できるが、なかでも、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が好ましく、例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ１９）ヌクレオカプシド（タンパク）抗体、及び、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（タンパク）抗体等がより好ましい。
　抗体－共重合体コンジュゲート中における、抗体の含有量に対する特定共重合体の含有量のモル基準の含有量比は特に制限さないが、０．１～１００．０、０．５～７０．０、０．５～５０．０、０．５～３０．０、１．０～５０．０、１．０～４０．０、２．０～１００．０、２．０～５０．０、５．０～１００．０、５．０～５０．０、１０．０～１００．０、１０．０～５０．０、又は、１０．０～３０．０が好ましい。
　抗体－共重合体コンジュゲートの作製方法は特に限定されないが、特定共重合体と、抗体－リンカー複合体とを、必要に応じて緩衝化剤を含む水中で混合、撹拌すればよい。反応温度は特に限定されないが、１～２０℃が好ましく、４～１０℃がより好ましい。反応時間は特に制限されないが、１～２４時間が好ましい。
　図１のフローに戻り、ステップＳ１における混合液の調製方法は特に限定されないが、生物学的試料と、抗体－リンカー複合体と、特定共重合体と、を混合する方法が挙げられる。生物学的試料が液状である場合、生物学的試料に、それ以外の成分を添加すればよい。抗体－リンカー複合体と、特定共重合体とを添加する順番は特に限定されず、抗体－リンカー複合体を添加した後に特定共重合体を添加しても、特定共重合体を添加した後に抗体－リンカー複合体を添加しても、抗体－リンカー複合体と特定共重合体とを一度に添加してもよい。
　生物学的試料に対する抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量としては特に限定されないが、例えば、検体（抗原タンパク質）の１ｍｇに対して、抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量として０．１ｍｇ以上であることが好ましく、０．５ｍｇ以上であることがより好ましく、１．０ｍｇ以上であることが更に好ましい。上限は特に制限されないが、一般に、５．０ｍｇ以下が好ましい。
　更に具体的には、検体を含む液体媒体（例えば、唾液等を含む）の１ｍＬに対して、抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量として０．１～１０．０ｍｇが好ましい。
　上記のとおり、生物学的試料に対する抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量は、検体（抗原タンパク質）の１ｍｇに対して、抗体－特定共重合体コンジュゲートの添加量として、０．１～５．０ｍｇ、０．５～５．０ｍｇ、又は、１．０～５．０ｍｇが好ましい。
　このとき、混合液に、遊離状態の特定共重合体（抗体とのコンジュゲートを形成していないもの）を更に添加してもよい。特定共重合体を添加することで、熱に対する応答をより鋭敏にし、より効率的に検体を濃縮することができる。特定共重合体の添加量としては特に制限されないが、抗体－共重合体コンジュゲートが含有する特定共重合体のモル基準の含有量を１としたとき、０．１～２０倍が好ましい。
　本ステップにおいて、混合液に含まれる検体は、特に限定されないが、生物学的試料から提供されるものであってよい。一形態としては、検体を含む生物学的試料をそのまま混合液に添加してもよい。
　一般に、生物学的試料には、多くの夾雑物が含まれている。一般的な核酸抽出においては、これを不活化したり、消化したりするために、タンパク質分解酵素等による処理が行われることが多い。
　しかし、本核酸抽出方法においては、タンパク質分解酵素の不存在下でも、抗体－共重合体コンジュゲートに検体が捕捉され、後述のステップＳ２で簡単に夾雑物から分離できるので、タンパク質分解酵素等による処理を行わなくても、十分な効率で核酸抽出が行える。
＜ステップＳ２＞
　図１のフロー図に戻り、次に、ステップＳ２として、ステップＳ１で得られた、検体と抗体－共重合体コンジュゲートとを含む混合液を加熱し、検体を捕捉させた抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、検体に内包される核酸を抽出する。この際、キャリア核酸の添加を行う必要はないが、添加してもよい。
　加熱の温度は特定共重合体のＬＣＳＴに応じて適宜調整されればよいが、２０～４０℃が好ましい。
　検体に内包される核酸を抽出するための一般的な手順には、タンパク質分解酵素による組織の溶解や不要な酵素の不活化、洗浄、フィルタリング、及び、成分の分画等が含まれる。何段階にもわたって操作を行う必要があり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＣＲ検査のための核酸抽出では、一般に、この処理に９０分程度かかる場合がある。また、種々の試薬を用いるために、１回の抽出操作に必要なコストが増大しがちである。
　一方、本核酸抽出方法によれば、驚くべきことに、タンパク質分解酵素の不存在下であっても、更には、キャリア核酸を使用しなくても、検体に内包される核酸を抽出できることを本発明者らは見出している。この機序は必ずしも明らかではないが、抗体－特定共重合体コンジュゲートが有する抗体との相互作用により検体が捕捉され、これを凝集させることにより、夾雑物の分離、及び、検体の濃縮が同時に行えるためだと推測される。
　本核酸抽出方法によれば、簡単な操作で、検体に内包される核酸を抽出することができる。
　具体的には、検体を捕捉した抗体－特定共重合体コンジュゲートを、加熱により凝集させ、固形分を遠心分離等により取得することで、夾雑物の除去と検体の濃縮とを併せて実施する。その後、取得した固形分に対し、公知の方法で検体に内包される核酸を放出させればよい。このような方法としては、特に限定されないが、例えば、シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いる方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２８　Ｎｏ．３，　ｐ．４９５－５０３　（１９９０））等が挙げられる。
　すなわち、カオトロピック剤の存在下で、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させ、その後、洗浄液で担体を洗浄し、そして、水、又は、低塩濃度緩衝液を用いて核酸を担体から溶出させる方法である。これらの方法は当業者にとって公知であり、また、市販のキットを使用することもできる。
　本核酸抽出方法により抽出された核酸は、核酸増幅に供することができる。
　検体から抽出したＤＮＡを増幅する方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の二本鎖ＤＮＡの熱変性工程を含む方法；ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ）、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ－ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のような二本鎖ＤＮＡの熱変性工程を含まない等温増幅法等が使用できる。
　検体から抽出したＲＮＡを増幅させる方法としては、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＲＣＲ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）等が使用できる。
［核酸増幅方法］
　核酸増幅方法の実施形態は、上記核酸抽出方法を用いて検体から核酸を抽出することと、抽出された核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることとを含む。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅方法は公知であり、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９，４８７－４９１（１９８８）等を参照して行うことができる。
　検体がＲＮＡウィルス等である場合、ＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅する前に、抽出したＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成するための逆転写反応を行うことができる。逆転写反応の方法は公知であるが、反応温度としては、耐熱性逆転写酵素が活性を示す温度であって、一形態としては、３５～９０℃が好ましい。なお、逆転写反応の時間は、合成されるｃＤＮＡの鎖長等を考慮して適宜設定することができる。
　なお、検体からのＲＮＡの抽出と、逆転写反応と、標的核酸の増幅反応は、順次行ってもよいし、連続して（１ステップで）行ってもよい。逆転写反応と標的核酸の増幅反応を連続して行う場合、耐熱性逆転写酵素、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＰＣＲに使用可能な各種のポリメラーゼが使用できる。また、耐熱性の逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。
　また、ｃＤＮＡの標的領域を増幅するためのプライマー対を使用することもできる。なお、この場合、プライマーの一方が、逆転写反応おける逆転写反応用プライマーと共用であってもよい。更に、標的核酸の領域が複数ある場合、そのために複数種のプライマー対を併用してもよい。
　本核酸増幅方法によれば、タンパク質分解酵素を用いなくても、簡便な操作で核酸抽出ができるため、ボトルネックが解消され、迅速に核酸増幅を実施できる。
［核酸抽出キット］
　核酸抽出キットの実施形態は、タンパク質分解酵素の不存在下で、検体から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出キットであって、特定共重合体を含む第１剤と、抗体－リンカー複合体を含む第２剤とを備える。
　第１剤は、例えば、容器と、容器に収容された特定重合体とを含んで構成され、特定重合体を含む固体状（例えば粉末状）であってもよいし、液状であってもよい。第１剤が液状である場合、特定重合体と、水（緩衝化剤を含む水溶液）とを含む形態が挙げられる。
　第２剤は、例えば、容器と、容器に収容された抗体－リンカー複合体とを含んで構成される。第２剤は、液状であってよく、抗体－リンカー複合体と、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）とを含む形態が挙げられる。第２剤中における抗体－リンカー複合体の含有量は特に制限されないが、０．０１～１００００μｇ／ｍＬが好ましい。
　第１剤と第２剤とを混合することで、抗体－共重合体コンジュゲートを生成できる。第１剤と第２剤との混合比は特に限定されないが、第２剤に含まれる（リンカーに結合された）抗体のモル基準（物質量基準）の含有量に対する、第１剤に含まれる特定共重合体のモル基準の含有量の比（抗体／特定共重合体）が、１～２００となるよう、調整されることが好ましく、１０～５０となるよう調整されることがより好ましい。
　なお、本核酸抽出キットに含まれる第１剤の全量と第２剤の全量とを混合したとき、抗体／特定共重合体が上記数値範囲となるよう、各剤の量が調整されていてもよい。
　本核酸抽出キットによれば、第１剤と第２剤と、検体とを含む混合液を調製して、抗体－共重合体コンジュゲートを生成した後、これを加熱することで、検体に含まれる核酸を濃縮・抽出できる。例えば、検体がＲＮＡウィルスである場合、ＲＮＡウィルスを含む唾液等に、第１剤と第２剤とを加えて反応させ、その後、加熱すると、抗体－共重合体コンジュゲートに捕捉されたＲＮＡウィルスが、抗体－共重合体コンジュゲートとともに凝集、沈殿する。これを固液分離することで、夾雑物（液相）が除去されるとともに、検体が濃縮される。その後、濃縮された検体から、ＲＮＡが抽出される。
　本核酸抽出キットによれば、タンパク質分解酵素の不存在下で、かつ、簡単な操作で核酸を抽出できる。また、検体（例えば、ＲＮＡウィルス）の含有量が少ない生物学的試料等からであっても、抗体－共重合体コンジュゲートが有する検体の捕捉、凝集機能によって、効率的に核酸抽出できる。
［ＰＣＲ検査キット］
　ＰＣＲ検査キットの実施形態は、上記核酸抽出キットを含んでいれば、他の構成要素（コンポーネント）は特に限定されない。他の構成としては、例えば、検体がＲＮＡウィルスである場合、ｃＤＮＡの合成のための逆転写酵素、リアルタイム検出用のプローブ、インタカレーター、緩衝剤、ｄＮＴＰ等のデオキシリボヌクレオチド類、界面活性剤、塩類、及び、プライマー等を含んでもよい。
　これらの成分の複数は、混合されてプレミックスとして提供されてもよい。
　本ＰＣＲ検査キットによれば、タンパク質分解酵素の不存在下で、生物学的試料等に含まれる検体から、簡単に核酸を抽出でき、更に、これを増幅することができる。本ＰＣＲ検査キットを用いることで、ＰＣＲ検査にかかる時間、及び、必要なコストを大幅に削減することができる。
　以下、非限定的な実施例により実施形態について更に詳細に説明する。
［特定共重合体の合成例］
・ＨＩＰＡＡｍの合成
　特定共重合体の合成のため、準備として「ＨＩＰＡＡｍ」を下記手順により合成した。なお、「ＨＩＰＡＡｍ」は、「Ｈｙｄｒｏｘｙ　ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ　ＡｃｒｙｌＡｍｉｄｅ」に由来する略語である。
　Ｄ，Ｌ－２－アミノ－１－プロパノール（０．１５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．１５ｍｏｌ）とを無水クロロホルムによく溶かし、５℃で２０分間撹拌した後、塩化アクリロイル（０．１５ｍｏｌ）をゆっくりと加え、５℃で２時間撹拌した。
　溶媒を蒸発させた後、２－プロパノールに再溶解し、－２０℃で２４時間以上保持した。最後にろ過して塩類を除去し、カラムクロマトグラフィーで濃縮、精製した。ＨＩＰＡＡｍが合成されたことは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と１Ｈ　ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（溶媒はＤ２Ｏ）で確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
・Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）の合成
　特定共重合体の前駆体化合物となる重合体として、「Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）」を以下の手順で合成した。
　Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）は、下記スキームに示すようにＨＩＰＡＡｍとＮＩＰＡＡｍ（構造は下記スキーム参照）とのＲＡＦＴ重合により合成した。ＮＩＰＡＡｍ　１．８９ｇ、ＨＩＰＡＡｍ　０．１１ｇ、ＡＩＢＮ　１．３１ｍｇ、ＣＤＴ（Ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｔｒｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）１２．７ｍｇ、及び、エタノール　１７．６ｍｌを含む溶液を２０℃で２０時間撹拌し、蒸発させて真空乾燥した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
・Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の合成
　特定重合体として、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を合成した。
　下記スキームのとおり、クリック反応部位を持つジベンジルシクロオクチン酸（ＤＢＣＯ－Ａｃｉｄ）をＨＩＰＡＡｍのヒドロキシ基に脱水縮合で導入し、クリッカブル応答性ポリマーＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）を得た。
　ＤＣＭ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）３０ｍｌ、ＤＢＣＯ酸３５．８ｍｇ、ＤＭＡＰ（４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）１２ｍｇ、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ）１００ｍｇ、ＤＣＣ（Ｎ′，Ｎ′－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２０ｍｇを含む溶液を一晩撹拌し、蒸発させて真空乾燥させた。
　得られたＰ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）の数平均分子量は２．０１×１０４であり、ＬＣＳＴは約３０℃だった。
　また、１Ｈ－ＮＭＲにより決定された繰り返し単位の含有量は、ＮＩＰＡＡｍ：ＨＩＰＡＡｍ：ＳＡＫＩＰＡＡｍ（いずれもモル基準）＝９６．４：１．２：２．４だった。なお、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）における「ＮＩＰＡＡｍ」の表記は、ＮＩＰＡＡｍに基づく単位を意味し、式１で表される単位に該当する。また、「ＨＩＰＡＡｍ」の表記も同様であり、式６で表される単位に該当する。また、「ＳＡＫＩＰＡＡｍ」の表記も同様であり、式２で表される単位に該当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
［抗体－リンカー複合体の合成］
　アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（Ａｚｉｄｏ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　（ＥＧ４）－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ、東京化成工業）粉末をＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解した。
　また、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（＞９５％、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ製、ａｎｔｉ－ＣＯＶＩＤ－１９　ａｎｔｉｂｏｄｙ　：　ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ　ＣＯＶＩＤ　１９　Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　（ＮＰ）　Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）に代えて、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｓ１－ＮＴＤ）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　＃５６９９６」（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、炭酸緩衝液（ＰＨ８．６）に分散させ、４℃で５時間撹拌し、抗体－リンカー複合体を合成した。
　なお、抗体／リンカー比は１：１００とした。
［生物学的試料の採取］
　生物学的試料は、エジプト肝臓研究教育病院の外来診療所において、２０２１年１０月から２０２２年４月の間に募集した患者（３２５人）から採取された。これらの患者には、ＣＯＶＩＤ－１９患者９２人（男性５０人、女性４２人）が含まれていた。すべての参加者から鼻咽頭スワブを採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検体輸送のための所定の輸送媒体で保存し、試験までの間、－８０℃で保存した。
　上記試験への参加基準は、以下のとおりとした。
・年齢１８歳以上
・書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があること。
・ＰＣＲ検査、又は、抗原検査により、ＣＯＶＩＤ－１９の陽性である者、陰性である者、又は、陽性疑いの者
　除外基準は、以下のとおりとした。
・年齢１８歳未満
・インフォームドコンセントに同意しない者
　上記研究プロトコルは、エジプト肝臓研究教育病院の研究倫理委員会によって承認されたものであり、研究のプロトコルと実施は、「ＣＩＯＭＳ／ＷＨＯ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｔｈｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｕｂｊｅｃｔｓ．　Ｇｅｎｅｖａ：　ＣＩＯＭＳ．　１９９３．」と、その修正版に準拠して、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントを得て実施された。
［実施例１］
　合成した特定共重合体、及び、抗体－リンカー複合体を用いて、タンパク質分解酵素の不存在下で、生物学的試料からウィルスＲＮＡを抽出した。その手順は以下のとおりである。
（手順１）
　まず、試料の９００μＬを抗体－リンカー複合体（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ　ＰＢＳ溶液）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）（抗体：特定共重合体比＝１：３０、Ｍｎ＝２．０１×１０４ｇ／ｍｏｌ）を、クリック反応により抗体－リンカー複合体に４℃で１時間コンジュゲートさせた。
　その後、混合液を２．０ｍＬマイクロチューブに移し、３７℃、１３，８００×ｇで５分間遠心分離を行った。濃縮沈殿物を回収し、上澄み液を破棄した。次に、ライシスチューブ（ＬＴ）に上記濃縮沈殿物と２００μＬＰＢＳとを添加した。
（手順２）
　更に、ここに２５０μＬのエタノール（９６－１００％）を加えた。
　およそ１５秒間撹拌（ボルテックス）した後、室温（１５－２５℃）で５分間インキュベートした後、遠心分離して液滴を除去した。
　次に、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を「ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム」に移し、６０００×ｇで１分以上遠心分離した。
　次に、ろ液が入った洗浄チューブを破棄し、５００μＬの「バッファーＡＷ１（キアゲン）」を加え、６０００×ｇで１分以上遠心分離した。次に、ろ液が入った洗浄チューブを破棄し、５００μＬの「バッファーＡＷ２（キアゲン）」を加え、６０００×ｇで１分以上遠心分離した。
　次に、ろ液が入った洗浄チューブを破棄し、５００μＬのエタノール（９６－１００％）を添加し、６０００×ｇで１分以上遠心分離した。次に、ろ液が入った洗浄チューブを捨て、ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムをクリーンな２ｍｌウォッシュチューブに移した（ＷＴ）。
　次に、約２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、メンブレンを乾燥させた。次に、「ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム」を新しい２ｍｌウォッシュチューブ（ＷＴ）に移した。次に、蓋を開け、５６℃で３分間インキュベートし、メンブレンを完全に乾燥させた。次に、「ＱＩＡａｍｐ　ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム」を溶出チューブ（ＥＴ）に移し、濾液を廃棄した。次に、２０－１５０μＬの「Ｂｕｆｆｅｒ　ＡＶＥ（キアゲン）」をメンブレンの中央に加え、室温で５分間インキュベートした。次に、約２０，０００×ｇで１分以上遠心分離した。
　上記手順により抽出したＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ（ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）試験に供した。具体的には、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ＤＮＡ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）」を用いてｃＤＮＡを合成し、「ＤＴｌｉｔｅ　リアルタイム　ＰＣＲ（ＤＮＡ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）」を用いて定量した。なお、サーマルサイクラーのプログラム等は、いずれも上記キットのマニュアルに従った。
［比較例１］
　特定共重合体、抗体－リンカー複合体を用いず、タンパク質分解酵素を用いて、実施例１と同様の生物学的試料からウィルスＲＮＡを抽出した。詳細な手順は、（手順１）を以下のとおりとしたことを除いては、実施例１の手順と同様である。
　まず、ライシスチューブ（ＬＴ）に２５μＬのＰｒｏｔｅａｓｅを添加した。次に、２００μＬの試料を、ライシスチューブに加えた。更に、２８μｇ／ｍＬのキャリアＲＮＡを含む「バッファーＡＬ（キアゲン）」の２００μＬを加え、およそ１５秒撹拌した。次に、ヒーティングブロック内で５６℃、１５分間インキュベートした後、遠心分離して液滴を除去した。その後の（手順２）は、実施例１と同様にした。
［参考例１］
　特定共重合体、抗体－リンカー複合体を用い、更に、タンパク質分解酵素を用いて、実施例１と同様の生物学的試料からウィルスＲＮＡを抽出した。詳細な手順は、実施例１における（手順１）を以下のとおり変更したことを除いては同様である。
　まず、試料の９００μＬを抗体－リンカー複合体（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ　ＰＢＳ溶液）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
　次に、Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＨＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＳＡＫＩＰＡＡｍ）（抗体：特定共重合体比＝１：３０、Ｍｎ＝２．０１×１０４ｇ／ｍｏｌ）を、クリック反応により抗体－リンカー複合体に４℃で１時間コンジュゲートさせた。
　その後、混合物を２．０ｍＬマイクロチューブに移し、３７℃、１３，８００×ｇで５分間遠心分離を行った。濃縮沈殿物を回収し、上澄み液を破棄した。
　次に、ライシスチューブ（ＬＴ）に２５μＬのＰｒｏｔｅａｓｅを添加した。ここに、上記濃縮沈殿物の入った試料の２００μＬを添加した。更に、２８μｇ／ｍＬのキャリアＲＮＡを含む「バッファーＡＬ（キアゲン）」の２００μＬを加え、およそ１５秒撹拌した。次に、ヒーティングブロック内で５６℃、１５分間インキュベートした後、遠心分離して液滴を除去した。その後の（手順２）は、実施例１と同様にした。
［結果］
　図２は、比較例１の方法、及び、参考例１の方法により抽出された核酸によるリアルタイムＰＣＲ法（「ＳＬＡＮ－９６Ｐ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ」）による定量結果である。
　図２の結果から、特定共重合体、及び、抗体－リンカー複合体を用いた参考例１による定量結果は、比較例１の定量結果の約１．５倍であり、特定共重合体、及び、抗体－リンカー複合体により検体が濃縮されることが明らかとなった。
　図３は、比較例１の方法、及び、実施例１の方法により抽出された核酸によるリアルタイムＰＣＲ法による定量結果である。実施例１による定量結果は、比較例１の定量結果の約３０倍であった。図３の結果から、タンパク質分解酵素、及び、キャリア核酸を使用しなくても、十分な感度で標的核酸を検出できることが明らかになった。

Claims (15)

  1. 　タンパク質分解酵素の不存在下で、
    　細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体と、
    　下記式１で表される繰り返し単位、及び、下記式２で表される繰り返し単位を含む共重合体と、
    　前記検体に結合する抗体、及び、下記式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体と、を含む混合液を調製し、
    抗体－共重合体コンジュゲートを生成させることと、
    　前記混合液を加熱し、抗体－共重合体コンジュゲートを凝集させ、前記検体に内包される核酸を抽出することを含む、核酸抽出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、Ｌ２は、２価の基を表し、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、複数あるＲ１は、それぞれ同一でも異なってもよく、その２個以上が互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～２４個のアルキル基、及び、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択され、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式３中、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表す）
  2. 　前記共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、前記式２で表される前記繰り返し単位の含有量が、１．０～３０．０モル％である、請求項１に記載の核酸抽出方法。
  3. 　前記式２で表される前記繰り返し単位が、下記式４で表される繰り返し単位、及び、下記式５で表される繰り返し単位からなる群より選択される少なくとも１種の繰り返し単位である、請求項１又は２に記載の核酸抽出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式４、及び、式５中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、式４中、Ｌ４は－Ｏ－、－Ｓ－、及び、－ＮＲ２－からなる群より選択される１種の基であり、Ｒ２は、水素原子、又は、炭素数が１～６個のアルキル基を表し、ｎは１～１０の整数を表し、式５中、Ｌ２は、２価の基を表す）
  4. 　更に、前記共重合体が、下記式６で表される繰り返し単位を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式６中、Ｘ６は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表す）
  5. 　前記共重合体の全繰り返し単位を１００モル％としたとき、前記式２で表される前記繰り返し単位の含有量が、２．０～３０．０モル％である、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  6. 　前記共重合体の数平均分子量が、５０００～５００００である、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  7. 　前記混合液中における前記抗体－リンカー複合体が含有する前記抗体の含有量に対する、前記共重合体の含有量のモル基準の比が、０．５～３０．０である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  8. 　前記抗体－共重合体コンジュゲートが、下記式１で表される繰り返し単位、及び、下記式７で表される繰り返し単位を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、式７中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、Ｌ２は、２価の基を表し、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表し、Ａｂは前記抗体の残基を表す）
  9. 　前記加熱が、前記混合液の温度を２０～４０℃に加熱することである、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  10. 　前記検体が脂質二重層を有する膜構造体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  11. 　前記検体がエンベロープウイルスである、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  12. 　前記検体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の核酸抽出方法を用いて、前記検体から前記核酸を抽出することと、
    　前記抽出された核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することと、を含む、核酸増幅方法。
  14. 　タンパク質分解酵素の不存在下で、細胞、細胞外小胞、及び、ビリオンからなる群より選択される少なくとも１種の検体から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出キットであって、
    　下記式１で表される繰り返し単位、及び、下記式２で表される繰り返し単位を含む共重合体を含む第１剤と、
    　前記検体に結合する抗体、及び、下記式３で表されるリンカーをアミド結合を介して結合させて得られる抗体－リンカー複合体を含む第２剤と、を備える、核酸抽出キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式１中、Ｘ１は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、式２中、Ｘ２は水素原子、又は、炭素数が１～６個の直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基を表し、Ｌ２は、２価の基を表し、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、炭素数が１～２４個のアルキル基、炭素数が２～２４個のアルケニル基、及び、炭素数が６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群より選択され、複数あるＲ１は、それぞれ同一でも異なってもよく、その２個以上が互いに結合して環を形成していてもよく、Ｒ５は、水素原子、ハロゲン原子、炭素数が１～２４個のアルキル基、及び、炭素数６～２４個の（ヘテロ）アリール基からなる群から選択され、Ｚは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ、及び、ＮＲ１からなる群より選択され、ａ′は、０～８の整数であり、ａ″は、０～８の整数であり、ａ′とａ″の和は１０未満である）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式３中、Ｌ３は、ヘテロ原子を有していてもよい２価の炭化水素基を表す）
  15. 　請求項１４に記載の核酸抽出キットを含むＰＣＲ検査キット。
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