JP4693944B2 - 核酸単離法 - Google Patents
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Description
本発明は水性媒体での核酸の精製の分野に属する。
サンプル内に存在する核酸を水性媒体内において精製する方法が文献WO-A-95/04140から知られており、それによると上記サンプルをシルカビーズから成る粒子系にカオトロピズム物質の存在下で接触させ、次いでビーズに付着した核酸を最終の水溶液から分離する。
文献F.Meunier等，Polymers for Advanced Technologies, 6:489-496,(1995)によると、重合開始剤の存在下で、(1)N-イソプロピルアクリルアミド、(2)N,N-メチレンビスアクリルアミド、そして(3)塩化2-アミノエチルメタクリル酸の重合による、PNIPAMと呼ばれるポリマーの調製が記述されている。この表面機能化ポリマーの挙動は、生物学的な分子の共有結合に特に適している。
文献EP-A-0 161 881は、N-アルキル-もしくはN-アルキレン-アクリルアミドまたはメタクリルアミドのモノマーと、アクリル酸もしくはメタクリル酸誘導体のモノマーの共重合によって得られるポリマーのような温度感受性ポリマーが、温度の関数として構造を変えるその能力によって、生物学的物質の単離に用いられ得ることを教示する。それは低温では開放構造をとり、生物学的物質の付着を促進し、高温では収縮した構造をとり、それが付着した生物学的物質の遊離を許容する。それゆえ生物学的物質の付着と遊離の段階のコントロールは、温度を変化させることによって実施可能である。よりよいコントロールとしては、pHをまた変化させることが可能である。
この文献で提案された使用は、サンプル内に存在する任意の生物学的物質の単離、特に核酸物質とタンパク質物質の単離に何の限定性もなく拡張される。
本発明によると、サンプル内に存在する核酸物質の選択的な単離法が提供される。サンプルが複雑で、タンパク物質および/または酵素反応の阻害剤を含んでいたとしてさえ、本発明のプロセスは核酸物質の単離を促進しながら、タンパク物質および/または上記阻害剤のいかなる単離をも制限し、または排除さえする。
サンプル内に存在する核酸物質の、本発明に係る水性相での単離方法は、以下の工程：
吸着試薬の製造工程(a)であって、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間、好ましくは30と40℃の間の所定の下部臨界溶解温度(LCST)を有している工程と、
接触工程(b)であって、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させる工程と、
(b)による接触のための吸着工程(c)であって、反応媒質に対して少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つの以下のパラメーターが選択される工程で、
・高くとも7に等しいpH
・高くとも10-2Mに等しいイオン強度
・ポリマーのLCST未満の温度
分離工程(d)であって、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、不連続相、特に核酸物質を吸着した不連続相を連続相から分離する工程と、
脱着工程(e)であって、10-2Mを越えるイオン強度までイオン強度を増大させて粒子状支持体から脱着により、核酸物質を引き離す工程、を含む。
有利には、脱着工程(e)で、pHと温度から選択される少なくとも一つのパラメーターを、加えて以下のように変化させる：
・7より高いpHまでpHを増大する。
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する。
本発明はまた、サンプル内に存在する核酸物質の水性相での単離法であって粒子状の支持体へ上記核酸物質を吸着させ、粒子状の支持体に吸着した核酸物質をその後の分析的ステップにおいて使用する工程を含んで成る方法にも関する。この方法は以下の工程：
吸着試薬の製造工程(a)であって、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間の所定の下部臨界溶解温度(LCST)を有している工程、
接触工程(b)であって、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させる工程、
(b)による接触のための吸着工程(c)であって、反応媒体に対し多くとも10-2Mに等しいイオン強度が選択される工程、
分離工程(d)であって、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、不連続相を連続相から分離する工程で、脱着工程が任意である工程を含んで成る。
後者の方法の好ましい実施態様に従うと、(b)による接触のための吸着工程(c)では、以下のパラメーターの少なくとも一つが加えて反応媒体のために選択される：
・高くとも7に等しいpH
・ポリマーのLCST未満の温度
もちろんこのプロセスは、分離工程(d)後に、イオン強度、pHそして温度から選択される少なくとも一つのパラメーターを以下のように変化させることによって、粒子状の支持体から脱着により核酸物質を引き離すことによる脱着工程を含んでもよい。
・10-2Mより高いイオン強度までイオン強度を増大する。
・7より高いpHまでpHを増大する。
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する。
少なくともイオン強度が好ましくは変化させられる。
本発明に係る上述の方法は好ましくは工程(a)と関連した二つの変形例にしたがって実施される。
実施例で説明する第一の変形例によると、粒子状の支持体が上記粒子状のポリマーよりなり、この場合架橋剤(類)(a)は水溶性である。
第二の変形例によると、粒子状の支持体は、加えて、上記粒子状ポリマーで完全にまたは部分的に被覆された有機または無機コアを含み、該コアは上記核酸物質に関してポリマーの吸着性を変えない。そしてそのコアまたはコア部分が架橋剤(2)の機能を果たし、水溶性架橋剤タイプのもう一つの架橋剤の提供を可能にする。例としてはコアはポリスチレンコアがあげられ、および/または磁性化合物を含んでもよい。
これらの方法の特定の好ましい実施態様によると、工程(b)の前または後に核酸物質と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも一つのプローブおよび/または一つのプライマーが、工程(b)の前のサンプルに、またはステップ(b)の後、特にステップ(c)またはステップ(d)の後の反応媒体に加えられる。
他の特定の実施態様によると、核酸物質はプローブまたはプライマーより成り、(b)と(c)で、吸着試薬がハイブリダイゼーション試薬を得るために上記核酸物質と接触せしめられ、それから(b’)において、吸着が起こり、反応媒体からハイブリダイゼーション試薬を分離したことが随意に観察された後、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長のために適したコンディションの下で、少なくとも一つの核酸または核酸断片を含む媒体と上記ハイブリダイゼーション試薬を接触させる。
有利には、粒子状ポリマーは、カチオン性または中性で、そして水溶性の重合開始剤の存在下でのフリーラジカル重合によって得られる。
第一のモノマー(1)は、好ましくは、N-アルキルアクリルアミドとN,N-ジアルキルアクリルアミドから、より詳しくはN-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、N-メチル-N-n-プロピルアクリルアミドから選択され、第一のモノマーは好ましくはN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)である。
第二の機能的なモノマー(類)は、好ましくはアクリル酸とメタクリル酸誘導体、塩化2-アミノエチルメタクリル酸(AEM)、N-ビニルピリジン誘導体、トリアルキルアンモニウム誘導体、および塩化イソチオウロニウム誘導体から選択される。
有利には、水溶性架橋剤(2)は、N,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)、エチレングリコールジメタクリラートから選択され、そして重合開始剤は塩化2,2’-アゾビスアミジノプロパン(V50)である。
分離工程(d)は、好ましくは遠心分離、濾過、沈殿、沈降、そして磁場の応用から選択される方法にしたがって実施される。
分離工程(d)の前に、吸着反応が生じることが随意に観察できる。例として、HPLCや細管電気泳動法を用いることができる。
より詳細に本発明を開示する前に、本記述と請求項で用いられるいくつかの語句を以下に定義する。
本発明において核酸物質の単離とは、質的なおよび/または量的な手法による特異的または非特異的な単離法にしたがった、この物質の分離、検出、核酸物質の画分の濃縮を意味する。
本発明において核酸物質とは、核酸、核酸断片、核酸および/または核酸断片の混合物、または核酸および/または核酸断片の画分である。核酸は細胞、細菌、またはウィルス由来等に関わらず、あらゆる種類の核酸、遊離した状態または随意にタンパク質と複合した状態を意味するものと理解される。それは、その構成要素が糖、リン酸基、そしてアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンから選択される窒素塩基である天然のヌクレオチドの配列、および/または三つの構成要素の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチドより成る；修飾が塩基レベルで起き、例えば、イノシン、5-メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、5-ジメチルアミノデオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、5-ブロモデオキシウリジンのような修飾塩基と、例えばビオチンによって修飾された塩基のような、当業者に既知の技術によって直接または間接に検出可能なトレーサーによって修飾された塩基のような修飾塩基を生じる；糖のレベルでは、主にポリアミドによって、少なくとも一つのデオキシリボースが置換されたもの；および/またはリン酸基のレベルでは、例えば特に二リン酸エステル、アルキル-とアリルリン酸エステル、そしてアリルモノチオリン酸エステルから選択されたエステルによって置換されたものである。本発明に係る核酸は、完全にまたは部分的に一本鎖および/または二本鎖であり、特にプローブ-核酸、プローブ-核酸断片、プライマー-核酸またはプライマー-核酸断片の二重鎖より成り得、二重鎖はホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る。
本発明は、もちろん、様々なサイズの上述のように定義された核酸の断片、またはオリゴヌクレオチド(ODN)の単離に適用される。
核酸物質は、天然由来、および/または遺伝学的な組換えによって得られたもの、および/または化学的合成によって得られたものであろう；例として、それはプローブまたはプライマーより成る。
本発明は、サンプル内に含まれる核酸および/または核酸断片の画分の非特異的単離に適用されるが、サンプル内に存在する核酸や核酸断片、または核酸の混合物や核酸断片の混合物の特異的単離にもまた応用できる。
本発明で理解されるサンプルとは、核酸物質を含むことが可能な任意のサンプル、特に生物学的液体、食物由来のサンプルのような生物学的サンプルを含む。該サンプルは全体的または部分的なサンプルより成ってもよく、特にそれは部分標本、希釈液より成るかもしれない。そのサンプルは前処理、特に核酸の遊離を促進するための精製や溶解を受けていてもいなくてもよい。
本発明の主題のもののようなポリマーのLCSTは、特に以下の文献に記述された技術によって定義されて測定される：Hiroshi Inomata等，Macromolecules 1994,27,6459-6464。
プローブは、ヌクレオチド断片とハイブリダイゼーション複合体を形成するための所定のコンディションの下で、ハイブリダイゼーション特異性を持ったヌクレオチド断片である。本発明の枠組み内で用いられるプローブは好ましくはキャプチャープローブ(capture probe)であるが、他のタイプのプローブを用いることもできる。
本発明によるプライマーは、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、いわゆるNASBA法(「核酸配列ベース増幅」(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification))、または代わりにいわゆるTMA法(転写介在性増幅(Transcription Mediated Amplification))のような増幅法、シークエンシングのような伸長過程、逆転写法等の酵素的な重合の開始のための所定のコンディションの下でハイブリダイゼイション特異性を持つプローブを意味する。
本発明ではアクリルアミド誘導体は、R0-CH=C(R1)-CONR2R3の式に相当する重合性モノマーを意味するものと理解され、ここでR0,R1,R2,そしてR3が水素、脂肪族または環状、直鎖状または分枝状の低級炭化水素基、イミダゾールのような窒素含有複素環基から独立に選択される基を表す。
本発明における理解では核酸物質の吸着とは、以下のように定義される：上記物質と粒子状の支持体の一定期間の接触の後、核酸物質の構成成分に属する基少なくとも一つが支持体の表面に付着したならば、核酸物質が粒子状の支持体に吸着される；吸着は物質と支持体間のイオンの相互作用、および/または水素結合、そしてあるいは疎水性の相互作用から由来し、いかなる共有結合も除かれる。
最後に、機能化したポリマーとは、核酸物質の構成成分の基と、吸着現象に関与する相互作用、および/または結合のどれか一つを生じることが可能な官能基を携えた少なくとも一つの界面を持つポリマーを意味する。好ましくはこれらの官能基は、NH3 +;NH4 +;NR3 +から選択され、あるいはRは脂肪族か環状、飽和か不飽和炭化水素基を表し、NR3 +がピリジニウム基;そしてイソチオウロニウム基を表すことも可能である。
本発明を以下に示す実施例1から6と図1から7を参照して説明する。
図1はpHと温度によるポリマーの界面の変動を表す。
図2はpHと温度のRNAの吸着に対する効果を表す。
図3は40℃でのpHのBSAの吸着に対する効果を表す。
図4はイオン強度と温度のRNAの吸着に対する効果を表す。
図5は20℃でのpHのRNA脱着に対する効果を表す。
図6は40℃でのpHのRNA脱着に対する効果を表す。
図7は20℃でpH9.2でのイオン強度のRNA脱着に対する効果を表す。
図2から4において、Ns値はポリマーに付着した生物学的存在の量に相当し、ポリマーのミリグラム当たりに付着した生物学的分子のミリグラムを表す。
図5から7において、Ns値は実施例2に従って以前に粒子に吸着したRNAの量に対しての、遊離RNA(フリーNs)または非遊離RNA(残余Ns)のパーセンテージに相当する。以下の実施例が例示するように、吸着工程(c)の間のpH、イオン強度、および/または温度条件は決定的に重要である。実際、図1で観察できるように、7と等しいpH値以下で温度がポリマーのLCST未満の値であると、ポリマーは荷電した親水性の尾を持ち、その一方で7と等しいpH値を越え温度がLCSTより高い値であると、ポリマーは疎水性で中性の収縮した構造を示し、それが核酸の吸着の減少と、同時にタンパク質の吸着の増大を引き起こす。
実施例1:NIPAMベースポリマーの調製
このポリマーの調製のため三つの重合法を用いた：
1)バッチ重合法(または閉反応器法)
2)半連続重合法
3)シード上での重合(polymerization on a seed)
これらの技術のそれぞれにおいて、以下の同じ試薬を用いた。
・第一のモノマー：Kodakで市販されているN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)
・架橋剤：Aldrichから入手可能なN,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)
・開始剤：Wakoで市販されている塩化2,2’-アゾビスアミジノプロパン(V50)
・イオン強度調節用塩：NaCl(Prolabo)
・機能的な第二のモノマー：Kodakで市販されている塩化2-アミノエチルメタクリル酸(AEM)
1)バッチ重合法
熱の影響の下で分解し、フリーラジカルを作り出す開始剤(V50)の添加により重合を開始する前に、第一のモノマー(NIPAM)、機能的な第二のモノマー(AEM)、そして架橋剤(MBA)を単一のステップで一緒に導入した。重合の継続時間は30分である。
得られるポリマーの組成は、参照符号PNIPAM42と与えられているが、以下の通りである：
全容量(a) 250ml
NIPAM 48.51mmol
MBA 3mmol
AEM 0.48mmol
V50 0.30mmol
温度 70℃
(a)沸騰脱気水
得られたポリマーの特性を以下の表Iに示す。
2)半連続重合法
重合の始めとそれらの全転換の終わりの間の期間中、機能的な第二のモノマーを反応器に導入する。この添加は一定速度の注入で実施することができ(連続添加による重合)、または代わりに規則的な間隔での十分に制御された添加による(半連続重合)。この重合法の目的は重合の進行を中断させるであろう反応媒体中の水溶性ポリマーのパーセンテージを増大させることなく、機能的な第二のモノマー(電荷している)の取り込みを増大することにある。
得られたポリマーの組成は、参照符号PNIPAM45と与えられているが、以下の通りである：
全容量(a) 250ml
NIPAM 48.51mmol
MBA 3mmol
AEM 0.48mmol
V50 0.30mmol
温度 70℃
添加 3から6分の間
(a)沸騰脱気水
得られるポリマーPNIPAM45の特性は以下の表IIに表されている。
3)シード上での重合
この技術は事前に準備され完全に特徴付けられたポリマーを含む反応媒体に、機能的な第二のモノマーを導入することから成る。機能的な第二のモノマーは一つのステップまたは半連続的に、単独で加えられるか、またはモノマー(類)やコモノマーと混ぜることが可能である。
得られるポリマーの組成は、参照符号PNIPAM94と与えられているが、以下の通りである：
4.5%の固体濃度を持つ40mlの容量のシードを用いる。試薬は5mlの容量の水で希釈して加えられた。第二の工程で加えられるNIPAM、MBA、そしてV50のモルパーセンテージは、シードのもの(1参照)と同一である。一方、機能的な第二のモノマーの濃度がコントロールされる(望ましい電荷密度にしたがって増減される)；この場合10%(モル)のAEMが、第一のモノマーNIPAMに比例して加えられる。
参照符号PNIPAM93の下で記録され、1)で記述された方法にしたがって合成されたシードを用いた再添加の後に得られたポリマーPNIPAM94の特性は以下の表IIIに表されている。
重合の最後に、遠心分離によって粒子を単に収集し、水または望ましい媒体に再分散する。
1)から3)の技術のいずれか一つにより得られたポリマーの特性は以下の通りである：
・5から150μmol/gの間のポリマーの電荷密度(カチオンの)
・20℃での動的光散乱法により測定された粒子の直径が、0.05から2μmの間の範囲の粒子径
・20℃では0.001から1.5mol/lのNaClで、40℃では0.01から0.9mol/lのNaClの間にある凝集のための臨界濃度の範囲
実施例2:実施例1により調製されたPNIPAMの粒子へのRNAまたはBSA(ウシ血清アルブミン)の吸着
以下のプロトコールが吸着反応のための一般的方法を構成する。
反応混合物は10μlのRNA(4mg/ml)または50μlのBSA(5mg/ml)、そして50μlのN-IPAM粒子(45g/l)より成る。望ましいイオン強度とpHに到達するためにリン酸塩バッファー(10mM,pH4.6または9.2)とNaCl(5M)を加えることにより、1ミリリッターの最終容量が得られる。
分子存在物(RNAまたはBSA)は、所定のコンディション(pH、イオン強度)で(20または40℃で)で2時間以上で粒子に吸着する：混合物を1分当たり14,000回転で20分遠心分離する。上清を回収し、懸濁液中のポリマー粒子を分離するためミリポアーフィルターMillex-GV13(0.22μm)を用いて濾過する。ポリマー支持体に付着した生物学的存在物の量は、始めに導入した量と、残余の遊離している量(上清をアッセイする)の間の単純な相違によって測定される：この量はポリマーのミリグラム当たりの生物学的分子のミリグラムにより表される(Ns)。RNAまたはBSAの濃度は、それぞれ260nmと280nmの波長によるUV分光光度計(Kontron Instrument)によって推定される。
E.coliの16Sと28SリボソームRNA(Boerhinger)とBSA(Sigma参照符号A0281)を事前の精製なしで用いてテストを実施した。
用いた粒子はPNIPAM94の熱感受性粒子である。これらの粒子は室温では非常に親水性で、LCST(32℃)以上の温度では疎水性である。それらは実施例1に記述されたように合成された。
酸性リン酸塩バッファー(KH2PO4 10mM pH4.6)と中性リン酸塩バッファー(K2HPO4 10mM pH9.2)を吸着反応と反応のpH調節のため用いた。
NaCl(5M)を反応のイオン強度調節のため用いた。
全ての反応で用いられる水はMillipore-MilliQ精製システムで精製した。
インキュベーションはサーモミキサー(Eppendorf 5436)で実施した。
全ての反応は1.5mlエッペンドルフチューブで実施した。
1)pHと温度の吸着に対する影響の研究
図2によれば、RNAのよりよい吸着は中性のpHより酸性のpHで観察される。酸性のpHでは、粒子は広く正に帯電し、負に帯電した核酸は静電気力によって粒子に付着する。付着は40℃より20℃の方がより起こりやすい。40℃での結果は吸着の減少を例示する。
図3によれば、粒子へのBSAの吸着はpHの影響を受けないで可能である。20℃では、この温度での粒子の親水性の性質のため、BSAの付着は観察されなかった。
2)イオン強度と温度の吸着に対する影響の研究
図4によれば、負に帯電したRNAと正に帯電したポリマー表面の間の吸引性のある静電気力は、イオン強度の増大と共に減少し、結果としてRNAの付着が減少する。
同じ実験条件の下で、イオン強度の増大が粒子へのBSAの付着を促進しないことが確かめられた。
結論として、核酸は好ましくはLCST(20℃)未満の温度、低いイオン強度、そして酸性pHで粒子に吸着する。これらのコンディションの下では、タンパク質(BSAのような)の吸着は好まれない。
実施例3:PNIPAMポリマーの粒子へ吸着したRNAの脱着
用いられる試薬は実施例2で記述されたものと同様である。
以下のプロトコールが脱着反応のための一般的方法を構成する。
実施例2で実施された吸着ステップの後、一分当たり14,000回転の遠心分離工程後に脱着反応が実施される。上清を取り除き、望ましいpHとイオン強度を得るため1ミリリッターの脱着バッファー(リン酸塩(10mM pH4.6または9.2)とNaCl(5M))に置き換える。脱着は20℃または40℃で2時間実施される。それから混合物を一分当たり14,000回転で20分遠心分離する。上清を回収し、懸濁液中のポリマー粒子を分離するためミリポアーフィルターMillex-GV13(0.22μm)を用いて濾過する。遊離したRNAの量は、260nmの波長によるUV分光光度計(Kontron Instrument)によって測定される。回収した核酸は他の解析に利用できる。
1)pHと温度のRNAの脱着に対する影響の研究
図5によれば、中性pHでの核酸の脱着はポリマーの電荷の欠如のためより起こりやすい；酸性pHでは、その時粒子は高く正に帯電しているので遊離する核酸の量はずっと低い。
図6によれば、上述のように核酸の脱着は中性のpHで促進される。それはまた、温度をLCST(32℃)以上にすると粒子は収縮するので、温度の増大によっても促進される。
2)イオン強度のRNAの脱着に対する影響の研究
図7によれば、イオン強度が増大するにつれRNAとポリマー表面の吸引性のある静電気の相互作用が減少する。
結論として、核酸の脱着は好ましくは40℃、高いイオン強度、そして中性pHでなされる。
さらに、40℃(LCSTより高い温度)での粒子の収縮性質は、核酸溶液を濃縮することに対して促進可能である。実際、核酸物質の脱着とLCST以上の温度の上昇の後核酸を吸着する粒子は収縮し、それゆえ緩んだ状態にあるものより小さい体積を占め、遠心分離の後より小さい最終体積で粒子を回収することが可能となる。
実施例4:NIPAMを用いたDNAとRHAの混合溶液からのDNAの吸着と脱着
Short Protocols in Molecular Biology第二版編：Harvard Medical School,1992,pp.2-4/2-7内のD.Trecoにより記述されたプロトコールにしたがって、Stap hylococcus epidermidisのDNA溶液を細菌から単離したコロニーから抽出し精製する。
milliQ水中の10%(w/v)BSA(ウシ血清アルブミン)溶液(Intergen3210-01)を用いる。
PCRプロトコール：以下のPCR法は、PCR Strategies編：Innis, Gelfand and Sninsky Academic Press 1995,pp.17-31内のGoodmanにより記述されたものである。二つの増幅プライマーを用いた。それらは以下のようなシークエンスをもつ。
プライマー1：
プライマー2：
以下のような温度サイクルを増幅プロトコールの間用いた。
10μlの増幅産物を事前にエチジウムブロマイドで染色した0.8%アガロースゲル(FMC 50003)上に沈殿させる。180Vで45分の電気泳動のイオン移動の後、核酸バンドを紫外線放射の下で明視化する(Short Protocols in Molecular Biology第二版編：Harvard Medical School,1992,pp.2-13/2-14内のD.Voytas)。
1)粒子へのDNAの吸着と脱着、そして遊離したDNAのPCR法後の検出
DNA溶液(1010コピー/ml)を20℃、pH4.6で2時間粒子に吸着させ、実施例2と3それぞれに記述されたような41℃、pH8.3、イオン強度0.05Hで15分の吸着ステップを受けさせた。吸着ステップと遠心分離の後、50μlの上清に回収した物質をPCRにより増幅させ、0.8%アガロースゲル上で分析した。期待されたサイズ(490pb)のバンドがゲル上で検出された。さらに、PCR後に検出されたDNAの量は、106コピー/mlのDNAのPCR増幅後に検出されたものと少なくとも同等であり、事前に粒子に吸着されたものではなかった。
NIPAM94の粒子はそれゆえDNAを吸着するのにも使用できる。脱着後、DNAはPCRタイプの増幅反応に用いることができる。
2)DNAとBSAの混合溶液からのDNAの吸着と、脱着により遊離したDNAのPCR法後の検出
10%(w/v)のBSAの存在下のDNA溶液(1010コピー/ml)が実施例4-1に記述されたような吸着と脱着ステップを受ける。同じ増幅法と検出法が用いられる。期待されたサイズのDNA(490pb)がゲル上で検出される。明視化されたDNAバンドの強度はBSAの存在、非存在で同様である。
NIPAM94の粒子はDNA-10%BSA混合溶液由来のDNAの吸着と、脱着による遊離を可能にする。始めの溶液内のBSAの存在は、粒子へのDNAの吸着を中断しない。
実施例5：NIPAMの粒子を用いた細菌溶解産物(Staphylococcus epidermidis)由来の核酸の精製
1)細菌溶解産物の調製
Staphylococcus epidermidisのカルチャーを37℃オーバーナイトで構成する。懸濁液中に含まれる細菌の数は550nmの光学濃度を測定することによって推定される。それぞれ2.106,2.104,そして2.101の細菌を含む細菌ペレットを14,000回転で3分の遠心分離で1.5mlチューブに調製する。上清は除去し、以下に記述する技術にしたがって細菌ペレットを溶解する(Arora等，J. Dairy Sci.1990,73,264-273の翻案)。
ペレットは6mg/mlのプロテイナーゼK(boehringer)と300μlのグラスビーズを含む1mlのバッファー(30mM Tris,100mM NaCl,5mM EDTA,pH7.2)内に集められる。この混合物をボルテックスで攪拌し、37度、15分間インキュベートする。遠心分離ステップ(14,000回転で3分)の後、核酸を含む上清を次なる段階のため回収する。
2)核酸の精製
用いられる粒子はその合成が実施例1に記述されているPNIPAM94の熱感受性粒子である。
以下のプロトコールは精製反応のための一般的方法を構成する。
反応混合物は、それぞれ105,103,そして106の細菌を含む50μlの細菌溶解産物と、2mgの粒子より成る。1ミリリットルの最終容量は、リン酸バッファー(10mM,pH4.6)で反応容量を調節して得られる。反応はサーモミキサー(Eppendorf 5436)で20℃で30分間インキュベートさせる。一分当たり14,000回転で20分間の遠心分離ステップの後、上清を取り除く。粒子に付着した核酸の脱着は、50μlのエルーションバッファー(elution buffer)(0.5M KCl,pH8.3)を加えることによりイオン強度の影響によって実施する；反応はサーモミキサーで42℃で15分間インキュベートさせる。一分当たり14,000回転で20分間のさらなる遠心分離ステップの後、核酸を含む上清を回収する；10μlをDNA増幅ステップ(PCR)のために用い、5μlをRNA増幅ステップ(NASBA)のために用いる。
3)核酸の検出
精製された核酸を酵素的な増幅ステップ(DNAならPCR、RNAならNASBA)の後分析する。それから増幅産物はELOSA(Enzyme Linked Oligo Sorbent Assay)、ミクロプレート(NASBA)、VIDAS(PCR)法によって明らかにされる。
PCRプロトコール：以下のプロトコールは実施例4で記述されたものと同一である。増幅産物(90μl)を、Habilat等，J.Clin.Microbiol;1994,32,2702-2705によって記述されたプロトコールにしたがって、自動バイダス免疫分析器(bioMeriuex)で分析し、キャプチャープローブと検出プローブは以下の通りである。
キャプチャープローブ：
検出プローブ：
検出プローブはアルカリフォスファターゼと接合しておく。
NASBAプロトコール：プロトコールはKievits等，J.Virol.Methods(1991)35,273-286に記述されたものと同一である。用いられるプライマーは以下のシークエンスを持つ。
プライマー1：
プライマー2：
増幅産物(5μl)をMallet等，J.Clin.Microbiol.(1993)31,1444-1449に記述されたプロトコールにしたがって、ミクロプレート形式(microplate format)でElosa法を用いて分析する。キャプチャープローブと検出プローブは以下のシークエンスを持つ：
キャプチャープローブ：
検出プローブ
検出プローブはセイヨウワサビペルオキシダーゼと接合しておく。
プロテイナーゼKは増幅反応の阻害剤として知られているが、1/10の連続的な希釈を得られる増幅の程度を測定するために増幅ステップの前に実施する。
得られた結果は付属書類中の表IVに整理されている。
増幅ステップの前にサンプルを1/1000に希釈することが必要であるため、プロテイナーゼKの阻害力をチェックする。増幅ステップ後、増幅前の1/10だけサンプルを希釈するが、それは100のファクターの増大を表す。粒子はサンプル内に連帯して存在するRNAとDNAの精製が可能である。これらの核酸は酵素的な増幅ステップで両立できる。
実施例6:磁気コアに融合されたNIPAMポリマーを用いた細菌溶解産物(Staphylococcus epidermidis)由来の核酸の精製
前述の実施例に記述された粒子は、吸着と脱着ステップの後の遠心分離ステップの調節に不都合がある。これらのステップは長く(20分が二回)、そして自動的にするのは難しい。可能な変更はNIPAMポリマーをカチオンの磁気コアに融合することである。試験された支持体の一つはカチオン磁気ラテックスR95-07(Estapor,Rhone-Poulenc)であり、その粒子は多分散である。
それゆえ得られた粒子の精製能が試験された。
1)Nipamの磁気粒子の合成
カチオンエスタポアー粒子R95-07をカプセル化した。各カプセル化の前に、粒子を0.005Mの塩酸溶液で3回洗った。
シード粒子の1gを、事前に沸騰した温度まで温められ窒素で脱気した40mlのmilliQ水に希釈した。
スチレン： 100μg
NIPAM： 0.3254g
BAM： 0.0274g
MAE： 0.0740g
トリトンX-405： 0.14g
V50： 0.0061g
コアへの修飾前ステップ(70℃で2時間)のための100μgのスチレン、NIPAM,BAM,MAEを10mlの水に可溶化し、シード(エスタポアーラテックス)に導入する。1mlの水に可溶化した開始剤を、シード粒子の周りへの重合を許容するために加える。重合は70℃の窒素雰囲気の下で実施される。
そしてこれらの粒子は、粒子のサイズ分散を修正しないと、220の電荷と粒子グラム当たり82μモルのNH2をもつ。
2)核酸の精製
用いられるプロトコールは実施例5に記述されたものに以下の修正を加えたものと同一である。
・200μgの粒子を用い
・粒子を上清と分離するための遠心分離ステップを取り除き、磁場の影響の下での分離ステップに置き換える(磁気分離装置、promega Z5342)。
全ての他のステップは電荷していないままである。
結果は付属書類中の表Ｖに整理されている。
増幅ステップの前にサンプルを1/1000に希釈することが必要であるため、プロテイナーゼKの阻害力を再びチェックする。増幅ステップ後、増幅前の1/10(PCR)または1/100(NASBA)にサンプルを希釈することが可能だが、それは10から100のファクターの増大を表す。これらの粒子もサンプル内に連帯して存在するRNAとDNAの精製が可能である。これらの核酸は酵素的な増幅ステップで両立できる。
サンプル内に存在する核酸を水性媒体内において精製する方法が文献WO-A-95/04140から知られており、それによると上記サンプルをシルカビーズから成る粒子系にカオトロピズム物質の存在下で接触させ、次いでビーズに付着した核酸を最終の水溶液から分離する。
文献F.Meunier等，Polymers for Advanced Technologies, 6:489-496,(1995)によると、重合開始剤の存在下で、(1)N-イソプロピルアクリルアミド、(2)N,N-メチレンビスアクリルアミド、そして(3)塩化2-アミノエチルメタクリル酸の重合による、PNIPAMと呼ばれるポリマーの調製が記述されている。この表面機能化ポリマーの挙動は、生物学的な分子の共有結合に特に適している。
文献EP-A-0 161 881は、N-アルキル-もしくはN-アルキレン-アクリルアミドまたはメタクリルアミドのモノマーと、アクリル酸もしくはメタクリル酸誘導体のモノマーの共重合によって得られるポリマーのような温度感受性ポリマーが、温度の関数として構造を変えるその能力によって、生物学的物質の単離に用いられ得ることを教示する。それは低温では開放構造をとり、生物学的物質の付着を促進し、高温では収縮した構造をとり、それが付着した生物学的物質の遊離を許容する。それゆえ生物学的物質の付着と遊離の段階のコントロールは、温度を変化させることによって実施可能である。よりよいコントロールとしては、pHをまた変化させることが可能である。
この文献で提案された使用は、サンプル内に存在する任意の生物学的物質の単離、特に核酸物質とタンパク質物質の単離に何の限定性もなく拡張される。
本発明によると、サンプル内に存在する核酸物質の選択的な単離法が提供される。サンプルが複雑で、タンパク物質および/または酵素反応の阻害剤を含んでいたとしてさえ、本発明のプロセスは核酸物質の単離を促進しながら、タンパク物質および/または上記阻害剤のいかなる単離をも制限し、または排除さえする。
サンプル内に存在する核酸物質の、本発明に係る水性相での単離方法は、以下の工程：
吸着試薬の製造工程(a)であって、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間、好ましくは30と40℃の間の所定の下部臨界溶解温度(LCST)を有している工程と、
接触工程(b)であって、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させる工程と、
(b)による接触のための吸着工程(c)であって、反応媒質に対して少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つの以下のパラメーターが選択される工程で、
・高くとも7に等しいpH
・高くとも10-2Mに等しいイオン強度
・ポリマーのLCST未満の温度
分離工程(d)であって、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、不連続相、特に核酸物質を吸着した不連続相を連続相から分離する工程と、
脱着工程(e)であって、10-2Mを越えるイオン強度までイオン強度を増大させて粒子状支持体から脱着により、核酸物質を引き離す工程、を含む。
有利には、脱着工程(e)で、pHと温度から選択される少なくとも一つのパラメーターを、加えて以下のように変化させる：
・7より高いpHまでpHを増大する。
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する。
本発明はまた、サンプル内に存在する核酸物質の水性相での単離法であって粒子状の支持体へ上記核酸物質を吸着させ、粒子状の支持体に吸着した核酸物質をその後の分析的ステップにおいて使用する工程を含んで成る方法にも関する。この方法は以下の工程：
吸着試薬の製造工程(a)であって、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間の所定の下部臨界溶解温度(LCST)を有している工程、
接触工程(b)であって、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させる工程、
(b)による接触のための吸着工程(c)であって、反応媒体に対し多くとも10-2Mに等しいイオン強度が選択される工程、
分離工程(d)であって、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、不連続相を連続相から分離する工程で、脱着工程が任意である工程を含んで成る。
後者の方法の好ましい実施態様に従うと、(b)による接触のための吸着工程(c)では、以下のパラメーターの少なくとも一つが加えて反応媒体のために選択される：
・高くとも7に等しいpH
・ポリマーのLCST未満の温度
もちろんこのプロセスは、分離工程(d)後に、イオン強度、pHそして温度から選択される少なくとも一つのパラメーターを以下のように変化させることによって、粒子状の支持体から脱着により核酸物質を引き離すことによる脱着工程を含んでもよい。
・10-2Mより高いイオン強度までイオン強度を増大する。
・7より高いpHまでpHを増大する。
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する。
少なくともイオン強度が好ましくは変化させられる。
本発明に係る上述の方法は好ましくは工程(a)と関連した二つの変形例にしたがって実施される。
実施例で説明する第一の変形例によると、粒子状の支持体が上記粒子状のポリマーよりなり、この場合架橋剤(類)(a)は水溶性である。
第二の変形例によると、粒子状の支持体は、加えて、上記粒子状ポリマーで完全にまたは部分的に被覆された有機または無機コアを含み、該コアは上記核酸物質に関してポリマーの吸着性を変えない。そしてそのコアまたはコア部分が架橋剤(2)の機能を果たし、水溶性架橋剤タイプのもう一つの架橋剤の提供を可能にする。例としてはコアはポリスチレンコアがあげられ、および/または磁性化合物を含んでもよい。
これらの方法の特定の好ましい実施態様によると、工程(b)の前または後に核酸物質と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも一つのプローブおよび/または一つのプライマーが、工程(b)の前のサンプルに、またはステップ(b)の後、特にステップ(c)またはステップ(d)の後の反応媒体に加えられる。
他の特定の実施態様によると、核酸物質はプローブまたはプライマーより成り、(b)と(c)で、吸着試薬がハイブリダイゼーション試薬を得るために上記核酸物質と接触せしめられ、それから(b’)において、吸着が起こり、反応媒体からハイブリダイゼーション試薬を分離したことが随意に観察された後、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長のために適したコンディションの下で、少なくとも一つの核酸または核酸断片を含む媒体と上記ハイブリダイゼーション試薬を接触させる。
有利には、粒子状ポリマーは、カチオン性または中性で、そして水溶性の重合開始剤の存在下でのフリーラジカル重合によって得られる。
第一のモノマー(1)は、好ましくは、N-アルキルアクリルアミドとN,N-ジアルキルアクリルアミドから、より詳しくはN-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、N-メチル-N-n-プロピルアクリルアミドから選択され、第一のモノマーは好ましくはN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)である。
第二の機能的なモノマー(類)は、好ましくはアクリル酸とメタクリル酸誘導体、塩化2-アミノエチルメタクリル酸(AEM)、N-ビニルピリジン誘導体、トリアルキルアンモニウム誘導体、および塩化イソチオウロニウム誘導体から選択される。
有利には、水溶性架橋剤(2)は、N,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)、エチレングリコールジメタクリラートから選択され、そして重合開始剤は塩化2,2’-アゾビスアミジノプロパン(V50)である。
分離工程(d)は、好ましくは遠心分離、濾過、沈殿、沈降、そして磁場の応用から選択される方法にしたがって実施される。
分離工程(d)の前に、吸着反応が生じることが随意に観察できる。例として、HPLCや細管電気泳動法を用いることができる。
より詳細に本発明を開示する前に、本記述と請求項で用いられるいくつかの語句を以下に定義する。
本発明において核酸物質の単離とは、質的なおよび/または量的な手法による特異的または非特異的な単離法にしたがった、この物質の分離、検出、核酸物質の画分の濃縮を意味する。
本発明において核酸物質とは、核酸、核酸断片、核酸および/または核酸断片の混合物、または核酸および/または核酸断片の画分である。核酸は細胞、細菌、またはウィルス由来等に関わらず、あらゆる種類の核酸、遊離した状態または随意にタンパク質と複合した状態を意味するものと理解される。それは、その構成要素が糖、リン酸基、そしてアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミンから選択される窒素塩基である天然のヌクレオチドの配列、および/または三つの構成要素の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチドより成る；修飾が塩基レベルで起き、例えば、イノシン、5-メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、5-ジメチルアミノデオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、5-ブロモデオキシウリジンのような修飾塩基と、例えばビオチンによって修飾された塩基のような、当業者に既知の技術によって直接または間接に検出可能なトレーサーによって修飾された塩基のような修飾塩基を生じる；糖のレベルでは、主にポリアミドによって、少なくとも一つのデオキシリボースが置換されたもの；および/またはリン酸基のレベルでは、例えば特に二リン酸エステル、アルキル-とアリルリン酸エステル、そしてアリルモノチオリン酸エステルから選択されたエステルによって置換されたものである。本発明に係る核酸は、完全にまたは部分的に一本鎖および/または二本鎖であり、特にプローブ-核酸、プローブ-核酸断片、プライマー-核酸またはプライマー-核酸断片の二重鎖より成り得、二重鎖はホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る。
本発明は、もちろん、様々なサイズの上述のように定義された核酸の断片、またはオリゴヌクレオチド(ODN)の単離に適用される。
核酸物質は、天然由来、および/または遺伝学的な組換えによって得られたもの、および/または化学的合成によって得られたものであろう；例として、それはプローブまたはプライマーより成る。
本発明は、サンプル内に含まれる核酸および/または核酸断片の画分の非特異的単離に適用されるが、サンプル内に存在する核酸や核酸断片、または核酸の混合物や核酸断片の混合物の特異的単離にもまた応用できる。
本発明で理解されるサンプルとは、核酸物質を含むことが可能な任意のサンプル、特に生物学的液体、食物由来のサンプルのような生物学的サンプルを含む。該サンプルは全体的または部分的なサンプルより成ってもよく、特にそれは部分標本、希釈液より成るかもしれない。そのサンプルは前処理、特に核酸の遊離を促進するための精製や溶解を受けていてもいなくてもよい。
本発明の主題のもののようなポリマーのLCSTは、特に以下の文献に記述された技術によって定義されて測定される：Hiroshi Inomata等，Macromolecules 1994,27,6459-6464。
プローブは、ヌクレオチド断片とハイブリダイゼーション複合体を形成するための所定のコンディションの下で、ハイブリダイゼーション特異性を持ったヌクレオチド断片である。本発明の枠組み内で用いられるプローブは好ましくはキャプチャープローブ(capture probe)であるが、他のタイプのプローブを用いることもできる。
本発明によるプライマーは、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、いわゆるNASBA法(「核酸配列ベース増幅」(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification))、または代わりにいわゆるTMA法(転写介在性増幅(Transcription Mediated Amplification))のような増幅法、シークエンシングのような伸長過程、逆転写法等の酵素的な重合の開始のための所定のコンディションの下でハイブリダイゼイション特異性を持つプローブを意味する。
本発明ではアクリルアミド誘導体は、R0-CH=C(R1)-CONR2R3の式に相当する重合性モノマーを意味するものと理解され、ここでR0,R1,R2,そしてR3が水素、脂肪族または環状、直鎖状または分枝状の低級炭化水素基、イミダゾールのような窒素含有複素環基から独立に選択される基を表す。
本発明における理解では核酸物質の吸着とは、以下のように定義される：上記物質と粒子状の支持体の一定期間の接触の後、核酸物質の構成成分に属する基少なくとも一つが支持体の表面に付着したならば、核酸物質が粒子状の支持体に吸着される；吸着は物質と支持体間のイオンの相互作用、および/または水素結合、そしてあるいは疎水性の相互作用から由来し、いかなる共有結合も除かれる。
最後に、機能化したポリマーとは、核酸物質の構成成分の基と、吸着現象に関与する相互作用、および/または結合のどれか一つを生じることが可能な官能基を携えた少なくとも一つの界面を持つポリマーを意味する。好ましくはこれらの官能基は、NH3 +;NH4 +;NR3 +から選択され、あるいはRは脂肪族か環状、飽和か不飽和炭化水素基を表し、NR3 +がピリジニウム基;そしてイソチオウロニウム基を表すことも可能である。
本発明を以下に示す実施例1から6と図1から7を参照して説明する。
図1はpHと温度によるポリマーの界面の変動を表す。
図2はpHと温度のRNAの吸着に対する効果を表す。
図3は40℃でのpHのBSAの吸着に対する効果を表す。
図4はイオン強度と温度のRNAの吸着に対する効果を表す。
図5は20℃でのpHのRNA脱着に対する効果を表す。
図6は40℃でのpHのRNA脱着に対する効果を表す。
図7は20℃でpH9.2でのイオン強度のRNA脱着に対する効果を表す。
図2から4において、Ns値はポリマーに付着した生物学的存在の量に相当し、ポリマーのミリグラム当たりに付着した生物学的分子のミリグラムを表す。
図5から7において、Ns値は実施例2に従って以前に粒子に吸着したRNAの量に対しての、遊離RNA(フリーNs)または非遊離RNA(残余Ns)のパーセンテージに相当する。以下の実施例が例示するように、吸着工程(c)の間のpH、イオン強度、および/または温度条件は決定的に重要である。実際、図1で観察できるように、7と等しいpH値以下で温度がポリマーのLCST未満の値であると、ポリマーは荷電した親水性の尾を持ち、その一方で7と等しいpH値を越え温度がLCSTより高い値であると、ポリマーは疎水性で中性の収縮した構造を示し、それが核酸の吸着の減少と、同時にタンパク質の吸着の増大を引き起こす。
実施例1:NIPAMベースポリマーの調製
このポリマーの調製のため三つの重合法を用いた：
1)バッチ重合法(または閉反応器法)
2)半連続重合法
3)シード上での重合(polymerization on a seed)
これらの技術のそれぞれにおいて、以下の同じ試薬を用いた。
・第一のモノマー：Kodakで市販されているN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)
・架橋剤：Aldrichから入手可能なN,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)
・開始剤：Wakoで市販されている塩化2,2’-アゾビスアミジノプロパン(V50)
・イオン強度調節用塩：NaCl(Prolabo)
・機能的な第二のモノマー：Kodakで市販されている塩化2-アミノエチルメタクリル酸(AEM)
1)バッチ重合法
熱の影響の下で分解し、フリーラジカルを作り出す開始剤(V50)の添加により重合を開始する前に、第一のモノマー(NIPAM)、機能的な第二のモノマー(AEM)、そして架橋剤(MBA)を単一のステップで一緒に導入した。重合の継続時間は30分である。
得られるポリマーの組成は、参照符号PNIPAM42と与えられているが、以下の通りである：
全容量(a) 250ml
NIPAM 48.51mmol
MBA 3mmol
AEM 0.48mmol
V50 0.30mmol
温度 70℃
(a)沸騰脱気水
得られたポリマーの特性を以下の表Iに示す。
重合の始めとそれらの全転換の終わりの間の期間中、機能的な第二のモノマーを反応器に導入する。この添加は一定速度の注入で実施することができ(連続添加による重合)、または代わりに規則的な間隔での十分に制御された添加による(半連続重合)。この重合法の目的は重合の進行を中断させるであろう反応媒体中の水溶性ポリマーのパーセンテージを増大させることなく、機能的な第二のモノマー(電荷している)の取り込みを増大することにある。
得られたポリマーの組成は、参照符号PNIPAM45と与えられているが、以下の通りである：
全容量(a) 250ml
NIPAM 48.51mmol
MBA 3mmol
AEM 0.48mmol
V50 0.30mmol
温度 70℃
添加 3から6分の間
(a)沸騰脱気水
得られるポリマーPNIPAM45の特性は以下の表IIに表されている。
この技術は事前に準備され完全に特徴付けられたポリマーを含む反応媒体に、機能的な第二のモノマーを導入することから成る。機能的な第二のモノマーは一つのステップまたは半連続的に、単独で加えられるか、またはモノマー(類)やコモノマーと混ぜることが可能である。
得られるポリマーの組成は、参照符号PNIPAM94と与えられているが、以下の通りである：
4.5%の固体濃度を持つ40mlの容量のシードを用いる。試薬は5mlの容量の水で希釈して加えられた。第二の工程で加えられるNIPAM、MBA、そしてV50のモルパーセンテージは、シードのもの(1参照)と同一である。一方、機能的な第二のモノマーの濃度がコントロールされる(望ましい電荷密度にしたがって増減される)；この場合10%(モル)のAEMが、第一のモノマーNIPAMに比例して加えられる。
参照符号PNIPAM93の下で記録され、1)で記述された方法にしたがって合成されたシードを用いた再添加の後に得られたポリマーPNIPAM94の特性は以下の表IIIに表されている。
1)から3)の技術のいずれか一つにより得られたポリマーの特性は以下の通りである：
・5から150μmol/gの間のポリマーの電荷密度(カチオンの)
・20℃での動的光散乱法により測定された粒子の直径が、0.05から2μmの間の範囲の粒子径
・20℃では0.001から1.5mol/lのNaClで、40℃では0.01から0.9mol/lのNaClの間にある凝集のための臨界濃度の範囲
実施例2:実施例1により調製されたPNIPAMの粒子へのRNAまたはBSA(ウシ血清アルブミン)の吸着
以下のプロトコールが吸着反応のための一般的方法を構成する。
反応混合物は10μlのRNA(4mg/ml)または50μlのBSA(5mg/ml)、そして50μlのN-IPAM粒子(45g/l)より成る。望ましいイオン強度とpHに到達するためにリン酸塩バッファー(10mM,pH4.6または9.2)とNaCl(5M)を加えることにより、1ミリリッターの最終容量が得られる。
分子存在物(RNAまたはBSA)は、所定のコンディション(pH、イオン強度)で(20または40℃で)で2時間以上で粒子に吸着する：混合物を1分当たり14,000回転で20分遠心分離する。上清を回収し、懸濁液中のポリマー粒子を分離するためミリポアーフィルターMillex-GV13(0.22μm)を用いて濾過する。ポリマー支持体に付着した生物学的存在物の量は、始めに導入した量と、残余の遊離している量(上清をアッセイする)の間の単純な相違によって測定される：この量はポリマーのミリグラム当たりの生物学的分子のミリグラムにより表される(Ns)。RNAまたはBSAの濃度は、それぞれ260nmと280nmの波長によるUV分光光度計(Kontron Instrument)によって推定される。
E.coliの16Sと28SリボソームRNA(Boerhinger)とBSA(Sigma参照符号A0281)を事前の精製なしで用いてテストを実施した。
用いた粒子はPNIPAM94の熱感受性粒子である。これらの粒子は室温では非常に親水性で、LCST(32℃)以上の温度では疎水性である。それらは実施例1に記述されたように合成された。
酸性リン酸塩バッファー(KH2PO4 10mM pH4.6)と中性リン酸塩バッファー(K2HPO4 10mM pH9.2)を吸着反応と反応のpH調節のため用いた。
NaCl(5M)を反応のイオン強度調節のため用いた。
全ての反応で用いられる水はMillipore-MilliQ精製システムで精製した。
インキュベーションはサーモミキサー(Eppendorf 5436)で実施した。
全ての反応は1.5mlエッペンドルフチューブで実施した。
1)pHと温度の吸着に対する影響の研究
図2によれば、RNAのよりよい吸着は中性のpHより酸性のpHで観察される。酸性のpHでは、粒子は広く正に帯電し、負に帯電した核酸は静電気力によって粒子に付着する。付着は40℃より20℃の方がより起こりやすい。40℃での結果は吸着の減少を例示する。
図3によれば、粒子へのBSAの吸着はpHの影響を受けないで可能である。20℃では、この温度での粒子の親水性の性質のため、BSAの付着は観察されなかった。
2)イオン強度と温度の吸着に対する影響の研究
図4によれば、負に帯電したRNAと正に帯電したポリマー表面の間の吸引性のある静電気力は、イオン強度の増大と共に減少し、結果としてRNAの付着が減少する。
同じ実験条件の下で、イオン強度の増大が粒子へのBSAの付着を促進しないことが確かめられた。
結論として、核酸は好ましくはLCST(20℃)未満の温度、低いイオン強度、そして酸性pHで粒子に吸着する。これらのコンディションの下では、タンパク質(BSAのような)の吸着は好まれない。
実施例3:PNIPAMポリマーの粒子へ吸着したRNAの脱着
用いられる試薬は実施例2で記述されたものと同様である。
以下のプロトコールが脱着反応のための一般的方法を構成する。
実施例2で実施された吸着ステップの後、一分当たり14,000回転の遠心分離工程後に脱着反応が実施される。上清を取り除き、望ましいpHとイオン強度を得るため1ミリリッターの脱着バッファー(リン酸塩(10mM pH4.6または9.2)とNaCl(5M))に置き換える。脱着は20℃または40℃で2時間実施される。それから混合物を一分当たり14,000回転で20分遠心分離する。上清を回収し、懸濁液中のポリマー粒子を分離するためミリポアーフィルターMillex-GV13(0.22μm)を用いて濾過する。遊離したRNAの量は、260nmの波長によるUV分光光度計(Kontron Instrument)によって測定される。回収した核酸は他の解析に利用できる。
1)pHと温度のRNAの脱着に対する影響の研究
図5によれば、中性pHでの核酸の脱着はポリマーの電荷の欠如のためより起こりやすい；酸性pHでは、その時粒子は高く正に帯電しているので遊離する核酸の量はずっと低い。
図6によれば、上述のように核酸の脱着は中性のpHで促進される。それはまた、温度をLCST(32℃)以上にすると粒子は収縮するので、温度の増大によっても促進される。
2)イオン強度のRNAの脱着に対する影響の研究
図7によれば、イオン強度が増大するにつれRNAとポリマー表面の吸引性のある静電気の相互作用が減少する。
結論として、核酸の脱着は好ましくは40℃、高いイオン強度、そして中性pHでなされる。
さらに、40℃(LCSTより高い温度)での粒子の収縮性質は、核酸溶液を濃縮することに対して促進可能である。実際、核酸物質の脱着とLCST以上の温度の上昇の後核酸を吸着する粒子は収縮し、それゆえ緩んだ状態にあるものより小さい体積を占め、遠心分離の後より小さい最終体積で粒子を回収することが可能となる。
実施例4:NIPAMを用いたDNAとRHAの混合溶液からのDNAの吸着と脱着
Short Protocols in Molecular Biology第二版編：Harvard Medical School,1992,pp.2-4/2-7内のD.Trecoにより記述されたプロトコールにしたがって、Stap hylococcus epidermidisのDNA溶液を細菌から単離したコロニーから抽出し精製する。
milliQ水中の10%(w/v)BSA(ウシ血清アルブミン)溶液(Intergen3210-01)を用いる。
PCRプロトコール：以下のPCR法は、PCR Strategies編：Innis, Gelfand and Sninsky Academic Press 1995,pp.17-31内のGoodmanにより記述されたものである。二つの増幅プライマーを用いた。それらは以下のようなシークエンスをもつ。
プライマー1：
プライマー2：
以下のような温度サイクルを増幅プロトコールの間用いた。
1)粒子へのDNAの吸着と脱着、そして遊離したDNAのPCR法後の検出
DNA溶液(1010コピー/ml)を20℃、pH4.6で2時間粒子に吸着させ、実施例2と3それぞれに記述されたような41℃、pH8.3、イオン強度0.05Hで15分の吸着ステップを受けさせた。吸着ステップと遠心分離の後、50μlの上清に回収した物質をPCRにより増幅させ、0.8%アガロースゲル上で分析した。期待されたサイズ(490pb)のバンドがゲル上で検出された。さらに、PCR後に検出されたDNAの量は、106コピー/mlのDNAのPCR増幅後に検出されたものと少なくとも同等であり、事前に粒子に吸着されたものではなかった。
NIPAM94の粒子はそれゆえDNAを吸着するのにも使用できる。脱着後、DNAはPCRタイプの増幅反応に用いることができる。
2)DNAとBSAの混合溶液からのDNAの吸着と、脱着により遊離したDNAのPCR法後の検出
10%(w/v)のBSAの存在下のDNA溶液(1010コピー/ml)が実施例4-1に記述されたような吸着と脱着ステップを受ける。同じ増幅法と検出法が用いられる。期待されたサイズのDNA(490pb)がゲル上で検出される。明視化されたDNAバンドの強度はBSAの存在、非存在で同様である。
NIPAM94の粒子はDNA-10%BSA混合溶液由来のDNAの吸着と、脱着による遊離を可能にする。始めの溶液内のBSAの存在は、粒子へのDNAの吸着を中断しない。
実施例5：NIPAMの粒子を用いた細菌溶解産物(Staphylococcus epidermidis)由来の核酸の精製
1)細菌溶解産物の調製
Staphylococcus epidermidisのカルチャーを37℃オーバーナイトで構成する。懸濁液中に含まれる細菌の数は550nmの光学濃度を測定することによって推定される。それぞれ2.106,2.104,そして2.101の細菌を含む細菌ペレットを14,000回転で3分の遠心分離で1.5mlチューブに調製する。上清は除去し、以下に記述する技術にしたがって細菌ペレットを溶解する(Arora等，J. Dairy Sci.1990,73,264-273の翻案)。
ペレットは6mg/mlのプロテイナーゼK(boehringer)と300μlのグラスビーズを含む1mlのバッファー(30mM Tris,100mM NaCl,5mM EDTA,pH7.2)内に集められる。この混合物をボルテックスで攪拌し、37度、15分間インキュベートする。遠心分離ステップ(14,000回転で3分)の後、核酸を含む上清を次なる段階のため回収する。
2)核酸の精製
用いられる粒子はその合成が実施例1に記述されているPNIPAM94の熱感受性粒子である。
以下のプロトコールは精製反応のための一般的方法を構成する。
反応混合物は、それぞれ105,103,そして106の細菌を含む50μlの細菌溶解産物と、2mgの粒子より成る。1ミリリットルの最終容量は、リン酸バッファー(10mM,pH4.6)で反応容量を調節して得られる。反応はサーモミキサー(Eppendorf 5436)で20℃で30分間インキュベートさせる。一分当たり14,000回転で20分間の遠心分離ステップの後、上清を取り除く。粒子に付着した核酸の脱着は、50μlのエルーションバッファー(elution buffer)(0.5M KCl,pH8.3)を加えることによりイオン強度の影響によって実施する；反応はサーモミキサーで42℃で15分間インキュベートさせる。一分当たり14,000回転で20分間のさらなる遠心分離ステップの後、核酸を含む上清を回収する；10μlをDNA増幅ステップ(PCR)のために用い、5μlをRNA増幅ステップ(NASBA)のために用いる。
3)核酸の検出
精製された核酸を酵素的な増幅ステップ(DNAならPCR、RNAならNASBA)の後分析する。それから増幅産物はELOSA(Enzyme Linked Oligo Sorbent Assay)、ミクロプレート(NASBA)、VIDAS(PCR)法によって明らかにされる。
PCRプロトコール：以下のプロトコールは実施例4で記述されたものと同一である。増幅産物(90μl)を、Habilat等，J.Clin.Microbiol;1994,32,2702-2705によって記述されたプロトコールにしたがって、自動バイダス免疫分析器(bioMeriuex)で分析し、キャプチャープローブと検出プローブは以下の通りである。
キャプチャープローブ：
検出プローブ：
検出プローブはアルカリフォスファターゼと接合しておく。
NASBAプロトコール：プロトコールはKievits等，J.Virol.Methods(1991)35,273-286に記述されたものと同一である。用いられるプライマーは以下のシークエンスを持つ。
プライマー1：
プライマー2：
増幅産物(5μl)をMallet等，J.Clin.Microbiol.(1993)31,1444-1449に記述されたプロトコールにしたがって、ミクロプレート形式(microplate format)でElosa法を用いて分析する。キャプチャープローブと検出プローブは以下のシークエンスを持つ：
キャプチャープローブ：
検出プローブ
検出プローブはセイヨウワサビペルオキシダーゼと接合しておく。
プロテイナーゼKは増幅反応の阻害剤として知られているが、1/10の連続的な希釈を得られる増幅の程度を測定するために増幅ステップの前に実施する。
得られた結果は付属書類中の表IVに整理されている。
増幅ステップの前にサンプルを1/1000に希釈することが必要であるため、プロテイナーゼKの阻害力をチェックする。増幅ステップ後、増幅前の1/10だけサンプルを希釈するが、それは100のファクターの増大を表す。粒子はサンプル内に連帯して存在するRNAとDNAの精製が可能である。これらの核酸は酵素的な増幅ステップで両立できる。
実施例6:磁気コアに融合されたNIPAMポリマーを用いた細菌溶解産物(Staphylococcus epidermidis)由来の核酸の精製
前述の実施例に記述された粒子は、吸着と脱着ステップの後の遠心分離ステップの調節に不都合がある。これらのステップは長く(20分が二回)、そして自動的にするのは難しい。可能な変更はNIPAMポリマーをカチオンの磁気コアに融合することである。試験された支持体の一つはカチオン磁気ラテックスR95-07(Estapor,Rhone-Poulenc)であり、その粒子は多分散である。
それゆえ得られた粒子の精製能が試験された。
1)Nipamの磁気粒子の合成
カチオンエスタポアー粒子R95-07をカプセル化した。各カプセル化の前に、粒子を0.005Mの塩酸溶液で3回洗った。
シード粒子の1gを、事前に沸騰した温度まで温められ窒素で脱気した40mlのmilliQ水に希釈した。
スチレン： 100μg
NIPAM： 0.3254g
BAM： 0.0274g
MAE： 0.0740g
トリトンX-405： 0.14g
V50： 0.0061g
コアへの修飾前ステップ(70℃で2時間)のための100μgのスチレン、NIPAM,BAM,MAEを10mlの水に可溶化し、シード(エスタポアーラテックス)に導入する。1mlの水に可溶化した開始剤を、シード粒子の周りへの重合を許容するために加える。重合は70℃の窒素雰囲気の下で実施される。
そしてこれらの粒子は、粒子のサイズ分散を修正しないと、220の電荷と粒子グラム当たり82μモルのNH2をもつ。
2)核酸の精製
用いられるプロトコールは実施例5に記述されたものに以下の修正を加えたものと同一である。
・200μgの粒子を用い
・粒子を上清と分離するための遠心分離ステップを取り除き、磁場の影響の下での分離ステップに置き換える(磁気分離装置、promega Z5342)。
全ての他のステップは電荷していないままである。
結果は付属書類中の表Ｖに整理されている。
増幅ステップの前にサンプルを1/1000に希釈することが必要であるため、プロテイナーゼKの阻害力を再びチェックする。増幅ステップ後、増幅前の1/10(PCR)または1/100(NASBA)にサンプルを希釈することが可能だが、それは10から100のファクターの増大を表す。これらの粒子もサンプル内に連帯して存在するRNAとDNAの精製が可能である。これらの核酸は酵素的な増幅ステップで両立できる。
Claims (11)
- 粒子状の支持体への核酸物質の吸着工程を含む、サンプル内に存在する核酸物質の水性相での単離方法において、
吸着試薬の製造工程(a)において、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり、該ポリマーは(1)N-イソプロピルアクリルアミド、(2)少なくともN,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)、および(3)少なくとも塩化2-アミノエチルメタクリル酸(AEM)の重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間の所定の下部臨界溶解温度(LCST)を持っており、
接触工程(b)において、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させ、水性連続層と核酸物質が粒子状の支持体に吸着している不連続相とを有するゾルを形成し、
接触工程(b)では、ゾルは
・高くとも7に等しいpH；
・高くとも10-2Mに等しいイオン強度；
・ポリマーのLCST未満の温度；
の全ての条件を有し、
観察工程(C)において、吸着が起こったことが必要に応じて観察され、
分離工程(d)において、不連続相を連続相から分離することを特徴とする単離方法。 - 更に、10-2M以上のイオン強度までイオン強度を増大することによる粒子状支持体からの脱着により、核酸物質を引き離す脱離工程(e)を含む、請求項１に記載の方法。
- 脱着工程(e)に対して、pHと温度から選択された少なくとも一つのパラメーターを、さらに以下のように変化させる：
・7より高いpHまでpHを増大する
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する
ことを特徴とする請求項2に記載の方法。 - 粒子状支持体が、加えて、上記粒子状ポリマーで完全にまたは部分的に被覆された有機または無機コアを含み、該コアは上記核酸物質に関してポリマーの吸着性を変えないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- コアがポリスチレンコアであることを特徴する請求項4に記載の方法。
- コアが磁性化合物を含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 核酸物質と特異的にハイブリダイズできる少なくとも一つのプローブおよび/または一つのプライマーを、吸着試薬とサンプルとを接触させる前にサンプルに加える、または吸着試薬とサンプルとを接触させた後にゾルに加えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ポリマーのLCSTが30から40℃の間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーが水溶性の中性及びカチオン性の開始剤から選択される重合開始剤の存在下で得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 分離工程(d)後に、イオン強度、pHそして温度から選択される少なくとも一つのパラメーターを以下のように
・10-2Mより高いイオン強度までイオン強度を増大する
・7より高いpHまでpHを増大する
・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する
変化させることによって、粒子状の支持体から脱着により核酸物質を引き離すことによる脱着工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 分離工程(d)は、遠心分離、濾過、沈殿、沈降、そして磁場の応用から選択される方法にしたがって実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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