KR20130041843A

KR20130041843A - 바이오 분자의 정제에 사용되는 중합체의 잔량을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20130041843A
Application number: KR1020127034439A
Authority: KR
Inventors: 마틴 질만; 제드 자버; 제임스 햄지크
Original assignee: 이엠디 밀리포어 코포레이션
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2013-04-25
Also published as: CN102933722A; SG185589A1; EP2580349A2; WO2011156467A2; WO2011156467A3; JP2013533738A; US20120070836A1

Abstract

본 발명은 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 항체, 백신 등과 같은 바이오 분자를 정제하기 위한 공정에 사용되는, 자극 응답성 중합체를 포함한 중합체의 잔량을 검출하는 방법에 관련된다.

Description

바이오 분자의 정제에 사용되는 중합체의 잔량을 검출하는 방법{METHODS OF DETECTING RESIDUAL AMOUNTS OF POLYMERS USED IN THE PURIFICATION OF BIOMOLECULES}

본 발명은 2010년 6월 8일에 출원된 미국 가특허출원 제61/397,186호의 우선권을 기초로 한 것이며, 이것은 전체로서 참고문헌으로 삽입된다.

본 발명은 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 항체, 백신 등과 같은 바이오 분자를 정제하기 위한 공정에 사용되는 중합체의 잔량을 검출하는 방법에 관련된다.

항체를 포함하는 치료 단백질과 같은 바이오 분자의 효율적이고 경제적인 거대 스케일의 정제는 바이오테크놀로지 및 제약학적 산업에서 점점 중요하게 인식되고 있다. 일반적으로, 정제 공정은 매우 정교하고 고비용이 소요되며, 많은 상이한 단계를 포함한다. 예컨대, 전형적으로 단백질의 경우, 단백질은 세포 배양 방법, 예컨대 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 플라즈미드의 삽입에 의해 목적하는 단백질을 생산하도록 설계된 포유류 또는 박테리아 세포 라인을 사용하여 생산된다. 일반적으로 표적 단백질의 발현에 이어서 예컨대 숙주 세포 단백질, 매질 부산물 및 DNA을 포함하는 하나 이상의 바람직하지 않은 성분으로부터 그것을 분리하는 것은 막대한 도전을 요구한다. 그러한 분리는 치료 단백질이 인간에게 사용되고 또 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인되어야 하는 경우에 특히 중요하다.

일반적으로, 단백질에 보통 사용되는 분리 및/또는 정제 공정은 적어도 하기 단계를 포함한다: 분비 단백질의 경우 매질로부터 단백질을 회수하거나 또는 세포내 단백질을 회수하도록 세포 분쇄하는 단계; 목적하는 단백질을 함유하는 정화된 시료를 얻기 위해 분별원심 또는 여과를 이용하여 세포 및 세포 부스러기를 제거하는 단계; 및 시료 내에서 다양한 불순물로부터 목적하는 단백질을 분리하기 위해 다-단계 공정으로 다양한 크로마토그래피 매질을 사용하는 단계.

시료 중에서 하나 이상의 불순물로부터 바이오 분자를 정제함에 있어서 특정 중합체가 특히 유용하다는 것이 밝혀졌다. 예컨대, 단백질을 정제하기 위해 응집물에 고분자 전해질 중합체를 사용하는 것이 잘 알려져 있다(예컨대, 국제특허 공개 WO2008/091740호 참조). 이것은 넓은 범위의 중합체로 수행될 수 있고, 중합체가 목적하는 종(예컨대, 표적 분자 또는 불순물)과 상호작용하는 일정 수준을 가져야 하는 일반적인 특성만 요구된다. 또한 각각 전체로서 참고문헌으로 삽입되는, 미국특허 공개 제20080255027호, 제20090036651호, 제20090232737호 및 제20110020327호는 스마트 중합체로 지칭되는 특정 중합체의 사용을 개시하고 있고, 이것은 pH, 온도 및/또는 염 농도와 같은 특정 세트의 공정 조건 하의 수계 용매에서 가용성이고, 그러한 조건이 하나 이상 변화되면 불용성이 되어 이후 침전된다.

스마트 중합체의 경우에, 이러한 중합체는 하나 이상의 용해성 및/또는 불용해성 불순물과 결합할 수 있거나 또는 목적하는 바이오 분자(예컨대, 분리되는 표적 단백질)과 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 그러한 중합체는, 전체로서 참고문헌으로 삽입되는 하나 이상의 제20080255027호, 제20090036651호, 제20090232737호 및 제20110020327호에 기술된 바와 같이, 자극(예컨대 pH, 온도, 염 등)에 후속 노출시킨 용액으로부터 침전될 수 있다.

중합체가 용액으로부터 침전됨에도 불구하고, 침전 단계는 생물학적 물질 함유 스트림 또는 시료 내에 존재하는 모든 중합체를 항상 제거하는 것은 아니므로, 목적하는 바이오 분자를 함유하는 시료 중에서 중합체의 잔량이 존재하게 된다. 특히 중합체의 잔량 검출은 목적하는 바이오 분자가 치료 단백질인 경우, 예컨대 단백질이 인간에게 사용되는 것이고 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승된되어야 하는 경우 결정적이다.

도 1은 소망하는 목적하는 바이오 분자에 대해 결합 친화성을 갖는 폴리(4-비닐피리딘)과 같은 pH 의존성 중합체를 적용한 정제 공정의 개략도이다.
도 2는 단일클론 항체의 정제를 위한 산업적 표준 템플릿을 도시한다.
도 3은 비-콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 태그에 대한 정량적 PCR 검량선을 도시하는 그래프이다. 동그란 원 안의 포인트는 공지된 부피 내에 재현탁된 미지의 중량을 갖는 올리고뉴클레오티드 스톡의 희석액으로부터 검출되는 ~10 복제물의 태그 인풋에 대한 것이다.
도 4는 올리고뉴클레오티드-콘쥬게이트된 중합체 내에서 중합체에 대한 올리고뉴클레오티드 태그의 몰비의 특성을 도시하는 그래프이다. 개방 다이아몬드는 비-콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 태그로 얻어지는 판독을 나타내고, 폐쇄 다이마몬드는 올리고뉴클레오티드 태그-콘쥬게이트된 중합체의 표준 작업으로 얻어지는 판독을 나타내며, 폐쇄 삼각형은 에틸 아세테이트를 이용하여 디메틸 포름아미드 중에서 반응 혼합물로부터 침전에 의해 정화된 후, 메탄올 중에서 재현탁되고 0.1M 소듐 하이드록사이드로로 재침전된, 올리고뉴클레오티드 태그-콘쥬게이트된 중합체로 얻어지는 판독을 나타낸다. 콘쥬게이트 및 비-콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 태그의 민감성이 유사하다는 가정을 기초로, 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드-태그 중합체에 대한 민감성은, 500 분자의 중합체 당 1 분자의 태그의 실험으로 측정된 콘쥬게이션 비에 대하여 ~125ppt(parts per trillion) 또는 그 이하이다.
도 5는 다운스트림 공정 모니터링에 대해 올리고뉴클레오티드 태그-콘쥬게이트된 중합체의 사용을 나타내는 개략도이다. 공정 작업흐름도는 올리고뉴클레오티드-태그 콘쥬게이트된 중합체가 동시 정화 및 정제를 위해 사용되고, 이때 중합체가 목적하는 바이오 분자 뿐만 아니라 하나 이상의 불순물 모두와 결합하며, 이어서 목적하는 바이오 분자가 선택적으로 용출되는 반면, 하나 이상의 불순물이 중합체에 결하되어 잔류하는 것을 도시한다.
도 6은 올리고뉴클레오티드 태그 추적자로부터의 판독을 이용하여 잔류 중합체에 대한 도 5의 작업 흐름도로부터 다양한 분획을 분석한 것을 도시하는 그래프이다. 분획이 정제 공정을 통과하여 이동함에 따라, 태그가 없는 대조군과 유사하게, 곡선이 모든 희석액에 대하여 약 48의 크로싱 쓰레스홀드(crossing threshold)(Ct)로 차츰 편평해진다.
도 7은 알려진 양의 BODIPY 507/545 태그된, 소수성 개질된 폴리알릴아민 자극 응답성 중합체를 이용하여 얻어지는, 미지 농도의 BODIPY 507/545 태그된 중합체를 정량하기 위한 표준 곡선을 도시한다. 중합체의 농도(ppm)가 x-축에 도시되고 545nm에서 강도가 y-축에 도시된다.
도 8은 세포 배양 매질의 응집 및 정화 이후에 잔류하는, BODIPY 507/545 태그된, 소수성으로 개질된 폴리알릴아민 자극 응답성 중합체의 정량을 도시하는 그래프이다. 부가되는 응집물 투여량%(중합체의 중량/세포 배양액의 부피)을 x-축에 나타내고 여과물 중의 잔류 중합체를 ppm으로 y-축에 나타내었다.

발명의 요약

본 발명은 시료 중에서 목적하는 바이오 분자를 농축(enriching)하기 위해 사용되는 중합체의 잔량을 검출하는 방법으로서, 종래기술의 방법에 비해 신규하고 또 더욱 민감한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 시료 가공을 요구하지 않으며 또 본 명세서에 기술된 방법을 기초로 올리고뉴클레오티드 태그의 경우 보통 실험실에서 사용되는 장치, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 써모사이클러(thermocycler) 기계를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 하나의 양상에서, 목적하는 바이오 분자를 포함하는 시료 중에서 중합체의 잔량을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 중합체는 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하기 위해 사용된다. 중합체는 하나 이상의 불순물과 결합하거나 또는 목적하는 바이오 분자와 결합함으로써 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리시킨다. 일부 구체예에서, 중합체는 목적하는 바이오 분자 뿐만 아니라 하나 이상의 불순물과 모두 결합할 수 있고, 이때 목적하는 바이오 분자가 이어서 선택적으로 용출되는 반면, 하나 이상의 불순물은 중합체와 결합된 상태로 남는다.

일부 구체예에서, 본원발명에 따른 중합체의 잔량을 검출하는 방법은 하기의 단계를 포함한다: (1) 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 시료를 중합체와 접촉하는 단계, 이때 상기 중합체는 태그와 친화성이고, 및 (2) 태그를 검출하는 단계, 이때 상기 검출된 태그의 양은 목적하는 바이오 분자를 포함하는 시료 내에서 중합체 잔량를 나타냄.

일부 구체예에서, 태그는 올리고뉴클레오티드 분자이다. 다른 구체예에서, 태그는 비-올리고뉴클레오티드 분자, 예컨대 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자이다. 분자가 검출가능한 부분인 경우, 용어 "태그" 및 "분자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

태그는 검출되는 중합체에 결합하거나 또는 올리고뉴클레오티드 분자에 결합된 후 검출되는 중합체에 결합될 수 있다. 대안으로, 태그는 검출되는 중합체에 결합되는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화(hybridize)하는 프로브에 결합될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 분자의 경우, 분자는 증폭 수단(amplification means) (예컨대, PCR) 또는 비-증폭 수단(예컨대, 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 프로브, 또는 올리고뉴클레오티드 분자에 결합되거나, 또는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 프로브에 결합되는 형광성 분자, 합텐 분자 또는 방사성 분자의 이용)을 사용하여 검출될 수 있다.

일부 구체예에서, 중합체는 자극 응답성 중합체이다. 일부 구체예에서, 중합체는 정화(즉, 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 시료 중에서 하나 이상의 불순물에 결합)에 사용된다. 다른 구체예에서, 중합체는 포획(즉, 목적하는 바이오 분자에 결합)에 사용된다. 또 다른 구체예에서, 중합체는 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물에 모두 결합되고, 이때 목적하는 바이오 분자는 이어서 선택적으로 중합체로부터 용출되는 반면, 하나 이상의 불순물은 중합체에 결합되어 남는다.

따라서, 일부 구체예에서, 자극 응답성 중합체의 잔량을 검출하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (1) 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액을 자극 응답성 중합체와 접촉시키는 단계, 이때 중합체 및 하나 이상의 불순물의 착물의 형성하도록 상기 중합체는 태그와 친화성이고; (2) 자극을 용액에 적용함으로써 착물을 침전시키는 단계; (3) 용액으로부터 침전물을 제거하는 단계; 및 (4) 목적하는 바이오 분자를 함유하는 용액 내에서 태그를 검출하는 단계, 이때 상기 검출된 태그의 양은 목적하는 바이오 분자를 포함하는 용액에서 중합체 잔량를 나타냄.

다른 구체예에서, 자극 응답성 중합체의 잔량을 검출하는 방법은 하기의 단계를 포함한다: (1) 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액을 자극 응답성 중합체와 접촉시키는 단계, 이때 상기 중합체는 태그와 친화성이고, 상기 중합체는 제 1 세트의 조건 하에서 하나 이상의 불순물 뿐만 아니라 목적하는 바이오 분자 모두와 착물을 형성하고, (2) 자극을 용액에 부가함으로써 착물을 침전시키는 단계; (3) 침전물을 제 2 세트의 조건으로 처리함으로써 착물로부터 목적하는 바이오 분자를 선택적으로 용출하는 단계; 및 (4) 목적하는 바이오 분자를 함유하는 용출물 내에서 태그를 검출하는 단계, 이때 상기 검출된 태그의 양은 용출물에서 중합체의 잔량을 나타냄.

일부 구체예에서, 단계 (2) 및 (3) 사이에 세척 단계가 존재한다.

일부 구체예에서, 자극 응답성 중합체는 염 자극 또는 pH 자극에 응답성이다. 특정 구체예에서, 상기 중합체는 다가 음이온 자극에 응답성이다.

예시적인 자극 응답성 중합체는 폴리비닐아민, 폴리알릴아민, 폴리비닐피리딘, 소수성 기로 개질된 중합체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

다양한 구체예에서, 태그(예컨대, 올리고뉴클레오티드 분자 또는 비-올리고뉴클레오티드 분자, 예컨대 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자)는 중합체와 공유결합되거나 또는 태그(예컨대 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자)는 올리고뉴클레오티드와 공유결합한 후 중합체와 결합한다. 일부 구체예에서, 태그는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화하는 프로브에 결합한 후 중합체와 결합된다.

일부 구체예에서, 사용되는 태그는 올리고뉴클레오티드 분자이고, 검출 단계는 증폭 반응을 포함한다. 일부 구체예에서, 증폭 반응은 올리고뉴클레오티드 분자의 5' 및 3' 말단에 혼성화하는 일 세트의 프라이머를 사용하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다.

일부 구체예에서, 사용되는 태그가 올리고뉴클레오티드 분자인 경우, 검출 단계는 비-증폭 반응을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 비-증폭 반응은 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화하는 표지 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 표지 프로브는 검출가능한 염료를 포함한다. 다른 예시적인 구체예에서, 비-증폭 반응은 올리고뉴클레오티드 분자에 결합되는 합텐 태그의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 비-증폭 반응은 올리고뉴클레오티드 분자에 결합되는 방사성 태그 또는 형광성 태그의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 합텐, 형광성 또는 방사성 태그는 검출되는 중합체에 결합되는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화하는 프로브에 결합된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 분자는 60 이하의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 태그의 길이는 10 뉴클레오티드, 15, 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 25 뉴클레오티드, 30 뉴클레오티드, 35 뉴클레오티드, 40 뉴클레오티드, 45 뉴클레오티드, 50 뉴클레오티드, 55 뉴클레오티드 및 60 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된다.

일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 태그의 3' 말단에서 반응성 기를 포함한다. 반응성 기는 히드록실 기, 아미노 기, 할로겐 기, 에폭시 기, 카르복실 기 및 설프히드릴 기로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 반응성 기는 예컨대 중합체 상에서 반응성 기와 상호작용하는 다른 반응성 기를 형성하도록 추가로 개질될 수 있다.

일부 구체예에서, 중합체는 반응성 기를 포함한다. 반응성 기는 알데히드 기, 에폭시 기, 카르복시산 기, 히드록실 기, 아미노 기(1급, 2급 또는 3급, 피리딘 포함), 설프히드릴 기, 및 방향족 기로부터 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 제 1 반응성 기를 포함하고, 중합체는 제 2 반응성 기를 포함하고, 이때 제 1 및 제 2 반응성 기는 서로 공유결합된다. 반응성 기는 상술한 것 중에서 선택될 수 있고 직접 또는 링커를 통해 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 반응성 아미노 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 분자는 1,1'카르보닐디이미다졸로 활성화된 요오드아세트아미드와 반응한 후 중합체 폴리(4-비닐피리딘)의 피리딘 반응성 기에 콘쥬게이트된다.

일부 구체예에서, 중합체와 비친화성인 태그(올리고뉴클레오티드 또는 비-올리고뉴클레오티드)는 정제에 의해 제거된다. 예시적인 정제 방법은 침전, 음이온 교환 막을 통한 여과, 초미세여과, 정용여과(diafiltration) 및 겔투과 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 구체예에서, 목적하는 바이오 분자는 단백질(예컨대 재조합 단백질), 항체 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 SEQ ID NO:l의 서열 세트를 포함하는 올리고뉴클레오티드 분자를 사용한다.

일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 제 2 구조가 없는 것으로 예측되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 4 이상의 염기 길이의 동종 중합체가 없는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 중합체는 폴리(4-비닐 피리딘)이다. 다른 구체예에서, 중합체는 폴리비닐아민이다. 다른 구체예에서, 중합체는 폴리알릴아민이다. 다른 구체예에서, 중합체는 소수성 기로 개질된 폴리알릴아민 또는 폴리비닐아민이다. 특정 구체예에서, 폴리알릴아민은 150 kDa의 분자량을 갖고, 이때 30%의 아민기는 벤질클로라이드와의 반응을 통해 공유적으로 개질된다.

일부 구체예에서, 중합체는 다가 음이온, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 이온의 부가에 응답한다.

일부 구체예에서, 검출을 위해 사용되는 태그는 형광성 태그 또는 형광단( fluorophore)이고, 이것은 중합체에 결합되거나 또는 중합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드 분자에 결합될 수 있다. 대안으로, 이것은 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화하는 프로브에 결합될 수 있다.

예시적인 형광성 태그는 N-(4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-2-일)요오드아세트아미드(BODIPY?507/545 IA(INVITROGEN)으로 공지됨) 및 7-히드록시쿠마린-3-카르복시산, 숙신이미딜 에스테르(INVITROGEN)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 구체예에서, 공유결합된 형광성 분자 또는 형광단을 갖는 중합체가 검출되고 형광 분광광도법을 통해 정량된다.

일부 구체예에서, 검출을 위해 사용되는 태그는 방사성 분자이고, 이것은 중합체에 결합되거나, 또는 중합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드 분자에 결합될 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 프로브에 결합될 수 있다.

예시적인 방사성 태그는 메틸 아이오다이드[3H] 및 메틸 아이오다이드[14C](MP BIOMEDICALS)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 구체예에서, 공유결합된 방사성 기를 갖는 중합체가 검출되고 섬광계측기(scintillation counter)를 이용하여 정량된다.

일부 구체예에서, 검출에 사용되는 태그는 중합체 또는 중합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드 분자에 결합될 수 있는 합텐 분자이다. 대안으로, 이것은 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 프로브에 결합될 수 있다. 예시적인 합텐 태그는 플루오로세인, 비오틴 및 디니트로페놀을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 반응성 기를 포함하는 합텐 태그는 DNP-X, SE, 6-(2,4-디니트로페닐)아미노헥사노익산, 숙신이미딜 에스테르(INVITROGEN), DSB-X™ 비오틴 C2-요오드아세트아미드(데스티오비오틴-XC₂-요오드아세트아미드)(INVITROGEN), 및 5(6)-플루오레세인 이소티오시아네이트 혼합된 이성체(THERMO SCIENTIFIC)를 포함한다.

일부 구체예에서, 결합된 합텐을 포함하는 중합체는 ELISA와 같은 면역분석법을 사용하여 검출되고 정량된다. ELISA의 예시적인 실시예는 비오틴 ELISA Kit(ALPCO DIAGNOSTICS)이다.

일부 구체예에서, 공유 결합된 합텐을 포함하는 중합체는 당업계에 공지되거나 또는 효소 리포터를 사용하는 아비딘/스트렙타아비딘 검출 방법 및 증폭 기술(예컨대, 겨자무과산화효소, 알칼리성 인산가수분해효소), 티라미드 시그널 증폭 또는 형광성 프로브를 이용하여 검출되고 정량된다.

본 발명의 방법에 따른 일부 구체예에서, 하나 이상의 불순물은 전체 세포, 세포 단편, 지질, DNA, RNA, 숙주 세포 단백질, 엔도톡신 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 시료 중에서 중합체의 잔량을 검출하는 방법을 제공하며, 이때 상기 중합체는 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 그러한 중합체는 "자극 응답성 중합체" 또는 "스마트 중합체"이다. 일부 구체예에서, 스마트 중합체는 목적하는 바이오 분자와 결합한다. 다른 구체예에서, 스마트 중합체는 하나 이상의 불순물과 결합한다. 다른 구체예에서, 스마트 중합체는 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물 모두와 결합하고, 이때 상기 목적하는 바이오 분자는 후속적으로 중합체로부터 용출되고 하나 이상의 불순물은 중합체에 결합되어 남는다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 먼저 특정 용어의 정의에 대해 설명한다. 부가적인 정의가 명세서 전체를 통해 개시된다.

I. 정의

본 명세서에서, 용어 "목적하는 바이오 분자" 또는 "소망하는 목적하는 바이오 분자"는 중합체, 예컨대 자극 응답성 중합체를 이용하여 하나 이상의 불순물로부터 분리되는 생물학적 물질(예컨대, 표적 바이오 분자 또는 목적하는 생성물)을 지칭한다. 예시적인 목적하는 바이오 분자는 예컨대, 단백질(예컨대, 재조합 단백질), 항체 및 백신을 포함한다. 특정 구체예에서, 목적하는 바이오 분자는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 목적하는 바이오 분자와 결합 및 침전(반드시 순차적인 것은 아님)함으로써 하나 이상의 불순물로부터 이것을 분리한 후 잔류될 수 있는 중합체의 잔량을 검출한다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 불순물과 결합 및 침전(반드시 순차적인 것은 아님)함으로써, 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리한 후 시료 중에 잔류될 수 있는 중합체의 잔량을 검출한다.

본 명세서에서, 용어 "하나 이상의 불순물"은 임의의 이질적이거나 부적합한 분자를 지칭하며, 이것은 전체 세포, 세포 단편 또는 생물학적 매크로분자 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 엔도톡신, 지질 및 그러한 이질적이거나 부적합한 분자로부터 분리되는 목적하는 바이오 분자를 함유하는 시료 중에서 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 본 발명에 따른 일부 구체예에서, 하나 이상의 불순물은 중합체를 이용하여 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 시료로부터 제거된다. 본 발명에 따른 방법은 목적하는 바이오 분자로부터 하나 이상의 불순물을 분리하기 위해 사용될 수 있는 중합체의 잔량을 검출할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "중합체"는 2 이상의 단량체 단위의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 지칭한다. 이러한 단량체 단위는 합성되거나 또는 천연에서 발생할 수 있다. 반복 단위에 의해 형성된 중합체는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 예시적인 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리알릴아민, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌 및 공중합체(예컨대. 폴리스티렌-코-폴리피리딘, 폴리아크릴산-코-메틸메타크릴레이트, 플루로닉스(pluronics), PF68 등)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 일부 구체예에서, 중합체는 고분자 전해질 백본(backbone)을 포함한다. 또한 본 명세서에서 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 공중합체는 자극에 응답성이다. 일반적으로, 중합체의 경우, 단량체 단위가 동일한 형태인 반면, 공중합체는 보통 다른 형태의 단량체 단위인 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "자극 응답성 중합체"는 자극 부가 이후에 물리적 및/또는 화학적 물성에 변화를 나타내는 중합체 또는 공중합체이다. 전형적인 자극 응답성은 중합체의 용해성 면에서의 변화이다.

일부 구체예에서, 자극 응답성 중합체는 pH, 염 농도 또는 온도와 같은 특정 세트의 공정 조건하에서 가용성이고, 하나 이상의 조건 변화에 응답하여 예컨대 조건(온도, 염 농도 또는 pH) 변화에 따라 용액에 불용성이고 침전된다. 예컨대, 중합체 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 약 35℃ 미만의 온도에서 수용성이지만, 약 35℃의 온도에서 수불용성이 된다. 스마트 중합체는 하나 이상의 불순물과 결합하기 위해 사용되거나 또는 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 시료 중에서 목적하는 바이오 분자와 결합하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 스마트 중합체로 목적하는 바이오 분자를 결합 및/또는 침전시킨 후에 잔류할 수 있는 스마트 중합체의 잔량을 검출하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 스마트 중합체의 잔량은 중합체로부터 목적하는 바이오 분자를 용출한 후에 검출된다. 다른 구체예에서, 스마트 중합체의 잔량은 스마트 중합체로 하나 이상의 불순물을 결합 및/또는 침전시킨 후에 검출된다.

본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "자극" 또는 "자극원"은 물리적 또는 화학적 환경의 변화를 지칭하고 이것은 본 발명에 따른 자극 응답성 중합체에 의해 응답성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 중합체의 용해성에 변화를 초래하는 자극에 응답하는 중합체의 잔량을 검출하는 방법을 제공한다. 중합체가 응답할 수 있는 자극의 예는 예컨대 온도의 변화, 도전성의 변화, 전기 및/또는 자기장의 변화 및/또는 pH의 변화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 자극은 시료에 염을 형성하는 착물 형성 염 또는 착화제의 부가를 포함한다. 다양한 구체예에서, 일반적으로 시료에 중합체를 부가한 이후에 자극이 가해진다. 그럼에도 불구하고 자극은 시료에 중합체를 부가하는 동안 또는 그 이전에 가해질 수 있다.

특정 구체예에서, 자극원은 염이다. 예시적인 염은 다가 이온, 예컨대 시트레이트, 포스페이트, 술페이트 및 EDTA, 이온-친화성 염, 예컨대 퍼클로로에이트, 도데실 술페이트 소듐염, 도데실 벤젠 술페이트, Fe(II)-4-클로로-2-니트로페놀 음이온, 테트라페닐 보레이트 소듐 염 및 헥사니트로디페놀 아민(예컨대 ANALYTICAL SCIENCES, DECEMBER 1987, VOL. 3, p. 479 참조)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 당업자는 본 명세서에 기술된 중합체와 함께 자극원으로서 사용될 수 있는 당업계에 공지된 많은 염에 대해 친숙할 것이다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 예컨대 염과 같은 자극원은 목적하는 바이오 분자 및/또는 하나 이상의 불순물 중 하나 또는 모두와 결합하는 중합체를 부가한 이후에 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 시료에 부가된다. 예컨대 염과 같은 자극원의 부가는, 목적하는 바이오 분자 및/또는 하나 이상의 불순물 중 하나 또는 모두와 중합체와의 가용성 및 불용성 착물 뿐만 아니라 유리된 중합체의 침전을 일으킨다.

가용성 또는 불용성 착물의 침전을 유도하는데 필요한 염의 양은 예컨대 pH, 중합체 농도 및 중합체가 결합하는 목적하는 바이오 분자 또는 하나 이상의 불순물의 농도와 같은 인자에 의존한다. 예컨대, 폴리알릴아민과 같은 일부 고분자전해질은 pH(아민 프로토네이션의 수준)로 변화하는 전하 밀도를 갖는다. pH가 증가될 수록 전하 밀도의 수준이 감소됨으로싸 침전을 일으키는데 필요한 자극의 정도가, 낮은 pH 또는 높은 전하 밀도 상태에서 자극 정도와 달라질 것이다.

본 명세서에서 용어 "농축" "분별", "분리" 및 "정제"는 시료 또는 생물학적 물질 함유 스트림으로부터 하나 이상의 소망하는 바이오 분자를 정제하기 위해 중합체를 사용하는 방법을 지칭한다. 다양한 구체예에서, 목적하는 바이오 분자를 농축, 분별, 분리 또는 정제하는 것은 목적하는 바이오 분자를 함유하는 시료 중에 존재하는 하나 이상의 불순물을 제거하는 것을 포함한다. 목적하는 바이오 분자는 하나 이상의 불순물과 결합하는 중합체를 이용하거나 또는 목적하는 바이오 분자와 결합하는 중합체를 이용하는 것에 의해 하나 이상의 불순물로부터 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 하나 이상의 불순물 뿐만 아니라 목적하는 바이오 분자 모두와 결합하고, 이때 목적하는 바이오 분자는 후속하여 선택적으로 중합체로부터 용출되는 반면, 하나 이상의 불순물은 결합된 상태로 남는다.

본 명세서에서, 용어 "잔량" 또는 "잔류량"은 생물학적 물질의 정제를 위해 사용되는 중합체, 예컨대 자극 응답성 중합체 또는 응집을 위해 사용되는 중합체의 양을 지칭하며, 이 양은 중합체가 하나 이상의 불순물과 결합하고 침전하거나 또는 목적하는 바이오 분자와 결합하고 침전한 후에 시료 또는 생물학적 물질 함유 스트림 중에 용해되거나 및/또는 분산되어 남는 양과 동일하거나 더 적다. 또한 잔량은 중합체, 예컨대 자극 응답성 중합체의 양을 지칭하고, 그 양은 중합체가 결합하고 침전하거나 또는 하나 이상의 불순물 또는 소망하는 목적하는 바이오 분자와 결합하고 침전하도록 자극원이 적용된 후에 시료 또는 생물학적 함유 스트림 중에 용해되거나 및/또는 분산되어 남는 양과 동일하거나 또는 더 적다.

본 명세서에서 용어 "조성물", "용액" 또는 "시료"는 생물학적 물질 함유 스트림을 지칭한다. 전형적으로, 생물학적 물질 함유 스트림은 하나 이상의 바람직하지 못한 부분 또는 불순물과 함께, 정제되는 목적하는 바이오 분자 또는 소망하는 생성물의 혼합물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 시료는 하나 이상의 불순물(예컨대, 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 세포 배양 첨가제, 세포 및 세포 부스러기)과 함께, 목적하는 바이오 분자(예컨대, 치료 단백질 또는 항체)를 포함한다. 일반적으로, 생물학적 물질 함유 스트림은 도 1에 도시된 바와 같이 정제 공정이 실시될 수 있다. 일부 구체예에서, 시료는 목적하는 바이오 분자 또는 소망하는 생성물이 분비되는 피드 스톡 또는 세포 배양 매질을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 자극 응답성 중합체를 이용하여 정화되는 바이오 분자로부터의 시료는, 자극 응답성 중합체와 시료를 접촉시키기 전에 "부분적으로 정제된다". 부분적 정제는 시료를 예컨대, 도 2에 도시된 바와 같이, 하나 이상의 비-친화성 크로마토그래피 단계와 같이 하나 이상의 정제 단계에 적용하는 것에 의해 수행될 수 있다. 바이오 분자는 하나 이상의 불순물을 침전시키거나 또는 목적하는 바이오 분자를 침전시키는 것에 의해 하나 이상의 바람직하지 못한 성분 또는 불순물로부터 분리될 수 있다.

일부 구체예에서, 자극 응답성 중합체는 예컨대 자극원이 시료에 부가되면, 제 1 세트의 조건 하에서 선택적으로 또 가역적으로 목적하는 바이오 분자에 결합하고, 제 2 세트의 조건 하에서 목적하는 바이오 분자를 침전시킨다. 다른 구체예서, 자극 응답성 중합체는 제 1 세트의 조건 하에서 선택적으로 하나 이상의 불순물과 결합하고 제 2 세트의 조건 하에서 하나 이상의 불순물을 침전시킨다. 일부 구체예에서, 자극 응답성 중합체는 자극원이 부가되면, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, DNA, 전체 세포, 세포 부스러기, 바이러스 및/또는 세포 배양 첨가제와 선택적으로 결합하고 침전한다. 다른 구체예에서, 자극 응답성 중합체는 제 1 세트의 조건 하에서 하나 이상의 불순물 뿐만 아니라 목적하는 바이오 분자 모두에 결합하고, 이때 목적하는 바이오 분자가 제 2 세트의 조건 하에서 중합체로부터 선택적으로 용출되는 반면, 하나 이상의 불순물은 결합된 상태로 남는다.

본 명세서에서 용어 "침전", "침전물"" 또는 "침전한다"는 결합된 (예컨대 목적하는 바이오 분자 또는 하나 이상의 불순물과 착물형성) 또는 비결합된 중합체가 수성 및/또는 가용성 상태에서 비-수성 및/또는 불용성 상태로 변경되는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "태그"는 본 발명에서 사용되는 것과 같이 중합체에 결합될 수 있고, 또 적당한 수단을 이용하여 검출될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 검출 방법에 사용되는 태그는 증폭 수단 또는 비-증폭 수단을 이용하여 검출될 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 검출 방법에 사용되는 태그는 중합체에 직접 결합되고 당업자에게 공지된 적합한 수단을 이용하여 쉽게 검출될 수 있는 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자이다. 또한, 특정 구체예에서, 합텐 분자(예컨대 비오틴), 방사성 분자 또는 형광성 분자가 중합체에 결합되는 것 대신에, 올리고뉴클레오티드 분자에 결합된 후, 중합체에 결합될 수 있다. 추가의 구체예에서, 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자는 중합체에 결합되는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 프로브에 결합되고 후속적으로 검출될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "올리고뉴클레오티드 태그" 또는 "올리고뉴클레오티드 분자"는 중합체에 결합할 수 있고 또 그 중합체의 검출에 사용되는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 태그는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 태그 또는 분자의 서열은 생물학적 물질 함유 스트림의 다양한 성분에 나타나지 않는 것이 바람직하다. 당업자는 예컨대 당업계에 공지된 컴퓨터(예컨대 숙주 세포 DNA 서열에 대해서 BLAST) 또는 실험적 방법(예컨대, 혼성화 기술)을 사용하여 올리고뉴클레오티드 태그의 서열의 존재 또는 비존재를 쉽게 증명할 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체와 올리고뉴클레오티드 분자 사이의 친화성은 공유 결합을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 증폭 반응을 이용하여 검출된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 예컨대 올리고뉴클레오티드 분자가 예컨대, 합텐 분자(예컨대 비오틴), 형광성 분자 또는 방사성 분자와 같은 검출가능한 부분으로 표지되는 비-증폭 반응을 이용하여 검출된다. 또한 예컨대 프로브를 이용하는 혼성화 방법은 올리고뉴클레오티드 분자의 검출에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로브는 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자로 표지된다.

본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오티드 분자 또는 그것의 역 상보물(reverse complement)에 혼성화될 수 있고 적당한 조건 하의 증폭 반응(예컨대 중합효소 연쇄 반응) 중에서서 침전할 수 있는 단일-가닥 핵산 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자는 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화될 수 있고 또 올리고뉴클레오티드 분자의 검출에 사용될 수 있는 5' 및 3' 프라이머 세트를 이용하여 검출된다. 검출되는 올리고뉴클레오티드 분자의 양은 시료 중에 존재하는 중합체의 잔량을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 예컨대 엄격한 혼성화 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화될 수 있는 단일-가닥 핵산 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 프로브는 표지 프로브이고, 이 경우 그것에 결합되는 검출가능한 시그널을 갖는다. 일부 구체예에서, 검출가능한 시그널은 라벨, 예컨대 염료이다. 일부 구체예에서, 검출되는 프로브의 양은 시료 중에 존재하는 중합체의 잔량을 나타낸다. 일부 구체예에서, 프로브는 검출될 수 있는 합텐 분자, 방사성 분자 또는 형광성 분자를 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "혼성화할 수 있다"는 것은 주어진 조건, 예컨대 엄격한 혼성화 조건 하에서 핵산 스트랜드에 대해 듀플렉스 상태에 친화적인 역-평행 핵산 스트랜드 간에 왓슨-크릭-형(Watson-Crick-type) 수소결합이 형성될 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "태그를 검출한다"는 것은 본 발명에 사용되는 태그의 측정 및 정량화를 허용하는 방법을 지칭한다. 일부 구체예에서, 태그가 올리고뉴클레오티드 분자인 경우 검출은 증폭 반응(예컨대, 중합효소 연쇄 반응의 이용)을 사용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서 태그가 올리고뉴클레오티드 분자인 경우, 검출은 비-증폭 반응(예컨대, 표지 프로브의 이용 또는 올리고뉴클레오티드 분자 또는 프로브에 결합되는 검출가능한 부분, 예컨대 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자의 이용)을 포함한다. 다른 구체예에서, 태그는 올리고뉴클레오티드 대신에 후속적으로 검출될 수 있는 중합체에 결합된다. 따라서, 검출가능한 부분은 예컨대 중합체에 결합될 수 있는 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "증폭 반응"은 초기 분자의 수가 더 큰 수의 분자로 증가되도록 하는 방법론을 지칭한다. 일부 구체예에서, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응을 이용한다.

본 명세서에서, 용어 "반응성 기"는 주어진 조건 하에서 나머지 분자 내의 원자 보다 다른 분자와 주도적으로 반응하는 분자 내의 일 세트의 원자를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 올리고뉴클레오티드 분자의 "제 2 구조"는 단일 핵산 분자 내에서 염기 대합(basepairing) 상호작용에 의해 생성된 3-차원 형태를 지칭한다. 일반적으로, 핵산 분자의 경우, 제 2 구조는 질소 염기 사이에서 수소 결합에 의해 생성된다. 본 발명에 따른 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 분자는 제 2 구조가 없는 것이 바람직하다. 핵산 분자 중에서 제 2 구조는 당업자에게 공지되거나 본 명세서에 기술된 하나 이상의 소프트웨어 도구를 이용하여 쉽게 예상될 수 있다.

II. 중합체를 이용하여 목적하는 바이오 분자를 정제하는 예시적인 방법

일반적으로 예컨대 단백질(예컨대, 재조합 단백질 또는 항체)와 같은 목적하는 바이오 분자는(예컨대, 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 사용하는 것에 의해) 숙주 세포 내에서 단백질을 발현시킨 후 단백질을 정제하는 방법을 이용하여 정제될 수 있다.

어떤 경우, 소망하는 숙주 세포 라인은 소망하는 수준에서 단백질을 발현하기 위하여 바이오리액터 내에서 성장시킨다. 예시적인 숙주 세포 라인은 중국 햄스터 난소세포주(Chinese hamster ovary)(CHO) 세포, 골수종(NSO) 세포, 박테리아 세포 예컨대 E.coli 및 인섹트 세포를 포함한다. 일단 단백질이 소망하는 수준에서 발현되면, 숙주 세포로부터 단백질이 제거되어 채취(harveste)된다. 세로, 세포 단편, 지질 및 기타 불용성 물질과 같은 현탁된 미립자는 전형적으로 여과 또는 원심분리에 의해 단백질-함유 유체로부터 제거됨으로써 다른 가용성 불순물 뿐만 아니라 목적하는 단백질을 용액 중에 함유하는 정화된 유체가 된다.

제 2 단계는 전형적으로 공정에서 유래하는 하나 이상의 불순물을 제거하가 위해 채취된 단백질을 정제하는 것을 포함한다. 그러한 불순물의 예는 예컨대 숙수 세포 단백질(HCP, 소망하거나 또는 표적화된 단백질 이외의 단백질임), 핵산, 엑도톡신, 바이러스 및 단백질 응집물을 포함한다. 이러한 정제 공정은 전형적으로 다공성 아가로스, 중합체 또는 유리와 같은 고체 매트릭스 상에서 친화성, 이온 교환 소수성 상호작용 등을 포함할 수 있는 몇 개의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예시적인 정제 공정은 도 2에 도시되어 있다.

단백질을 정제하기 위한 다른 대안적인 방법이 최근 개발되어 왔다. 그러한 방법은 응집 기술(예컨대 WO2008/091740호 참조)을 포함한다. 이 기술에서, 불순물을 포획하기 위하여 가용성 고분자전해질이 정화되거나 또는 비정화된 세포 배양 브로스에 부가됨으로써 응집물이 형성되고, 방치되고 나서 후속적으로 단백질 용액으로부터 제거된다.

공동 계류 중이고, 전체로서 참고문헌으로 삽입되는 미국특허 공개 제20090036651호에는 온도 또는 pH와 같은 특정 조건 하에서 가용성인 중합체가, 가용성인 상태에서 하나 이상의 불순물과 선택적으로 결합하고 나서 하나 이상의 불순물을 제거하는 조건(pH 또는 온도 등)으로 변화시키면 침전되도록 사용되는 것이 개시되어 있다. 목적하는 바이오 분자는 추가로 전통적인 크로마토그래피 또는 막 흡수제 등으로 처리될 수 있다.

도 1은 하나 이상의 불순물과 결합할 수 있는, 폴리(4-비닐피리딘)와 같은 pH 의존성 중합체에 적용된 비-제한적인 정제 공정의 개략도를 도시한다. 제 1 단계에서, 혼합물은 용액 중 선택된 중합체를 유지하도록 정확한 파라미터로 컨디셔닝된다. 대안으로, 혼합물의 조건이, 이미 중합체가 혼합물 중에서 용해되도록 되는 경우이면 추가의 컨디셔닝이 요구되지 않을 수 있다. 또한 중합체는 컨디셔닝되지 않은 혼합물에 고체로서 부가된 후, 혼합물(고체 중합체 함유)은 혼합물 중 중합체를 용해하도록 정확한 파라미터로 컨디셔닝될 수 있다. 제 2 단계에서, 중합체가 혼합물에 부가되고 혼합물의 다양한 구성물과 접촉하도록 용액 내로 진입하게 된다. 제 2 단계는, 예컨대 바이오리액터가 1회용 품목인 경우 바이오리액터 중에서 또는 필요한 경우 개별적인 지지 탱크 중에서 실행될 수 있는 것으로 여겨진다. 제 3 단계에서, 혼합물 조건은 중합체가 용액으로부터 침전되면서 하나 이상 성분의 혼합물을 유지하도록 변경된다. 이어서 혼합물 및 침전된 중합체는 제 4 단계에서 서로 분리된다. 침전물 및 잔류 혼합물은 원심분리 또는 여과에 의해 분리될 수 있다.

일부 구체예에서, 일단 세포 배양액이 정화되면, 목적하는 바이오 분자는 하전된 UF 막, 바이러스 제거/비활성화 단계, 최종 여과 단계 등의 존재 또는 비존재하에, 크로마토그래피 단계 예컨대, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 고성능 접선 흐름 여과법(affinity performance tangential flow filtration)(HPTFF)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 공지된 부가적인 공정 단계로 처리될 수 있다.

생물학적 함유(biological containing) 스트림으로부터 목적하는 바이오 분자를 정제하는데 중합체를 사용하면, 바람직하지 못한 양의 중합체가 스트림 내에 잔류할 수 있는 가능성이 존재한다. 필요한 경우, 이온 교환 수지, 활성 탄소, 알루미나, 규조토 등과 같이 혼합물로부터 잔류 중합체를 제거하는 물질을 함유하는 단계로 혼합물을 처리하는 것에 의해, 모든 중합체가 확실하게 혼합물로부터 제거되도록 하나 이상의 부가적인 단계를 수행할 수 있다. 그러나 잔류 중합체를 제거함에 있어서, 상기에 기술된 단계의 효율성을 따르면서 중합체의 잔량을 정량하기 위한 민감한 분석법을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법은 중합체의 잔량을 검출하고 정량하기 위한 향상되고 민감한 분석법을 제공한다.

이론에 구속됨이 없이, 본 발명에 따른 검출 방법은 목적하는 바이오 분자 및/또는 하나 이상의 불순물 중 하나, 또는 양자를 침전시키기 위한 중합체를 사용하는 임의의 정제 공정과 조합될 수 있으며, 기술된 바와 같이 검출가능한 올리고뉴클레오티드 또는 비-올리고뉴클레오티드 태그가 중합체에 결합될 수 있는 것으로 이해된다.

III. 목적하는 바이오 분자를 정제하는 방법에 사용하기 위한 예시적인 중합체

전체로서 참고문헌으로 삽입되는, 미국특허공개 제20080255027호, 제20090036651호, 제20090232737호 및 제20110020327호, 및 미국특허출원 제13/108576호에 개시된 것을 포함하는 중합체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

예시적인 중합체는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 아가로즈, 덱스트란, 폴리에틸렌 옥사이드, 히드록시알킬 셀룰로오스, 키토산, 폴리비닐피리딘, 비닐피리딘의 공중합체, 1급 아민 함유 중합체, 2급 아민 함유 중합체, 3급 아민 함유 중합체를 포함하는 군에서 선택된 양이온성 고분자전해질, 및 아크릴산 및 메틸 메타크릴레이트의 공중합체 및 메타크릴산 및 메틸 메타크릴레이트의 공중합체를 포함하는 군에서 선택된 음이온성 고분자전해질을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

예컨대 폴리(N-비닐 카프로락탐), 폴리(N-아크릴로일피페리딘), 폴리(N-비닐 이소부틸아미드), 폴리(N-치환된 아크릴아미드)(예컨대 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(N,N-디에틸아크릴아미드), 및 폴리(N-아크릴로일-N-알킬피페라진), 히드록시알킬셀룰로오스, 아크릴산 및 메타크릴산의 공중합체, 2 또는 4-비닐피리딘 및 키토산의 중합체 및 공중합체와 같은 하나 이상의 중합체는, 중합체에 결합되는 리간드 또는 관능기의 존재하 또는 부재하에서, 목적하는 바이오 분자 또는 하나 이상의 불순물과 선택적으로 또 가역적으로 결합함으로써 시료, 예컨대 생물학적 물질 함유 스트림 중에서 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하도록 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 중합체는 폴리비닐아민 중합체이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 중합체는 폴리알릴아민 중합체이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 중합체는 예컨대 전체로서 참고문헌으로 삽입되는 2011년 5월 16일자 출원된 미국특허출원 제13/108576호에 개시된 바와 같이 소수성기로 개질된 폴리알릴아민 중합체이다.

IV. 중합체에 결합하기 위한 올리고뉴클레오티드 분자를 확인하는 방법

본 발명에 기술된 중합체의 잔량을 검출하는 방법에서, 올리고뉴클레오티드 분자가 사용될 수 있다. 거의 동일한 뉴클레오티드 염기 분포(A:C:G:T - 1:1:1:1)를 갖고 4 이상 연속된 C 또는 G 염기가 없는, 잠재적 올리고뉴클레오티드 태그 서열 40 염기 길이의 라이브러리를 예컨대 소프트웨어를 이용하여 인 실리코에서 생성할 수 있다. 일단 잠재적 올리고뉴클레오티드 서열이 확인되면 생물학적 물질 함유 스트림 중에서 서열이 나타나지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 서열의 존재 또는 비존재가 컴퓨터(예컨대 숙주 세포 DNA의 게놈 서열에 대해 BLAST 서치를 러닝하는 것에 의해) 및/또는 실험적(예컨대 생물학적 물질 함유 스트림에 대해 혼성화 하는 것에 의해) 기법을 사용하여 입증될 수 있다. .

V. 올리고뉴클레오티드 분자로 중합체를 태그하는 방법

올리고뉴클레오티드는 할로겐, 에폭시, 히드록실, 아미노, 카르복시산 또는 설프히드릴와 같은 내부 또는 말단 반응성 기로 합성되고, 이어서 중합체에 결합될 수 있다. 또한, 내부 또는 말단 반응성 기를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 중합체로의 결합을 촉진하기 위해 예컨대 시아노겐 브로마이드, N-히드록시 숙신이미드 에스테르, 1,1'-카르보닐디이미다졸, 카르보디이미드 EDC, 글리시딜, 유기 술포닐 클로라이드, 아즈락톤, 시나누르산 염화물, 및 말레이미드와 같은 다양한 커플링 화학으로 추가로 활성화될 수 있다(예컨대 Immobilized affinity ligand techniques. Hermanson, Mallia 및 Smith 1992 참조).

일부 구체예에서, 3'-말단 아미노 기를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 대하여, 말단 요오드기와 결합하여 후속적으로 폴리비닐피리딘 중 피리딘과 반응함으로써 올리고뉴클레오티드를 중합체에 공유결합하도록 1,1'-카르보닐디이미다졸로 활성화된 요오드아세트아미드가 사용될 수 있다. 또한 말단 글리시딜 기가 3'-말단 아미노 기를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 후속적으로 폴리비닐피리딘 중 피리딘과 반응함으로써 올리고뉴클레오티드가 중합체에 공유결합하도록 에피클로로히드린이 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 특정 구체예는 임의로 제한하고자 하는 것은 아니다.

VI. 비-올리고뉴클레오티드 분자로 중합체를 태그하는 방법

일부 구체예에서, 중합체는 예컨대 방사성 분자, 형광성 분자 또는 합텐 분자와 같은 비-올리고뉴클레오티드 분자로 태그된다. 일부 구체예에서, 분자는 공유결합을 통해 중합체와 직접 반응할 수 있는 말단 또는 내부 반응성 기를 갖는다. 하나의 구체예에서, 분자의 말단 또는 내부 기는, 공지된 단백질 화학 방법, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르(NHS-에스테르), 산 플루오라이드, 테트라플루오로페닐 에스테르(TFP-ester), 또는 STP-에스테르의 형성에 의해 활성화될 수 있으며, 이것은 산 아미드의 형성으로 중합체의 아미노 또는 피리딘 작용과 반응한다(예컨대 Immobilized affinity ligand techniques. Hermanson, Mallia and Smith 1992 참조). 커플링 반응은 pH 5 내지 pH 12의 pH에서 수성 용액 또는 메탄올, 디메틸 포름아미드(DMF) 또는 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 유기 용액 중에서 수행될 수 있다. 하나의 구체예에서, 커플링 반응은 실온(약 20℃ 내지 약 60℃)에서 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 태그로서 사용될 수 있는 형광성 분자의 예는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산; 아크리딘 및 유도체: 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트; 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-l-술폰산(EDANS); 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5-디술포네이트; N-(4-아닐리노-l-나프틸)말레이미드; 안트라닐아미드; BODIPY; 알렉사; 플루오레시엔(fluorescien); 콘쥬게이트된 다중-염료; 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow); 쿠마린 및 유도체; 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, Coumarin 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(Coumaran 151); 시아닌 염료; 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5'5"-디브로모피로갈롤-술포나프탈레인(Bromopyrogallol Red); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산; 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드(DNS, 댄실클로라이드); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(D ABITC); 에오신 및 유도체; 에오신, 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 및 유도체; 에리트로신 B, 에리트로신, 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체; 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2',7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC, (XRITC); 플루오레사민; IR144; IR1446; Malachite Green 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로자닐린; 페놀 레드; B-피코에리트린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체: 피렌, 피렌부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌; 부티레이트 퀀텀 도트; Reactive Red 4(Cibacron™ Brilliant Red 3B-A) 로다민 및 유도체: 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민(R6G), lissamine 로다민 B 술포닐 클로라이드 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101, 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체(Texas Red); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA); 테트라메틸 로다민; 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로졸산; 테르븀 킬레이트 유도체; Atto 염료, Cy3; Cy5; Cy5.5; Cy7; IRD 700; IRD 800; La Jolla Blue; 프탈로 시아닌; 및 나프탈로시아닌을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 광학적으로-검출가능한 부분도 본 발명의 방법에서 태그로서 사용될 수 있다.

태그로서 사용될 수 있는 방사성 분자의 예는 동위원소 함유 분자 ¹⁴C, ³H, ⁴⁵Ca, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ³⁶Cl, ¹²⁵I, ³²P, ³³P, 및 ³⁵S을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

태그로서 사용될 수 있는 합텐 분자의 예는 DNP-X, SE, 6-(2,4-디니트로페닐)아미노헥사노익산, 숙신이미딜 에스테르(INVITROGEN), DSB-X™ 비오틴 C₂-요오드아세트아미드(데스티오비오틴-XC2-요오드아세트아미드)(INVITROGEN) 및 5(6)-플루오레세인 이소티오시아네이트 혼합된 이성체(THERMO SCIENTIFIC)을 포함한다.

VII. 비친화성 태그를 제거하는 방법

태그로 중합체를 태깅한 후에, 시료로부터 비친화성 태그를 제거하는 것이 바람직하다. 예컨대, DNA 태그된 PVP 용액은 음이온 교확막, 예컨대 Chromasorb?(MILLIPORE, Billerica, Mass.)을 통해 여과시킨 후 DMF 및 물(50:50 부피비)의 용액으로 예비-평형화하는 것에 의해 비-콘쥬게이트된 DNA 태그의 제거를 위해 정제될 수 있다.

용액으로부터 비-콘쥬게이트된 태그(올리고뉴클레오티드 또는 비-올리고뉴클레오티드)의 제거는 침전을 통해 달성될 수 있다. 예컨대, 비콘쥬게이트된 태그가 상청액에 유지되면서 태그된 중합체가 침전하도록 특정 부피비에서 태그된 중합체 함유 용액과 용매가 혼합된다. 대안으로, 태그된 중합체의 유지를 촉진시키면서 비콘쥬게이트된 태그를 침전시키는 적당한 조건이 선택될 수 있다. 당업자는 루틴한 실험으로 당업계에 알려진 지식을 기초로 적당한 조건을 쉽게 특정할 수 있을 것이다.

초미세여과/정용여과 막은 목적하는 생성물이 유지되면서 비친화성 태그와 같이 저분자량 물질이 여과물 내로 통과하도록 노미널(nominal) 분자량 컷-오프("NMWCO")를 기초로 선택될 수 있다. 당업자는 루틴한 실험을 반복하여 목적하는 생성물의 크기 및 성질을 기초로 막을 선택할 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 태그가 올리고뉴클레오티드 10-60 염기 크기이고, 중합체가 폴리(4-비닐 피리딘) 200,000Da 크기인 경우, 30의 NMWCO을 갖는 Millipore Centricon Plus-70? unit을 사용하여 초미세여과/정용여과가 수행될 수 있다. 겔 투과 크로마토그래피 컬럼은, 더 큰 분자량 물질 예컨대 중합체가 정지 상의 포어 구조 내에서 더 적은 시간을 소비하고 더 빨리 용출되며, 더 작은 분자량 물질, 예컨대 비-친화된 올리고뉴클레오티드가 포어 구조 중에서 더 많은 시간을 소비하고 더 느리게 용출되도록 배제 분자량을 기초로 선택될 수 있다. 당업자는 루틴한 실험을 반복하여 목적하는 물질의 크기 및 성질을 기초로 컬럼을 쉽게 선택할 수 있다.

특정 구체예에서, 태그가 올리고뉴클레오티드 10-60 염기 크기이고 중합체가 폴리(4-비닐 피리딘) 200,000kDa 크기인 경우, 겔 투과 크로마토그래피는 400,000 Da의 배제 분자량을 갖는 SHOWA DENKO K.K GPC KF-804L 컬럼을 사용하여 수행될 수 있다.

VIII. 중합체와 친화성인 올리고뉴클레오티드 분자를 검출하는 방법

상기에 기술된 바와 같이 중합체 상에 올리고뉴클레오티드 분자가 결합되고 이어서, 비친화성 분자를 제거한 후에, 친화성 분자가 증폭 반응 또는 비-증폭 반응을 이용하여 검출될 수 있다. 증폭 반응의 경우, 분자의 5' 및 3' 부분에 혼성화하는 프라이머가 선택된다. 예컨대, 프라이머는 분자 서열이 유리되거나 또는 중합체-콘쥬게이트된 형태로 증폭되고 증폭 반응, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 검출되도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 증폭 생성물은 크로싱 쓰레스홀드 값(crossing threshold value)(Ct)을 얻기 위한 분자를 기초로 하는 형광의 직접 측정에 의해 가시화될 수 있다. 측정된 Ct 값은 공지된 농도의 분자로부터 생성된 캘리브레이션 곡선을 이용하여 시료 중에 존재하는 분자의 농도를 검출하도록 사용될 수 있다.

비-증폭 반응의 경우, 올리고뉴클레오티드 분자의 검출을 위해 표지 프로브가 사용될 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드 분자 자체가 예컨대, 합텐태그, 형광성 태그 또는 방사성 태그와 같은 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 분자와 혼성화하는 프로브가 검출가능한 부분으로 표지된다.

VIII. 중합체와 친화성인 비-올리고뉴클레오티드 분자를 검출하는 방법

예컨대, 형광성 태그, 방사성 태그 또는 합텐 태그와 같은 비-올리고튜클레오티드 분자를 중합체에 결합한 후에, 임의의 비친화성 분자를 제거하고 나서 친화성 분자가 태그로서 사용되는 분자에 따라 다양한 기법을 이용하여 검출될 수 있다. 예시적인 검출 방법은 방사성 검출, 흡광도 검출, 예컨대 UV-가시광선 흡광도 검출, 발광 검출, 예컨대 형광 또는 케미루미네슨스, 면역 분석법, 예컨대 ELISA 및 아비딘/스트랩트아비딘 검출 방법을 포함한다. 단일 분자로부터 형광을 센싱할 수 있는 장치는 주사형 터널 현미경(siM) 및 원자간력 현미경(AFM)을 포함한다. 방사성 시그널에 대하여, 포스포이미저(phosphorimager) 장치가 사용될 수 있다. 이미지화 기구의 다른 상업적 공급처는 General Scanning Inc.(Watertown, Mass), Genix Technologies(Waterloo, Ontario, Canada) 및 Applied Precision Inc을 포함한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해서 추가로 설명되며, 실시예로 한정되는 것은 아니다. 모든 문헌, 특허 및 특허공개문헌의 내용 뿐만 아니라 도면이 참고문헌으로 삽입된다.

실시예

실시예 1: 중합체에 콘쥬게이션하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열의 선택

거의 동일한 뉴클레오티드 염기 분포(A:C:G:T - 1:1:1:1)를 갖고 4 이상 연속된 C 또는 G 염기가 없는, 40 염기 길이의 50 이상 잠재적 올리고뉴클레오티드 태그 서열의 라이브러리를 예컨대 소프트웨어를 이용하여 인 실리코에서 생성하였다.

올리고뉴클레오티드 태그 라이브러리의 멤버는 37℃, 1mM MgC1₂, 및 50mM NaCl에서 리니어 DNA에 대한 예상을 선택하고, 프로그램 M-fold(Zuker M. 2003. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization rediction. Nucleic Acids Res. 31: 3406)을 이용하여 제 2 구조에 대해서 스크리닝하여, 하기 표 I에 도시된 바와 같이, 예상되는 구조의 융점에 의해서 더 낮은 것이 더 좋은 것으로 우선 순위를 두었다.

이어서 선택된 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 중합체에 콘쥬게이션하기 위하여 다양한 내부 또는 말단 반응성 기로 화학적 합성하였다.

표 I

표 I은 G 및 C 뉴클레오티드(%GC)의 조합된 퍼센트 분획, PCR 조건 하에서 예측된 듀플렉스 용융 온도(hybrid Tm), 및 예측된 헤어핀 용융 온도(hairpin Tm)를 갖는 랜덤 40-mers를 나타낸다. 가장 낮은 헤어핀 용융 온도(강조 표시됨) 서열을 프라이머 디자인으로 선택하였다.

PCR 증폭(Tm ~ 55℃)을 위한 프라이머 매칭을 고안하고 잠재적 태그 올리고뉴클레오티드 앰플리콘(amplicons)을 태그 표적을 함유하는 반응과 함유하지 않는 반응 사이의 사이클 크로싱(cycle crossing)(Ct) 차이를 이용하여 랭크하였다. 표적을 갖는 것과 갖지 않는 반응 사이에 가장 큰 차이를 제공하는 올리고뉴클레오티드 태그를 중합체 상에 콘쥬게이션하기 위해 선택하였다.

선택된 올리고뉴클레오티드 태그 서열은 중합체에 콘쥬게이션하기 위한 선택적 반응성 기로서 결합된 3' 아미노 개질제와 함께 1μmole 또는 더 큰 스캐일로 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies)(IDT)을 이용하여 합성하였다.

실시예 2: 목적하는 바이오 분자를 정제하기 위해 사용되는 폴리(4-비닐피리딘) 중합체로부터 잔류하는 단량체의 제거

대표적 실험에서, 본 발명의 방법에 사용하기 전에 폴리(4-비닐피리딘)로부터 잔류하는 4-비닐 피리딘 단량체를 제거하였다. SCIENTIFIC POLYMER PRODUCTS, INC사로부터 입수한 분자량 200,000을 갖는 선형 폴리(4-비닐피리딘)(PVP)을 유리 접시에 균일하게 펴고 진공 오븐에 방치하였다. 오븐 내 대기는 임의의 산소를 제거하기 위해 아르곤으로 5분 동안 몇 번 퍼지하였다. 오븐 내 압력은 기계적 진공 펌프를 이용하여 0.1 머큐리(mercury)로 감소시키고 이어서 온도는 약 120℃로 승온시켰다. 중합체를 총 24시간 동안 이러한 조건으로 처리하였다. 이때 오븐 내 대기는 아르곤으로 5분 동안 몇 번 퍼지하였다. 가열 시간 말미에 오븐 온도를 실온으로 내리고, 오븐은 도어를 열기 전에 아르곤으로 몇 번 퍼지하였다. 얻어진 중합체는 인식가능한 냄새를 갖지 않은 반면, 미처리된 중합체는 뚜렷한 냄새의 4-비닐 피리딘 단량체를 갖는다. 처리된 중합체 중에 존재하는 4-비닐 피리딘 단량체의 잔량은 겔투과 크로마토그래피에 의해 검출할 수 없지만, 미처리된 중합체는 약 0.05%(w/w) 잔류하는 4-비닐 피리딘 단량체를 갖는다.

실시예 3: 요오드아세트아미드 화학을 이용하여 DNA 태그로 폴리(4-비닐피리딘) 중합체의 개질

폴리(4-비닐피리딘)으로부터 잔류하는 단량체를 제거한 후에, DNA 태그로 중합체를 태그하였다. 대표적 실험에서, 40 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 태그를 사용하였으며, 이것은 하기 서열을 갖는다: 5'-GTT ATC GGATTC TTA ATA GGA ACA CAC TCT ATC TCA CCC G/3AmM/-3'(SEQ ID NO:l), 표 1에서 ID 36으로 도시되며, 1급 아민 기로 개질된다.

요오드아세트아미드(Ultragrade), 1,1'-카르보닐디이미다졸(≥97%), 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(DMF), 및 디메틸 술폭시드(DMSO, 무수, ≥99.9%)을 SIGMA으로부터 입수하였다. 약 5.56mg의 요오드아세트아미드를 0.5ml의 무수 DMSO 중에 용해된 4.48mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸로 활성화시켰다. 반응은 광으로부터 보호하여 약 1 시간 동안 실온에서 수행하였다. 상술한 약 3.71mg의 DNA 태그를 100㎕의 탈이온수(DI)에 용해시킨 후 0.4ml DMSO을 적가하였다. 약 0.5ml의 DNA 태그 용액을 0.5ml의 활성화된 요오드아세트아미드 용액과 혼합하고 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 생성물, 요오드 말단화된 DNA 태그는 0.5ml의 아세토니트릴을 이용하여 침전시키고 2분 동안 2500rpm에서 원심분리하는 것에 의해 펠렛으로 수집하였다. 과량의 미-반응된 요오드아세트아미드는 상청액에 잔류하고, 용액은 폐기하였다. 펠렛을 1ml 아세토니트릴로 세척하고 1.0ml의 탈이온수에 재용해시켰다. 후자를 2ml DMF에 용해된, 실시예 2로부터 50mg PVP 용액에 적가하였다. 혼합물을 24시간 동안 약 60℃의 온도에서 반응시켰다.

실시예 4: 에피클로로히드린을 이용하여 DNA 태그로 폴리(4-비닐피리딘) 중합체의 개질

폴리(4-비닐피리딘)으로부터 잔류하는 단량체를 제거한 후에 올리고뉴클레오티드 DNA 태그로 중합체를 태그하였다. 대표적 실험에서 40 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 태그를 사용하고 이것은 하기 서열을 갖는다: 5'- GTT ATC GGATTC TTA ATA GGA ACA CAC TCT ATC TCA CCC G/3AmM/-3'(SEQ ID NO:l), 1급 아민 기로 개질된다.

에피클로로히드린(99%), 디에틸에테르, 디메틸포름아미드(DMF), 에틸아세테이트(ACS reagent grade), 메탄올(ACS reagent grade), 소듐 테트라보레이트(99%) 및 소듐 히드록사이드(0.1N)를 SIGMA로부터 입수하였다. 약 2.97mg의 상술한 DNA 태그를 1ml 소듐 테트라보레이트 용액(20mM, pH 9.2)에 용해시킨 후 3 ㎕의 에피클로로히드린을 함유하는 0.2ml DMF를 부가하였다. 반응은 실온에서 약 1시간 동안 수행되었다. 이어서 과량의 미-반응된 에피클로로히드린을 제거하기 위해 용액은 2ml 디에틸에테르의 3 부분으로 추출하였다. 정제된 용액을 실시예 2로부터 3g의 PVP을 함유하는 30ml DMF의 용액에 적가하였다. 혼합물을 24시간 동안 약 50℃에서 반응시켰다.

실시예 5: DNA 태그된 폴리(4-비닐피리딘) 중합체로부터 과량의 DNA 태그의 제거

실시예 4로부터 DNA 태그된 PVP를 동일 부피의 에틸아세테이트 용액을 사용하여 침전시키고 동일 부피의 메탄올 내에 재용해시키며 비콘쥬게이트된 DNA 태그를 제거하기 위해 동일 부피의 0.1M NaOH을 이용하여 마지막으로 침전시켰다. 이어서 침전물을 6wt%의 최종 농도로 DMF 및 물(50:50 부피비)의 혼합물에 용해시켰다.

실시예 6: 폴리(4-비닐피리딘) 중합체에 콘쥬게이트된 DNA 태그의 정량

과량의 DNA 태그를 제거한 후에, PVP에 콘쥬게이트된 태그의 양을 정량하였다. 비콘쥬게이트된 DNA 태그의 연속 희석 표준(Serial dilution standard)은 25㎕의 최종 부피 중 2㎕의 시료로 0.9μM의 각 프라이머, 12.5㎕ Fast SYBR Green Master Mix(APPLIED BIOSYSTEMS)을 이용하여 하기 증폭 조건에 따라 증폭하였다: 60초 동안 95℃의 1 변성 사이클(denaturation cycle); 2초 동안 95℃의 50 사이클; 및 30초 동안 50℃, 이어서 30초 동안 50℃에서 최종 확장(extension). 증폭 생성물은 크로싱 쓰레스홀드 값(Ct)을 얻기 위해 형광을 직접 측정함으로써 가시화하였다.

공지된 부피의 공지 중합체 농도는 1 : 100 이상 희석한 이후에 증폭하고, 얻어진 Ct는 콘쥬게이트된 중합체의 시료 중에서 복제물(copies)의 수를 얻기 위해 비콘쥬게이트된 중합체를 이용하여 생성된 표준 곡선에서 얻은 것과 비교하였다. 이것은 폴리(4-비닐 피리딘) 중합체의 분자 당 DNA 태그 복제물의 수를 계산할 수 있도록 한다. 파일롯 배치(pilot batches)에 대하여, 콘쥬게이션 비는 200 중합체 분자 당 대략 1 DNA 태그인 것으로 측정되었다.

실시예 7: 비정화된 세포 배양액의 pH 조정

비-발현 중국 햄스터 난소세포주(CHO) 세포 라인으로부터 유도된 세포를 10L의 배양 매질 중 lOxlO⁶cells/ml의 밀도로 바이오리액터(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC) 내에서 성장시키고 64% 생존활성(viability)에서 채취하였다. IgG를 1.0gL의 농도로 스파이크하고 숙주 세포 단백질(HCP)의 농도는 385669ng/mL로 검출되었다. 액의 pH는 7.2이었다. 비정화된 세포 배양액의 pH는 정제 공정을 시작하기 전에 0.17ml의 3.0M 아세트산을 이용하여 4.5로 조정하였다.

실시예 8: 아세트산 내에서 정제되고 DNA 태그된 PVP 용액의 제조

실시예 5로부터의 용액을 24시간 동안 60℃ 온도에서 작동되는 진공 오븐에서 건조하였다. 잔류 고체를 실온에서 1시간 동안 연속 교반하여 3M 아세트산 중에서 15wt%의 최종 농도로 재구성하였다.

실시예 9: 다운스트림 공정 모니터링을 위한 올리고뉴클레오티드 태그-콘쥬게이트된 중합체의 사용

실시예 8로부터 0.5ml의 PVP 용액과 0.56g 암모늄 술페이트를 실시예 7로부터 10ml의 비-정화된 세포 배양액에 부가하고 비용해성 불순물, 예컨대 세포 및 세포 부스러기 뿐만 아니라 용해성 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, 핵산 등과 결합하는 것을 허용하기 위해 5분 동안 실온에서 혼합하였다. 이어서 0.08g 암모늄 술페이트를 함유하는 1.45ml의 2M 트리스를 이용하여 혼합물의 pH를 8.5로 조정하는 것에 의해 중합체-불순물 착물이 침전하고, 이것은 소망하는 생성물(IgG)이 착물에 결합하는 것을 허용한다. 분산된 고체 현탁액 형태의 침전물은 연속적으로 10분 동안 액 내에서 혼합하였다. 이어서 IgG 착물을 함유하는 침전물을 원심분리(1분 동안 4000rpm)에 의해 수집하고 느슨하게 결합된 불순물을 제거하기 위해 1M 암모늄 술페이트(10mM Tris, pH 8.5)로 세척하였다. 세포, 세포 부스러기 및 다른 용해성 불순물은 침전물에 결합된 상태로 남지만, IgG은 20분 동안 혼합한 후 0.2μm Durapore? 필터로 여과하면서 pH 5.3(100mM 소듐 아세테이트)에서 침전물로부터 선택적으로 용출하였다. 이러한 조건 하에서 원 시료에 존재하는 93%의 IgG가 중합체에 결합되며 용출한 후 회수된 IgG의 퍼센트는 80wt%이었다.

정제 공정의 다른 단계에서 잔류하는 PVP는 실시예 6 및 도 6에 개시된 바와 같이 정량하였다. 정제 공정을 통해 분획이 이동하기 때문에, 태그가 없는 대조군과 유사하게, 모든 희석에 대해서 곡선은 약 48의 크로싱 쓰레스홀드(Ct)로 편평화되기 시작했다.

실시예 10: 비정화된 비-발현 세포 배양액(CCF)의 제조

대표적 실험에서, 단일클론 IgG₁을 발현하는 중국 햄스터 난소세포주(CHO) 세포 라인으로부터 유도되는 세포를 10L 바이오리액터(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)에서 13x10⁶cells/mL의 밀도로 성장시키고 < 50% 생존활성에서 채취하였다. 항체 역가(titer)는 단백질 A HPLC을 통해 0.7mg/mL으로 측정되었다. 숙주 세포 단백질(HCP)의 레벨은 ELISA (CYGNUS #F550)을 이용하여 141800ng/mL인 것으로 밝혀졌고 DNA 농도는 PicoGreen? 분석법에 의해 11.9ug/mL인 것으로 측정되었다. 비정화된 세포 배양의 pH는 7.2었다.

실시예 11: 자극 응답성 중합체를 기초로 소수성으로 개질된 폴리알릴아민의 제조

본 발명의 대표적 실험에서, 본 발명에 기술된 중합체는 거대 스캐일상에서 쉽게 제조될 수 있는 것으로 입증되었다.

폴리알릴아민(PAA, NITTOBO, 150kD; 40%wt./wt.) 용액을 이용하여 소수성으로 개질된 자극 응답성 중합체가 하기와 같이 제조되었다.

500g의 폴리알릴아민(PAA, NITTOBO, 150 kD; 40%wt./wt.)(약 200g의 폴리알릴아민)을 4 리터 유리 용기에 부가하였다. 이어서, 80g의 NaOH 펠렛 및 1000mL의 탈이온수를 용해하고 용기에 부가하였다. 이어서 공-용매로서 1000mL 1,2-디메톡시에탄(SIGMA)을 부가하고 용액을 균질해질 때까지 급격하게 교반하였다. 이어서 114g의 벤질클로라이드(ACROS 또는 GANICS, 99%)를 반응 용기에 부가하였다. 용액을 마그네틱 교반하면서 16시간 동안 60℃에서 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고 10리터 비이커에 이동시켰다.

이어서, 1000mL의 탈이온수를 교반하면서 부가하고 점성 고체 매스가 용액으로부터 침전하였다. 생성물은 추가로 200mL의 2M 소듐 포스페이트를 부가하여 침전시키고 고체를 수집하여 탈이온수로 세척하였다. 중합체는 추가로 하기 방법에 의해 정제될 수 있다.

고체를 교반하면서 3 리터의 1M 아세트산에 용해시켰다. 총 부피는 탈이온수로 10 리터로 만들고, pH는 50% NaOH를 적가하여 7로 조정하였다. 생성물은 800g의 2M 소듐 포스페이트를 부가하여 침전시키고 고체를 수집하여 탈이온수로 세척하였다. 중합체는 하기 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다. 고체를 교반하면서 3 리터의 1M 아세트산에 용해시켰다. 총 부피는 탈이온수로 10 리터로 만들고 pH는 50% NaOH를 적가하여 7.0으로 조정하였다. 생성물은 800g의 2M 소듐 포스페이트를 부가하여 침전시키고 고체를 수집하여 탈이온수로 세척하였다.

얻어진 고체 매스를 3일 동안 65℃에세 진공 오븐 중에 건조하였다. 건조된 중합체는 액체 질소로 냉각하고 미세 분말로 분쇄하며, 1일 동안 추가로 건조하였다. 얻어진 건조 분말의 매스는 250g이었다. 작은 시료를 1M CD₃COOD/D₂O 산에 용해시키고 ¹H-NMR 스펙트럼을 얻었다. ¹H-NMR 피크를 통합하여 벤질 개질(modification) 양이 33%인 것으로 측정되었다.

얻어진 분말을 10% w/w 용액이 되도록 1M 아세트산에 용해하였다. 얻어진 용액은 0.5% 중합체 용액의 5mL 시료에 2M 소듐 포스페이트 또는 0.2M 소듐 시트테이트를 적가하는 것에 의해서 다가 이온 자극에 대한 민감성에 대해 시험하였다. 포스페이트 또는 시트레이트 이온을 부가하면 백색 침전물이 얻어짐으로써 중합체가 다가 음이온 자극에 응답성인 것으로 나타났다.

실시예 12: 형광 태그로 소수성 개질된 폴리알릴아민 자극 응답성 중합체의 표지화

실시예 11로부터 얻어진 중합체를 하기 방법에 의해 형광성 태그로 표지하였다. 2g의 고체 중합체를 10mL의 1M 아세트산에 부가하고 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 얻어진 용액 부피를 탈이온수 부가에 의해 100mL로 증가시켰다. 용액의 pH는 4M NaOH의 부가에 의해 8.5로 조정하였다. 6mL DMF에 12mg의 N-(4,4-디플루오로-l,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-2-일)요오드아세트아미드(BODIPY? 507/545 IA)(INVITROGEN)을 부가하는 것에 의해 반응성 염료 용액을 제조하였다. 침전 이후 즉시, 반응성 염료 용액을 급격하게 교반하면서 중합체 용액에 부가하였다. 반응 용액을 1시간 동안 50℃에서 회전시켰다. 이어서, 용액을 원심분리하고 상청액을 디캔트하고 폐기하였다. 적색 펠렛을 50mM 포타슘 포스페이트 pH 7 중에서 재현탁하고 교반하였다. 이어서 용액을 원심분리하고 상청액을 디캔트하고 폐기하였다.

적색 고체 중합체를 10mL의 1M 아세트산에 용해하는 것에 의해 추가로 정제하였다. 얻어진 오렌지/적색 용액 부피를 탈이온수를 부가하는 것에 의해 500mL로 증가시켰다. pH를 7로 조정하고 용액을 2M 포타슘 포스페이트를 적가하여 50mM 포타슘 포스페이트의 농도로 만들고 적색 침전물을 관측하였다. 1회 이상 정제를 반복하여 밝은 적색 고체 중합체를 회수하고 탈이온수로 세척하였다. 적색 고체를 2일 동안 50℃에서 진공 하에 건조하였다. 마지막으로, 1.27g의 건조된 적색 중합체를 미세 분말로 분쇄하고 1M 아세트산에 용해하여 5% w/w 용액을 얻었다.

실시예 13: 형광 태그로 자극 응답성 중합체의 잔량 검출

실시예 12로부터 BODIPY 507/545 태그된, 소수성으로 개질된 폴리알릴아민의 5% 용액을 이용하여, 1000, 100, 10, 1, 및 0.1ppm 고형분의 표준 용액 농축액을 탈이온수 중에서 제조하였다. 형광 분광광도계를 507nm의 여기 및 545nm의 방출로 셋팅하였다. 각 시료에 대하여 545nm에서 강도를 기록하고 도 7에 도시된 바와 같이 표준 곡선을 플롯팅하였다.

다가 음이온 자극을 이용한 중합체의 침전 효능 뿐만 아니라 잔류 중합체의 농도를 측정하기 위하여 하기 실험이 수행되었다.

5mL 탈이온수 중에 4000ppm의 태그된 중합체를 스파이크(spike)하였다. pH를 7로 조정하고 포타슘 포스페이트의 농도를 50mM로 만들었다. 이때, 적색 침전물을 분리하고 바이얼(vial)을 2분 동안 3000rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 상청액의 탁도는 46NTU으로 측정되었고, 상청액 중의 잔류 중합체는 형광 분광광도계에 의해 44ppm으로 측정되었다. 상청액을 0.22 micron Durapore Millex(MILLIPORE, 33mm)을 통과하여 여과시키고 여과물 중의 잔류 중합체는 형광 분광광도계에 의해 30ppm으로 측정되었다. 이 실험은 시료에 자극을 부가하고, 원심분리 및 여과함으로써 물 중에서 잔류 중합체가 99.25%의 높은 수준으로 제거되는 것을 나타낸다.

이러한 결과는 형광 태그를 포함하는 자극 응답성 중합체가 물에 부가될 수 있고 자극의 부가에 의해 불용성이 되며, 고체를 분리될 수 있어 잔류 중합체가 형광 분광광도계에 의해 측정될 수 있는 것을 입증한다.

실시예 14: 응집된 CHO 세포 배양 중에서 형광 태그로 자극 응답성 중합체의 잔량 검출

실시예 12로부터 BODIPY 507/545 태그된, 소수성 개질된 폴리알릴아민의 5% 용액을 이용하여, 1000, 100, 10, 1, 및 0.1ppm 고형분의 표준 용액 농축액을 탈이온수에서 제조하였다. 형광 분광광도계를 507nm의 여기 및 545nm의 방출로 셋팅하였다. 각 시료에 대하여 545nm에서 강도를 기록하고 실시예 13에 따라 표준 곡선을 플롯팅하였다.

CHO 세포 배양을 실시예 10과 유사한 방법을 이용하여 제조하였다. 자극이 가해진 양이온성 스마트 중합체를 이용하여 세포 배양의 응집 및 침전으로부터의 잔류 중합체를, 자극이 없는 양이온성 스마트 중합체를 이용하여 비교하였다. 0.1, 0.4 또는 0.6 w/v 투여량의 태그된 중합체를 15mL 원뿔형 튜브들 중의 5mL의 비정화된 CHO 세포 배양에 2회 부가하였다.

3개의 중합체 농도 중 일 시리즈는 2M 트리스 염기로 pH 7.2로 조정하였다. 포타슘 포스페이트 농도는 2M 포타슘 포스페이트의 적가에 의해 50mM로 증가시키고 용액을 교반하였다. 소듐 포스페이트 및 pH 조정은 세포, 세포 부스러기, 불순물, 잔류 중합체의 착물과 함께 자극 응답성 중합체를 침전시키는 것 뿐만 아니라 고체를 응집하고 입자 크기를 증가시키기 위해 수행하였다. 3개의 중합체 농도 중 제 2 시리즈는 단순하게 교반하고 자극을 가하지 않았다. 바이얼(vial)을 2분 동안 3000rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 상청액의 탁도를 기록하고 상청액을 0.22 micron Durapore Millex(MILLIPORE, 33mm)을 통과시켜 여과하였다. 여과물 중 잔류 중합체를 형광 분광광도계에 의해 측정하였다. CHO 세포 배양을 대조군으로서 사용하고 블랭크로서 빼내었다. 결과를 표 II에 요약하고 도 8에 도시하였다.

표 II 및 도 8에 개시된 바와 같이, 3개의 결과는 형광 태그를 포함하는 자극 응답성 중합체가 물에 부가될 수 있고, 자극의 부가에 의해 불용성이 되며, 고체는 분리되고 잔류 중합체가 형광 분광광도계에 의해 측정될 수 있다는 것을 입증한다. 또한 이 결과는 세포 배양 중 자극 응답성 응집물 또는 침전물에 자극을 부가하는 것에 의해 잔류 중합체에 대한 대조군의 장점을 입증한다.

표 II

실시예 15: 형광 태그로 태그된 자극 응답성 중합체의 검출 후 정화된 세포 배양으로부터 단일 클론 항체의 단백질 A 포획으로 사용

실시예 12로부터 BODIPY 507/545 태그된, 소수성 개질된 폴리알릴아민의 5% 용액을 이용하여, 1000, 100, 10, 1 , 및 0.1ppm 고형분의 표준 용액 농축액을 탈이온수에서 제조하였다. 형광 분광광도계를 507nm의 여기 및 545nm의 방출로 셋팅하였다. 각 시료에 대하여 545nm에서 강도를 기록하고 실시예 13에 따라 표준 곡선을 플롯팅하였다.

CHO 세포 배양을 실시예 10과 유사한 방법을 이용하여 제조하였다. 세포 배양을 실시예 12로부터 0.4% w/w BODIPY 507/545 태그된, 소수성 개질된 폴리알릴아민을 투여하고 응집시키는 것에 의해 정화하였다. 세포 배양의 pH를 2M 트리스 염기를 적가하여는 것에 의해 7.0으로 조정하였다. 이어서 최종 포타슘 포스페이트 농도가 50mM가 되도록 2M 포타슘 포스페이트를 부가하였다. 이때 용액 중에서 고체의 응집이 있었다. 용액을 원심분리하고 펠렛을 폐기하였다. 상청액을 0.22 micron Durapore filter(MILLEPORE)을 통해 여과하고 여과물을 수집하여 풀링하였다.

1mL의 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지(ProSep Ultra Plus?)를 0.66cm 내부 직경을 갖는 Omnifit 크로마토그래피 컬럼(DBA INDUSTRIES)에 패킹하여 2.9cm의 최종 베드 높이를 얻었다. 단백질 A 컬럼을 3분 체류 시간에서 35mgmL IgG의 밀도로 로딩하고 플로우 쓰루(flow through)를 수집하였다. 이어서 컬름을 50mM 트리스 pH 7.2로 세척하고 세척된 풀을 수집하였다. 이어서 IgG를 50mM 아세트산으로 5 컬럼 부피 용출하고 용출된 풀을 수집하였다. 용출된 풀로부터 280nm에서 흡광도를 기록하고, 흡광도로부터 수율이 매스 밸런스를 통해 97 퍼센트인 것으로 측정되었다. 최종적으로, 컬럼을 0.15M 인산으로 재생시키고 풀을 수집하였다. 시료를 2M 트리스 염기를 이용하여 pH 7.0으로 중화하였다.

형광 분광광도계를 507nm에서 여기 및 545nm에서 방출로 셋팅하였다. 각 시료에 대해 545nm에서 강도를 기록하였다. 표 III에 도시된 바와 같이 세포 배양 상청액 뿐만 아니라 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집된 각각의 풀에 대해 잔류 중합체를 정량하였다. 분석법에 대한 정량의 한계(limit)는 1.0ppm인 것으로 측정되었다.

이 결과는 형광성 태그된 스마트 중합체가 세포 배양 상청액에서 검출될 수 있고 표적 분자의 다운스트림 정제가 진행되는 동안 잔류 중합체 제거가 추적될 수 있다는 것을 입증한다.

표 III

실시예 16: 자극 응답성 중합체의 비오틴화

소수성 개질된 폴리알릴아민을 기초로 하는 자극 응답성 중합체를 실시예 11과 유사하게 합성하였다. 얻어진 중합체를 하기 방법을 이용하여 비오틴 태그로 표지하였다.

150,000Da의 분자량을 갖는 33% 벤질화된 폴리알릴아민의 5% w/w 용액 20g을 마그네틱 교반기가 장착된 1000mL 유리 비이커에 부가하였다. 부피는 탈이온수를 부가하여 200mL로 증가시키고 pH는 4M NaOH를 적가하여 9.5로 조정하였다.

반응성 비오틴 용액을 6mL의 디메틸포름아미드(DMF) 중에 15mg의 DSB-X™ 비오틴 C₂-요오드아세트아미드(데스티오비오틴-XC₂-요오드아세트아미드)(INVITROGEN)을 용해시키는 것에 의해 제조하였다. 반응성 비오틴 용액을 즉시 pH 조절된 33% 벤질화된 폴리알릴아민 용액을 함유하는 유리 비이커에 부가하였다. 얻어진 혼합물을 급격하게 교반하고 70℃로 승온하며 1시간 동안 이 조건에서 유지하였다. 이어서 혼합물을 실온으로 냉각하고 탈이온수로 1000mL로 희석하였다. 비오틴화된 중합체를 더이상 침전물이 관측되지 않을 때까지 2M 소듐 포스페이트를 적가하여 침전을 통해 분리하였다. 용액을 부직포 필터 물질을 통해 진공 여과하고 고체를 수집하면서 여과물을 폐기하였다. 고체 중합체 생성물을 100mL의 탈이온수로 세척하였다.

비오틴화된 생성물을 밤새 1M 아세트산의 50ml 중에 고체 매스를 용해하는 것에 의해 추가로 정제하였다. 용액을 2리터의 부피로 만들고 pH는 4M NaOH의 적가에 의해 7.0으로 조정하였다. 비오틴화된 생성물은 추가의 침전물이 관측되지 않을 때까지 2M 소듐 포스페이트를 적가하여 침전을 통해 분리하였다. 용액을 부직포 필터 물질을 통과시켜 진공여과하고 고체를 수집하면서 여과물을 폐기하였다. 고체는 100mL의 탈이온수로 세척하고 밤새 60℃에서 진공 오븐 중에 방치하였다.

얻어진 건조된 비오틴화된 생성물은 분말로 분쇄되고 최종 농도 5 % w/w로 1M 아세트산 및 0.05 몰 HCl 중에서 용해하였다.

얻어진 비오틴화된 스마트 중합체는 세포 배양 또는 단백질 함유 피드로부터 표적 분자를 증집 또는 정제하는데 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 일단 중합체가 세포 배양 또는 단백질 함유 피드에 부가되면 자극이 적용되고, 원심분리, 여과, 세틀링, 고체 액체 분리의 다른 방법 또는 이들 방법의 조합에 의하여 상청액로부터 고체 매스가 분리될 수 있다. 또한, 정화된 액은 정량 전 또는 이후에 잔류 중합체의 제거를 위해 특이적으로 고안된 필터를 통과할 수 있다. 최종적으로, 임의의 잔류하는 비오틴화된 스마트 중합체가 비오틴화된 분자를 검출하고 정량하기 위한 기존의 방법을 통해 검출되고 정량화될 수 있다. 효소 리포터(예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파제) 또는 형광성 프로브를 포함하는 검출 및 정량 방법은 아비딘/스트랩트아비딘-태그된 검출 방법을 포함할 수 있다. 또한 검출 및 정량은 예컨대 ELISA와 같은 면역분석법으로 수행될 수 있다.

검출 키트의 예는 THERMO SCIENTIFIC로부터 입수가능한 형광 비오틴 정량 키트(Quantitation Kit)를 포함한다. 사용될 수 있는 검출 키트의 다른 예는 ALPCO DIAGNOSTICS로부터 입수가능한 비오틴 ELISA 키트이다.

본 명세서는 참고문헌으로 삽입된 명세서에 기술 내용에 비추어 이해될 수 있다. 본 명세서에 포함되는 구체예는 본 발명의 구체예에 대한 설명을 위해 제공된 것이고 그 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 많은 다른 구체예가 본 발명에 포함되는 것을 쉽게 인식할 것이다. 모든 공개물 및 발명이 전체로서 참고문헌으로 삽입된다. 참고문헌으로 삽입되는 내용이 본 발명에 모순되거나 일치되지 않으면 본 발명이 그러한 내용 보다 우선할 것이다. 임의의 참고문헌에 대한 언급이 본원발명의 선행기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

다른 언급이 없는 한, 청구범위를 포함하여 본 명세서에서 사용되는 성분, 세포 배양, 처리 조건 등의 양을 나타내는 모든 수치는 용어 "약"에 의해 모든 경우 개질되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대의 언급이 없는 한, 수치 파라미터는 근사치이며, 본 발명에 의해 얻어지는 소망하는 물성에 따라 변경될 수 있다. 다른 언급이 없는 한, 일련의 구성요소 앞에 기재된 용어 "적어도"는 시리즈 내에 개시된 모든 구성요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일반적인 실험을 이용하여 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물에 대해 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 그러한 균등물은 첨부된 청구범위에 포함된다.

본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한 본 발명의 많은 변형 및 개질이 이루어질 수 있고, 이것은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 개시된 특정 구체예는 예시를 위해서만 제공된 것이고, 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로만 이해되어야 하고 본 발명의 정신 및 범위는 첨부된 청구범위에 의해 표시될 것이다.

Claims

목적하는 바이오 분자를 포함하는 시료 내에서 중합체의 잔량을 검출하는 방법으로서, 상기 중합체는 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하는데 사용되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(1) 시료를 중합체와 접촉하는 단계, 이때 상기 중합체는 태그와 친화성이고; 및
(2) 태그를 검출하는 단계, 이때 상기 검출된 태그의 양은 목적하는 바이오 분자를 포함하는 용액 내에서 중합체의 잔량을 나타냄.
제1항에 있어서, 중합체가 올리고뉴클레오티드 태그와 친화성인 방법.
제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 증폭 반응을 이용하여 검출되는 방법.
제3항에 있어서, 증폭 반응이 올리고뉴클레오티드 태그의 5' 및 3' 말단에 혼성화할 수 있는 프라이머 세트를 부가하는 것을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 합텐 분자, 형광성 분자 또는 방사성 분자와 친화성인 방법.
제2항에 있어서, 검출 단계가 비-증폭 반응을 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 비-증폭 반응이 표지된 프로브의 사용을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 표지된 프로브가 검출가능한 염료를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 공유결합을 이용하여 올리고뉴클레오티드 태그와 친화성인 방법.
제3항에 있어서, 증폭 반응이 중합효소 연쇄 반응을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 10 뉴클레오티드, 15, 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 25 뉴클레오티드, 30 뉴클레오티드, 35 뉴클레오티드, 40 뉴클레오티드, 45 뉴클레오티드, 50 뉴클레오티드, 55 뉴클레오티드 및 60 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 길이를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 60 뉴클레오티드 또는 60 뉴클레오티드 미만의 길이를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 태그의 3' 말단에 반응성 기를 포함하는 방법
제12항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 태그의 3' 말단에 반응성기를 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 반응성 기가 할로겐 기, 에폭시 기, 히드록실 기, 아미노 기, 설프히드릴 기 및 카르복실 기로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제14항에 있어서, 반응성 기가 할로겐 기, 에폭시 기, 히드록실 기, 아미노 기, 설프히드릴 기 및 카르복실 기로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제15항에 있어서, 반응성 기가 추가로 개질되는 방법.
제16항에 있어서, 반응성 기가 추가로 개질되는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 반응성 기를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 제 1 반응성 기를 포함하고, 중합체가 제 2 반응성 기를 포함하며, 상기 제 1 및 제 2 반응성 기가 서로 공유 결합되는 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 정제에 의해 제거되는 중합체와 비친화성인 방법.
제1항에 있어서, 바이오 분자가 단백질, 항체 및 백신으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
제22항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 제 2 구조가 없는 것으로 예상되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 태그가 4 이상 염기 길이의 동종 중합체가 없는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 폴리(4-비닐 피리딘)인 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 폴리알릴아민인 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 폴리비닐아민인 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 자극 응답성 중합체인 방법.
제30항에 있어서, 자극 응답성 중합체가 염 자극에 응답성인 방법.
제30항에 있어서, 자극 응답성 중합체가 pH 자극에 응답성인 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 1급 아민 및 소수성 부분을 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 방향족 기로 공유적으로 개질된 1-80%의 아민을 갖는 폴리비닐아민인 방법.
제30항에 있어서, 중합체가 다가 음이온 자극에 응답성인 방법.
제1항에 있어서, 검출 단계가 면역분석법 또는 ELISA을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료 내에서 하나 이상의 불순물과 결합하여 침전하는 것에 의해 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료 내에서 목적하는 바이오 분자와 결합하여 침전하는 것에 의해 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 중합체가 형광성 태그 또는 방사성 태그 또는 합텐 태그와 친화성인 방법.
하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하는데 사용되는 자극 응답성 중합체의 잔량을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(1) 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액을 자극 응답성 중합체와 접촉시키는 단계, 이때 중합체 및 하나 이상의 불순물의 착물을 형성하도록 상기 중합체는 태그와 친화성이고;
(2) 자극을 용액에 적용함으로써 착물을 침전시키는 단계;
(3) 용액으로부터 침전물을 제거하는 단계; 및
(4) 목적하는 바이오 분자를 함유하는 용액 내에서 태그를 검출하는 단계, 상기 검출된 태그의 양은 목적하는 바이오 분자를 포함하는 용액 내에서 중합체 잔량를 나타냄.
제40항에 있어서, 자극 응답성 중합체는 1급 아민 및 소수성 부분을 함유하는 방법.
제40항에 있어서, 자극 응답성 중합체는 형광성 태그 또는 방사성 태그 또는 합텐 태그와 친화성인 방법.
제40항에 있어서, 자극 응답성 중합체는 다가 음이온 자극에 응답성인 방법.
제42항에 있어서, 합텐 태그는 비오틴을 포함하는 방법.
제40항에 있어서, 검출 단계는 ELISA 분석법의 사용을 포함하는 방법.
용액 내의 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 바이오 분자를 분리하기 위해 사용된 자극 응답성 중합체의 잔량을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(1) 목적하는 바이오 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액을 자극 응답성 중합체와 접촉시키는 단계, 이때 상기 중합체는 태그와 친화성이고, 상기 중합체는 제 1 세트 조건 하에서 하나 이상의 불순물 뿐만 아니라 목적하는 바이오 분자 모두와 착물을 형성하고,
(2) 용액에 자극을 부가함으로써 착물을 침전시키는 단계;
(3) 침전물을 제 2 세트 조건으로 처리함으로써 착물로부터 목적하는 바이오 분자를 선택적으로 용출하는 단계; 및
(4) 목적하는 바이오 분자를 함유하는 용출물 내에서 태그를 검출하는 단계, 이때 상기 검출된 태그의 양은 용출물 내에서 중합체의 잔량을 나타냄.
제46항에 있어서, 상기 방법이 추가로 단계 (2) 및 (3) 사이에 세척 단계를 포함하는 방법.