CN102933722A - 检测在生物分子纯化中使用的聚合物的残余量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测在纯化生物分子的方法中使用的聚合物(包括刺激响应聚合物)残余量的方法，所述生物分子例如蛋白质、多肽、抗体、疫苗等。

Description

检测在生物分子纯化中使用的聚合物的残余量的方法

优先权 

本申请要求2010年6月8日提交的美国临时专利申请号61/397,186的优先权，其全部内容以其整体通过引用并入本文。 

发明领域

本发明涉及检测在纯化生物分子的方法中使用的聚合物的残余量的方法，所述生物分子例如蛋白质、多肽、抗体、疫苗等。 

背景技术

生物分子(例如包括抗体在内的治疗性蛋白质)的高效和经济的大规模纯化对于生物技术和医药工业是日益重要的问题。一般而言，纯化方法相当复杂和昂贵并包括许多不同的步骤。例如，典型地以蛋白质为例，蛋白质使用细胞培养方法产生，例如使用工程化的哺乳动物或细菌细胞系通过插入含有编码该蛋白质的基因的质粒来产生目标蛋白。一般而言，在靶蛋白表达后，将其与一或多种不期望的组分(如宿主细胞蛋白、培养基副产物和DNA)分开是一个巨大的挑战。当治疗性蛋白质旨在用于人而必须获得食品和药物管理局(FDA)的批准时，这样的分开尤其重要。 

一般而言，目前用于蛋白质分离和/或纯化的方法包括至少以下步骤：裂解细胞以回收胞内蛋白或如果是分泌蛋白则从培养基回收蛋白；使用差异离心或过滤去除细胞和细胞碎片以获得含有目标蛋白的净化的样品；和在多步骤方法中使用多种层析介质将目标蛋白与样品中的多种杂质分开。 

已经证明某些聚合物在生物分子从样品中的一或多种杂质的纯化中特别有用。例如，已经很好地确立了聚电解质聚合物在絮凝中纯化蛋白质的用途(见例如国际PCT专利申请号WO2008/091740)。这可以用广范围的聚合物实现，仅仅所需的一般特性为所述聚合物必须和目标物质(例如靶分子或杂质)具有某些水平的相互作用。此外，美国专利公开号20080255027、20090036651、20090232737和20110020327(其各自以其整体援引加入本文) 讨论了称作智能聚合物的某些聚合物的使用，其在特定的处理条件下(如pH、温度和/或盐浓度)可溶于水基溶剂，而在一或多种这样的条件改变时变得不可溶并且随后沉淀出来。 

在智能聚合物的例子中，已发现这些聚合物可以结合一或多种可溶和/或不可溶杂质或者它们可以结合目标生物分子(如待分离的靶蛋白)。一般而言，如援引加入本文的20080255027、20090036651、20090232737和20110020327中的一或多个所述，这样的聚合物在暴露至刺激(如pH、温度、盐等)后能够从溶液中沉淀出来。 

尽管所述聚合物能够从溶液中沉淀出来，但是该沉淀步骤并不总是去除样品中或含生物材料的流(stream)中存在的全部聚合物，由此造成在含有目标生物分子的样品中存在残余量的聚合物。当目标生物分子是治疗性蛋白质时，例如当所述蛋白旨在用于人类并需要获得食品和药物管理局(FDA)的批准时，检测残余量的聚合物尤其重要。 

发明概述 

本发明提供了新的、相对于现有技术方法更灵敏的检测聚合物残余量的方法，所述聚合物用于富集样品中的目标生物分子。此外，本发明的方法不需要样品加工，并且可以使用实验室常见的设备进行，例如在本文描述的基于寡核苷酸标签的方法中使用聚合酶链反应(PCR)热循环仪。 

在本发明的一个方面，提供了检测包含目标生物分子的样品中的聚合物残余量的方法，其中所述聚合物用于将所述目标生物分子与一或多种杂质分开。所述聚合物可以与一或多种杂质结合或其可以结合所述目标生物分子，由此将所述目标生物分子与一或多种杂质分开。在一些实施方案中，所述聚合物可以结合所述目标生物分子以及一或多种杂质，其中所述目标生物分子随后被选择性洗脱，而所述一或多种杂质保持与所述聚合物结合。 

在一些实施方案中，根据本发明的用于检测聚合物残余量的方法包括以下步骤：(1)使含有目标生物分子和一或多种杂质的样品与聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连；和(2)检测所述标签，其中所检测的标签的量代表在包含所述目标生物分子的样品中的残余聚合物的量。 

在一些实施方案中，所述标签是寡核苷酸分子。在其它一些实施方案中，所述标签是非寡核苷酸分子，例如半抗原分子、荧光分子或放射性分 子。如果分子是可检测部分，则术语“标签”和“分子”在本文可互换使用。 

标签可以与待检测的聚合物连接，或者其可以与寡核苷酸分子连接，所述寡核苷酸分子接着与待检测的聚合物连接。或者，所述标签可以与探针连接，所述探针与连接至待检测聚合物的寡核苷酸分子杂交。 

在寡核苷酸分子的情况下，所述分子可以使用扩增手段(如PCR)或非扩增手段(如，使用与所述寡核苷酸分子杂交的探针，或使用与所述寡核苷酸分子连接或与杂交至所述寡核苷酸分子的探针连接的荧光分子、半抗原分子或放射性分子)检测。 

在一些实施方案中，聚合物是刺激响应聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物用于净化(即与含有目标生物分子和一或多种杂质的样品中的一或多种杂质结合)。在其它实施方案中，所述聚合物用于捕获(即与所述目标生物分子结合)。在另一些实施方案中，聚合物结合所述目标生物分子以及一或多种杂质，其中随后从所述聚合物选择性洗脱所述目标生物分子，而所述一或多种杂质保持与所述聚合物结合。 

因此，在一些实施方案中，提供了用于检测刺激响应聚合物残余量的方法，其中所述方法包括步骤：(1)使含有目标生物分子和一或多种杂质的溶液与刺激响应聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连，由此形成聚合物和一或多种杂质的复合物；(2)向所述溶液施加刺激，由此沉淀所述复合物；(3)从溶液中去除沉淀物；和(4)检测所述含有目标生物分子的溶液中的所述标签，其中所检测的标签的量代表所述包含目标生物分子的溶液中的残余聚合物的量。 

在另外一些实施方案中，用于检测刺激响应聚合物的残余量的方法包括步骤：(1)使含有目标生物分子和一或多种杂质的溶液与刺激响应聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连并且其中所述聚合物和所述目标生物分子以及一或多种杂质在第一组条件下形成复合物；(2)向所述溶液加入刺激，由此沉淀所述复合物；(3)使沉淀物处于第二组条件由此从所述复合物选择性洗脱所述目标生物分子；(4)检测含有所述目标生物分子的洗脱液中的所述标签，其中所检测的标签的量代表所述洗脱液中残余聚合物的量。 

在一些实施方案中，在步骤(2)和(3)之间存在洗涤步骤。 

在一些实施方案中，所述刺激响应聚合物对盐刺激或pH刺激响应。在一具体实施方案中，所述聚合物对多价阴离子刺激响应。 

示例性的刺激响应聚合物包括但不限于聚乙烯胺、聚烯丙胺、聚乙烯吡啶和用疏水基团修饰的聚合物。 

在多个实施方案中，所述标签(如寡核苷酸分子或非寡核苷酸分子如半抗原分子、荧光分子或放射性分子)共价地与所述聚合物相连，或所述标签(如半抗原分子、荧光分子或放射性分子)共价地与所述寡核苷酸相连，而所述寡核苷酸接着与所述聚合物相连。在一些实施方案中，所述标签与探针相连，所述探针与连接至所述聚合物的寡核苷酸杂交。 

在一些所使用的标签是寡核苷酸分子的实施方案中，所述检测步骤包括扩增反应。在一些实施方案中，所述扩增反应包括使用杂交至所述寡核苷酸分子的5′和3′末端的引物套。在一具体的实施方案中，所述扩增反应包括使用聚合酶链反应(PCR)。 

在一些所使用的标签是寡核苷酸分子的实施方案中，所述检测步骤包括非扩增反应。在一示例性实施方案中，所述非扩增反应包括使用标记的探针，其与所述寡核苷酸分子杂交。在一具体的实施方案中，所述标记的探针包含可检测的染料。在另一个示例性实施方案中，所述非扩增反应包括使用半抗原标签，其与寡核苷酸分子相连。在仍另一个示例性实施方案中，所述非扩增反应包括使用放射性标签或荧光标签，其与所述寡核苷酸分子相连。在仍一其它实施方案中，半抗原标签、荧光标签或放射性标签与探针相连，所述探针与连接于待检测的聚合物的寡核苷酸分子杂交。 

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的寡核苷酸分子包括60个核苷酸或更短的长度。在一些实施方案中，所述寡核苷酸标签的长度选自10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸和60个核苷酸。 

在一些实施方案中，所述寡核苷酸分子包含在所述标签3′末端的反应性基团。所述反应性基团可以选自羟基、氨基、卤素基团、环氧基、羧基和巯基。在一些实施方案中，所述反应性基团可以进一步修饰以例如产生与所述聚合物上的反应性基团相互作用的另外的反应性基团。 

在一些实施方案中，所述聚合物包含反应性基团。所述反应性基团可以选自醛基、环氧基、羧酸基团、羟基、氨基(伯、仲或叔，包括吡啶)、巯基和芳香基。 

在仍另一实施方案中，所述寡核苷酸分子包含第一反应性基团而所述聚合物包含第二反应性基团，其中所述第一和第二反应性基团彼此共价地相连。所述反应性基团可以选自上面描述的基团并且可以直接或经由接头偶联。在一具体的实施方案中，含有反应性氨基的寡核苷酸分子与用1,1′-羰二咪唑活化的碘乙酰胺反应，然后与聚合物聚(4-乙烯吡啶)的吡啶反应性基团缀合。 

在一些实施方案中，通过纯化去除未与所述聚合物相连的标签(寡核苷酸或非寡核苷酸)。示例性的纯化方法包括但不限于沉淀、通过阴离子交换膜的过滤、超滤、透析和凝胶渗透层析。 

在一些实施方案中，所述目标生物分子选自蛋白质(如重组蛋白)、抗体和疫苗。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。 

在一具体实施方案中，本发明的方法使用包括SEQ ID NO:1所示序列的寡核苷酸分子。 

在一些实施方案中，所述寡核苷酸分子包括预测为无二级结构的核苷酸序列。 

在一些实施方案中，所述寡核苷酸分子包括不含长度为4个或更多碱基的同聚物的核苷酸序列。 

在一些实施方案中，所述聚合物是聚(4-乙烯吡啶)。在其它实施方案中，所述聚合物是聚乙烯胺。在其它实施方案中，所述聚合物是聚烯丙胺。在仍进一步的实施方案中，所述聚合物是用疏水基团修饰的聚烯丙胺或聚乙烯胺聚合物。在一具体实施方案中，所述聚烯丙胺具有150kDa的分子量,其中其胺基的30%通过与氯苯的反应来共价修饰。 

在一些实施方案中，所述聚合物响应于多价阴离子的添加，例如磷酸根离子或柠檬酸根离子。 

在一些实施方案中，用于检测的标签是荧光标签或荧光团，其可以与聚合物相连或与结合所述聚合物的寡核苷酸分子相连。或者，其可以与探针相连，所述探针与所述寡核苷酸分子杂交。 

示例性的荧光标签包括但不限于N-(4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二杂氮-s-茚烯-2-基)碘乙酰胺(别名

507/545IA(INVITROGEN))和7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(INVITROGEN)。 

在一些实施方案中，带有共价连接的荧光分子或荧光团的所述聚合物通过荧光分光光度法检测和定量。 

在一些实施方案中，用于检测的标签是放射性分子，其可以与聚合物相连或与结合所述聚合物的寡核苷酸分子相连。或者，其可以与探针相连，所述探针与所述寡核苷酸分子杂交。 

示例性的放射性标签包括但不限于甲基碘[3H]和甲基碘[14C](MPBIOMEDICALS)。 

在一些实施方案中，所述带有共价连接的放射性基团的聚合物使用闪烁计数器检测和定量。 

在一些实施方案中，用于检测的标签是半抗原分子，其可以与聚合物相连或与结合所述聚合物的寡核苷酸分子相连。或者，其可以与探针相连，所述探针与所述寡核苷酸分子杂交。示例性的半抗原标签包括但不限于荧光素、生物素和二硝基酚。包括反应性基团的实例半抗原标签包括DNP-X,SE,6-(2,4-二硝基苯)六氨基己酸琥珀酰亚胺酯(INVITROGEN)、DSB-X^TM生物素C₂-碘乙酰胺(脱硫生物素-X C2-碘乙酰胺)(INVITROGEN)、和5(6)-荧光素异硫氰酸酯混合异构体(THERMO SCIENTIFIC)。 

在一些实施方案中，含有连接的半抗原的聚合物使用免疫测定如ELISA检测和定量。示例性的ELISA实例是生物素ELISA试剂盒(ALPCODIAGNOSTICS)。 

在一些实施方案中，含有共价连接的半抗原的聚合物使用本领域已知的亲和素/链霉亲和素检测方法检测和定量，或使用酶报道物和扩增技术(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、酪胺信号扩增或荧光探针检测和定量。 

在本发明的方法的一些实施方案中，所述一或多种杂质选自全细胞、细胞片段、脂质、DNA、RNA、宿主细胞蛋白、内毒素和病毒。 

附图简述 

图1示出可应用于pH依赖型聚合物的纯化方法示意图，所述聚合物例如聚(4-乙烯吡啶)，其对期望的目标生物分子具有结合亲和力。 

图2示出用于纯化单克隆抗体的工业标准模板。 

图3示出未缀合的寡核苷酸标签的定量PCR校准曲线。圈出的点为~10拷贝的标签输入，其从悬浮于已知体积的未知重量寡核苷酸的储液稀释物确定。 

图4示出在寡核苷酸缀合的聚合物中寡核苷酸标签与聚合物的摩尔比的鉴定。空心菱形显示用未缀合的寡核苷酸标签获得的读数，实心菱形显示用寡核苷酸标签缀合的聚合物标准品(stanard workup)获得的读数，而实心三角形显示用寡核苷酸标签缀合的聚合物获得的读数，所述聚合物通过在二甲基甲酰胺中使用乙酸乙酯沉淀而从反应混合物中纯化，随后重悬于甲醇并用0.1M氢氧化钠再沉淀。基于对缀合的和未缀合的寡核苷酸标签的灵敏度是相似的假设，对缀合的寡核苷酸标记的聚合物的灵敏度为约万亿分之一百二十五或低于实验测定的1分子标签每500分子聚合物的缀合比例。 

图5是示出使用寡核苷酸标签缀合的聚合物进行下游工艺检测的示意图。显示了工艺流程，其中所述寡核苷酸标签缀合的聚合物用于同时净化和纯化，其中所述聚合物结合目标生物分子以及一或多种杂质，其中所述目标生物分子随后被选择性洗脱，而所述一或多种杂质保持与所述聚合物结合。 

图6示出使用来自寡核苷酸标签示踪剂的读数分析来自图5的流程的不同级分的残余聚合物。随着级分自纯化工艺中移动，曲线开始平坦，所有稀释物具有约48的交叉阈值(Ct)，类似于无标签对照。 

图7示出用于定量未知浓度的BODIPY 507/545标记聚合物的标准曲线，其用已知量的BODIPY 507/545标记的疏水修饰的聚烯丙胺刺激响应聚合物产生。聚合物的浓度以百万分比(ppm)示于x轴而在545nm的强度示于y轴。 

图8示出在细胞培养基的絮凝和净化作用后剩下的BODIPY 507/545标记的疏水修饰的聚烯丙胺刺激响应聚合物的定量。添加的絮凝剂剂量%(聚合物重量/细胞培养液体积)示于x轴，而滤液中检测出的残余聚合物以百万分比示于y轴。 

发明详述 

本发明提供检测样品中聚合物残余量的方法，其中所述聚合物用于将 目标生物分子与一或多种杂质分开。在一些实施方案中，此类聚合物是“刺激响应聚合物”或“智能聚合物”。在一些实施方案中，所述智能聚合物结合目标生物分子。在其它实施方案中，所述智能聚合物结合一或多种杂质。在另一些实施方案中，所述智能聚合物结合所述目标生物分子以及一或多种杂质，其中所述目标生物分子随后被从所述聚合物选择性洗脱，而所述一或多种杂质保持与所述聚合物结合。 

为了使本公开能够更容易被理解，首先定义一些术语。其它定义在详述中各处说明。 

I.定义

如本文所用，术语“目标生物分子”或“期望的目标生物分子”是指待使用聚合物(如刺激响应聚合物)与一或多种杂质分开的生物学材料(如，靶生物分子或目标产物)。示例性的目标生物分子包括，例如，蛋白质(如重组蛋白)、抗体和疫苗。在一个具体实施方案中，目标生物分子是单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的方法检测聚合物的残余量，所述聚合物可能在结合并沉淀(不一定按此顺序)目标生物分子从而将其与一或多种杂质分开后剩下。在其它实施方案中，本发明的方法检测聚合物的残余量，所述聚合物可能在结合并沉淀(不一定按此顺序)一或多种杂质从而将目标生物分子与一或多种杂质分开后保留在样品中。 

如本文所用，术语“一或多种杂质”指的是任何外来的或不期望的分子，包括全细胞、细胞片段或生物学大分子如DNA、RNA、一或多种宿主细胞蛋白、外毒素、脂质和一或多种添加剂，其可能存在于含有待与此类外来的或不期望的分子分开的目标生物分子的样品中。在本发明的一些实施方案中，使用聚合物将一或多种杂质从含有目标生物分子和一或多种杂质的样品中去除。本发明的方法使得能够检测聚合物的残余量，所述聚合物可以用于将一或多种杂质与目标生物分子分开。 

如本文所用，术语“聚合物”指的是通过两个或更多个单体单元共价连接形成的分子。这些单体单元可以是合成的或天然存在。由重复单元形成的所述聚合物可以是线性的或是分支的。聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯和共聚物(如聚苯乙烯-共-聚吡啶、聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸酯、普流罗尼类(pluronics)、 PF68等)。在本发明的一些实施方案中，聚合物包括聚电解质主链。本文还描述了共聚物，其可以在本发明的方法中使用，其中所述共聚物对刺激响应。一般而言，理解在聚合物中单体单元属于相同类型，而共聚物将通常具有不同类型的单体单元。 

如本文所用，术语“刺激响应聚合物”是在添加刺激后显示物理和/或化学特性改变的聚合物或共聚物。典型的刺激响应是聚合物可溶性的改变。 

在一些实施方案中，刺激响应聚合物在某些组的处理条件(如pH、盐浓度或温度)下是可溶的，而在条件(温度、盐浓度或pH)改变时变得不可溶并从溶液沉淀出，例如，作为对一或多种条件改变的应答。例如，聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)在低于约35℃的温度是水溶性的，但是在约35℃的温度变成在水中不可溶。智能聚合物可以用于结合一或多种杂质或它们可以用于结合样品中的目标生物分子，所述样品含有所述目标生物分子和一或多种杂质。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以用于检测智能聚合物的残余量，所述智能聚合物可能在用所述智能聚合物结合和/或沉淀目标生物分子后剩下。在一些实施方案中，智能聚合物的残余量检测在将所述目标生物分子从聚合物上洗脱后进行。在其它实施方案中，智能聚合物的残余量检测在用所述智能聚合物结合和/或沉淀一或多种杂质后进行。 

术语“刺激(stimulus)”或“刺激(stimuli)”在本文可互换使用，旨在指环境中的物理或化学改变，其造成本发明的刺激响应聚合物的响应。因此，本发明提供了检测聚合物残余量的方法，所述聚合物响应于造成所述聚合物可溶性改变的刺激。聚合物可以响应的刺激的实例包括但不限于，例如，温度的改变、电导率的改变、电场和/或磁场的改变和/或pH的改变。在一些实施方案中，刺激包括向样品添加络合剂或复合物形成盐。在多个实施方案中，一般在向样品添加聚合物后添加刺激。不过，所述刺激也可以在向样品添加聚合物期间或之前添加所述刺激。 

在一个具体实施方案中，刺激是盐。示例性的盐包括但不限于，多价离子如柠檬酸盐、磷酸盐、硫酸盐和EDTA，和离子缔合盐如高氯酸盐、十二烷基硫酸钠盐、十二烷基苯硫酸盐、Fe(II)-4-氯-2-硝基酚阴离子、四苯硼酸钠盐和六硝基苯酚胺(见例如ANALYTICAL SCIENCES,DECEMBER1987,VOL.3,p.479)。一般而言，本领域技术人员会熟悉本领域公知并可用作本文描述聚合物的刺激物的多种盐。 

在本文描述的多个实施方案中，在添加结合目标生物分子和/或一或多种杂质的聚合物后，向含有所述目标生物分子和一或多种杂质的样品添加刺激，例如盐。刺激(如盐)的添加导致游离聚合物以及所述聚合物与所述目标生物分子和/或一或多种杂质的可溶和不可溶复合物的沉淀。 

诱导所述可溶或不可溶复合物沉淀所需的盐的量取决于例如以下因素，例如，pH、聚合物浓度和所述聚合物结合的目标生物分子或一或多种杂质的浓度。例如，一些聚电解质如聚烯丙胺具有随pH(胺质子化水平)变化的电荷密度。随着pH升高，电荷密度水平降低，因此诱导沉淀所需的刺激程度将不同于在较低pH或较高电荷密度状态下的刺激程度。 

如本文所用，术语“富集”、“分开”、“分离”和“纯化”是指用聚合物从样品或含生物学材料的流中纯化一或多种期望的生物分子的过程。在多个实施方案中，富集、分开、分离或纯化目标生物分子包括去除存在于含有所述目标生物分子的样品中的一或多种杂质。可以通过使用结合一或多种杂质的聚合物或通过使用结合目标生物分子的聚合物将所述目标生物分子和一或多种杂质分开。在一些实施方案中，聚合物结合目标生物分子以及一或多种杂质，其中随后从所述聚合物选择性洗脱所述目标生物分子，而所述一或多种杂质保持结合。 

如本文所用，术语“残余量”或“残余量”指的是用于纯化生物学材料的聚合物如刺激响应聚合物或用于絮凝的聚合物的量，该量等于或少于在所述聚合物结合和沉淀一或多种杂质或结合和沉淀所期望的目标生物分子后保持溶解和/或分散于样品或含生物材料的流中的量。所述残余量还指的是聚合物如刺激响应聚合物的量，该量等于或少于在施加刺激使得所述聚合物结合和沉淀或沉淀和结合一或多种杂质或期望的目标生物分子后保持溶解和/或分散于样品或含生物材料的流中的量。 

如本文所用，术语“组合物”、“溶液”或“样品”指的是含生物学材料的流。一般地所述含有生物学材料的流指的是待纯化的目标生物分子或期望的产物与一或多种不期望的实体或杂质的混合物。在一些实施方案中，所述样品包含目标生物分子(如治疗性蛋白质或抗体)以及一或多种杂质(例如宿主细胞蛋白、DNA、RNA、脂质、细胞培养添加剂、细胞和细胞碎片)。通常而言，所述含生物学材料的流可以进行如图1所示的纯化方案。在一些实施方案中，所述样品包括原料或细胞培养基，目标生物分子或期 望的产物被分泌入其中。在一些实施方案中，待用本文所述的一或多种刺激响应聚合物纯化的生物分子所来自的样品在所述样品与刺激响应聚合物接触前是“部分纯化的”。部分纯化可以通过例如使所述样品进行一或多个纯化步骤来完成，所述纯化步骤例如图2所示的一或多个非亲和层析步骤。可以通过沉淀一或多种杂质或通过沉淀目标分子将所述生物分子与一或多种不期望的实体或杂质分开。 

在一些实施方案中，刺激响应聚合物在第一组条件下选择性地和可逆地结合目标生物分子并在第二组条件下(如在向样品加入刺激时)沉淀所述目标生物分子。在其它实施方案中，刺激响应聚合物在第一组条件下选择性地结合一或多种杂质并在第二组条件下沉淀所述一或多种杂质。在一些实施方案中，刺激响应聚合物在加入刺激时选择性地结合和沉淀宿主细胞蛋白、DNA、全细胞、细胞碎片、病毒和/或细胞培养添加剂中的一或多种。在仍另外的实施方案中，刺激响应聚合物在第一组条件下结合目标生物分子以及一或多种杂质，并且在第二组条件下所述目标生物分子从所述聚合物选择性地洗脱，而所述一或多种杂质保持结合。 

本文所用术语“沉淀(precipitate)”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation)”指的是结合的或(如，与目标生物分子或一或多种杂质在复合物中)未结合的聚合物从水性和/或可溶状态转变为非水性和/或不可溶状态。 

如本文所用，术语“标签”指的是能够结合本文所用的聚合物并且能够使用合适的手段检测的任何分子。在一个实施方案中，在本发明的检测方法中使用的标签是寡核苷酸分子，其能够使用扩增手段或非扩增手段检测。在另一实施方案中，本发明的检测方法使用的标签是半抗原分子、荧光分子或放射性分子，其直接与所述聚合物相连并能够使用本领域公知的或本文描述的合适的手段容易地检测。此外，在某些实施方案中，半抗原分子(如生物素)、放射性分子或荧光分子不是直接与聚合物相连，它们与寡核苷酸分子相连，而所述寡核苷酸分子接着连接至聚合物。在另外的实施方案中，半抗原分子、荧光分子或放射性分子与探针相连并且随后能被检测，其中所述探针与连接于聚合物的寡核苷酸分子杂交。 

如本文所用，术语“寡核苷酸标签”或“寡核苷酸分子”指的是能够结合聚合物并且用于检测该聚合物的核酸分子。在一具体实施方案中，本 发明的方法使用的寡核苷酸分子包括SEQ ID NO:1所示序列。期望本发明的方法所使用的寡核苷酸标签或分子的序列并不另外在所述含生物材料的流的多种组分中出现。本领域技术人员能够容易地验证所述寡核苷酸标签序列的存在或不存在，例如，使用本领域公知的计算方法(如，针对宿主细胞DNA序列进行BLAST)或实验方法(如杂交技术)。在一些实施方案中，所述聚合物和所述寡核苷酸分子之间的关联包括共价连接。在一些实施方案中，所述寡核苷酸分子使用扩增反应检测。在其它的实施方案中，所述寡核苷酸分子使用非扩增反应检测，例如在所述寡核苷酸分子本身用可检测部分(如半抗原分子(如生物素)、荧光分子或放射性分子)标记的情况下。此外，使用如探针的杂交方法可以用于检测所述寡核苷酸分子。在一些实施方案中，探针用半抗原分子、荧光分子或放射性分子标记。 

如本文所用，术语“引物”指的是单链核酸分子，其能够与寡核苷酸分子或其反向互补链杂交并能够在合适的条件下参与扩增反应(如聚合酶链反应)。在一些实施方案中，寡核苷酸分子使用一套5′和3′引物检测，所述引物能与寡核苷酸分子杂交并能用于检测所述寡核苷酸分子。检测的所述寡核苷酸分子的量代表了样品中残余聚合物的量。 

如本文所用，术语“探针”指的是单链核酸分子，其能在例如严格性杂交条件下与寡核苷酸分子杂交。在一些实施方案中，所述探针是标记的探针，其中具有与所述探针连接的可检测信号。在一些实施方案中，所述可检测信号是标记，如染料。在一些实施方案中，检测的所述探针的量代表了样品中残余聚合物的量。在一些实施方案中，所述探针包括可以被检测的半抗原分子、放射性分子或荧光分子。 

如本文所用，术语“能够杂交”指在反平行核酸链之间能形成沃森-克里克-类型氢键，其支持所述核酸链的在给定条件如严格性杂交条件下的双链体状态。 

如本文所用，术语“检测所述标签”指的是允许测量和定量本文所用的标签的方法。在一些所述标签是寡核苷酸分子的实施方案中，检测包括使用扩增反应(如使用聚合酶链反应)。在其它所述标签是寡核苷酸分子的实施方案中，检测包括使用非扩增反应(如使用标记的探针或使用与所述寡核苷酸分子或所述探针相连的可检测的部分例如，半抗原分子、荧光分子或放射性分子)。在仍其它实施方案中，标签与聚合物而不是寡核苷酸相连， 其随后能被检测。因此，包括但不限于如半抗原分子、荧光分子或放射性分子的可检测部分可以与聚合物相连。 

如本文所用，术语“扩增反应”指的是分子初始数目被增加至较大的分子数目的方法。在一些实施方案中，扩增反应采用聚合酶链反应。 

如本文所用，术语“反应性基团”指的是分子中的一组原子，其在给定的一组条件下比所述分子其余原子更优选地与另外的分子反应。 

如本文所用，本文所用的寡核苷酸分子的“二级结构”指的是通过单个核酸分子内的碱基配对相互作用产生的三维形式。一般而言，在核酸分子的例子中，所述二级结构由含氮碱基之间的氢键产生。在本发明的多个实施方案中，期望本发明的方法中使用的寡核苷酸分子没有二级结构。使用本领域技术人员熟知的和本文描述的一或多种软件工具能够容易地预测核酸分子中的二级结构。 

II.使用聚合物纯化目标生物分子的示例性方法

一般而言，目标生物分子，例如蛋白质(如重组蛋白或抗体)可以使用这样的方法纯化，所述方法采用在宿主细胞中表达所述蛋白质(如通过使用包括编码所述蛋白质的核酸分子的宿主细胞)，随后纯化所述蛋白质。 

在一些例子中，使期望的宿主细胞系在生物反应器中生长来以期望的水平表达所述蛋白质。示例性的宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤(NSO)细胞、细菌(如大肠杆菌)细胞和昆虫细胞。一旦蛋白质以期望的水平表达，从所述宿主细胞去除并收获所述蛋白质。通常通过过滤或离心从所述含蛋白液体去除悬浮颗粒，例如细胞、细胞片段、脂质和其它不可溶物质，获得含有溶液中的目标蛋白以及其它可溶杂质的净化的液体。 

第二步一般包括纯化所收获的蛋白质以去除该方法固有的一或多种杂质。此类杂质的实例包括例如宿主细胞蛋白(HCP，其是除期望的蛋白或靶蛋白之外的蛋白质)、核酸、外毒素、病毒和蛋白质聚集体。该纯化方法一般包括若干层析步骤，其可包括在固体基质(如多孔琼脂糖、聚合物或玻璃)上的亲和层析、离子交换疏水相互作用层析等。示例性的纯化方法示于图2。 

近年来已经研究了其它用于纯化蛋白质的可选的方法。一种这样的方法包括絮凝技术(见如WO2008/091740)。在该技术中，将可溶的聚电解质加 入净化的或未净化的细胞培养肉汤中以捕获杂质由此形成絮凝物，其可以沉降并且随后可以从所述蛋白质溶液中去除。 

在共同未决的美国专利公开号20090036651(以其整体通过引用并入本文)中，使用在某些条件(如温度或pH)下可溶的聚合物在其可溶状态选择性结合一或多种杂质，然后在条件(pH或温度等)改变时沉淀出来，去除伴随其的一或多种杂质。所述目标生物分子可以进一步进行传统层析或膜吸收等。 

图1示出可应用于pH依赖型聚合物的非限制性纯化方法示意图，所述聚合物例如聚(4-乙烯吡啶)，其能够结合一或多种杂质。在第一步，调整混合物至正确的参数以维持所选的聚合物在溶液中。或者，如果混合物的条件已经使得所述聚合物在混合物中可溶，可以无需进一步的调整。并且，所述聚合物可以作为固体添加至未调整的混合物，然后将所述混合物(含有所述固体聚合物)调整至正确参数以将所述聚合物溶解于所述混合物中。在第二步，将所述聚合物添加至混合物中并使其进入溶液从而与混合物中的不同成分接触。预期所述第二步可以在生物反应器中发生，例如，如期望的如果所述生物反应器是一次性产品或位于独立的支持槽中。在第三步中，改变所述混合物条件以导致所述聚合物从溶液沉淀出同时保留所述混合物的一或多种实体在混合物中。然后在第四步中使所述混合物和所述沉淀的聚合物相互分离。所述沉淀物和剩下的混合物可以通过离心或过滤分离。 

在一些实施方案中，一旦细胞培养液被净化，所述目标生物分子可以进行一或多种已知的额外的处理步骤例如层析步骤，包括但不限于，离子交换、具有或不具有带电UF膜的疏水相互作用或亲和性能正切流动过滤、病毒去除/灭活步骤、最终过滤步骤等。 

从含生物学材料的流中纯化目标生物分子中使用聚合物的一个不期望的后果是有可能不确定量的聚合物保留在所述流中。如果需要，可以进行一或多个额外的步骤来确保全部聚合物已经从所述混合物中去除，其通过使所述混合物进行含有会从所述混合物去除任何残余聚合物的材料的步骤，所述材料例如离子交换树脂、活化碳、铝、硅藻土等。然而，需要有灵敏的测定来定量残余聚合物量并追踪上面描述的在去除任何残余聚合物中的步骤的效率。本发明的方法提供了改进的和灵敏的测定来检测和定量聚合物的残余量。 

不希望受理论限制，理解本发明的所述检测方法可以与任何的采用聚合物来沉淀目标生物分子和/或一或多种杂质的纯化方法联合使用，其中如本文所述，可以将可检测的寡核苷酸或非寡核苷酸标签与所述聚合物连接。 

III.用于纯化目标生物分子的方法中的示例性聚合物

包括描述于美国专利公开号20080255027、20090036651、20090232737和20110020327以及美国专利申请号13/108576(其各自以其整体通过引用并入本文)中的那些的聚合物可以用于本文描述的方法中。 

示例性的聚合物包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)、琼脂糖、葡聚糖、聚氧化乙烯、羟烷基纤维素、阳离子聚电解质(选自包括壳聚糖、聚乙烯吡啶、乙烯吡啶共聚物、含伯胺聚合物、含仲胺聚合物、含叔胺聚合物的组)和阴离子聚电解质(选自包括丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物以及甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物的组)。 

一或多种聚合物，例如聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(N-丙烯酰哌啶)、聚(N-乙烯基异丁酰胺)、聚(N-取代的丙烯酰胺)(如聚(N-异丙基丙烯酰胺))、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)和聚(N-丙烯酰1-N-烷基哌嗪))、羟烷基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2-乙烯吡啶或4-乙烯吡啶的聚合物或共聚物和壳聚糖，其具有或不具有与所述聚合物连接的配体或官能团，可以在本文描述的方法中使用以选择性和可逆地结合目标生物分子或一或多种杂质，由此使样品(如含生物学材料的流)中的一或多种杂质与所述目标生物分子分开。 

在一具体实施方案中，本发明的方法中使用的聚合物是聚乙烯胺聚合物。在另一实施方案中，本发明的方法中使用的聚合物是聚烯丙胺聚合物。在仍另一实施方案中，本发明的方法中使用的聚合物是用疏水基团修饰的聚烯丙胺聚合物，如2011年5月16日提交的美国专利申请号13/108576中所述描述，其全部内容以其整体通过引用并入本文。 

IV.鉴定用于与聚合物连接的寡核苷酸分子的方法

在本文描述的一些检测残余聚合物的方法中，可以采用寡核苷酸分子。可以计算机模拟(in silico,如使用软件程序)产生40个核苷酸长的可能的寡核苷酸分子文库，其具有几乎相等的核苷酸碱基分布(即A:C:G:T~1:1:1:1)并 且避免4个或更多个连续的C或G碱基。一旦鉴定可能的寡核苷酸序列，期望所述序列不在所述含生物学材料的流中出现。因此，使用计算机技术(如，通过针对宿主细胞DNA的基因组序列运行BLAST搜索)和/或实验技术(如通过与所述含生物学材料的流杂交)能够验证所述序列的存在与否。 

V.使用寡核苷酸分子标记聚合物的方法

可以合成具有内部或末端反应性基团(例如卤素、环氧基、羟基、氨基、羧酸或巯基)的寡核苷酸，其随后连接至聚合物。此外，具有内部或末端反应性基团的寡核苷酸可以进一步用多种化学(例如溴化氰、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1,1′-羰基二咪唑、碳二亚胺EDC、缩水甘油基、有机磺酰氯、二氢恶唑酮、三聚氯氰和马来酰亚胺)活化以促进与聚合物的连接。见，如Immobilized affinity ligand techniques.Hermanson,Mallia and Smith 1992。 

在一些实施方案中，对于含有3′末端氨基的寡核苷酸，可以使用用1,1′-羰基二咪唑活化的碘乙酰胺来连接上末端碘基团，其随后与聚乙烯吡啶中的吡啶反应，产生所述寡核苷酸与所述聚合物的共价连接。也可以使用表氯环氧丙烷来将末端缩水甘油基连接至含3′末端氨基的寡核苷酸，其随后与聚乙烯吡啶中的吡啶反应，产生所述寡核苷酸与所述聚合物的共价连接。此处描述的具体实施方案并不旨在受到任何限制。 

VI.使用非寡核苷酸分子标记聚合物的方法

在一些实施方案中，聚合物用非寡核苷酸分子，例如半抗原分子、荧光分子或放射性分子标记。在一些实施方案中，所述分子具有末端或内部反应性基团，所述基团能直接与所述聚合物反应产生共价缀合。在一些实施方案中，所述分子的末端或内部基团可以用已知的蛋白质化学方法(如形成N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、酸性氟化物、四氟苯基酯(TFP-酯)或STP-酯)活化使得其与所述聚合物的氨基或吡啶官能反应形成酰胺(见如Immobilized affinity ligand techniques.Hermanson,Mallia and Smith 1992)。所述偶联反应可以在有机溶液(如甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO))或pH为pH5-pH12的水性溶液中进行。在一个实施方案中，所述偶联反应可以在室温(约20℃至约60℃)进行。 

在本文所述的方法中可以使用的荧光分子的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸二苯乙烯-2,2′-二磺酸；吖啶和衍生物：吖啶、吖啶异硫氰酸酯；5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基酸-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；alexa；荧光素；缀合的多染料(multi-dyes)；灿烂黄(BrilliantYellow)；香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,Coumarin120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；花青染料；焰红染料；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′5″-二溴邻苯三酚-磺酞(溴代邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4′-二异硫氰酸二氢-二苯乙烯-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹酰氯)；4-二甲氨基苯偶氮基苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物：曙红、曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物；赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯；胡米胺；荧光素和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光色(DTAF)、2′,7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮原甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红；B-藻红蛋白；o-酚酞；芘和衍生物：芘、芘丁酸盐、琥珀酰亚胺1-芘；丁酸量子点；活性红4(Cibacron^TM Brilliant Red3B-A)；罗丹明和衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺玫瑰红B、磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N′,N′四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；Atto染料,Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；IRD 700；IRD 800；La Jolla蓝；酞菁；和萘酞菁。另外，光学可检测的部分也可以被用作本发明方法中的标签。 

可用作标签的放射性分子的实例是含同位素的分子，包括但不限于 ¹⁴C、³H、⁴⁵Ca、⁵¹Cr、⁵⁷Co、³⁶Cl、¹²⁵I、³²P、³³P和³⁵S。 

可用作标签的半抗原分子包括DNP-X,SE,6-(2,4-二硝基苯)六氨基己酸琥珀酰亚胺酯(INVITROGEN)、DSB-X^TM生物素C₂-碘乙酰胺(脱硫生物素-X C2-碘乙酰胺)(INVITROGEN)和5(6)-荧光素异硫氰酸酯混合异构体(THERMO SCIENTIFIC)。 

VII.去除未连接的标签的方法

在用标签标记聚合物后，需要从样品去除任何未连接的标签。例如，在用DMF和水溶液(50:50体积比)预平衡后，通过阴离子交换膜(如 

(MILLIPORE,Billerica,Mass.))过滤，可以纯化DNA标记的PVP溶液以去除未缀合的DNA标签。 

可以通过沉淀实现从溶液去除未缀合的标签(寡核苷酸或非寡核苷酸)。例如，以特定比例将溶剂与含标记的聚合物的溶液混合，由此将未缀合标签保留在上清液中而所述标记的聚合物沉淀。或者，可以选择合适的条件，其有利于保留标记的聚合物而沉淀未缀合的标签。本领域技术人员基于本领域的知识结合常规实验能否容易地鉴定用于沉淀的合适的条件。 

可以基于标称分子量截留值(“NMWCO”)选择超滤/渗滤膜以将目标产物保留在渗余物，同时允许低分子量材料如未连接的标签通入滤出液。基于目标产物的大小和性质并结合常规实验，本领域技术人员将能够选择这样的膜。在一具体的实施方案中，其中所述标签是10-60个碱基大小的寡核苷酸，而所述聚合物是大小为200000Da的聚(4-乙烯吡啶)，可以使用NMWCO为30的Millipore Centricon

单元进行超滤/渗滤。可以基于排阻分子量选择凝胶过滤层析柱，使得大分子量材料如聚合物在固定相的孔结构中花较少的时间并且比较小分子量材料更快地被洗脱，所述较小分子量材料例如未连接的寡核苷酸，其在所述孔结构中花更多时间并且在较后的时间洗脱。基于目标材料的大小和性质并结合常规实验，本领域技术人员将能够容易地选择这样的柱。 

在一具体的实施方案中，其中所述标签是10-60个碱基大小的寡核苷酸，而所述聚合物是大小为200000Da的聚(4-乙烯吡啶)，可以使用具有400000Da的排阻分子量的SHOWA DENKO K.K GPC KF-804L柱进行凝胶渗滤层析。 

VIII.检测与聚合物相连的寡核苷酸分子的方法

如本文所述，在将寡核苷酸分子连接至聚合物上并随后去除任何未连接的分子之后，所述已连接的分子可以使用扩增反应或非扩增反应检测。在扩增反应的情况中，选择与所述分子5′和3′部分杂交的引物。例如，可以选择引物使得游离或聚合物缀合形式的所述分子序列可以使用扩增反应如 聚合酶链反应(PCR)扩增和检测。在一些实施方案中，通过直接测量基于所述分子的荧光来显示扩增产物以获得交叉阈值(Ct)。所测得的Ct值可以用来确定样品中存在的分子的浓度，其使用从已知浓度的分子产生的校准曲线。 

在非扩增反应的情况中，可以使用标记的探针来检测所述寡核苷酸分子。或者，所述寡核苷酸分子本身可以用可检测部分标记，所述可检测部分例如半抗原标签、荧光标签或放射性标签。在一些实施方案中，用可检测部分标记与所述寡核苷酸分子杂交的探针。 

VIII.检测与聚合物相连的非寡核苷酸分子的方法

在将非寡核苷酸分子(如荧光标签、放射性标签或半抗原标签)连接至聚合物并随后去除任何未连接的分子后，可以使用多种技术中的任一种(取决于用作标签的该分子)来检测已连接的分子。示例性检测方法包括放射性检测、光吸收检测(如紫外-可见光吸收检测)、光发射检测(如荧光或化学发光)、免疫测定(如ELISA)以及亲和素/链霉亲和素检测方法。能够传感来自单分子的荧光的装置包括扫描隧道显微镜(siM)以及原子力显微镜(AFM)。对于放射性信号，可以使用磷屏显像仪(phosphorimager)。其它显像设备供应商包括General Scanning Inc.(Watertown,Mass)、Genix Technologies(Waterloo,Ontario,Canada)和Applied Precision Inc。 

本发明通过下面的实施例进一步阐述，所述实施例并不旨在限制本发明。本申请全文引用的所有参考文献、专利和专利公开的内容以及其附图，均通过引用并入本文。 

实施例

实施例1选择用于缀合至聚合物的寡核苷酸序列 

计算机模拟(in silico,如使用软件程序)产生50个或更多个长度为40个核苷酸的潜在的寡核苷酸分子的文库，其具有几乎相等的核苷酸碱基分布(即A:C:G:T~1:1:1:1)并且避免4个或更多个连续的C或G碱基。 

使用M-fold程序(Zuker M.2003.Mfold web server for nucleic acidfolding and hybridization prediction.Nucleic Acids Res.31:3406)针对二级结构对所述寡核苷酸标签文库成员进行筛选，选择对线性DNA在37℃,1mM MgCl2和50mM NaCl下的预测，并以所预测的结构的解链温度区分优先次序，较低的较好，如下表I所示。 

随后化学合成选定的寡核苷酸标签序列，其具有多个内部或末端反应性基团用于缀合至聚合物。 

表I 

表I示出随机40聚体以及G和C核苷酸百分比之和(%GC)、预测的在PCR条件下的双链体解链温度(杂交Tm)以及预测的发夹解链温度(发夹Tm)。选择具有最低发夹解链温度的序列(高亮)用于引物设计。 

设计用于PCR扩增的匹配引物(Tm~55℃)，并且使用含和不含所述标签靶的反应之间的循环交叉(Ct)对可能的标签寡核苷酸扩增子进行排序。在含和不含所述标签靶的反应之间产生最大差异的寡核苷酸标签选择用于缀合至聚合物。 

选定的寡核苷酸标签序列由Integrated DNA Technologies(IDT)以1微摩尔或更大规模合成，连接有3′氨基修饰剂作为用于缀合至聚合物的选择性反应性基团。 

实施例2从用于纯化目标生物分子的聚(4-乙烯吡啶)去除残余单体 

在一代表性实验中，在用于本文所述的方法之前从聚(4-乙烯吡啶)去除残余4-乙烯吡啶单体。具有200000分子量的获得自SCIENTIFIC POLYMERPRODUCTS,INC.的线性聚(4-乙烯吡啶)均匀地铺展在玻璃盘上并置于真空箱内。箱内大气用氩气净化5分钟若干次以去除任何氧气。使用机械真空泵将箱内压力降至0.1汞柱，随后将温度升高至约120℃。所述聚合物置于这些条件下共24小时。在该期间，箱内大气用氩气净化5分钟若干次。在加热期结束，箱温降低至室温并且在开门前用氩气净化所述箱若干次。获得的聚合物没有显著的气味，而未处理的聚合物具有4-乙烯吡啶单体特有的气味。处理的聚合物中存在的残余4-乙烯吡啶的量通过凝胶渗透层析无法检测到，而未处理的聚合物具有约0.05%(w/w)的残余4-乙烯吡啶单体。 

实施例3使用碘乙酰胺化学修饰具有DNA标签的聚(4-乙烯吡啶)聚合物 

从聚(4-乙烯吡啶)去除残余单体后，所述聚合物用DNA标签标记。在 一个代表性实验中，使用包括40个核苷酸的DNA标签，其具有以下序列：5’-GTT ATC GGATTC TTA ATA GGA ACA CAC TCT ATC TCA CCCG/3AmM/-3’(SEQ ID NO:1)，也以ID36示于表I，并且用伯胺基团修饰。 

碘乙酰胺(超纯级)、1,1′-羰二咪唑(≥97%)、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO,无水，≥99.9%)获得自SIGMA。用溶解在0.5ml无水DMSO的4.48mg 1,1′-羰二咪唑活化约5.56mg碘乙酰胺。所述反应在室温避光进行约1小时。将约3.71mg上面描述的DNA标签溶解于100μl去离子(DI)水，随后滴入0.4ml DMSO中。将约0.5ml的所述DNA标签溶液与0.5ml的活化的碘乙酰胺溶液混合并在室温反应24小时。产物，碘封端的DNA标签，使用0.5ml乙腈沉淀，通过在2500rpm离心2分钟作为沉淀收集。过量的未反应的碘乙酰胺保留在上清液中，丢弃所述溶液。沉淀用1ml乙腈洗涤，并重溶于1.0ml的DI水中。将后者滴加至溶解于2ml DMF的50mg来自实施例2的PVP的溶液中。所述混合物在约60℃的温度反应24小时。 

实施例4使用表氯环氧丙烷修饰具有DNA标签的聚(4-乙烯吡啶)聚合物 

从聚(4-乙烯吡啶)去除残余单体后，所述聚合物用寡核苷酸DNA标签标记。在一个代表性实验中，使用包括40个核苷酸的DNA标签，其具有以下序列：5’-GTT ATC GGATTC TTA ATA GGA ACA CAC TCT ATCTCA CCC G/3AmM/-3’(SEQ ID NO:1)，并且用伯胺基团修饰。 

表氯环氧丙烷(99%)、乙醚、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯(ACS试剂级)、甲醇(ACS试剂级)、四硼酸钠(99%)和氢氧化钠(0.1N)获得自SIGMA。将约2.97mg的上面描述的DNA标签溶解于1ml四硼酸钠溶液(20mM,pH9.2)，随后加入含有3μl表氯环氧丙烷的0.2ml DMF中。所述反应在室温进行约1小时。所述溶液然后用3份2ml乙醚萃取以去除过量的未反应的表氯环氧丙烷。纯化的溶液滴加至含有3g来自实施例2的PVP的30mlDMF溶液中。所述混合物在约50℃的温度反应24小时。 

实施例5从DNA标记的聚(4-乙烯吡啶)聚合物去除过量的DNA标签 

使用等体积的乙酸乙酯溶液沉淀来自实施例4的DNA标记的PVP，重溶于等体积甲醇，并最终使用等体积的0.1M NaOH沉淀以去除未缀合的 DNA标签。然后将沉淀溶解于DMF和水(50:50体积比)的混合物中至终浓度6重量%。 

实施例6与聚(4-乙烯吡啶)聚合物缀合的DNA标签的定量 

在去除过量的DNA标签后，定量了缀合至PVP的标签的量。未缀合的DNA标签的系列稀释标准物使用12.5μl的Fast SYBR Green Master Mix(APPLIED BIOSYSTEMS)、0.9μM的各引物和2μl的样品在终体积25μl中使用以下扩增条件扩增：95℃ 60秒的1个变性循环；95℃ 2秒和50℃ 30秒50个循环，随后50℃最终延伸30秒。通过直接测量荧光显示扩增产物以获得交叉阈值(Ct)。 

已知聚合物浓度的已知体积在1:100或更高稀释后被扩增，所获得的Ct与来自使用未缀合聚合物生成的标准曲线进行比较以获得在缀合的聚合物的样品中的拷贝数。这使得可以校准每分子聚(4-乙烯吡啶)聚合物的DNA标签拷贝数。对于预实验批次，缀合比例确定为大约每200个聚合物分子一个DNA标签。 

实施例7未净化的细胞培养液的pH调节 

衍生自非表达型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的细胞在生物反应器(NEWBRUNSWICK SCIENTIFIC)中在10L培养基生长至10x10⁶个细胞/ml的密度，并以64%的存活率收获。加入IgG至1.0g/L的浓度并且宿主细胞蛋白(HCP)的浓度确定为385669ng/ml。液体的pH为7.2。在开始纯化处理前，所述未净化的细胞培养液的pH使用0.17ml的3.0M乙酸调节至4.5。 

实施例8在乙酸中制备纯化的DNA标记的PVP溶液 

在真空箱中60℃ 24小时干燥来自实施例5的溶液。剩下的固体重建于3M乙酸中，室温连续搅拌1小时，至15重量%的终浓度。 

实施例9寡核苷酸标签缀合的聚合物在下游处理监测中的用途 

0.5ml来自实施例8的PVP溶液和0.56g硫酸铵添加至10ml来自实施例7的未净化的细胞培养液，在室温混合5分钟以使得结合不溶杂质(例如细胞和细胞碎片)以及可溶杂质(例如宿主细胞蛋白、核酸等)。然后通过 使用1.45ml的含0.08g硫酸铵的2M Tris将所述混合物的pH调节至8.5沉淀所述聚合物-杂质复合物，这允许期望的产物(IgG)与所述复合物结合。以分散的固体悬浮液形式的沉淀物持续地在液体中混合10分钟。随后通过离心(4000rpm,1分钟)收集含有所述IgG复合物的沉淀并用1M硫酸铵(10mM Tris,pH 8.5)洗涤以去除松散结合的杂质。当细胞、细胞碎片和其它可溶杂质保持与沉淀结合时，在pH 5.3(100mM乙酸钠)，混合20分钟，随后通过0.2μm

滤器过滤，IgG从所述沉淀选择性地洗脱。在这些条件下，原始样品中存在的IgG的93%与聚合物结合，在洗脱后回收的IgG的百分比是80重量%。 

如实施例6和图6中描述的定量在所述纯化处理中不同步骤中的残余PVP。随着级分在纯化处理中移动，曲线开始平坦，所有稀释物具有约48的交叉阈值(Ct)，类似于无标签对照。 

实施例10制备未净化的非表达型细胞培养液(CCF) 

在一个代表性实验中，衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的表达单克隆IgG1的细胞在10L生物反应器中生长至13x10⁶细胞/ml的密度并以<50%存活率收获。通过A蛋白HPLC测定所述抗体效价为0.7mg/mL。使用ELISA(CYGNUS#F550)发现宿主细胞蛋白(HCP)的水平为141800ng/mL，而通过

测定确定DNA浓度为11.9ug/mL。未净化细胞培养物的pH为pH7.2。 

实施例11制备基于疏水性修饰的聚烯丙胺的刺激响应聚合物 

在本文描述的代表性实验中，证明了本文描述的聚合物能够容易地大规模制备。 

使用聚烯丙胺溶液(PAA,NITTOBO,150kD;40%wt./wt.)，如下制备疏水性修饰的刺激响应聚合物。 

将500g的聚烯丙胺(PAA,NITTOBO,150kD;40%wt./wt.)(约200g聚烯丙胺)添加至4升玻璃瓶。接着，80g的NaOH块溶解于1000ml去离子水并加入瓶中。然后加入1000ml 1,2-二甲氧基乙烷(SIGMA)作为共溶剂并且剧烈搅拌所述溶液直至其均质。接着，将114g的氯苯(ACROS ORGANICS, 99%)添加入所述反应瓶。所述溶液在60℃加热16小时并磁力搅拌。使所述溶液冷却至室温并转移至10升烧杯。 

接着，搅拌加入1000ml去离子水，从溶液沉淀出粘性固体物质。缓慢加入200ml的2M磷酸钠进一步沉淀所述产物，收集固体并用去离子水洗涤。进一步用以下方法纯化所述聚合物。 

所述固体溶解于3升的1M乙酸中并搅拌。用去离子水使总体积为10升并通过滴加50%NaOH调节pH至7。加入800g的2M磷酸钠沉淀产物，收集固体并用去离子水洗涤。进一步用以下方法纯化所述聚合物。所述固体溶解于3升的1M乙酸中并搅拌。用去离子水使总体积为10升并通过滴加50%NaOH调节pH至7.0。加入800g的2M磷酸钠沉淀产物，收集固体并用去离子水洗涤。 

获得的固体物质在真空箱中在65℃干燥3天。干燥的聚合物在液氮中冷冻并研磨成细粉并进一步干燥1天。获得的干燥粉末的质量为250g。将小样溶解于1M CD3COOD/D2O酸并获得1H-NMR谱。对1H-NMR峰积分，确定苯甲基修饰的量为33%。 

获得的粉末溶解于1M乙酸以制备10%w/w溶液。通过滴加2M磷酸钠或0.2M柠檬酸钠至5ml的0.5%聚合物溶液样品中测试所获得的溶液对多价离子刺激的灵敏度。在添加所述磷酸盐或柠檬酸盐离子时，观察到白色沉淀，由此指示所述聚合物对多价阴离子刺激响应。 

实施例12用荧光标签标记疏水性修饰的聚烯丙胺刺激响应聚合物 

实施例11获得的聚合物用荧光标签通过以下方法标记。将2g所述固体聚合物加入至10ml的1M乙酸中并搅拌直至所述固体溶解。通过加入去离子水将获得的溶液体积增加至100ml。加入4M NaOH将所述溶液的pH调节至8.5。通过将12mg的N-(4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二杂氮-s-茚烯-2-基)碘乙酰胺(

507/545IA)(INVITROGEN)加入6mL DMF中制备反应性染料溶液。制备后立即将所述反应性染料溶液加入所述聚合物溶液并剧烈搅拌。将反应溶液在50℃旋转1小时。接着，对溶液进行离心，倾倒并丢弃上清液。红色的沉淀重悬于50mM磷酸钾pH7并搅拌。接着，对溶液进行离心，倾倒并丢弃上清液。 

红色的固体聚合物通过溶解于10ml的1M乙酸进一步纯化。通过加入去离子水将获得的橙色/红色溶液体积增加至500ml。通过滴加2M磷酸钾将pH调节至7并使溶液为50mM磷酸钾的浓度，观察到红色的沉淀。再次重复纯化，回收鲜红色固体聚合物并用去离子水洗涤。红色固体在真空50℃干燥2天。最终，将1.27g的干燥红色聚合物研磨成细粉并溶解于1M乙酸制备5%w/w溶液。 

实施例13检测具有荧光标签的刺激响应聚合物的残余量 

使用来自实施例12的BODIPY 507/545标记的疏水性修饰聚烯丙胺的5%溶液，在去离子水中制备1000、100、10、1和0.1ppm固体的标准溶液浓度。将荧光分光光度计设置为507nm激发和545nm发射。记录每个样品的545nm强度并标绘标准曲线，如图7所示。 

为了确定使用多价阴离子刺激沉淀聚合物的效率以及残余聚合物的浓度，进行了以下实验。 

在5mL去离子水中，加入4000ppm的所述标记的聚合物。将pH调节至7并使磷酸钾的浓度为50nM。此时，分离出红色沉淀并且在3000rpm将瓶离心2分钟。获得的上清液的浊度测定为46NTU，通过荧光分光光度法测定上清液中的残余聚合物为44ppm。通过0.22微米Durapore Millex(MILLIPORE,33mm)过滤上清液，通过荧光分光光度法测定滤出液中的残余聚合物为30ppm。值得注意的是，该实验用简单的添加刺激、离心和过滤获得水中高水平残余聚合物的99.25%的去除。 

这些结果证明可以将包含荧光标签的刺激响应聚合物加入水中，通过加入刺激使其不可溶，可以分离固体并可以通过荧光分光光度法检测残余聚合物。 

实施例14测定絮凝的CHO细胞培养物中具有荧光标签的刺激响应聚合物的残余量 

使用来自实施例12的BODIPY 507/545标记的疏水性修饰聚烯丙胺的5%溶液，在去离子水中制备1000、100、10、1和0.1ppm固体的标准溶液浓度。将荧光分光光度计设置为507nm激发和545nm发射。记录每个样品的545nm强度并根据实施例13标绘标准曲线。 

使用与实施例10类似的方法制备CHO细胞培养物。来自使用置于刺激的阳离子智能聚合物絮凝和沉淀的细胞培养物的残余聚合物与使用阳离子智能聚合物而无刺激的进行比较。剂量为0.1、0.4或0.6w/v的标记的聚合物加入至5mL的未净化的CHO细胞培养物，在15ml圆锥管中一式两份。 

所述三个聚合物浓度系列中的一个用2M tris碱调节pH 7.2，通过滴加2M磷酸钾将磷酸钾浓度增加至50nM，并搅拌所述溶液。进行磷酸钠和pH调节以将所述刺激响应聚合物和细胞、细胞碎片、杂质、残余聚合物的复合物一起沉淀，以及絮凝固体和增加颗粒大小。三种聚合物浓度的第二个系列简单地搅拌，不施加刺激。将瓶在3000rpm离心2分钟。记录所获得的上清液的浊度，并用0.22微米Durapore Millex(MILLIPORE,33mm)过滤上清液。滤出液中的残余聚合物通过荧光分光光度法测定。使用CHO细胞培养物作为对照并作为空白扣除。结果列于表II并示于图8。 

如表II和图8所示，这些结果证明可以将包含荧光标签的刺激响应聚合物加入水中，通过加入刺激使其不可溶，可以分离固体并可以通过荧光分光光度法检测残余聚合物。该结果还证明通过向细胞培养物中的刺激响应絮凝剂或沉淀剂施用刺激来控制残余聚合物的优势。 

表II 

实施例15使用A蛋白从净化的细胞培养物捕获单克隆抗体后检测用荧光标签标记的刺激响应聚合物 

使用来自实施例12的BODIPY 507/545标记的疏水性修饰聚烯丙胺的5%溶液，在去离子水中制备1000、100、10、1和0.1ppm固体的标准溶液浓度。将荧光分光光度计设置为507nm激发和545nm发射。记录每个样品的545nm强度并根据实施例13标绘标准曲线。 

使用与实施例10类似的方法制备CHO细胞培养物。通过使用0.4%w/w剂量的来自实施例12的用BODIPY 507/545标记、疏水性修饰的聚烯丙胺进行絮凝来净化所述细胞培养物。通过滴加2M tris碱将所述细胞培养物的pH调节至7.0。接着，加入2M磷酸钾使得最终的磷酸钾浓度为50mM。此时溶液中存在固体聚集。将所述溶液离心并丢弃沉淀。上清液用0.22微米Durapore滤器(MILLIPORE)，收集滤液并合并。 

将1mL的A蛋白亲和层析树脂(ProSep Ultra

)封装于具有0.66cm内径的Omnifit层析柱至最终床高2.9cm。所述A蛋白柱以3分钟停留时间装载至密度为35mg/mL的IgG，收集流穿液。随后用50mM tris pH7.2洗涤该柱并收集洗涤液合并物。接着，用5个柱体积的50mM乙酸洗脱IgG，收集洗脱合并物。记录洗脱合并物的280nm的吸光度，从该吸光度通过质量平衡确定产率为97%。最后，用0.15M磷酸再生柱并收集合并物。样品用2M tris碱中和至pH7.0。 

将荧光分光光度计设置为507nm激发和545nm发射。记录每个样品在545nm的强度。对细胞培养物上清液以及收集自A蛋白层析柱的每个合并物的残余聚合物进行定量，如表III所示。确定该测定的定量限为1.0ppm。 

该结果证明可以检测细胞培养物上清液中的荧光标记的智能聚合物，并且可以追踪在靶分子下游纯化期间的残余聚合物的去除。 

表III 

步骤	残余聚合物(ppm)
		滤液	12.3
A蛋白流穿液	11.4
		A蛋白中间洗涤	0.6(LOQ)
A蛋白洗脱	0.2(LOQ)
		A蛋白再生	0.2(LOQ)

*LOQ=定量限 

*初始掺入=0.4w/w%或4000ppm 

实施例16刺激响应聚合物的生物素化 

与实施例11类似地合成基于疏水性修饰的聚烯丙胺的刺激响应聚合物。获得的聚合物用生物素标签使用以下方法标记。 

将20g 33%苄化聚烯丙胺(分子量150,000Da)的5%w/w溶液加入装配有磁搅拌器的1000mL玻璃烧杯。加入去离子水将体积增加至200mL，并通过滴加4M NaOH将pH调节至9.5。 

通过在6mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解15mg的DSB-X^TM生物素C2-碘乙酰胺(脱硫生物素-X C2-碘乙酰胺)(INVITROGEN)制备反应性生物素溶液。将所述反应性生物素溶液立即加入至含有已调节pH的33%苄化聚烯丙胺溶液的玻璃烧杯中。获得的混合物剧烈搅拌，加热至70℃并在这些条件下保持1小时。接着，使混合物冷却至室温并用去离子水稀释至1000mL。通过滴加2M磷酸钠沉淀分离生物素化的聚合物直到观察不到进一步的沉淀物。通过非编织过滤材料真空过滤所述溶液，收集固体并丢弃滤液。用100mL的去离子水洗涤固体聚合物产物。 

通过将所述固体物质在50mL的1M乙酸中溶解过夜进一步纯化生物素化的产物。使所述溶液体积为2升并通过滴加4M NaOH调节pH至7.0。通过滴加2M磷酸钠沉淀分离生物素化的产物直到观察不到进一步的沉淀物。通过非编织过滤材料真空过滤所述溶液，收集固体并丢弃滤液。用100mL去离子水洗涤该固体并置于真空箱中在60℃过夜。 

获得的干燥生物素化产物研磨成粉末并溶解于1M乙酸和0.05摩尔HCl至终浓度5%w/w。 

了解所获得的生物素化智能聚合物能够用于从细胞培养物或含蛋白质的养料中絮凝或纯化靶分子。一旦所述聚合物被添加至细胞培养物或含蛋白质的养料并施加刺激，固体物质可以通过离心、过滤、沉降、任意其他固液分离方法或这些方法的组合从上清液中分离。此外，可以使净化的液体通过特别设计用于在定量之前或之后去除残余聚合物的滤器。 

最后，使用已有的用于检测和定量生物素化分子的方法可以检测和定量任何的残余生物素化智能聚合物。所述检测和定量方法可以包括亲和素/链霉亲和素标记的检测策略，包括涉及酶报道物(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)或荧光探针的策略。检测和定量也可以用免疫测定如ELISA进行。 

检测试剂盒的实例包括荧光生物素定量试剂盒，可从THERMOSCIENTIFIC获得。而另一个可以使用的检测试剂盒的实例是来自ALPCODIAGNOSTICS的生物素ELISA试剂盒。 

依照说明书中引用的参考文献(通过引用并入本文)最充分地理解说明书。说明书中的实施方案提供了本发明中的实施方案的具体说明而不应认为限制其范围。本领域技术人员容易确认许多其他实施方案涵盖于本发明中。所有出版物和发明以其整体援引加入。如果援引加入的材料与本说明书冲突或不一致，以本说明书为准。本文对任何参考文献的应用并不承认这样的文献是本发明的现有技术。 

除非另外指明，说明书包括权利要求中使用的表达成分、细胞培养物、处理条件等等的量的全部数字应该理解为在所用情况下都由术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，数字参数是近似值并且可以根据本发明需要获得的性质而不同。除非另有说明，一系列元素前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。使用不超过常规的实验，本领域技术人员将承认或能确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案也涵盖于权利要求中。 

本领域技术人员将明白可以不偏离本发明的精神和范围而做出其许多的修改和变形。本文描述的具体实施方案仅是通过示例的方式提供，无论如何都不是为了限制。说明书和实施例应该被认为仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由权利要求说明。 

Claims (47)

1.检测包含目标生物分子的样品中的聚合物残余量的方法，其中所述聚合物用于将所述目标生物分子与一或多种杂质分开，所述方法包括以下步骤：(1)使所述样品与所述聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连；和(2)检测所述标签，

其中所检测的标签的量代表所述包含目标生物分子的溶液中的残余聚合物的量。

2.权利要求1的方法，其中所述聚合物与寡核苷酸标签相连。

3.权利要求2的方法，其中使用扩增反应检测所述寡核苷酸标签。

4.权利要求3的方法，其中所述扩增反应包括添加能够与所述寡核苷酸标签5′和3′末端杂交的一套引物。

5.权利要求2的方法，其中所述寡核苷酸标签与半抗原分子、荧光分子或放射性分子相连。

6.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括非扩增反应。

7.权利要求6的方法，其中所述非扩增反应包括使用标记的探针。

8.权利要求7的方法，其中所述标记的探针包含可检测染料。

9.权利要求1的方法，其中所述聚合物使用共价连接与所述寡核苷酸标签相连。

10.权利要求3的方法，其中所述扩增反应包括聚合酶链反应。

11.权利要求2的方法，其中所述寡核苷酸标签包含选自10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸和60个核苷酸的长度。

12.权利要求2的方法，其中所述寡核苷酸标签包含60个核苷酸或少于60个核苷酸的长度。

13.权利要求11的方法，其中所述寡核苷酸标签包含位于所述标签3′末端的反应性基团。

14.权利要求12的方法，其中所述寡核苷酸标签包含位于所述标签3′末端的反应性基团。

15.权利要求13的方法，其中所述反应性基团选自卤素基团、环氧基、羟基、氨基、巯基和羧基。

16.权利要求14的方法，其中所述反应性基团选自卤素基团、环氧基、羟基、氨基、巯基和羧基。

17.权利要求15的方法，其中所述反应性基团被进一步修饰。

18.权利要求16的方法，其中所述反应性基团被进一步修饰。

19.权利要求1的方法，其中所述聚合物包含反应性基团。

20.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸标签包含第一反应性基团而所述聚合物包含第二反应性基团，且其中所述第一和第二反应性基团彼此共价地相连。

21.权利要求1的方法，其中通过纯化去除不与所述聚合物相连的寡核苷酸标签。

22.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自蛋白质、抗体和疫苗。

23.权利要求22的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

24.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸标签包含SEQ ID NO:1所示的序列。

25.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸标签包含预测为无二级结构的核苷酸序列。

26.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸标签包括不含长度为4个或更多碱基的同聚物的核苷酸序列。

27.权利要求1的方法，其中所述聚合物是聚(4-乙烯吡啶)。

28.权利要求1的方法，其中所述聚合物是聚烯丙胺。

29.权利要求1的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺。

30.权利要求1的方法，其中所述聚合物是刺激响应聚合物。

31.权利要求30的方法，其中所述刺激响应聚合物对盐刺激响应。

32.权利要求30的方法，其中所述刺激响应聚合物对pH刺激响应。

33.权利要求1的方法，其中所述聚合物含有伯胺和疏水部分。

34.权利要求1的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺，其1%-80%的胺用芳香基共价修饰。

35.权利要求30的方法，其中所述聚合物对多价阴离子刺激响应。

36.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括免疫测定或ELISA。

37.权利要求1的方法，其中通过结合和沉淀在包含目标生物分子和一或多种杂质的样品中的一或多种杂质，所述聚合物将所述目标生物分子和一或多种杂质分开。

38.权利要求1的方法，其中通过结合和沉淀在包含目标生物分子和一或多种杂质的样品中的目标生物分子，所述聚合物将所述目标生物分子和一或多种杂质分开。

39.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸标签与荧光标签或放射性标签或半抗原标签相连。

40.检测刺激响应聚合物残余量的方法，所述刺激响应聚合物用于将目标生物分子与一或多种杂质分开，所述方法包括以下步骤：

(1)使含有目标生物分子和一或多种杂质的溶液和刺激响应聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连，由此形成聚合物和一或多种杂质的复合物；

(2)向所述溶液施加刺激，由此沉淀所述复合物；

(3)从所述溶液去除沉淀物；和

(4)检测含有所述目标生物分子的溶液中的所述标签，其中所检测的标签的量代表所述含有目标生物分子的溶液中的残余聚合物的量。

41.权利要求40的方法，其中所述刺激响应聚合物含有伯胺和疏水部分。

42.权利要求40的方法，其中所述刺激响应聚合物与荧光标签或放射性标签或半抗原标签相连。

43.权利要求40的方法，其中所述刺激响应聚合物对多价阴离子刺激响应。

44.权利要求42的方法，其中所述半抗原标签包括生物素。

45.权利要求40的方法，其中所述检测步骤包括使用ELISA测定。

46.检测刺激响应聚合物残余量的方法，所述刺激响应聚合物用于将溶液中的目标生物分子与一或多种杂质分开，所述方法包括以下步骤：

(1)使含有目标生物分子和一或多种杂质的溶液和刺激响应聚合物接触，其中所述聚合物与标签相连，并且所述聚合物和所述目标生物分子以及所述一或多种杂质在第一组条件下形成复合物；

(2)向所述溶液添加刺激，由此沉淀所述复合物；

(3)使沉淀物置于第二组条件，由此选择性地从所述复合物洗脱所述目标生物分子；和

(4)检测含有所述目标生物分子的洗脱液中的所述标签，

其中所检测的标签的量代表洗脱液中残余聚合物的量。

47.权利要求46的方法，其中所述方法在步骤(2)和(3)之间还包括洗涤步骤。

Images