CN106047872B - 几种识别灭草松的核酸适配体序列及其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的核酸适配体(DNA aptamer)是单链寡聚脱氧核糖核苷酸(Oligodeoxynucleotide)，具有不同的脱氧核糖核苷酸(Deoxynucleotide)序列，它们在溶液中对除草剂灭草松(Bentazon)具有识别能力，可作为生物识别材料用于开发检测样品中灭草松的含量。这些核酸适配体序列是通过从随机核酸库(Random DNA pool)中进行体外筛选(In vitro Selection或SELEX)获得。在水溶液中，本发明的核酸适配体序列对灭草松分子的结合强度达到微摩尔每升(μM)量级的离解常数(Kd)。

Description

几种识别灭草松的核酸适配体序列及其衍生物
技术领域
本发明属于生物识别材料领域，所开发的核酸适配体序列是性能优越的生物识别分子，可识别灭草松分子及其衍生物。这些核酸适配体序列可以作为生物识别材料来开发检测各种样品(包括环境样品、食品样品等)中灭草松的试剂、技术及仪器。
技术背景
目前中国农业用化工产品存在严重的环境污染问题，例如大量无序地除草剂使用后，其通过暴雨径流进入和江、湖泊、水库等地表水体，引发严重的地表水的污染，威胁水生生态系统安全及生活饮用水的安全。灭草松是一种较为常用的除草剂[1-2]，在中国实用范围广、用量大。为了应对除草剂污染问题，对环境水样中除草剂的检测监控十分重要，可用于污染预警以及作为针对性污染物处理的指导依据。中国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)中将灭草松列为污染物之一，其限制浓度在环境水样中不可高于1ppm[3]。
常见的环境污染物检测方法通常使用大型仪器，例如高效液相色谱或质谱联用等技术[4]。这些大型仪器检测虽然非常准确，但是只能在固定的实验室里使用，因而需要从取样点将样品送至实验室进行检测，时间长，而且需要专业的技术人员操作。近年来，可现场快速对污染物进行检测或初筛的技术需求越来越迫切[5]，这些方法通常使用便携式仪器和识别目标污染物的生物识别材料来实现。在生物识别材料方面，通常使用抗体、核酸适配体等材料来在样品中特异性识别目标污染物，从而使得检测过程避免复杂的样品预处理，便于操作，且可达到较高的检测灵敏度，同时对环境背景干扰物有较强的选择性。抗体通常通过生物免疫技术从动物体内获得[6]，核酸适配体通常通过生物体外筛选技术从随机核酸库中得到[7]。
尽管对于一些环境污染物都已有成熟的抗体或核酸适配体可用，但是目前无论是商品化产品或科学研究中，都没有针对灭草松的抗体或适配体等生物识别材料可用。开发识别灭草松的生物识别材料，是开发现场快速检测灭草松的试剂盒和技术的重要基础。
发明内容
利用体外筛选技术，本发明获得了针对灭草松及其衍生物的核酸适配体生物识别材料，包括一系列的脱氧核糖核酸序列，这些序列对灭草松的结合能力达到了微摩尔每升(μM)量级的离解常数(Kd)。
发明的优点和积极效果
1、本发明的核酸适配体序列，是目前国际上第一次获得的可识别灭草松的核酸适配体。至今在专利、科学研究论文、商业产品中都没有任何针对灭草松的抗体或核酸适配体报道或使用。
2、使用本发明的核酸适配体序列作为生物识别材料，将可开发现场快速检测灭草松的试剂盒和监测技术及仪器，具有广泛的环境检测应用前景，也可进一步拓展用于食品安全的快速检测。
具体实施方式
1、核酸随机库合成
(1)合成步骤：
取出固相合成柱(储存无水即可，一般储存在-20℃冷冻室内，取出恢复室温才可用)；
打开电脑、固相合成仪、气泵(打开高纯氩，拧松分压阀，调节阀门使压力表达到指定范围)；打开软件MM；
提前建立文本文档编辑合成随机库的序列，格式：名称+半角逗号+序列(顺序为5’端到3’端)；检查已有方法，确保碱基为对应通道，检查管路液体流出是否正常；
设置随机库合成程序，开启反应；
待反应结束后取出固相合成柱，关闭仪器、高纯氩气。
(2)反应步骤：
去封闭(Deblocking)：用三氯乙酸(TCA)去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5’羟基，供下一步缩合。此步需要注意TCA为较强的酸，可能会有脱嘌呤作用,故TCA与寡核苷酸接触时间不能超过规定时间。
活化(Activation)：在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保证了单体活化充分。
连接(Coupling)：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了高效率连接。
盖帽(Capping)：为了防止未反应的与CPG相连的5’羟基在随后的循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭，常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成活性很强的乙酰化试剂，与少量未参与连接反应的5’羟基缩合成酯键。由于须封闭的羟基少且乙酰化试剂活性高和充分过量，此步反应速度很快，几秒钟即足够。太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可能，且增加乙酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键的危险性。
氧化(Oxidation)：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键(磷为三价)与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷，常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。
循环上述一至五步，寡核苷酸链即可延伸至所需长度时即可完成。
(3)合成后处理：
切割：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
将合成柱中的固相载体取出至1.5mL的离心管中，加入1mL浓氨水70℃加热2.5小时。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。
本专利选用HPLC纯化方法，将HPLC的柱子选为C18用于DNA纯化。
脱保护基：须在此步前选好后续的纯化方法。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT.
加入3％体积的三氟乙酸(浓缩后的DNA为1体积)，振荡反应45秒左右，迅速加入2体积的10×TBE缓冲溶液进行中和；将DNA过Amicon清洗浓缩，12500rpm，离心12分钟，共离心6次，最后一次30分钟左右。
(4)定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
(5)储存：通常一次合成提供的寡核苷酸的量会比所需要的量大得多，所以会涉及到寡核甘酸的储存问题。一般来说，由于寡核甘酸的稳定性很好，但需要注意的是避免紫外线等剧烈的物理环境，避免反复冻融，-20℃可稳定保存一年以上。
2、核酸适配体的筛选
(1)缓冲溶液清单
偶合缓冲液：50mM磷酸钠溶液，pH为7.2，0.15M NaCl；
清洗缓冲液：50mM Tris-HCl，pH为7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA；
筛选缓冲液：50mM Tris-HCl，pH为7.3，0.4M NaCl；
单链缓冲液：110mM Tris-HCl，pH为7.3，0.86M NaCl；
磷酸盐缓冲液：10mM磷酸溶液，100mM NaCl，pH为7.4～8.0；
荧光测量缓冲液：0.5M磷酸钠溶液，pH为8.0；
10×TBE缓冲液：890mM Tris-硼酸，20mM EDTA。
(2)灭草松分子固定
制备接有灭草松的琼脂(图1)
a.MB-COOH缀合反应(COOH-NH2)
试剂：
琼脂糖(NHS活化)
含有氨基分子(20mM,溶液中不含COOH，本实验中使用含有氨基、叠氮的小分子)
偶合缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.2,0.15M NaCl)
清洗缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4,0.15M NaCl,1mM EDTA)
过程：
从冷冻室之中取出琼脂，等其回到室温且无水时，快速取15mg的干琼脂于离心过滤柱上，剩余琼脂迅速用封口膜封好，放置冰箱。过滤离心柱中加入0.25mL偶合缓冲液混合，使琼脂体积膨胀，混合均匀。使用离心方法去除上清液。
加入0.5mL偶合缓冲液于固体残留物中，混合均匀，然后使用小离心机离心，弃去上清液。
加入0.5mL偶合缓冲液于固体残留物中，混合均匀，加入新配置的EDC溶液(10-15mgEDC溶于20uL偶合buffer中)，再加入1μL叠氮溶液。混合均匀后，在室温下放置于滚转机反应至少2小时。同时确保溶液在均匀混合搅拌。
使用离心法去除上清液。然后加入0.5mL清洗缓冲液清洗琼脂3次，储存在0.5mL清洗缓冲液中，4℃保存。
b.生物分子缀合反应(叠氮-炔)
试剂：
含叠氮的生物分子(DNA,蛋白质等，本专利中是带有磁球的叠氮的分子)
含炔的生物分子(蛋白质,DNA等，本专利中使用带炔的小分子)
磷酸盐缓冲液(10mM磷酸盐,100mM NaCl,pH 7.4～8.0)作为“PBS”
硫酸铜(5mM水溶液，现配现用)
抗环血酸钠(20mM水溶液，现配现用)
Triazole ligand TBTA(10mM溶于PBS)
DMSO二甲基亚砜
过程：
称取12.48mg硫酸铜以及39.62mg抗环血酸钠分别置于1.5mL管中，各加水1mL。然后将上述两种液体再次稀释10倍后，各取0.1mL混合，等待约1分钟，得到黄色悬浊液(必须现配现用)。称取带炔灭草松1.39mg，加入DMSO0.2mL，混匀。再加入0.1mLPBS，混匀。再加入0.1mLPBS，混匀。若此时未成白色悬浊液或无沉淀析出，则加入0.1mLPBS，否则加入0.1mLDMSO。
称取TBTA5.31mg，加入0.1mLDMSO混合溶解，接着加入0.125mLPBS，混合后，加入0.775mlDMSO充分溶解。
将带有叠氮的琼脂使用PBS缓冲液清洗3次，然后将第2步中获得的0.5mL溶液全部加入装有琼脂的离心过滤柱(下部封口)，然后加入0.1mL第3步获得的溶液，再加入0.1mL第1步获得的溶液。.
将混合溶液在室温下置于滚转机中反应至少2小时，然后用筛选缓冲液清洗1次，再用DMSO快速而充分的清洗1次，再用筛选缓冲液清洗2次，最后加入0.5mL筛选缓冲液，将琼脂转移到1.5mL离心管中，置于4℃保存。
(3)筛选过程
a.PCR
试剂：
DNA primers(引物)
DNA template(模板)
dNTP mix(碱基AGCT单体)
Taq DNA polymerase(聚合酶)
10×PCR缓冲液
超纯水
过程：
按次序混合以下成分
试剂 空白体系 扩增体系
超纯水 42.3μL 41.3μL
10×PCR缓冲液 5μL 5μL
引物(每种引物100μM) 0.6μL×2 0.6μL×2
碱基单体混合体系(每种单体25mM) 1μL 1μL
Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL 0.5μL
DNA模板(0.1～10μM) 0μL 1μL
PCR条件
b.聚丙烯酰胺凝胶电泳
试剂：
Acrylamide(丙烯酰胺)
Bisacrylamide(双丙烯酰胺)
Urea(尿素)
10×TBE缓冲液(890mM Tris-Boric acid,20mM EDTA；配制过程：108g Tris,7.44g Na2-EDTA*2H2O,55g Boric acid,加入超纯水至总体积为1L)
10％APS(10％Ammonium persulfate solution in water,质量比)
TEMED
40％蔗糖
6×PAGE marker
过程：
制备做胶的储备液，混合以下各种成分
试剂 10％变性PAGE 20％变性PAGE
丙烯酰胺 47.5g 95g
双丙烯酰胺 2.5g 5g
尿素 210g 210g
1×TBE 加至总体积500mL 加至总体积500mL
制备用于DNA分离的胶时，混合下列各组分：
试剂 大胶 小胶
储备液(10％或20％) 40mL 20mL
10％APS 132μL 70μL
TEMED 36μL 20μL
将上述试剂充分混合后，立即将其倒入胶片模具。等待1～1.5小时。
c.跑胶
将样品与40％的蔗糖溶液以1:1的体积比混合，再取5～10μL的混合液加入到胶片的槽中；
在跑胶前，使用1×TBE清洗各个胶槽(使用移液枪)；
参数设置：300V，时长约27分钟
设置 10％大胶 10％小胶 20％大胶 20％小胶
V 300V 300V 450V 450V
I 100 100 100mA 100mA
P 160 160 160W 160W
使用紫外灯成像。
d.DNA双链分离
试剂：
PCR产物(1μM,引物上含有生物素biotin与荧光素FAM)
链霉亲和素包被的琼脂粉末(作为固体物料)
筛选缓冲液(50mM Tris-HCl pH为7.3，0.4M NaCl)
NaOH(0.2M)
单链缓冲液(110mM Tris-HCl pH为7.3，0.86M NaCl)
过程：
取链霉亲和素包被的琼脂250μL于离心过滤柱中，离心脱水后加入0.5mL筛选缓冲液清洗并离心脱水(1000g，1min)，重复2次。保留没有溶剂残留的固体物料。
在最后一次离心脱水后，加入0.35mL PCR产物(DNA为1μM，带有荧光素和生物素)，充分混合后在室温下放置于滚转机中反应1-1.5小时【需测量原DNA荧光强度】。
分离固体物料和上清液：离心脱去未结合的DNA后【需测量离心脱去液荧光强度】，再用筛选缓冲液清洗3次每次300μl，直至洗液中不含DNA。如果第一次脱去未结合DNA时，上清液中有很强的荧光，则加入更多固体物料(第一步获得的物料)且保持在滚转机上反应更长时间，直到绝大部分DNA被固定在固体物料上(上清液中没有荧光或者很少)。
接着加入0.5mL浓度为0.2M的NaOH，在室温下放置于滚转机中反应0.5小时。离心于大管中，获得含FAM-DNA的产物。
加入0.040mL浓度为2M的HCl于第4步的大管中，在离心过滤柱中加入0.1mL单链缓冲液，离心，然后在大管中加入0.4mL单链缓冲液，获得ssDNA转移到Amicon Ultra-0.5mL10K的超滤离心管中，以12500rpm的转速离心浓缩15分钟，离心4次，用筛选缓冲液补足体积，得到400ul浓缩的ssDNA。【测量ssDNA荧光强度】。注意，将DNA产物置于0.2M NaOH中时间严格30min。
d.筛选
试剂：
修饰后带有分子的琼脂
单链DNA溶液(ssDNA)
筛选缓冲液(50mM Tris-HCl pH为7.3，0.4M NaCl)
灭草松溶液(0.5mM，取灭草松5mg，用筛选缓冲液溶，体积40mL)
过程：
取已连接灭草松分子的琼脂80μL(120μL)，加入筛选缓冲液300μL进行清洗，再离心分离废液，反复清洗2次。
加入100μL(400μL)洗脱的ssDNA，用筛选缓冲液定容至600μL(500μL)，在室温下放置于滚转机中反应2小时。【需测量原ssDNA荧光强度】
离心分离固液两相后弃去废液，用500μL筛选缓冲液反复冲洗2次。第3次加入500μL筛选缓冲液混合均匀后，将原体系分为250μL与250μL两个体系(两管装)，离心得到的液体为洗3。【需测量首轮废液以及第1-3次清洗废液的荧光强度】
离心过滤管用封口膜封好，分别使用500μL 0.5mM的灭草松溶液，500μL的筛选缓冲液清洗，充分混合后，反应30分钟。【需测量两者清洗废液的荧光强度】
将筛选缓冲液及灭草松洗出液各取100测量其荧光，其余转移到Amicon Ultra-0.5mL 10K的超滤离心管中，以12500rpm的转速离心浓缩15分钟，离心4次，用筛选缓冲液补足体积。最后获得100μL的筛选产物(倒置离心管内部微滤管，1250rpm，2min即可)，用于下一轮PCR反应。
3、荧光测量
试剂：
待测DNA样品
荧光测量缓冲溶液(0.2M磷酸钠溶液，pH7.4)
过程：
测量前，先用酒精洗用于测荧光的玻璃管，基本擦干吹干后，用超纯水洗，再加入荧光测量缓冲液测量基线(两条，blank-1是直接测，blank-2是先Auto Zero再测的)，相比较测得的样品，基线上极值差的绝对值不能太大。
测量双链DNA解链成单链DNA时，取待测溶液20μL于玻璃管，加入荧光测量缓冲液280μL，充分混合后测量荧光强度。
测量筛选过程中DNA结合、洗脱DNA量的荧光强度时，取待测溶液100μL于玻璃管，加入荧光测量缓冲液200μL，充分混合测量荧光强度。
荧光测量激发波长为490nm，发射波长为520nm。第2步记录520nm，第3步记录520nm和560nm的数值；
其余参数的设置与操作，注意细节；
1的测量命名为日期+CF；2的命名为“日期”+“S”+“筛选轮数”。
4、筛选实验步骤
首先将来自合成库的DNA进行扩增，至少8管加了DNA与1管空白对照(即一共9管)；
将PCR扩增的DNA进行拆分单链，获得的分离液与单链产物需要留样保存；
将第2步中用于反应的PCR产物、分离液以及单链产物进行荧光测定；
将获得的单链产物进行筛选，测量7个荧光(单链DNA，分离液，1～3洗液，buffer洗出液，灭草松洗出液)；
将筛选获得的产物进行PCR扩增，其中以筛选产物为模板的扩增1管，对照空白1管；
对一轮筛选的产物进行跑胶验证，顺序为Mark、上一轮PCR的空白对照、上一轮PCR产物、本轮拆分分离液(浓缩后)、本轮拆分得到的单链(浓缩后)、筛选分离液PCR的空白对照、空白分离液(Buffer洗液)浓缩后的PCR产物、灭草松分离液浓缩后的PCR产物，共8个条带。验证跑胶结果合格，则将筛选获得的产物(第5步实验)进行扩增，至少扩增8管，全为加了DNA模板，然后回到第2步开始循环；否则，停止实验，直到找出跑胶结果不合格的原因。
5、测量离解常数
在筛选缓冲液(50mM Tris-HCl pH为7.3，0.4M NaCl)中配制50μM灭草松溶液
加入0-100μM一种核酸适配体进入上述灭草送溶液的过程中在紫外可见分光光度计中监控350nm处吸光度的变化
通过吸光度-DNA浓度曲线计算离解常数Kd，按照以下公式计算：
Kd＝[B0×(Amax-A)/(A-A0)]×[D-B0×(A-A0)/(Amax-A0)]
其中，B0为灭草松的初始浓度(50μM)，D为DNA的加入浓度(0-100μM)，A为测得吸光度(加入相应DNA浓度后)，A0为初始吸光度(未加入DNA)，Amax为加入无限大DNA浓度后的吸光度
附图说明
图1炔取代的灭草松的合成方法示意图
图2将灭草松分子固定到琼脂(蓝色圆球)表面的方法
图3体外筛选流程示意图
图4 5种灭草松适配体序列901、905、907、909、913，从左至右为5’端到3’端
图5 5种灭草送适配体结合灭草松的离解常数、拟合曲线、模拟的核酸二级结构
实施实例
1、按照以上实施方式，将灭草松分子通过图1和图2的方法进行化学修饰并固定在琼脂上。
2、按照以上实施方式，合成了以下序列的核酸随机库以及引物：
核酸随机库：5’-CATCCAATCGGTAGTAGC-N40-CATGGGTTCAAGCGTTAG-3’
其中N40代表40个随机核苷酸(A、T、G、C几率各25％)
引物：5’-FAM-CAT CCA ATC GGT AGT AGC-3’以及5’-Biotin-CTA ACG CTT GAACCC ATG-3’
3、按照以上实施方式，以图3的方法进行体外筛选。通过15轮筛选后，对相应的功能化核酸库进行克隆测序，得到识别灭草松的核酸适配体序列，如图4所示。
4、按照以上实施方式，通过灭草松分子的紫外可见吸收光谱随着与核酸适配体的相互作用的变化，测量得到核酸适配体序列对灭草松结合的离解常数，如图5所示，用于表征其识别灭草松的能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 几种识别灭草松的核酸适配体序列及其衍生物
<130> HA201501825
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggaacactgg gcagcattcc atggatccta atgaccaagg 40
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
acgaccggct gtgtagaccc aaccatggat cctaatgacc aagg 44
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tggagtgcag gaatgtgaaa tggatcctaa tgaccaagg 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgccagtcgg atagtgttag agcaaccaac ggggtgtgg 39
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cctaaacgtg gctattgatt aagaaccgat gagtggccca gg 42

Claims (1)

1.一种用于识别或检测灭草松及其衍生物的脱氧核糖核酸适配体序列，其特征在于，由如SEQ ID NO：1-5所示的序列组成。
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