JP2010029126A - 核酸抽出方法と核酸抽出キット及び遺伝子検出方法と遺伝子検出キット - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、遺伝子型の検査のための細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法として、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅の反応や遺伝子検出の反応を阻害することが少ない核酸含有溶液を得る核酸抽出方法を提供することである。さらに、該核酸抽出方法に用いることのできる核酸抽出キットを提供することと、さらに、該核酸検出方法により生成される核酸含有溶液を用いた遺伝子検出方法と該遺伝子検出方法に用いることのできる遺伝子キットを提供することである。
【解決手段】少なくとも細胞とアルカリ性の水溶液を混合した溶液に緩衝液を加えた溶液から核酸抽出溶液を得る核酸抽出方法において、ベタインを添加することを特徴とする核酸抽出方法と該核酸抽出方法に基づく核酸抽出キットと該核酸抽出溶液を用いる遺伝子検出方法と遺伝子検出キット。
【選択図】 図１

Description

本発明は遺伝子型の検査のための、細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法とその方法を実施するための核酸抽出キットと該核酸抽出方法によって生成される核酸含有溶液を用いる遺伝子検出方法と遺伝子検出キットに関する。

近年、遺伝子検出は、研究用途から体質検査やそれを用いた臨床応用へと拡大してきている。例えば、２００７年８月１６日にＦＤＡ（米国食品医療品局）により、抗血液凝固剤の一種であるワルファリンに関係する遺伝子多型の情報を盛り込んだ改定添付文書が承認されるに至っている。

ワルファリンは、心臓弁膜症の治療として、機械弁を用いた弁置換術の施術の後や、心房細動が原因となる脳塞栓症予防、あるいは深部静脈血栓症による肺塞栓症予防のためなどや、抗リン脂質抗体症候群での血栓症予防のためにしばしば処方される。

しかしながら、特定の遺伝子型を持つ患者では、ワルファリンの処方量が同一であっても、ワルファリンの処方量が不足となって十分な効果が出なかったり、逆にワルファリンの処方量が過剰となって、出血をきたしやすい患者が潜在的に存在する。

このため、同じ生物種の集団のなかで遺伝子型の異なる遺伝子配列またはＤＮＡ配列である遺伝子多型を調べることが有用となる。

ワルファリンの場合については、ワルファリンの薬物代謝酵素であるＣＹＰ２Ｃ９と血液凝固に関する酵素であるＶＫＯＲＣ１の２つの酵素の遺伝子多型によって、ワルファリン代謝速度に違いが認められるため、この２つの酵素の遺伝子の多型により、抗凝固作用を得る投与量が異なるという臨床データが前記改定添付文書に掲載され、どの程度の投与量調整が必要かが明示されている。

このようなワルファリンの処方量に関係する遺伝子多型の情報のように、遺伝子型は治療法を選択するために有意な情報であり、治療に迅速性を要する場合、医療現場で遺伝子型を検査する必要がある。この遺伝子型の検査は、細胞中の核酸の解析により行われる。

従って、遺伝子型の検査の手順として、一般的には、まず、細胞から核酸抽出方法により核酸を抽出して核酸抽出溶液を生成する。次に、得られた核酸抽出溶液から遺伝子を検出する精度を向上させるために、特定の部分の核酸を増やして増幅させる核酸増幅反応を行う。さらにその特定の部分の遺伝子の検出を行い遺伝子多型の識別を行う。というプロセスを実施する必要がある。

核酸抽出方法の実施する際には、対象となる細胞から核酸を抽出するための一連の酵素や、薬剤などから成る核酸抽出キットを用いることもできる。

また、核酸増幅反応や、遺伝子の検出のための反応においても、それらの反応に必要な一連の酵素や、薬剤などから成るキットをそれぞれ用いることもできる。

核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちPolymerase Chain Reaction（以下ＰＣＲと記載する）が用いられることが多い。この反応を用いた手法をＰＣＲ法という。

以上のように、遺伝子型の検査のためには、その反応に係わるキットと器具や装置の操作や運用といった取り扱い技術が必要となる。しかしながら、現状は、研究施設等とは異なり、一般の医療現場にこのような遺伝子型の検査のための前記取扱い技術を取得している作業者が必ずしも常にいるとは限らない状況となっている。従って、該取り扱い技術を簡便化し、医療現場へ遺伝子型の検査を導入しやすくすることが必要である。

細胞を得る手段としては、細胞を液体中に分散して含む血液が、遺伝子型の検査のための細胞を得る媒体としてよく用いられる。血液は、液体状態のときに、遺伝子検出のための他の薬剤や、酵素を用いた反応に便利なため、操作が容易となるためである。また、血液を精製せずに、全血を用いることができれば、精製の手順を必要としないため、より簡便であり望ましい。

一方、前記の遺伝子型の検査の手順に示したような、全血の細胞から核酸を精製してから核酸増幅反応を行うのではなく、直接全血を核酸増幅反応に用いる方法もある。

そのような方法として、反応促進剤としてポリアミンを用いる例がある（特許文献１及び非特許文献１）。しかし、反応組成が限定されるため、特定のポリメラーゼ酵素を用いる必要がある。また、制限酵素切断等、別の酵素反応を同一の反応組成で用いることが困難であり、汎用性が制限される。また、核酸増幅効率が低いため、各段階（変性、アニーリング、伸長）の時間を、精製核酸を用いた場合より長く設定する必要があり、遺伝子の解析に要する時間が核酸を精製する方法に比べてむしろ増すなど様々な問題があり、簡便であるとはいえない。

血液に含まれる核酸増幅反応への阻害成分に対して耐久性を示す特別な性質をもつポリメラーゼ酵素を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）に関しては、核酸増幅反応液中での血液の割合が、一定以下の場合は有効である（特許文献２参照）。この場合、抽出するのに特殊な前記酵素が比較的多量に必要で、コストが高くなるという課題がある。

一方、全血からゲノム核酸を精製するための一連の反応のための酵素や、薬剤をセットにしたキットも多く市販されている。例えばキアゲン社のDNeasy（登録商標） Blood & Tissue kit製品を用いると、全血100μｌから高精製度の核酸が３〜６μｇ得られる（非特許文献２参照）。
しかし、分子生物学実験に熟練していない作業員には，このようなキットを使う際に必要となる分注や遠心、廃液等の操作が、必ずしも簡便であるとは言えない。従って、取り扱い技術に熟練を要するという課題がある。

また、ＰＣＲ等の反応に用いる核酸抽出溶液を得るための方法として、前記キットを用いる場合のような、熟練を要する操作を必要としない方法として、たとえば、Klintscharらが2000年に報告したアルカリ性の水溶液を用いて血液の細胞を破壊変性した後に、ｐＨ７．５の緩衝液を加えて緩衝状態にする方法がある（非特許文献３）。
この方法は、取り扱い技術が簡便で、熟練を要せず、さらに薬液が廉価である、という特徴がある。

これは、まず、全血を０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液と１：４の割合で混合して混合溶液として、攪拌操作を行った後、緩衝液をさらに混合する。緩衝液としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）を塩酸（HCl）で中和した溶液であるTris-HCl緩衝液を用いる。このTris-HCLが０．２ｍｏｌ／ｌの濃度のTris-HCL緩衝液を加えて、強アルカリ性の混合溶液と混合させる。充分な量の該緩衝液を加えることにより、ｐＨの値は、緩衝作用により該緩衝液の値と同等となる。生じる沈殿物を、遠心操作により除去して、上澄み液を核酸抽出溶液としてＰＣＲに用いて核酸の増幅を行い、さらに、遺伝子の検出を行う。

この方法は、必要な器具等が少なく、操作も簡便で優れている。しかし、生成される核酸含有溶液中に血液中の核酸増幅反応を阻害するタンパク質等の反応阻害物質を含むため、精製された核酸を用いた場合に比べて核酸増幅反応の効率が低下する傾向を示すという問題がある。また、核酸抽出効率そのものが低いという問題がある。

これとは別に、核酸増幅反応であるＰＣＲの効率を向上させる方法として、ベタイン（N,N,N-トリメチルグリシン）を添加すると効果のあることが知られている。

すなわち、グリシンベースの細胞内浸透圧調整物質の一つであるベタイン（N,N,N-トリメチルグリシン）の有効量をＰＣＲの反応液に添加することで、ＰＣＲによる標的ヌクレオチド配列の増幅効率を改善できることが示されている（特許文献３参照）。ベタインなどの細胞内浸透圧調整物質は、遺伝子検出のための核酸増幅生成物中で「スタッターバンド」または「シャドウバンド」と呼ばれる核酸配列の解析が困難な部分を減らし、核酸配列における標的ヌクレオチド配列の検出を容易にする。その結果、遺伝子多型の検出に関わる標的ヌクレオチド配列の増幅効率が向上する。

ベタインが標的ヌクレオチド配列の増幅効率を向上させるという効果の原理に関しては、リース(Rees)らが、ベタインは、小さな分子量のテトラアルキルアンモニウムイオンとして水溶液中に存在しており、これがｐＨの中性近傍において双極性のイオンとして働き、ＤＮＡの二重螺旋構造が、加熱により一本鎖となるＤＮＡの融解の後に、もともとの長いＤＮＡの塩基対同士が再び対で組む傾向を、減らす、もしくはなくすという効果がある、ということを示して説明している。(非特許文献４参照）。

次に、抽出された核酸を含む核酸抽出溶液から、特定の遺伝子を検出する方法を示す。代表的な方法として、たとえば、Invader Plus法がある（非特許文献５参照）。

Invader Plus法は米国Third Wave Technology社の技術であり、核酸増幅の方法であるＰＣＲ法と遺伝子検出の方法であるInvader法を同一反応液で行うことができる。先にＰＣＲにより標的の遺伝子断片の部分の核酸を増幅して、Invader法により特定の遺伝子を検出し、遺伝子多型の識別を行う。

InvaderPlus法では、同時に２種類の塩基配列の検出が可能で、２種類の多型を検出することによく用いられる。この場合、それぞれの塩基配列を認識し、異なる配列に対応する異なる蛍光色素を含む２種類の検出用物質であるＤＮＡプローブが使用される。それぞれに対応した該ＤＮＡプローブは対応する塩基配列に反応し、反応後に蛍光色素を解離して標的部位の塩基に特異的な蛍光シグナルを生じるように設計されている。遺伝子の検出は、この蛍光シグナルの強度を測定して行われる。

前記Invader Plus法のように、遺伝子型の検査の手順のなかで、前記核酸増幅の方法と遺伝子検出の方法についてはすでに比較的簡便で有効な方法が提案されており、その方法に基づくキットや装置も商品化されている。しかしながら、前述のごとく、核酸抽出の方法と同キットおよび同装置については、すでに説明したような、様々な課題がある。
特開平８−９９９７号公報 特表２００８−５０６４１７号公報 米国特許第５，５４５，５３９号明細書 ShimadzuBiotech社のAmpDirectウエブサイトhttp://www.shimadzu-biotech.jp/reagents/amp/ampdata2.pdf キアゲン社の血液からDNAを精製する商品例のウエブサイトhttp://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/QIAampSystem/QIAampDNABloodMiniKit.aspx Klintschar M, Neuhuber F. J of Forensic Sci、2000年、４５（３）：669-673 Rees et al。 Biochemistry、 1993年、32:137-144 サードウエーブジャパン社、Ｉｎｖａｄｅｒ技術説明ウエブサイトhttp://www.twt.co.jp/02.html

本発明の課題は、遺伝子型の検査のための細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法として、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅の反応や遺伝子検出の反応を阻害することが少ない核酸含有溶液を得る核酸抽出方法を提供することである。さらに、該核酸抽出方法に用いることのできる核酸抽出キットを提供することと、さらに、該核酸検出方法により生成される核酸含有溶液を用いた遺伝子検出方法と該遺伝子検出方法に用いることのできる遺伝子キットを提供することである。

上記課題を解決するための請求項１に記載の発明は、細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法において、少なくとも細胞とアルカリ性の水溶液を混合して混合溶液として、さらに該混合溶液に緩衝液を加えて成る混合緩衝溶液から核酸を抽出して核酸抽出溶液を得る核酸抽出方法において、少なくも該混合緩衝溶液、または該混合緩衝溶液となる前までのいずれかの段階で、ベタインを添加することを特徴とする核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項２に記載の発明は、前記細胞が、血液に含まれることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項３に記載の発明は、前記核酸抽出溶液におけるベタインの濃度が０．１〜２．０ｍｏｌ／ｌであることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項４に記載の発明は、前記アルカリ性の水溶液のｐＨの値が１２以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか1項に記載の核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項５に記載の発明は、前記緩衝液のｐＨの値の範囲が、５〜９であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項に記載の核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項６に記載の発明は、前記核酸抽出溶液のｐＨの値の範囲が、５〜９であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか1項に記載の核酸抽出方法である。

上記課題を解決するための請求項７に記載の発明は、アルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことを特徴とする核酸抽出キットである。

上記課題を解決するための請求項８に記載の発明は、請求項７に記載の核酸抽出キットを用いることを特徴とする請求項1〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出方法である。

請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸抽出方法または請求項８に記載の核酸抽出方法によって生成される核酸抽出溶液を用いることを特徴とする遺伝子検出方法である。

アルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことを特徴とする遺伝子検出キットである。

請求項１に記載の本発明による核酸抽出方法によって、細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法において、少なくとも細胞とアルカリ性の水溶液を混合して混合溶液として、さらに該混合溶液に緩衝液を加えて成る混合緩衝溶液から核酸を抽出して核酸抽出溶液を得る核酸抽出方法において、少なくも該混合緩衝溶液、または該混合緩衝溶液となる前までのいずれかの段階において、ベタインを添加することにより、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することの少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項２に記載の本発明による核酸抽出方法によって、血液に含まれる細胞から、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することが少ない核酸含有溶液を得ることができる。

請求項３に記載の本発明による核酸抽出方法によって、ベタインの濃度が０．１〜２．０ｍｏｌ／ｌであることによって、核酸抽出効率を高くすることができ、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することの少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項４に記載の本発明による核酸抽出方法によって、前記アルカリ性の水溶液のｐＨの値が１２以上であることにより、細胞を変性させ破壊する効率を高くすることができ、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することの少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項５に記載の本発明による核酸抽出方法によって、前記緩衝液のｐＨの値の範囲が、５〜９であることにより、前記細胞とアルカリ性の水溶液を混合した溶液に前記緩衝液を加えた場合のｐＨの値を、５〜９の範囲にすることができる。これによって、核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することの少ない核酸抽出溶液を得ることができる
請求項６に記載の本発明による核酸抽出方法によって、前記核酸抽出溶液のｐＨの値の範囲を、５〜９とすることによって、核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することの少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項７に記載の本発明による核酸抽出キットをもちいることによって、核酸抽出キットにアルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことにより、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することが少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項８に記載の本発明による核酸抽出方法において、請求項７に記載の核酸抽出キットを用いることによって、該核酸抽出方法に必要な溶液を容易に得ることができ、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することが少ない核酸抽出溶液を得ることができる。

請求項９に記載の本発明による遺伝子検出方法において、請求項１〜６のいずれか1項
に記載の核酸抽出方法または請求項８に記載の核酸抽出方法によって生成される核酸抽出溶液を用いることにより、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することが少ない核酸抽出溶液とすることができ、遺伝子を検出する効率の高い遺伝子検出方法が可能となる。

請求項１０に記載の本発明による遺伝子検出キットにおいて、アルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことにより、器具や操作が簡便でかつ核酸抽出効率が高く、さらに後のプロセスである核酸増幅反応や遺伝子検出反応を阻害することが少ない核酸抽出溶液とすることができ、遺伝子の検出時間を短くすることのできる遺伝子検出キットが可能となる。

まず、本発明による核酸抽出方法と、該核酸抽出方法に用いることのできる核酸抽出キットについて、その実施の形態の一例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明を実施の形態の一例として、細胞として全血を用いた例を、次に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。

本発明の核酸抽出方法の手順を図１に基づいて説明する。まず、全血ａと、ｐＨを調整したアルカリ性の水溶液ｂの適量とで混合プロセス１を行い、混合溶液ｇとする。

なお、図１において、プロセスの下に記載されている点線で結合された四角の枠はそれぞれのプロセス内で生成される物質を示す。以下同様とする。

次に該混合溶液ｇに対してボルテックス攪拌プロセス２を行い、血液細胞を破壊変性して混合攪拌溶液ｈとする。

次に、該混合攪拌溶液ｈを２〜５分の静置プロセス３を経た後、混合攪拌溶液ｉとして、該混合溶液ｉとｐＨを調整した緩衝液ｃとを混合する混合プロセス４を行い混合緩衝溶液ｊとする。加える緩衝液ｃの量は、強アルカリ性の該混合攪拌溶液ｈと該緩衝液ｃとが混合することによって、ほとんどｐＨが変動しないようにする緩衝液ｃの緩衝作用により、該混合緩衝溶液ｊのｐＨが該緩衝液ｃと同等のｐＨの値となるような充分な量とする。

核酸抽出方法の手順において、ここまでの手順である図1の点線で囲まれたＡの区間のなかの段階においてベタインｄを適量加える。

すなわち、ベタインｄは、全血ａとアルカリ性の水溶液ｂとを混合する前に、全血ａに加えてもよい。

また、ベタインｄは、全血ａとアルカリ性の水溶液ｂとを混合する前に、アルカリ性の水溶液ｂに加えてもよい。

また、ベタインｄは、全血ａとアルカリ性の水溶液ｂとの混合プロセス１の際に加えてもよい。

またベタインｄは、全血ａとアルカリ性の水溶液ｂをボルテックス攪拌プロセス２の際にくわえてもよい。

またベタインｄは、該混合攪拌溶液ｉを静置３する際に加えてもよい。

また、ベタインｄは、緩衝液ｃに加えてもよい。

また、ベタインｄは、緩衝液ｃを該混合攪拌溶液ｉとの混合プロセス４の際にくわえてもよい。

また、ベタインｄは、該混合緩衝溶液ｊに加えてもよい。

このようにしてベタインｄが添加された該混合緩衝溶液ｊを遠心分離装置に設置し、遠心分離プロセス５により沈殿物ｅを除去して上澄みを核酸抽出溶液ｆとする。場合によっては、この後に濾過をおこなってもよい。

また、本発明による核酸抽出キットには、前記アルカリ性の水溶液と前記緩衝液と前記ベタインとを少なくとも含む。

核酸抽出キットの一要素であるアルカリ性の水溶液ｂとしては、ｐＨを調整したＮａＯＨ溶液を用いることができる。ＮａＯＨの濃度はｐＨが１２以上となるように調製することが好ましいが、その限りではない。

核酸抽出キットの一要素である緩衝液ｃとしては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）を塩酸（HCｌ）で中和した溶液であるTris-HCLバッファーなどを用いることができる。Tris-HClバッファーのｐＨの値は５〜９の範囲となるように調製することが望ましいが、その限りではない。

核酸抽出キットの一要素であるベタインｄの量は、前記核酸抽出溶液ｆにおいて、すべて溶液中に溶解した状態に換算して０．１〜２．０ｍｏｌ／ｌの濃度相当となるように調製して添加することが好ましい。

次に前記核酸抽出溶液ｆから遺伝子の検出を行う遺伝子検出方法と該遺伝子検出方法に用いることのできる遺伝子検出キットについてその実施の形態の一例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。

遺伝子の検出を行う方法としては、前記核酸抽出溶液ｆとＤＮＡマイクロアレイを組み合わせる方法や、リアルタイムＰＣＲ法や、Invader Plus法などと組み合わせて行う方法などがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明の核酸抽出方法によって得られる核酸抽出溶液ｆを用いて、Invader Plus法により遺伝子の検出を行う方法について次に示すが、本発明は、これに限定されるものではない。

以下に、Invader Plus法により、ワルファリンの処方量に関係する血液凝固に関する酵素であるＶＫＯＲＣ１、またはワルファリンの薬物代謝酵素であるＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子多型に関する遺伝子検出の方法の例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。

本発明によって得られた核酸抽出溶液ｆに、Invader Plus反応液であるInvader Plus bufferと、ＶＫＯＲＣ１に対応する遺伝子を検出するためのＶＫＯＲＣ１オリゴミックスと、Enzyme Mixとを混合し、変性処理（95℃で5分加熱）してＤＮＡの二重螺旋を一本鎖に融解させる。なお、ＶＫＯＲＣ１オリゴミックスは、ＰＣＲ用プライマー、ＤＮＡプローブ、インベイディングオリゴ、ＦＲＥＴカセットから成る。

また、ＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子多型に関する遺伝子検出の場合では、ＣＹＰ２Ｃ９に対応する遺伝子を検出するためのＣＹＰ２Ｃ９オリゴミックスを用いて同様にして操作を行う。なお、ＣＹＰ２Ｃ９オリゴミックスは、ＰＣＲ用プライマー、ＤＮＡプローブ、インベイディングオリゴ、ＦＲＥＴカセットから成る。

次に、ＰＣＲ法（95℃5分、95℃30秒（変性）、72℃45秒（伸長））を３５サイクル行ってＶＫＯＲＣ１に相当する部分の核酸の増幅反応を行った後、Taq失活（99℃10分）を行いＰＣＲすなわちポリメラーゼ連鎖反応を停止させる。

最後にInvader法（63℃2分）を実施して、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子に対応する核酸配列に特異的に結合したＤＮＡプローブを分解させて、さらにこの分解反応により生成されたＤＮＡの加熱プローブの５’オリゴヌクレオチドが蛍光色素を持つＦＲＥＴカセット結合し、さらに該ＦＲＥＴが分解されて蛍光色素が該ＦＲＥＴカセットから遊離し、蛍光を発光するようにして、ＶＫＯＲＣ１の遺伝子の検出を、蛍光の測定により間接的に測定できるようにする。

Invader法により解離された蛍光色素であるＦＡＭの蛍光シグナル強度（励起波長 485nm, 発光波長 535nm）と同じく解離された蛍光色素であるＲＥＤの蛍光シグナル強度（励起波長 560nm, 発光波長 612nm）を、蛍光を測定する装置であるTECAN社Infinite F200で測光し評価する。このＦＡＭの蛍光シグナル強度ｈが対応するＶＫＯＲＣ１の遺伝子の検出量を示す。

通常、Third Wave Technology社のInvader Plus法においては、２種類のＤＮＡプローブの反応を同時に行うことが可能である。蛍光測定装置は、２種類の蛍光シグナル強度を同時に測定することが可能であり、これを用いて、２種類の遺伝子の塩基配列の検出が可能である。このため、遺伝子多型の検出に用いられることが多い。また、この蛍光シグナル強度の値が目的の遺伝子検出量の値を示す。蛍光シグナル強度の値が高いと遺伝子検出量の値が高いことを示す。以下の実施例では、正常な反応が起きた場合は対応するＦＡＭの蛍光シグナル強度が遺伝子の検出量に応じて高くなり、ＲＥＤの蛍光シグナル強度は低く、バックグラウンドと同等の値となる例を示す。

本発明による遺伝子検出キットには、前記アルカリ性の水溶液と前記緩衝液と前記ベタインとを少なくとも含む。

遺伝子検出キットの一要素であるアルカリ性の水溶液ｂとしては、ｐＨを調整したＮａＯＨ溶液を用いることができる。ＮａＯＨの濃度はｐＨが１２以上となるように調製することが好ましいが、その限りではない。

遺伝子検出キットの一要素である緩衝液ｃとしては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）を塩酸（HCｌ）で中和した溶液であるTris-HCLバッファーなどを用いることができる。Tris-HClバッファーのｐＨの値は５〜９の範囲となるように調製することが望ましいが、その限りではない。

遺伝子検出キットの一要素であるベタインｄの量は、前記核酸抽出溶液ｆにおいて、すべて溶液中に溶解した状態で０．１〜２．０ｍｏｌ／ｌの濃度相当となるように調製して添加することが好ましい。

次に、本発明による核酸抽出方法により具体的に核酸の抽出を行って核酸抽出溶液を得
た例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また、次に、本発明による遺伝子検出方法により該核酸抽出溶液から特定の遺伝子の検出を行い、評価する例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

まず、本発明による核酸抽出方法により、核酸の抽出を行った。図２に基づき各手順について説明を行う。

１０μｌの全血ａと、１００μｌのNaOH 溶液ｂ（０．２ｍｏｌ／ｌ）とを混合プロセス１をして調製した混合溶液ｇを、ボルテックス攪拌プロセス２を１０秒間行って混合攪拌溶液ｈとする。
ここで、静置プロセス３を２〜５分行う。このようにして、血液細胞を破壊変性する。

次に、該混合攪拌溶液ｉに緩衝液ｃ（２１.１６ｍｍｏｌ／ｌのTris-HCl緩衝液 ）を１８９０μｌ加えて混合プロセス４をして混合緩衝溶液ｊを調製する。該混合緩衝溶液ｊを遠心分離プロセス５（５０００Ｇ、１分）により沈殿物ｅを除去して上澄みから核酸抽出溶液ｆを得た。

前記の手順において、ベタインｄの添加の有無により、実施例１の試料と比較例１の試料をそれぞれ調製した。

図２においてＢで示す領域は、本発明の核酸抽出方法の実施の形態の一例を示すプロセスフローである。

ベタインｄの添加は、図２に示すように、該緩衝液ｃにベタインｄを事前に添加しておくことで行った。

実施例１として、前記緩衝液ｃに、前記核酸抽出溶液ｆ中におけるベタインｄの濃度が、それぞれ、０．２５，０．５，０．７５，１ｍｏｌ／ｌ(Ｍ)となるような相当量を、それぞれ添加して用いた。このようにして各々のベタインｄの濃度の核酸抽出溶液ｆを４種類調製した。また、比較例１として、ベタインｄを加えない場合を、０ｍｏｌ／ｌ(Ｍ)、として同様にして試料を調製した。

次に、Invader Plus法により、該核酸抽出溶液ｆからの遺伝子の検出を行い、本発明による核酸抽出方法の評価を行った。ここでは、実施例１のベタインを添加した４種類と、比較例１のベタインを添加しない１種類の核酸抽出溶液についてワルファリンの処方量に関係する血液凝固に関する酵素であるＶＫＯＲＣ１の遺伝子検出を行った。

前記により調製した実施例１の４種類と比較例１の1種類の核酸抽出溶液ｆを7.75μｌ、それぞれ用意し、１０倍の濃度のInvader Plus buffer（ｋ）を1μlと、１０倍の濃度のＶＫＯＲＣ１ オリゴミックス（ｌ）を1μｌと、４０倍濃度のEnzyme Mix（ｋ）を0.25μｌ、とをそれぞれ混合し、ＤＮＡ変性処理（95℃で5分加熱）した後、ＰＣＲ法（95℃5分、95℃30秒（変性）、72℃45秒（伸長））を３５サイクル実施して核酸増幅を行った後、Taq失活（99℃10分）を行ってＰＣＲを停止した。次に、Invader法（63℃2分）を実施して遺伝子の検出のための蛍光色素を遊離させ蛍光シグナルを発現させた。

Invader反応により解離された蛍光色素であるＦＡＭ（ 励起波長 485nm,発光波長535nm）の蛍光シグナル強度と同じく解離された蛍光色素であるＲＥＤの蛍光シグナル強度（励起波長 560nm, 発光波長 612nm）をTECAN社Infinite F200で測光した。この蛍光シグナル強度の測定値は遺伝子の検出量を示す。

本実施例１と比較例１の測定結果を図３に示す。ここで、縦軸は、蛍光シグナル強度を示す相対的な値である。数字の大きい方が遺伝子の検出量の値が大きいことを示す。また、横軸は、ベタインｄの濃度を示す。横軸の濃度の単位はｍｏｌ／ｌである。また、ＮＣは、反応液として核酸抽出溶液の代わりに水を用いた場合の値であり、測定装置のノイズによるものと推定される。すなわち、ＮＣでの値が実質的に検出量が０であることを示す。

比較例１のベタインｄの濃度が０の場合は、ＮＣの場合とほぼ同じで、遺伝子がほとんど検出されなかった。実施例１のベタインを添加した場合はいずれも遺伝子が検出された。特にベタインｄの濃度が0.5〜0.75Mの場合はＶＫＯＲＣ１の遺伝子の検出量が多く、ベタインｄの濃度に最適値があることを示す。また、本反応のバックグラウンドを示すＲＥＤの蛍光シグナル強度の上昇がみられなかった。

以上の結果から、本発明の核酸抽出方法に基づいて、ベタインｄを核酸の抽出において混合緩衝溶液ｊに添加することにより得た核酸抽出溶液ｆにおいて、遺伝子の検出量が増加し、添加しない場合に比べ著しく遺伝子の検出の効率を向上させることが示された。

次に、本発明による核酸抽出方法により具体的に核酸の抽出を行って核酸抽出溶液を得た例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また、次に本発明による遺伝子検出方法により該核酸抽出溶液から実施例1とは異なる遺伝子の検出を行い、評価する例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例２として、ベタインｄを、図２に示すプロセスにおいて添加した場合と、比較例２として、ベタインを核酸抽出のプロセスではなくＰＣＲの核酸増幅反応において添加した場合について、同じ遺伝子の検出を行い比較、評価した。

遺伝子の検出方法として、Invader Plus法を用いて、ワルファリンの薬物代謝酵素であるＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子多型の一つであるＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出の方法の例を示すが、本発明は、これに限定されるものではない。

まず、本発明による、核酸抽出方法に基づき、核酸の抽出を行って核酸抽出溶液ｆを作製した。図２に基づき説明する。

１０μｌの全血ａと、１００μｌのNaOH 溶液ｂ（０．２ｍｏｌ／ｌ）とを混合プロセス１をして調製した混合溶液ｇを、ボルテックス攪拌プロセス２を１０秒間行って混合攪拌溶液ｈとする。
ここで、静置プロセス３を２〜５分行う。このようにして、血液細胞を破壊変性する。

次に、該混合攪拌溶液ｉに緩衝液ｃ（２１.１６ｍｍｏｌ／ｌのTris-HCl緩衝液 ）１８９０μｌを加えて混合プロセス４をして混合緩衝溶液ｊを調製する。該混合緩衝溶液ｊを遠心分離プロセス５（５０００Ｇ、１分）により沈殿物ｅを除去して上澄みから核酸抽出溶液ｆを得た。

なお、実施例２として、前記緩衝液ｃに、この核酸抽出溶液ｆ中において、ベタインｄの濃度が、０．７５，１．０，１．５ｍｏｌ／ｌ(Ｍ)となるように、それぞれ添加して用いた。このようにして各々のベタインｄの濃度の核酸抽出溶液を３種類調製した。また、比較例２として、ここまでのプロセスではベタインｄを加えない場合を、０ｍｏｌ／ｌ(Ｍ)、として３つの試料を同様にして調製した。

次に、Invader Plus法により、ベタイン添加の効果の検証を行った。ここでは、実施例２として、核酸の抽出において、ベタインｄを前記各濃度で添加した核酸抽出溶液ｆの例を3種類と、比較例２として、ベタインを添加しないで調製した核酸抽出溶液に、ベタインをInvader Plus法におけるＰＣＲの反応液に添加した例を3種類作製した。

比較例２においては、実施例２で作製した３種類の場合と遺伝子検出の際のベタインｄの濃度をベタインｄが溶液にすべて溶けている濃度相当とそれぞれ同じになるように対応させて３種類調製した。

ここでは、実施例２と比較例２のそれぞれにおいて、前記ワルファリンの薬物代謝酵素であるＣＹＰ２Ｃ９の遺伝子多型の一つであるＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子の検出を行った。

次に、Invader Plus法によるＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子の検出方法について記載するが、本発明は、これに限定されるものではない。

実施例２として、本発明の核酸抽出方法により得られたそれぞれのベタインｄの濃度の核酸抽出溶液ｆの7.75μｌを、1μlの１０倍濃度のInvader Plus buffer（ｋ）と1μｌの１０倍濃度のＣＹＰ２Ｃ９＊３ オリゴミックス（ｍ）と0.25μｌの４０倍濃度のEnzyme Mix（ｋ）と混合し、変性処理（95℃5分）を行いＤＮＡの融解をさせる。

次に、ＰＣＲ法（95℃5分、95℃30秒（変性）、72℃45秒（伸長））を３５サイクル実施しＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子の核酸増幅を行った後、Taq失活（99℃10分）を行いＰＣＲを停止させる。

次にＩｎｖａｄｅｒ法（63℃2分）を行いＣＹＰ２Ｃ９＊３に対応する遺伝子に相当する蛍光シグナルがでるようにした。

比較例２では、ｄを含まない核酸抽出溶液7.75μｌを1μlの１０倍濃度のInvader Plus
buffer（ｇ）と1μｌの１０倍濃度のＣＹＰ２Ｃ９＊３ オリゴミックス（ｉ）と0.25μｌの４０倍濃度のEnzyme Mix（ｇ）と混合し、変性処理（95℃5分）を行いＤＮＡの融解をさせる。

次に、ＰＣＲ反応液に前記実施例２と同等の濃度となる量のベタインを添加して3種類用意してＰＣＲ法（95℃5分、95℃30秒（変性）、72℃45秒（伸長））を３５サイクル実施しＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子の核酸増幅を行った後、Taq失活（99℃10分）を行いＰＣＲを停止させる。

次にInvader法（63℃2分）を行いＣＹＰ２Ｃ９＊３に対応する遺伝子に相当する蛍光シグナルがでるようにして3種類作製した。

Invader反応により解離された蛍光色素であるＦＡＭ（ 励起波長485nm, 発光波長535nm）と解離された蛍光色素であるＲＥＤ（励起波長 560nm, 発光波長 612nm）のそれぞれの蛍光シグナル強度をTECAN社Infinite F200で測光した。この蛍光シグナル強度の測定値を遺伝子の検出量とした。

本実施例２の測定結果を図２（ａ）に示す。また比較例２の測定結果を図２（ｂ）に示す。ここで、縦軸は、遺伝子の検出量を示す。また、横軸は、ベタインｄの濃度を示す。横軸の濃度の単位はｍｏｌ／ｌである。

本発明の核酸抽出方法によりベタインｄを添加して作製した核酸抽出溶液ｆを用いたそれぞれの濃度の実施例２と、核酸抽出溶液ｆにはベタインｄを添加せずに、ＰＣＲの反応液に実施例と同等量のベタインｄを添加した比較例２の結果から、それぞれのすべての場合において、遺伝子を検出することができた。

また、実施例２と比較例２とを比べると、すべての各々の対応するベタインｄの濃度において、実施例２で示した本発明の核酸抽出方法によって作製された核酸抽出溶液の遺伝子の検出量の値の方が大きく、遺伝子の検出の効率をより向上させることが示された。また、本反応のバックグラウンドを示すＲＥＤの蛍光シグナル強度の上昇がみられなかった。

前記のように、ＰＣＲにおいて、ベタインが核酸増幅反応の効率を向上させることがわかっている。従って、核酸抽出溶液にベタインが残存している場合、ベタイン添加の効果として、ＰＣＲの効率向上の効果と核酸抽出のプロセスの効率向上への効果との二つが想定される。

前記実施例における実施例２により、本発明の核酸抽出方法に基づいてベタインｄを添加した場合では、比較例２で行った方法であるベタインｄのＰＣＲの効率向上の効果に基づく結果よりも高い遺伝子検出効率をしめすことから、本発明による遺伝子検出方法は、遺伝子の検出効率を従来の方法よりも向上させ、これは、本発明による核酸抽出方法が核酸抽出溶液の核酸を抽出する効率を向上させる効果があるためであることが示された。

本発明の核酸抽出方法の一実施例を示すプロセスフロー１ 本発明の核酸抽出方法の一実施例を示すプロセスフロー２ 実施例1：それぞれの核酸抽出方法に基づく核酸抽出液の遺伝子検出量の比較 実施例２：（ａ）を核酸抽出液に添加した場合と（ｂ）Invader Plus反応に添加した場合、の効果の比較

符号の説明

１： 混合プロセス
２： ボルテックス攪拌プロセス
３： 混合攪拌溶液静置プロセス
４： 混合緩衝溶液混合プロセス
５： 遠心分離プロセス
ａ： 全血
ｂ： アルカリ性の水溶液
ｃ： 緩衝液
ｄ： ベタイン
ｅ： 沈殿物
ｆ： 核酸抽出溶液
ｇ： 混合溶液
ｈ： 混合攪拌溶液
ｉ： 混合攪拌溶液
ｊ： 混合緩衝溶液
ｋ： Universal Enzyme Mix & Buffer 、サードウエーブテクノロジース社型番97-019
ｌ： VKORC1オリゴミックス、サードウエーブテクノロジース社型番95-435及び 95-437
ｍ： CYP2C9*2*3 オリゴミックス、サードウエーブテクノロジース社型番95-436及び 95-434
Ａ：本発明の核酸抽出方法においてベタインを添加する段階の範囲
Ｂ：本発明の核酸抽出方法のプロセスフローの例

Claims (10)

1. 細胞から核酸を抽出するための核酸抽出方法において、少なくとも細胞とアルカリ性の水溶液を混合して混合溶液として、さらに該混合溶液に緩衝液を加えて成る混合緩衝溶液から核酸を抽出して核酸抽出溶液を得る核酸抽出方法において、少なくも該混合緩衝溶液、または該混合緩衝溶液となる前までのいずれかの段階で、ベタインを添加することを特徴とする核酸抽出方法。
2. 前記細胞が、血液に含まれることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
3. 前記核酸抽出溶液におけるベタインの濃度が０．１〜２．０ｍｏｌ／ｌであることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出方法。
4. 前記アルカリ性の水溶液のｐＨの値が１２以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
5. 前記緩衝液のｐＨの値の範囲が、５〜９であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
6. 前記核酸抽出溶液のｐＨの値の範囲が、５〜９であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
7. アルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことを特徴とする核酸抽出キット。
8. 請求項７に記載の核酸抽出キットを用いることを特徴とする請求項1〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出方法。
9. 請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸抽出方法または請求項８に記載の核酸抽出方法によって生成される核酸抽出溶液を用いることを特徴とする遺伝子検出方法。
10. アルカリ性の水溶液と緩衝液とベタインとを少なくとも含むことを特徴とする遺伝子検出キット。