JP4829509B2 - 遺伝子検査方法 - Google Patents
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Description
また、内部標準核核酸は、生体試料の標的核酸の特異的増幅との関係が既知であり、標的核酸の所定量(所定濃度、所定コピー数)に対応する内部標準核酸の量(濃度、コピー数)が既知である。また、好ましい内部標準核酸は、その増幅効率が標的核酸の増幅効率と略等しい核酸である。
また、生体試料から調製された核酸含有試料と、DNAポリメラーゼ等の酵素を含む酵素試薬、標的核酸を特異的に増幅させるためのプライマを含むプライマ試薬等とを混合して測定用試料を調製し、この測定用試料が核酸増幅反応に供せられる。このように生体試料に含まれる標的核酸の特異的増幅を測定し、第3測定結果を取得する。
ここで第1〜第3測定結果を取得する工程については、上述した第1遺伝子検査方法と同様であるので説明を省略する。
なお、上記第1遺伝子検査方法においても、第1及び第2測定結果から求められる補正値を用いて、第3測定結果または基準値を補正するようにしてもよい。
ヒトサイトケラチン19(以下、CK19とする)のmRNAと、RBCS−1AのmRNAとを鋳型として、阻害物質の存在下及び非存在下においてRT−LAMP法によりそれぞれcDNAを増幅させ、阻害物質がそれぞれの核酸増幅にどのように影響を与えるかを分析した。なお、CK19のmRNAが乳癌のリンパ節転移を判定するための標的核酸である。CK19のmRNAを鋳型にして増幅したcDNAの配列(配列番号1)およびRBCS−1AのmRNAを鋳型にして増幅したcDNAの配列(配列番号2)を示す。
以下の各成分を混合して13.97μlの反応液を調製した。
750mM トリス緩衝液(pH8.0) 1.00μl
10×Thermopol緩衝液
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl
100mM MgSO4 0.75μl
100mM ジチオスレイトール 1.25μl
2% Tergitol(シグマアルドリッチジャパン株式会社製) 2.50μl
H2O 3.97μl
以下の各成分を混合して3.04μlの酵素試薬を調製した。
10U/μl AMV逆転写酵素(プロメガ株式会社製) 0.14μl
8U/μl Bst DNAポリメラーゼ
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.27μl
RNase inhibitor(プロメガ株式会社製) 0.63μl
以下の各成分を混合して6.00μlのプライマー試薬1を調製した。
80pmol/μl forward inner primer 1.00μl
(配列番号3:ggagttctcaatggtggcaccaactactacacgaccatcca)
80pmol/μl reverse inner primer 1.00μl
(配列番号4:gtcctgcagatcgacaacgcctccgtctcaaacttggttcg)
5pmol/μl forward outer primer 1.00μl
(配列番号5:tggtaccagaagcagggg)
5pmol/μl reverse outer primer 1.00μl
(配列番号6:gttgatgtcggcctccacg)
60pmol/μl forward loop primer 1.00μl
(配列番号7:agaatcttgtcccgcagg)
60pmol/μl reverse loop primer 1.00μl
(配列番号8:cgtctggctgcagatga)
以下の各成分を混合して6.00μlのプライマー試薬2を調製した。
80pmol/μl forward inner primer 1.00μl
(配列番号9:accgaacaagggaagcttccactgagcacggtaactcaccc)
80pmol/μl reverse inner primer 1.00μl
(配列番号10:accgactccgctcaagtgttg-tcctaatgaaggcattgggg)
5pmol/μl forward outer primer 1.00μl
(配列番号11:tggagcacggatttgtgtac)
5pmol/μl reverse outer primer 1.00μl
(配列番号12:cactggacttggcgggtg)
60pmol/μl forward loop primer 1.00μl
(配列番号13:ccagtaccgtccatcatag)
60pmol/μl reverse loop primer 1.00μl
(配列番号14:gaagtggaagagtgcaagaa)
上記反応液、酵素試薬およびプライマー試薬1からなるRT−LAMP反応液Aを調製した。RT−LAMP反応液Aは、CK19のmRNAを鋳型として、RT−LAMP法によりcDNAを増幅させるための反応液である。
また、上記反応液、酵素試薬およびプライマー試薬2からなるRT−LAMP反応液Bを調製した。RT−LAMP反応液Bは、RBCS−1AのmRNAを鋳型として、RT−LAMP法によりcDNAを増幅させるための反応液である。
以下に示す成分を含む可溶化試薬を調製した。
200mM(pH3.0) Glycin−HCl緩衝液
20%(v/v)ジメチルスルホキシド
5%非イオン性界面活性剤Brij35(Sigma製)
0.05%消泡剤KS−538(信越化学工業製)
乳癌手術中に郭清した癌転移陰性ヒトリンパ節(検体X)に可溶化試薬100μlを添加し、金属ブレンダーによって12000rpmでホモジナイズしたものを30mlずつ分注し4つのモデルサンプルXを作成した。このモデルサンプルXには核酸増幅を阻害する物質が含まれているが、CK19mRNAはほとんど発現していない。
可溶化試薬2μlに1×106(copy/reaction)のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液を実験例1で調製したRT−LAMP反応液A23μlに添加して測定用試料aを調製した。
(測定用試料bの調製)
可溶化試薬2μlに1×104(copy/reaction)のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液をRT−LAMP反応液A23μlに添加して測定用試料bを調製した。
(測定用試料cの調製)
可溶化試薬2μlに1×106(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液をRT−LAMP反応液B23μlに添加して測定用試料cを調製した。
(測定用試料dの調製)
可溶化試薬2μlに1×104(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液をRT−LAMP反応液B23μlに添加して測定用試料dを調製した。
(測定用試料eの調製)
モデルサンプルXに1×106(copy/reaction)のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液2μlをRT−LAMP反応液A23μlに添加して測定用試料eを調製した。
(測定用試料fの調製)
モデルサンプルXに1×104(copy/reaction)のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液2μlをRT−LAMP反応液A23μlに添加して測定用試料fを調製した。
(測定用試料gの調製)
モデルサンプルXに1×106(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液2μlをRT−LAMP反応液B23μlに添加して測定用試料gを調製した。
(測定用試料hの調製)
モデルサンプルXに1×104(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液2μlをRT−LAMP反応液B23μlに添加して測定用試料hを調製した。
テラメックス社製LA−200を用い、核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。
RT−LAMP法により各測定用試料に含まれるmRNAに対応するcDNAが増幅して濁度が0.1に達するまで時間(検出時間)を測定した。測定結果を図1に示す。
◇(内部標準純系)は、測定用試料cおよびdの測定結果(阻害物質の非存在下でRBCS−1Aの核酸増幅の測定結果)を示す。
■(CK19可溶化液サンプル)は、測定用試料eおよびfの測定結果(阻害物質の存在下でCK19の核酸増幅の測定結果)を示す。
□(内部標準可溶化液サンプル)は、測定用試料gおよびhの測定結果(阻害物質の存在下でRBCS−1Aの核酸増幅の測定結果)を示す。
図1において、◆と■とを比較すると、CK19の核酸増幅において、阻害物質の存在による検出時間の遅れを求めることができる。
また、◇と□とを比較すると、RBCS−1Aの核酸増幅において、阻害物質の存在による検出時間の遅れを求めることができる。
図1より、CK19の核酸増幅における検出時間の遅れと、RBCS−1Aの核酸増幅における検出時間の遅れは略同じであり、CK19とRBCS−1Aの阻害物質による核酸増幅阻害の影響が同程度である。
(核酸含有試料A〜Dの調製)
乳癌手術によって摘出された癌転移陽性ヒトリンパ節Aに可溶化試薬4mlを添加し、金属ブレンダーによって12000rpmでホモジナイズして核酸含有試料Aを調製した。同様にして、乳癌手術によって摘出された癌転移陽性ヒトリンパ節B〜Dについて核酸含有試料B〜Dを調製した。
核酸含有試料Aに1×106(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを内部標準核酸として添加し、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌して得られた溶液2μlを、RT−LAMP反応液A(CK19測定用RT−LAMP反応液)23μlに添加して測定試料a1を調製した。
核酸含有試料Aに代えて、核酸含有試料B〜Dを用いること以外は測定試料a1の調製と同様にして測定用試料b1〜d1を調製した。
(測定用試料a2〜d2の調製)
RT−LAMP反応液Aに代えてRT−LAMP反応液B(RBCS−1A測定用RT−LAMP反応液)を用いること以外は測定用試料a1〜d1同様にして、測定用試料a2〜d2を調製した。
(測定用試料a3〜d3(10倍希釈)の調製)
核酸含有試料Aを可溶化試薬で10倍希釈し、1×106(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを添加し、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌して得られた溶液2μlを、RT−LAMP反応液A23μlに添加して測定試料a3を調製した。
核酸含有試料Aに代えて、核酸含有試料B〜Dを用いること以外は測定試料a2の調製と同様にして測定用試料b3〜d3を調製した。
(測定用試料a4〜d4(10倍希釈)の調製)
RT−LAMP反応液Aに代えてRT−LAMP反応液Bを用いること以外は測定用試料a1〜d1同様にして、測定用試料a4〜d4を調製した。
(測定用試料g2(10倍希釈)の調製)
可溶化試薬で10倍希釈したモデルサンプルXを用いること以外は実験例1の測定試料gの調製と同様にして測定用試料g2を調製した。各測定用試料の概略組成を表2に示す。
一方、検体Cの内部標準核酸の変動値(検出時間差)は0.3分、検体Dの内部標準核酸の変動値(検出時間差)は0.2分であり、何れも閾値である0.6分未満であった。図2に示されるように、検体C(図中■)およびD(図中◆)のターゲット遺伝子(CK19mRNA)の検出時間は、10倍希釈したサンプルの方が希釈した分だけ検出時間が遅くなる。
(測定用試料3A〜5A、3B〜5Bの調製)
上記モデルサンプルXに1.5×108(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNA(CK19のmRNA2.5×105(copy/reaction)相当)とCK19のmRNA2.5×105(copy/reaction)を添加し、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌した。得られた溶液2μlを上記RT−LAMP反応液A23μlに添加して測定用試料3Aを調製した。
また、RT−LAMP反応液AをRT−LAMP反応液Bに変更する以外は測定用試料3Aと同様にして測定用試料3Bを調製した。
CK19のmRNAの添加量を2.5×106(copy/reaction)に変更する以外は測定用試料3Aと同様にして測定用試料4Aを調製した。
また、RT−LAMP反応液AをRT−LAMP反応液Bに変更する以外は測定用試料4Aと同様にして測定用試料4Bを調製した。
CK19のmRNAの添加量を2.5×104(copy/reaction)に変更する以外は測定用試料3Aと同様にして測定用試料5Aを調製した。
また、RT−LAMP反応液AをRT−LAMP反応液Bに変更する以外は測定用試料5Aと同様にして測定用試料5Bを調製した。
各測定用試料の概略組成を表4に示す。
(基準測定用試料の調製)
可溶化試薬2μlに2.5×105(copy/reaction)のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液を実験例1で調製したRT−LAMP反応液A23μlに添加して基準用測定用試料1を調製した。なお、2.5×105(copy/reaction)というCK19のmRNAの発現量は、リンパ節への癌転移が強陽性(++)であるか、弱陽性(+)であるかを判定する基準値である。
可溶化試薬2μlに2.5×104のCK19のmRNAを添加した溶液を調製した。この溶液をRT−LAMP反応液A23μlに添加して基準用測定用試料2を調製した。なお、2.5×104(copy/reaction)というCK19のmRNAの発現量は、リンパ節への癌転移が弱陽性(+)であるか、陰性(−)であるかを判定する基準値である。
また、可溶化試薬2μlに1.5×108(copy/reaction)の内部標準核酸(RBCS-1AのmRNA)を添加した溶液を調製した。この溶液をRT−LAMP反応液B23μlに添加して測定用試料IC(内部標準コントロール)を調製した。なお、上記実験例3で説明したように、1.5×108(copy/reaction)という内部標準核酸の発現量は、2.5×105(copy/reaction)のCK19のmRNAの発現量に相当するものであり、リンパ節への癌転移が弱陽性(+)であるか、陰性(−)であるかを判定する基準値となる。
(核酸含有試料E〜Gの調製)
乳癌手術によって摘出された癌転移陽性ヒトリンパ節Eに可溶化試薬4mLを添加し、金属ブレンダーによって12000rpmでホモジナイズして核酸含有試料Eを調製した。同様にして、乳癌手術中に郭清した癌転移陽性ヒトリンパ節FおよびGについて核酸含有試料FおよびGを調製した。
核酸含有試料Eに1.5×108(copy/reaction)のRBCS−1AのmRNAを内部標準核酸として添加し、ボルテックスミキサーで30秒間撹拌して得られた溶液2μlを、RT−LAMP反応液A(CK19測定用RT−LAMP反応液)23μlに添加して測定試料E1を調製した。
核酸含有試料Eに代えて、核酸含有試料FおよびGを用いること以外は測定用試料E1の調製と同様にして測定用試料F1およびG1を調製した。
(測定用試料E2〜G2の調製)
RT−LAMP反応液Aに代えてRT−LAMP反応液B(RBCS−1A測定用RT−LAMP反応液)を用いること以外は測定用試料E1〜G1同様にして、測定用試料E2〜G2を調製した。
各測定用試料の概略組成を表6に示す。
アプライドバイオシステム社製 TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents及びアプライドバイオシステム社製 リアルタイム定量PCR装置(ABI PRISMR 7700)を用いてRT-PCRを実施した。TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagentsは、2×Master Mixと40×RNase inhibitor Mixより構成されるRT-PCR用の試薬キットである。また、ABI PRISMR 7700は、予め設定した温度および時間で核酸増幅反応を行い、核酸の増幅に対応して増大する蛍光強度を検出することにより、増幅した核酸を定量することができる。
次に、Master Mix、RNase inhibitor Mix及び3種類のプライマーを含む反応液を調製した。CK19用の反応液1は、1×Master Mix、1×RNase inhibitor Mix、300nM forward primer(配列番号15:cagatcgaag gcctgaagga)、300nM reverse primer(配列番号16:cttggcccct cagcgtact)、200nM Taq Man Probe(配列番号17:gcctacctga agaagaacca tgaggaggaa)を含有していた。また、RBCS−1A用の反応液2は、1×Master Mix、1×RNase inhibitor Mix、300nM forward primer(配列番号18:cgcaaggctaacaacgacatt)、300nM reverse primer(配列番号19:ggccacacctgcatgca)、200nM Taq Man Probe(配列番号20:ttccatcacaagcaacggcgga)を含有していた。
次に、上記反応液1と核酸増幅反応用試料1(または核酸増幅反応用試料2)とを混合し、リアルタイム定量PCR装置(ABI PRISMR 7700)を用いてRT -PCRを実施した。また、上記反応液2と核酸増幅反応用試料3(または核酸増幅反応用試料4)とを混合し、リアルタイム定量PCR装置(ABI PRISMR 7700)を用いてRT-PCRを実施した。RT-PCR反応は、48℃で30分間逆転写反応を行い、95℃で10分間保持した後に、95℃で15秒間及び60℃で1分間の操作を40サイクル行った。結果を図6に示す。
Claims (13)
- 生体試料としてヒトから採取された組織中に存在する標的核酸を特異的に増幅して測定する遺伝子検査方法であって、
前記生体試料中には存在しない核酸であり、既知量の内部標準核酸を、前記生体試料の非存在下で特異的に増幅し、その増幅に基づいて内部標準核酸量に関する第1測定結果を取得する工程と、
前記生体試料中の核酸を抽出精製することなく調製された核酸含有試料に前記第1測定結果取得工程と同量の前記内部標準核酸を加えて、前記内部標準核酸を前記生体試料の存在下で特異的に増幅し、その増幅に基づいて内部標準核酸量に関する第2測定結果を取得する工程と、
前記生体試料中の核酸を抽出精製することなく調製された核酸含有試料中に存在する前記標的核酸を特異的に増幅し、その増幅に基づいて前記標的核酸量に関する第3測定結果を取得する工程と、
前記標的核酸量に関する第3測定結果と所定の基準値を比較し、前記標的核酸量に関する第3測定結果が、前記基準値より多いか否かを判定した判定結果を求める工程と、
内部標準核酸量に関する第1測定結果および内部標準核酸量に関する第2測定結果の差異に基づいて、生体試料成分中の阻害物質の前記判定結果に対する影響を判定する工程と、を備えたことを特徴とする遺伝子検査方法。 - 第1測定結果と第2測定結果との差を、閾値と比較し、差が閾値より大きいとき、阻害物質の影響が大きいと判定する請求項1記載の遺伝子検査方法。
- 阻害物質の影響が大きいと判定されたとき、前記判定結果の信頼性について警告する請求項2記載の遺伝子検査方法。
- 阻害物質の影響が大きいと判定されたとき、前記第3測定結果取得工程における標的核酸の増幅を、所定の希釈倍率で希釈した条件下で再度測定する請求項2記載の遺伝子検査方法。
- 阻害物質の影響が大きいと判定されたとき、前記第1測定結果と第2測定結果との差に基づいて、前記第3測定結果または基準値を補正する請求項2記載の遺伝子検査方法。
- 前記判定結果が、陽性か否か、または正常か異常かを判定した判定結果を含む請求項1記載の遺伝子検査方法。
- 前記判定結果が、前記第3測定結果と、第1の基準値および第2の基準値を比較し、前記標的核酸量に関する第3測定結果が、前記第1基準値および第2基準値より多いか否かを判定した判定結果を含む請求項1〜5の何れか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記判定結果が、陽性、弱陽性および陰性の何れであるかを判定した判定結果を含む請求項7記載の遺伝子検査方法。
- 前記第1〜第3測定結果取得工程が、所定の希釈倍率で希釈された条件下で行われる請求項1〜8の何れか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 生体試料としてヒトから採取された組織中に存在する標的核酸を特異的に増幅して測定する遺伝子検査方法であって、
前記生体試料中には存在しない核酸であり、既知量の内部標準核酸を、前記生体試料の非存在下で特異的に増幅し、その増幅に基づいて内部標準核酸量に関する第1測定結果を取得する工程と、
前記生体試料中の核酸を抽出精製することなく調製された核酸含有試料に前記第1測定結果取得工程と同量の前記内部標準核酸を加えて、前記内部標準核酸を前記生体試料の存在下で特異的に増幅し、その増幅に基づいて内部標準核酸量に関する第2測定結果を取得する工程と、
前記生体試料中の核酸を抽出精製することなく調製された核酸含有試料中に存在する前記標的核酸を特異的に増幅し、その増幅に基づいて前記標的核酸量に関する第3測定結果を取得する工程と、
内部標準核酸量に関する第1測定結果および内部標準核酸量に関する第2測定結果の差異に基づいて、前記第3測定結果および所定の基準値の何れか一方を補正する工程と、
前記第3測定結果および前記基準値のうちの補正された一方と、補正されていない他方とを比較し、前記標的核酸量に関する第3測定結果が、前記基準値より多いか否かを判定した判定結果を求める工程と、を備えたことを特徴とする遺伝子検査方法。 - 前記第1測定結果が、内部標準核酸の増幅を測定した第1測定値が所定値になった時間を内部標準核酸量に関する測定結果として含み、前記第2測定結果が、内部標準核酸の増幅を測定した第2測定値が所定値になった時間を内部標準核酸量に関する測定結果として含み、前記第3測定結果が、標的核酸の増幅を測定した第3測定値が所定値になった時間を標的核酸量に関する測定結果として含む請求項1〜10の何れか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記内部標準核酸が前記標的核酸と阻害物質により略同等の増幅阻害を受ける核酸である請求項1〜11の何れか1項に記載の遺伝子検査方法。
- 前記内部標準核酸がリブロース2リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン1A遺伝子及び/又は前記遺伝子のmRNAである請求項1〜12の何れか1項に記載の遺伝子検査方法。
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