CN116640850A - 一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，提供了一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒，包括针对CALR基因1型突变、CALR基因2型突变基因位点的特异性引物及探针，引物组合包括CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合，引物探针针对两种突变的基因型进行设计，检测突变型的引物不会扩增野生型样本，特异性高；试剂盒不仅能够准确检测高丰度(1％‑100％)的突变，满足初诊患者CALR基因突变筛查的需求，也能够准确检测低丰度突变，检测灵敏度能够达到0.01％‑0.1％，满足患者治疗后MRD监测的需求；检测对象的范围宽泛。

Description

一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及了一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒。
背景技术
骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一组能够进展为急性白血病的慢性髓系肿瘤。研究发现PV、ET和PMF与各种基因突变相关，包括JAK2、MPL、TET2、ASXL1、IDH1、IDH2、CBL、IKZF1、LNK、EZH2、DNMT3A和CALR。2013年，Klampfl等人首次在没有JAK2、MPL突变的MPN患者中发现钙网蛋白(CALR)基因的体细胞突变。研究表明CALR基因突变发生于25％以上的ET患者和36％的PMF患者中，PV患者中CALR基因突变较罕见。到目前为止发现的所有突变都发生在外显子9中，除了少数罕见点突变外，几乎所有这些突变都是插入缺失。Klampfl等人将那些具有52bp缺失(p.L367fs*46)的突变定义为1型突变，将具有5bp TTGTC插入(p.K385fs*47)的突变定义为2型突变，而这两种类型的突变占所有CALR突变患者的85％以上。
CALR基因突变检测的常用技术是一代(Sanger)测序、聚合酶链反应(PCR)和片段分析。与其他基因中常见的点突变不同的是，CALR基因的突变主要是插入和缺失，这是常规一代测序难以检测到的。目前有四种方法用于CALR基因突变定量：Sanger测序联合毛细管电泳、高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting,HRM)分析、实时定量PCR和下一代测序(NGS)。Sanger测序联合毛细管电泳在灵敏度和特异性方面保持了较好的平衡，但检测成本较高操作也较复杂；HRM分析基于野生型和突变体的不同熔解曲线，是一种快速且灵敏度的基因分型方法，HRM可以对大多数类型1和类型2进行分类，但由于其他突变的熔解特性相似，偶尔会出现错误分类或不确定的情形；实时定量PCR能够检测到突变丰度1％的1型和2型突变，特别适用于确认这两种最常见的突变；CALR突变同样可以通过NGS来检测，优点是它可以检测所有类型的突变并进行定量，但缺点是检测成本较高，检测流程复杂。
MPN的主要治疗目标是避免血栓形成和出血、治疗MPN相关症状、提高生活质量以及将恶性转化和/或ET/PV后骨髓纤维化的风险降至最低。MPN患者常见的JAK2、MPL、CALR等驱动突变可以作为患者微小残留病(MRD)的标志物，能够预测治疗疗效和提示疾病的复发；已经有临床研究证明了CALR基因作为MRD监测指标的临床有效性，治疗方案包括干扰素α、JAK1/2抑制剂和自体干细胞移植(ASCT)。目前常见的CALR基因突变qPCR检测方法灵敏度有限，多为1％左右，无法达到MRD检测的要求(灵敏度<0.1％)，目前已公开的相关专利(例如公开号CN112359112A、CN107164473B、CN107164474B等)检测灵敏度均在1-3％左右，文献研究中(例如PMID:30080988、35548965等)灵敏度也在1％左右。因此开发更高灵敏度的CALR基因1型和2型突变检测方法具有很高的临床应用价值
发明内容
针对现有技术中CALR基因1型和2型突变检测方法的不足和实际需求，本发明提供了一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法及试剂盒，克服了现有技术中CALR基因1型和2型突变检测方法不能达到MRD检测要求的问题。
本发明第一方面提供了一种检测CALR基因1型及2型突变的引物组合，包括针对CALR基因1型突变、CALR基因2型突变的特异性引物及对应检测探针，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
CALR基因1型突变型正向引物：5’-AACAGGACGAGGAGCAGAGAA-3’；
CALR基因1型野生型正向引物：5’-CAGGACGAGGAGCAGAGACT-3’；
CALR基因1型反向引物：5’-GTCCAGCCCTGGAGGCAG-3’；
CALR基因1型探针：
5’FAM-GAGGATGAGGAGGATGAGGAGGACA-TAMRA3’；
CALR基因2型正向引物：5’-CAAATGAAGGACAAACAGGACG-3’；
CALR基因2型突变型反向引物：5’-TCCTCATCATCCTCCGACAA-3’；
CALR基因2型野生型反向引物：5’-GTCCTCATCATCCTCCTT-3’；
CALR基因2型探针：5’FAM-CTGCCTCCTCCTCCTCTTTGCG-TAMRA3’。
进一步，所述引物组合包括CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合；
所述CALR基因1型突变型引物组合包括CALR基因1型突变型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
所述CALR基因1型野生型引物组合包括CALR基因1型野生型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
所述CALR基因2型突变型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型突变型反向引物和CALR基因2型探针；
所述CALR基因2型野生型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型野生型反向引物和CALR基因2型探针。
第二方面提供了一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1.抽提待测样本的基因组DNA；
S2.制备qPCR反应体系；
S3.进行qPCR扩增；
S4.计算突变丰度。
进一步，所述qPCR反应体系包括CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系。
进一步，所述CALR基因1型突变型检测体系包括CALR基因1型突变型引物组合；所述CALR基因1型野生型检测体系包括CALR基因1型野生型引物组合；所述CALR基因2型突变型检测体系包括CALR基因2型突变型引物组合；所述CALR基因2型野生型检测体系包括CALR基因2型野生型引物组合。
进一步，所述qPCR扩增反应条件为：95℃30s；95℃10s，60℃30s，45个循环；4℃保存。
进一步，所述CALR基因1型及2型突变的阳性判断标准为当ct值＜42时为阳性，所述检测方法的质控标准为CALR基因1型野生型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的ct值＜30时为合格。
进一步，所述待测样本为包含待检测对象基因组DNA的样本。
第三方面提供了一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测试剂盒，包括用于提取待测样本的基因组DNA的试剂和qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的qPCR反应液；
所述qPCR反应液包括权利要求2所述的CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合；
所述qPCR反应液还包括其他用于qPCR的扩增试剂；
所述qPCR反应液中的特异性引物的工作浓度为0.5μM，探针的工作浓度为0.2μM。
进一步，所述试剂盒还包括阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、空白对照品。
本发明的优点在于：
1)通过检测CALR基因1型和2型突变，再配合标准曲线能够准确定量突变基因型拷贝数和野生基因型拷贝数，进而能够计算变异等位基因频率(Variant Allele Frequency,VAF)；
2)引物探针针对两种突变的基因型进行设计，检测突变型的引物不会扩增野生型样本，因此野生型样本背景干净，无底峰干扰；
3)该检测试剂盒不仅能够准确检测高丰度(1％-100％)的突变，满足初诊患者CALR基因突变筛查的需求，也能够准确检测低丰度突变，检测灵敏度能够达到0.01％-0.1％，满足患者治疗后MRD监测的需求；
4)检测对象的范围宽泛，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可，可以是骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种。
附图说明
图1本发明的实施例3和实施例4中的CALR基因1型突变样本的qPCR扩增曲线图；
图2本发明的实施例3和实施例4中的CALR基因2型突变样本的qPCR扩增曲线图。
具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1：检测CALR基因1型及2型突变的引物组合
针对CALR基因1型及2型突变基因位点设计特异性引物及探针，特异性引物及探针的核苷酸序列如表1所示：
表1引物和探针的核苷酸序列
引物组合包括CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合；
CALR基因1型突变型引物组合包括CALR基因1型突变型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
CALR基因1型野生型引物组合包括CALR基因1型野生型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
CALR基因2型突变型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型突变型反向引物和CALR基因2型探针；
CALR基因2型野生型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型野生型反向引物和CALR基因2型探针。
实施例2：CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测试剂盒
1、提取待测样本的基因组DNA的试剂，从检测对象中抽提出基因组DNA所需试剂，满足qPCR对基因组DNA质量的要求，具体的为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂，待测样本可以是骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种。
2、qPCR反应液，qPCR反应液分别为CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的qPCR反应液，具体的qPCR反应液包括实施例1所述的CALR基因1型突变引物组合、CALR基因1型野生引物组合、CALR基因2型突变引物组合和CALR基因2型野生引物组合，还包括用于qPCR的扩增试剂，具体的为Taq Pro HS Universal U+Probe Master Mix(厂家：诺唯赞，货号QN114-01)，qPCR反应液中的特异性引物的工作浓度为0.5μM，探针的工作浓度为0.2μM。
3、对照品，包括阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、空白对照；
阳性对照品，经其他已验证方法确认的具有CALR基因1型或2型突变的样本，VAF在20％以上；
弱阳性对照品，经其他已验证方法确认的具有CALR基因1型或2型突变的样本，VAF在1％～10％范围内；
阴性对照品，经其他已验证方法确认的CALR基因1型或2型突变为阴性的样本；
空白对照，可以使用超纯水作为空白对照。
其他已验证方法具体指Sanger测序联合毛细管电泳、高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting,HRM)分析、实时定量PCR或下一代测序(NGS)。
实施例3CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法
利用实施例2的试剂盒对CALR基因1型及2型突变进行高灵敏qPCR检测。
1、待测样本
选取2个样本，样本来自见康华美医学诊断中心，经NGS测序已知具有1型突变丰度为50.4％的CALR基因1型突变核酸样本A和经NGS测序已知2型突变丰度为40.1％的CALR基因2型突变核酸样本B，每个样本设3个重复。
2、取待测样本抽提的DNA，作为qPCR模板；
本实施例的DNA抽提选用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行提取(货号：DP304)，具体方法参见使用说明书。
3、配置制备qPCR反应体系，qPCR反应体系包括CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系，具体如表2所示，
表2qPCR反应体系
4、将qPCR反应体系置于ABI 7500荧光定量PCR仪中进行扩增检测，同时设置一组标准曲线用于拷贝数的定量，标准曲线使用已知拷贝数的内参基因(ABL)标准品，标准曲线的浓度应包含从20拷贝到2*106拷贝这样的一系列的浓度，在扩增的延伸阶段收集FAM荧光。扩增反应条件如表3所示，扩增反应完成后4℃保存。
表3qPCR扩增反应条件
CALR基因1型及2型突变的突变阳性判断标准为当ct值＜42时为阳性，检测方法的质控标准为CALR基因1型野生型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的ct值＜30时为合格。
5、计算突变丰度
在扩增结束后根据标准曲线计算出CALR基因1型突变的拷贝数及对应的野生型基因拷贝数，再用CALR基因1型突变的拷贝数除以CALR基因1型突变的拷贝数和野生型基因拷贝数之和，从而计算出CALR基因1型突变的突变丰度；同理计算出CALR基因2型突变的突变丰度。
本实施例中的突变核酸样本A和突变核酸样本B的检测结果如表4所示，扩增曲线如图1和图2所示，检测突变型的引物不会扩增野生型样本，因此野生型样本背景干净，无底峰干扰。
表4突变核酸样本A和突变核酸样本B的检测结果
实施例4检测灵敏度
选用实施例3中的待测样本，根据核酸浓度和突变丰度将突变核酸样本A和突变核酸样本B与已知CALR基因野生型的核酸样本稀释得到突变丰度分别为1％、0.1％、0.01％的样本，稀释后的样本再次使用Qubit 3.0进行浓度测定，根据测定的浓度补水将所有样本稀释到10ng/μl，检测时每例样本取3μl进行检测，使用CALR基因野生型样本作为阴性样本，每个样本设3个重复，具体检测结果如表5所示，扩增曲线如图1和图2所示，在30ng核酸投入量时，能够检测到突变丰度低至0.01％的CALR基因1型突变和突变丰度低至0.1％的CALR基因2型突变，检测灵敏度高，能够满足MRD检测要求。
表5灵敏度检测结果
实施例5检测特异性
选取来自见康华美医学诊断中心的20例已知CALR基因野生型的核酸样本，使用实施例3的方法对20例样本的CALR基因1型和CALR基因2型突变进行检测，检测结果如表6所示，所有样本均未检出突变型拷贝，特异性能够达到100％。
表6特异性检测结果
实施例6检测准确性
选取见康华美医学诊断中心使用NGS方法检测到的CALR基因1型和CALR基因2型突变高丰度和低丰度各9例样本，使用实施例3的方法对样本进行检测定量，检测结果如表7所示，所有样本均能够准确检出，检测准确性达到100％。
表7准确性检测结果
本发明的检测方法及试剂盒对CALR基因1型和CALR基因2型突变的检测灵敏度能够达到0.01％和0.1％，且不会检出假阳性，与NGS检测结果相比准确性也能够达到100％。

Claims (10)

1.一种检测CALR基因1型及2型突变的引物组合，其特征在于，包括针对CALR基因1型突变、CALR基因2型突变的特异性引物及探针，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
CALR基因1型突变型正向引物：5’-AACAGGACGAGGAGCAGAGAA-3’；
CALR基因1型野生型正向引物：5’-CAGGACGAGGAGCAGAGACT-3’；
CALR基因1型反向引物：5’-GTCCAGCCCTGGAGGCAG-3’；
CALR基因1型探针：
5’FAM-GAGGATGAGGAGGATGAGGAGGACA-TAMRA3’；
CALR基因2型正向引物：5’-CAAATGAAGGACAAACAGGACG-3’；
CALR基因2型突变型反向引物：5’-TCCTCATCATCCTCCGACAA-3’；
CALR基因2型野生型反向引物：5’-GTCCTCATCATCCTCCTT-3’；
CALR基因2型探针：5’FAM-CTGCCTCCTCCTCCTCTTTGCG-TAMRA3’。
2.根据权利要求1所述的一种检测CALR基因1型及2型突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合；
所述CALR基因1型突变型引物组合包括CALR基因1型突变型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
所述CALR基因1型野生型引物组合包括CALR基因1型野生型正向引物、CALR基因1型反向引物和CALR基因1型探针；
所述CALR基因2型突变型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型突变型反向引物和CALR基因2型探针；
所述CALR基因2型野生型引物组合包括CALR基因2型正向引物、CALR基因2型野生型反向引物和CALR基因2型探针。
3.一种包括权利要求1-2任一项所述的一种检测CALR基因1型及2型突变的引物组合的CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1.抽提待测样本的基因组DNA；
S2.制备qPCR反应体系；
S3.进行qPCR扩增；
S4.计算突变丰度。
4.根据权利要求3所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述qPCR反应体系包括CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系。
5.根据权利要求4所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述CALR基因1型突变型检测体系包括CALR基因1型突变型引物组合；所述CALR基因1型野生型检测体系包括CALR基因1型野生型引物组合；所述CALR基因2型突变型检测体系包括CALR基因2型突变型引物组合；所述CALR基因2型野生型检测体系包括CALR基因2型野生型引物组合。
6.根据权利要求5所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述qPCR扩增反应条件为：95℃30s；95℃10s，60℃30s，45个循环；4℃保存。
7.根据权利要求6所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述CALR基因1型及2型突变的阳性判断标准为当ct值＜42时为阳性，所述检测方法的质控标准为CALR基因1型野生型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的ct值＜30时为合格。
8.根据权利要求7所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法，其特征在于，所述待测样本为包含待检测对象基因组DNA的样本。
9.一种适用于权利要求8所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测方法的试剂盒，其特征在于，包括用于提取待测样本的基因组DNA的试剂和qPCR反应液，所述qPCR反应液分别为CALR基因1型突变型检测体系、CALR基因1型野生型检测体系、CALR基因2型突变型检测体系和CALR基因2型野生型检测体系的qPCR反应液；
所述qPCR反应液包括权利要求2所述的CALR基因1型突变型引物组合、CALR基因1型野生型引物组合、CALR基因2型突变型引物组合和CALR基因2型野生型引物组合；
所述qPCR反应液还包括其他用于qPCR的扩增试剂；
所述qPCR反应液中的特异性引物的工作浓度为0.5μM，探针的工作浓度为0.2μM。
10.根据权利要求9所述的一种CALR基因1型及2型突变高灵敏qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、空白对照品。
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