JP2002345463A - 核酸吸着バッファ及び核酸精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 有害なカオトロピック塩を含有しない核
酸吸着バッファ及びそれを用いた核酸精製方法を提供す
ることにある。 【解決手段】 上記課題は、主成分として塩化物及び／
又は臭化物含有し、カオトロピック塩を含有しない核酸
吸着バッファ及びそれを用いた核酸精製方法によって達
成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学の分野
に関する。特に、本発明は水溶液中に存在する核酸のガ
ラス等の固相への吸着を促進する核酸吸着バッファ及び
それを用いた核酸精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸は、様々な分野で、種々の形態で使
用されている。例えば、組換え核酸技術の領域において
は、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核
酸の形状で用いることを要求する。

【０００３】診断分野においても、核酸は種々の方法で
用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原
体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に
核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食
品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は
遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現にお
よぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定
および単離において日常的に用いられている。

【０００４】多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手
できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要す
る。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損
失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカル
チャーから得られた試料の核酸の精製においては、コン
タミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険
性も加わる。

【０００５】従来一般的に行われている精製方法では全
血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液等を検体
として使用し、核酸を抽出するための溶液でこれらの検
体を処理して核酸を処理液中に抽出する。次いで、この
核酸を含む処理液をシリカゲル、ガラス、アルミナ、ゼ
オライト、二酸化チタン等に吸着させ、これを遠心分離
処理して、あるいはクロマト法による分離等の処理をし
て精製する。そして、通常こうして得た核酸をＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅した後、上述した種々
の目的に使用している。

【０００６】従来、シリカゲルやガラス等への核酸の吸
着を促進させる溶液（以下、「核酸吸着バッファ」と記
す。）としては、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニ
ジン、イソチオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウ
ム、沃化ナトリウム等のカオトロピック塩を含有するこ
とが必須とされている（特開平１０−７２４８５、特表
平２０００−５０５２９５等）。しかし、カオトロピッ
ク塩は腐食性でかつ有毒であるといわれており（例え
ば、特公平７−５１０６５）、これらの使用は好ましい
ものではない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、有害
なカオトロピック塩を含有しない核酸吸着バッファ及び
それを用いた核酸精製方法を提供することにある。

【０００８】本発明の課題は、主成分として塩化物及び
／又は臭化物を含有し、かつカオトロピック塩を含有し
ない核酸吸着バッファ及びそれを用いた核酸精製方法に
より達成された。

【０００９】

【発明の実施の形態】検体としては上述した体液等を使
用することができるが、ヒト全血を使用した場合を例に
とり、一般的な核酸の精製工程を説明する。先ず、真空
採血管を用いて全血を採取する。これに所要の液を添加
して赤血球、白血球、核膜等を溶解して核酸を抽出す
る。抽出された核酸を含む液に本発明になる核酸吸着バ
ッファを添加して、核酸の吸着及び脱着が可能な固相
（以下、「固相」と記す）に接触させ、核酸を固相に吸
着させる。この際、核酸のみではなく一部不純物も固相
に吸着する。この核酸等が吸着した固相を、吸着した核
酸はそのままに保ち、同時に吸着した不純物を脱着させ
る機能を有する液(以下、「洗浄バッファ」と記す。)で
洗浄し、残留液と不純物を除去する。最後に、吸着して
いる核酸を脱着させる機能を有する液(以下、「回収
液」と記す。)を固相に接触させて回収液中に核酸を脱
着させ、その液を回収する。

【００１０】本発明になる核酸吸着バッファは、主成分
として塩化物及び／又は臭化物を含有し、かつ有害なカ
オトロピック化合物を含有しないことを特徴とする。従
って、例えばカオトロピック塩である塩化グアニジンは
本発明になる核酸吸着バッファには含まれていない。塩
化物及び／又は臭化物の濃度範囲は約０．５Ｍ〜約４
Ｍ、好ましくは約１．５Ｍ〜約２．５Ｍである。

【００１１】本発明になる核酸吸着バッファは、主成分
に加えて緩衝剤及び必要に応じて界面活性剤を含有す
る。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ等が、界面活
性剤としてはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等が使用できる。
緩衝剤及び界面活性剤の濃度は、それぞれ１０〜１００
ｍＭ、０．１〜１０％が好ましい。

【００１２】本発明になる核酸吸着バッファは、更にア
ルコール類を含有してもよい。アルコール類としては、
エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピル
アルコール等が好ましく、特にエチルアルコールが好ま
しい。アルコール類の濃度は約１０〜９０％、好ましく
は約２０〜９０％である。

【００１３】次に、上記核酸吸着バッファを使用した核
酸の精製方法について説明する。先ずこの核酸吸着バッ
ファと核酸を含有する試料液を固相に接触させる。固相
としてはシリカゲル、ガラス、アルミナ、ゼオライト、
二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、金属酸化物及び／
又は混合金属酸化物等からなる多孔性又は非多孔性の無
機材料が挙げられる。これらの中ではガラス、特にガラ
ス繊維濾紙が好ましい。ガラス繊維濾紙としては、ワッ
トマン社製のＧＦ／Ａ、ＧＦ／Ｂ、ＧＦ／Ｃ、ＧＦ／Ｄ
あるいはアドバンテック社の製品等が使用できる。この
際、これらのガラス繊維濾紙の密度、保留粒子径、ガラ
ス繊維の太さ等には無関係に使用可能である。

【００１４】ガラス繊維濾紙は、そのままの形態で使用
することもできるが、操作性の観点からは一定の容器中
に収容した核酸精製ユニットとすることが好ましい。こ
の容器は、通常、ガラス繊維濾紙を収容する本体と、蓋
体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個
の開口が設けられている。一方は上述した試料液や後述
する洗浄バッファ等の入口及び出口として使用され、他
方は容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生
装置に接続される。本容器を使用することにより、圧力
差のみを利用して液の吸入と排出を行い、ガラス繊維濾
紙に核酸を吸着させ、かつ後述するように核酸の精製及
び回収が可能となる。

【００１５】本体の形状に特に限定はないが、製造が容
易で、試料溶液等がガラス繊維濾紙の全面に拡散し易く
するには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四
角形にすることも、ガラス繊維濾紙の裁断屑を発生させ
ないために好ましい。

【００１６】上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内
部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されて
いる必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法
は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込
み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による溶着等が挙
げられる。

【００１７】容器の内容積は処理すべき試料溶液の量の
みによって決められるが、通常、収容するガラス繊維濾
紙の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍで直径が約２ｍ
ｍ〜２０ｍｍのガラス繊維濾紙を１枚〜６枚程度収容す
る大きさとすることが好ましい。ガラス繊維濾紙の端面
は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密
着させることが好ましい。

【００１８】試料液等の入り口に使用される開口に対向
するガラス繊維濾紙の下は、容器の内壁に密着させずに
空間を設け、試料溶液等がガラス繊維濾紙の全面にでき
るだけ均等に拡散する構造にする。

【００１９】他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合
される開口に対向するガラス繊維濾紙の上には、ほぼ中
央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材
は、ガラス繊維濾紙を押さえると共に、試料溶液等を効
率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴
に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する
形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角
度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量やガラス繊
維濾紙を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が
適宜定めることができる。この部材と当該開口の間に
は、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発
生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けるこ
とが好ましい。この空間の大きさも当業が適宜選択する
ことができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、
ガラス繊維濾紙の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料
溶液を吸引することが好ましいことは言うまでもない。

【００２０】また、吸引している開口の真下の部分にの
み試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等がガ
ラス繊維濾紙内を比較的均一に通過できるようにするた
め、ガラス繊維濾紙とこの部材の間にも空間を設けるこ
とが好ましい。このためには、当該部材からガラス繊維
濾紙に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突
起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができる
が、空間を保持しながらガラス繊維濾紙の開口面積をで
きる限り大きく保つことが好ましい。

【００２１】なお、容器に３以上の開口を設けた場合に
は、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能に
すべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があること
は当然である。

【００２２】容器の材料に特別な限定はなく、固相が収
容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができ
ればよいが、製造の容易性からプラスチックが好まし
い。例えば、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカ
ーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが
好ましい。

【００２３】図１に、精製ユニットの一例を示す。ガラ
ス繊維濾紙３０としては、厚さが約０．９１ｍｍで直径
が約２０．０ｍｍのワットマン社製のＧＦ／Ｄを６枚使
用している。これを収容する容器１は透明なポリスチレ
ン製で、本体１０と蓋２０から成る。

【００２４】本体１０は、内径が２０．１ｍｍ、深さが
５．９ｍｍ、底面１０２から開口１０１までの長さは約
７０ｍｍであり、試料液等を吸引する開口１０１を有す
る。開口から続いている底面１０２は漏斗状に形成さ
れ、ガラス繊維濾紙３０との間に空間１２１が設けられ
ている。ガラス繊維濾紙３０を支えて空間１２１を保つ
ために、底面１０２と一体となった枠１０３が設けられ
ている。

【００２５】図１において、ガラス繊維濾紙の上部には
漏斗状の押さえ部材１３が設けられている。押さえ部材
１３の中央には穴１３１があり、かつ下方に一群の突起
１３２が設けられ、ガラス繊維濾紙３０との間に空間１
２２が設けられている。ガラス繊維濾紙３０と本体１０
の壁１０４の間から試料溶液等が漏れにくい様に、壁１
０４の上部の直径はガラス繊維濾紙の直径より大きく作
成され、段差１０５の上に押さえ部材１３の端が乗って
いる。

【００２６】蓋２０は本体１０と超音波加熱により接合
されている。蓋２０のほぼ中央部には、圧力差発生装置
を結合する開口２１が設けられている。蓋２０と押さえ
部材１３の間には、穴１３１から流出する試料溶液等を
保持する空間１２２が設けられている。空間１２２の容
積は約０．１ｍｌである。

【００２７】圧力差発生装置は、ガラス繊維濾紙を収容
した容器内を減圧にして所定の液を容器内に吸引し、次
いで容器内を加圧にして吸引した液を容器外に排出する
ために使用する。圧力差発生装置としては、注射器、ピ
ペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧
が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作
には注射器が、自動操作にはポンプが適している。ま
た、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有
する。

【００２８】本発明に係る核酸精製方法では、検体から
抽出された核酸と上記試料液中に上記容器の一の開口を
挿入し、容器の他の開口に接続された圧力差発生装置を
用いて容器内を減圧にして容器内のガラス繊維濾紙に接
触するまで試料液を吸引する。次いで圧力差発生装置を
用いて容器内を加圧し、試料液を容器外に排出する。こ
の操作によって、後述する通りガラス繊維濾紙に核酸が
吸着する。この際試料液中の不純物も幾分かガラス繊維
濾紙に吸着される。

【００２９】次に、洗浄バッファを用いて同様の操作を
行い容器内部を洗浄する。洗浄バッファは、容器内に残
留する試料液を洗浄すると同時に、ガラス繊維濾紙に吸
着された不純物を脱着させる機能を有する液である。こ
の操作において吸着された核酸は実質的に脱着しない必
要がある。この様にして核酸が精製される。洗浄バッフ
ァとしては、エチルアルコールと緩衝剤、例えばＴｒｉ
ｓを含有する液が好ましい。

【００３０】次に、回収液を用いて同様の操作を行いガ
ラス繊維濾紙に吸着された核酸を脱着させ、核酸を含む
回収液を回収する。この液中の核酸は引き続くＰＣＲ等
の処理に使用できる。回収液としては、精製蒸留水、Ｔ
Ｅバッファ（１０ｍＭのｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．
５、１ｍＭのＥＤＴＡ）等が好ましい。

【００３１】以下、実施例により本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３２】

【実施例】実施例１ 表１に示す組成の核酸吸着バッファ１を調製した。 表１ 核酸吸着バッファ１の組成 塩化ナトリウム ０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、４Ｍの４水準 ２回蒸留水 １０００ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ １０ｇ

【００３３】ＤＮＡ標準液として、クロンテック製のＨ
ＵＭＡＮ ＤＮＡを１００ｎｇ／μｌの濃度に調製し
た。この標準液２ｍｌを１０ｍｌの試験管４本に分取
し、それぞれに表１に示した４水準の核酸吸着バッファ
の一つを２ｍｌ加えた。よく混和させた後、それぞれに
エタノール２ｍｌを添加してさらに攪拌した。この液中
に、図１に示した精製ユニットの開口１０５を挿入し、
開口１０６に接続した注射器（テルモ社製、容量５ｍ
ｌ）を接続して、開口６の外に出ない速度で試料液を吸
引し、次いで加圧して排出した。

【００３４】排出後直ちに、下記組成の洗浄バッファを
吸引し排出してユニット内を洗浄した。

【００３５】表２ 洗浄バッファの組成 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ７０％ エタノール

【００３６】次いで、精製蒸留水２ｍｌを吸引し排出し
て、その排出液を回収した。この液の２６０ｎｍにおけ
る光吸収を測定し、液中の核酸の量を定量した。４水準
の液について、元のＤＮＡに対する回収したＤＮＡの比
率（％）を表３に示す。

【００３７】実施例２ 実施例１で調製した核酸吸着バッファ１で用いた塩化ナ
トリウムの代わりに臭化ナトリウムを用いて核酸吸着バ
ッファ２を調整した。以下、実施例１と同様の操作を行
い、回収した比率を定量した。結果を表３に示す。

【００３８】実施例３〜６ 実施例１で調製した核酸吸着バッファ１で用いた塩化ナ
トリウムの代わりに、塩化アンモニウム、塩化カリウ
ム、臭化アンモニウム又は臭化カリウムを使用して、実
施例３〜６の核酸吸着バッファ３〜６を調整した。以下
実施例１と同様の操作を行い、回収した比率を定量し
た。結果を表３に示す。

【００３９】比較例１ 実施例１で調製した核酸吸着バッファ１で用いた塩化ナ
トリウムの代わりにチオシアン酸グアニジウムを使用し
て、比較例１の吸着バッファを調整した。以下実施例１
と同様の操作を行い、回収した比率を定量した。結果を
表３に示す。

【００４０】 表３ 元のＤＮＡに対する回収したＤＮＡの比率（％） ０．５Ｍ １Ｍ ２Ｍ ４Ｍ 実施例１ １５ ６３ ９５ ７２ 実施例２ １８ ９１ １０１ ８８ 実施例３ １４ ８１ ９８ ９０ 実施例４ １５ ７６ ９１ ８７ 実施例５ １８ ９０ ９９ ８８ 実施例６ １６ ８８ １００ ９５ 比較例１ １７ ９３ ９７ ８５

【００４１】表３の結果から、実施例１〜６のいずれに
おいても、実用的には比較例と同等のＤＮＡが回収され
ていること、特に約１．５Ｍ〜２．５Ｍの濃度範囲にお
いて好ましいことが判る。

【００４２】

【発明の効果】本発明の核酸吸着バッファにより、有害
性が高いといわれるカオトロピック塩を使用せずに、検
体から核酸を精製することができる。また、本発明の核
酸精製方法により、核酸を含む液を圧力差による吸引と
排出のみで精製することができるので、精製工程の自動
化が容易になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明で使用する核酸精製ユニット
の一例である。

【符号の説明】 １…容器 １０…本体 １０１…開口 １０２…底面 １０３…枠 １０４…壁 １０５…段差 １２１…空間 １２２…空間 １３…押さえ部材 １３１…穴 １３２…突起 ２０…蓋 ３０…ガラス繊維濾紙

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩化物及び／又は臭化物及び緩衝剤を含
   有し、かつカオトロピック化合物を含有しない核酸吸着
   バッファ。
2. 【請求項２】 前記塩化物及び／又は臭化物の濃度が
   １．５〜２．５Ｍである請求項１に記載の核酸吸着バッ
   ファ。
3. 【請求項３】 前記塩化物又は臭化物が、塩化ナトリウ
   ム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウ
   ム、臭化カリウム、臭化アンモニウムから選ばれた少な
   くとも一種である請求項１又は請求項２に記載の核酸吸
   着バッファ。
4. 【請求項４】 更にエチルアルコールを含有する請求項
   １、請求項２又は請求項３に記載の核酸吸着バッファ。
5. 【請求項５】 核酸の吸着及び脱着が可能な固相を収容
   する、少なくとも２個の開口を有する容器から成る核酸
   精製ユニットを使用した、以下の工程を含む核酸精製方
   法。 (１) 前記核酸精製ユニットの一の開口を請求項１に記
   載の核酸吸着バッファ及び核酸を含む試料液中に挿入す
   る工程、 (２) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された圧
   力差発生装置を用い、前記容器内を減圧状態にして前記
   試料液を吸引し、前記核酸の吸着及び脱着が可能な固相
   に接触させる工程、 (３) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された試料液を前記容器外に排出する工程、 (４) 前記核酸精製ユニットの一の開口を洗浄バッファ
   中に挿入する工程、 (５) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を減圧状態にして
   前記洗浄バッファを吸引し、前記核酸の吸着及び脱着が
   可能な固相に接触させる工程、 (６) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された洗浄バッファを前記容器外に排出する工
   程、 (７) 前記核酸精製ユニットの一の開口を、前記核酸の
   吸着及び脱着が可能な固相に吸着された核酸を脱着せし
   めうる液中に挿入する工程、 (８) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を減圧状態にし
   て、前記核酸の吸着及び脱着が可能な固相に吸着された
   核酸を脱着せしめうる液を吸引し、前記核酸の吸着及び
   脱着が可能な固相に接触させる工程、及び (９) 前記核酸精製ユニットの他の開口に結合された前
   記圧力差発生装置を用いて前記容器内を加圧状態にし、
   前記吸引された核酸の吸着及び脱着が可能な固相に吸着
   された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工
   程。