WO2021010239A1 - Ｒｎａウイルス検出方法 - Google Patents

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WO2021010239A1
WO2021010239A1 PCT/JP2020/026646 JP2020026646W WO2021010239A1 WO 2021010239 A1 WO2021010239 A1 WO 2021010239A1 JP 2020026646 W JP2020026646 W JP 2020026646W WO 2021010239 A1 WO2021010239 A1 WO 2021010239A1
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norovirus
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PCT/JP2020/026646
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慎一郎 小林
四方　正光
直子 高岡
健二 二宮
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株式会社島津製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting RNA virus by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and a kit for carrying out the method. More specifically, a method for detecting RNA virus by mixing a sample with a surfactant in the presence of hydroxide and further adding an RT-PCR reaction solution, and a kit for carrying out the method. Regarding.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • RNA virus is a virus that has RNA as its genome, and has an enveloped coronavirus, which is a membrane composed of a lipid bilayer, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, and other non-enveloped noroviruses. , Rotavirus, Rhinovirus, etc., and many are pathogenic.
  • Norovirus is a virus belonging to the family Caliciviridae and has a single-stranded RNA of about 7,000 bases in its genome. This virus is also called a small spherical virus (SRSV) according to the morphological classification observed with an electron microscope, and is also called a virus called Norwalk-like virus. Is. Viruses belonging to norovirus are classified into two gene groups, Genogroup (GI) and Genogroup II (GII), and further classified into 14 and 17 or more genotypes, respectively.
  • GI Genogroup
  • GII Genogroup II
  • norovirus When norovirus infects humans, it causes acute gastroenteritis symptoms such as vomiting and diarrhea. About half of the annual food poisoning patients in Japan are caused by norovirus, and about 70% of them occur from November to February, and norovirus is known as a causative virus of winter-type gastroenteritis and food poisoning. Food poisoning due to norovirus is mainly caused by food contamination through cooks. Norovirus is highly infectious and easily causes outbreaks such as large-scale food poisoning. The transmission route to humans is mainly oral infection. Typical sources of infection include feces or vomitus of infected persons and articles directly or indirectly contaminated with them, as well as foods such as oysters or other bivalves contaminated with norovirus. Therefore, it is important to identify patients infected with norovirus and contaminants caused by the virus in order to prevent the spread of virus infection.
  • Patent Documents 1 to 3 As a virus test for detecting infection or contamination by a virus, an immunological measurement method for detecting a virus antigen or a virus gene amplification method is used (Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1).
  • a means for measuring norovirus with high sensitivity there is a method of amplifying RNA of norovirus by RT-PCR and measuring the amount of amplification product.
  • norovirus detection by RT-PCR method and quantitative detection of norovirus by real-time PCR method are widely performed. ing.
  • RNA virus particles have a basic structure in which a core consisting of an RNA genome and a protein is enclosed in a protein shell called a capsid. Therefore, in order to detect viral RNA by the gene amplification method, it is necessary to extract RNA from viral particles.
  • a fecal sample is suspended in distilled water or physiological saline at a concentration of 5 to 10% (w / v), and commercially available viral RNA is extracted from the centrifugal supernatant.
  • RNA is extracted and purified using a kit (for example, QIAamp (registered trademark) ViralRNA Mini, QIAGEN) (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 4 a simple detection method in which the stool suspension is mixed with the sample treatment solution and heat-treated for a short time to remove the shell protein, the internal RNA is released, and the released RNA is directly subjected to RT-PCR.
  • the reaction vessel is sealed with a lid to prevent bumping and evaporation of the mixture, and after the heat treatment, the lid is removed and the RT-PCR reaction solution is added. It takes time and effort to do.
  • a method of detecting a virus by RT-PCR by mixing a sample with a chaotropic agent such as a guanidine salt without performing heat treatment has been proposed (Patent Document 4).
  • An object of the present invention is to provide a simple method for detecting RNA virus. Specifically, RNA extraction from RNA virus particles such as norovirus is performed using one or more surfactants without heat treatment, and subsequent virus detection operation by RT-PCR reaction of free RNA is simplified. To provide a way to do it. Further, by performing RNA extraction from RNA virus particles and RT-PCR in the same container without opening and closing the lid of the container, a simpler method for detecting RNA virus is provided.
  • a method for detecting RNA virus in a sample (1) The process of suspending the sample in distilled water, physiological saline or buffer solution, (2) The process of extracting the centrifugal supernatant of the suspension produced in step (1), (3) A step of mixing the centrifugal supernatant extracted in step (2) with a sample treatment solution containing one or more kinds of surfactants. (4) A step of mixing the mixed solution obtained in step (3) with a 1-step RT-PCR reaction solution containing reverse transcriptase and DNA polymerase to perform RT-PCR, and (5) Step of detecting the RT-PCR product, How to include.
  • RNA virus is selected from the group consisting of norovirus, rotavirus, rhinovirus, coronavirus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, Japanese encephalitis virus and dengue virus.
  • the RNA virus is a norovirus.
  • the norovirus genotype is genogroup I (GI) or genogroup II (GII).
  • the sample is derived from a sample selected from the group consisting of a biological sample, a biological sample, an environmental sample and an environmental sample.
  • the anionic surfactants include alkyl sulphate, alkyl ether sulphate, docusate, sulfonate fluoro surfactant, alkylbenzene sulfonate, alkylaryl ether phosphate, alkyl ether phosphate, alkyl carboxylate, lauroyl sarcosine sodium, carboxylate fluoro surfactant,
  • the method according to [7] which is one or more anionic surfactants selected from the group consisting of sodium cholic acid and sodium deoxycholate.
  • the method according to [7], wherein the anionic surfactant is an alkyl sulfate.
  • [15] The method according to any one of [1] to [14], wherein the mixing ratio of the centrifugal supernatant and the sample treatment solution in the step (3) is 1: 3 to 6 as a volume ratio.
  • the reverse transcriptase is selected from the group consisting of AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, HIV reverse transcriptase and variants thereof.
  • the DNA polymerase is selected from the group consisting of Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, KOD DNA polymerase, Pfu DNA polymerase and variants thereof.
  • RNA virus detection kit containing a sample treatment solution containing one or more surfactants and a one-step RT-PCR reaction solution containing reverse transcriptase and DNA polymerase.
  • the RNA virus is selected from the group consisting of norovirus, rotavirus, rhinovirus, coronavirus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, Japanese encephalitis virus and dengue virus.
  • the RNA virus is a norovirus.
  • the norovirus genotype is determined to be genogroup I (GI) or genogroup II (GII).
  • the anionic surfactants include alkyl sulphate, alkyl ether sulphate, docusate, sulfonate fluoro surfactant, alkylbenzene sulfonate, alkylaryl ether phosphate, alkyl ether phosphate, alkyl carboxylate, lauroyl sarcosine sodium, carboxylate fluoro surfactant,
  • the kit according to [26] which is one or more anionic surfactants selected from the group consisting of sodium cholic acid and sodium deoxycholate.
  • virus particles are mixed without heat treatment by mixing a centrifugal supernatant of a sample suspension containing RNA virus particles such as norovirus with a sample treatment solution containing one or more surfactants.
  • RNA can be released efficiently from the virus. Therefore, the treatment for releasing RNA and the subsequent series of operations for adding the RT-PCR reaction solution for detecting the presence of the virus can be continuously performed in the same container, and RNA can be easily performed. Viruses can be detected. Furthermore, in the present invention, since the release efficiency of RNA from virus particles is high, the virus detection sensitivity is high, and the virus shedding period can be detected with high accuracy. Therefore, it is useful for detecting subclinical infections, especially for identifying infected patients in the convalescent period after infection.
  • the present invention provides a method for detecting RNA virus in a sample.
  • the method includes (1) a process of suspending a sample in distilled water, physiological saline or a buffer solution, (2) a process of extracting the centrifugal supernatant of the suspension produced in step (1), and (3) step.
  • 1-step RT-PCR reaction solution containing the above is mixed, and RT-PCR is performed, and (5) the step of detecting the RT-PCR product is included.
  • the RNA virus to be detected in the sample is a virus having RNA as a genome, a corona virus having an envelope which is a membrane composed of a lipid bilayer, a human immunodeficiency virus, a hepatitis C virus, and Japanese encephalitis.
  • examples include, but are not limited to, viruses, dengue viruses, and non-enveloped noroviruses, rotaviruses, rhinoviruses, and the like. Since the main component of the envelope is lipid, it is easily destroyed by an organic solvent such as alcohol or a surfactant, but RNA viruses such as norovirus that do not have such an envelope are generally organic solvents and surfactants. Shows resistance to.
  • Examples of the sample in the present invention include a biological sample, a biological sample, an environmental sample, and an environmental sample.
  • Biological samples include animal and plant tissues including the midgut gland of shellfish and body fluids such as blood, saliva, nasal discharge, and tissue secretion. In particular, shellfish are regarded as the most important foods that cause food poisoning caused by norovirus.
  • Examples of the biological sample include those obtained by treating the biological sample with, for example, sonication.
  • Examples of environmental samples include all samples including air, soil, dust, water and the like.
  • the environment-derived sample includes a sample obtained by treating the environment sample with, for example, sonication.
  • examples of the sample include excrement sample, excrement-derived sample, vomit and vomit-derived sample.
  • the excrement sample and the vomit sample may be used as they are, but as step (1), they may be suspended in distilled water, physiological saline or a buffer solution at, for example, 10% (w / v) to form an emulsion. ..
  • the buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include a good (Good) buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, a boric acid buffer solution, and HEPES.
  • the emulsion of the sample may be centrifuged as step (2) at, for example, 10000 to 12000 rpm for 2 to 20 minutes, and the centrifugal supernatant may be used as a sample.
  • Excrement-derived samples and vomit-derived samples include wiped samples.
  • the wiping sample is a sample obtained by wiping fingers, tableware, cutting boards, kitchen knives, cooking equipment, toilet equipment, housing equipment, etc. with a cotton swab, cut cotton, etc. for the purpose of confirming virus contamination, and elution with a phosphate buffer solution, etc. It is a thing.
  • the obtained eluate can be ultracentrifuged and the centrifugal sediment suspended or dissolved can be used as a sample (Yoshiko Munemura et al., Food Hygiene Journal, 2017, Vol. 58, No. 4, p.201-204). ..
  • the step (3) of the present invention is a step of mixing the sample with a sample treatment solution containing one or more kinds of surfactants.
  • surfactant is a general term for substances that act on the interface between substances and change their properties.
  • Surfactants have a structure that has both hydrophilic and hydrophobic moieties in the molecule.
  • Surfactants are classified into anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants.
  • anionic surfactants include alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, docusates, sulfonate fluorosurfactants, alkylbenzene sulfonates, alkylaryl ether phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl carboxylates, lauroyl sarcosine sodium, carboxylate fluoro surfactants, Examples include, but are not limited to, sodium colate and sodium deoxycholate. As the alkyl sulfate, sodium dodecyl sulfate (SDS) and ammonium dodecyl sulfate are preferable, and sodium dodecyl sulfate is more preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • ammonium dodecyl sulfate sodium dodecyl sulfate is more preferable.
  • Sodium dodecyl sulfate is also referred to as sodium lauryl sulfate (SLS).
  • SLS sodium lauryl sulfate
  • examples of the cationic surfactant include, but are not limited to, ethyltrimethylammonium bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide and tetradecyltrimethylammonium bromide.
  • Amphoteric surfactants include, but are not limited to, betaine and alkylamino fatty acid salts.
  • nonionic surfactants include nonylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween® 80), and polyoxyethylene pt-octylphenol (Triton X-100 (registered)). Trademarks)), etc., but are not limited to these.
  • RNA virus particles protein shell capsids and lipid envelopes are solubilized, denatured, or destroyed in the presence of detergents above the critical micelle concentration. As a result, the RNA encapsulated in the capsid tends to be exposed in the aqueous solution.
  • the critical micelle concentration of the surfactant varies depending on the type of surfactant, but in order to efficiently expose the viral RNA, the concentration of the surfactant in the sample treatment solution is 0.02 to 0.5% (w). / v) is preferable, 0.05 to 0.2% (w / v) is more preferable, and 0.1% (w / v) is even more preferable.
  • the mixing ratio of the sample and the sample processing solution is preferably 1: 3 to 6 as a volume ratio, and more preferably 1: 4.
  • the sample treatment solution contains a hydroxide.
  • hydroxide refers to a substance in which a metal ion as a cation and a hydroxide ion (OH ⁇ ) as an anion are ionically bonded.
  • the metal is an alkali metal or an alkaline earth metal.
  • the hydroxide include lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and barium hydroxide, but sodium hydroxide and potassium hydroxide are preferable.
  • Hydroxides are also called alkalis because they are strongly basic and generate hydroxide ions when dissolved in water.
  • Hydroxides denature proteins by changing the charge status of dissociative amino acids such as aspartic acid and glutamic acid in protein molecules in aqueous solution. Due to this action, alkaline treatment of RNA virus particles causes destruction of capsids. As a result, the RNA encapsulated in the capsid tends to be exposed in the aqueous solution.
  • the hydroxide concentration in the sample treatment solution is preferably 10 to 100 mM, more preferably 40 to 60 mM, and even more preferably 50 mM.
  • the surfactant and the hydroxide coexist in the sample treatment solution.
  • the step (3) of the present invention for efficiently exposing viral RNA from the capsid is preferably performed at a temperature of 1 to 60 ° C., more preferably 1 to 50 ° C., and 1 to 40 ° C. It is more preferable, and most preferably it is carried out at room temperature of 1 to 30 ° C. After mixing the sample and the sample processing solution, it is preferable to leave it for 3 minutes or more. Since the step (3) of the present invention does not require heat treatment, there is a low risk of sudden boiling or evaporation of the mixed solution of the sample and the sample processing solution in the reaction vessel, and the reaction vessel is opened without being sealed with a lid or the like. Can be done.
  • Step (4) of the present invention is a step of mixing the mixed solution obtained in step (3) with a one-step RT-PCR reaction solution containing reverse transcriptase and DNA polymerase to perform RT-PCR.
  • step (3) since step (3) is performed in a non-closed container that does not use a lid, the one-step RT-PCR reaction with respect to the container containing the mixed solution obtained in step (3).
  • steps (3) and (4) can be performed in the same container.
  • SDS has a particularly strong denaturing effect on proteins.
  • the mixing ratio of the mixed solution obtained in the step (3) to the 1-step RT-PCR reaction solution is preferably 1: 2 to 6 as a volume ratio, and more preferably 1: 4.
  • step (4) of the present invention 1-step RT-PCR is adopted in order to analyze a large number of samples in a short time.
  • Reverse transcriptase and DNA polymerase are mixed in advance in the 1-step RT-PCR reaction solution, and reverse transcription reaction (single-stranded cDNA synthesis) and PCR can be performed in the same container.
  • the reverse transcriptase contained in the one-step RT-PCR reaction solution is an enzyme that produces single-stranded complementary DNA (DNA) using viral RNA as a template, and is not particularly limited as long as it catalyzes the reverse transcription reaction.
  • RNA-dependent from RNA viruses such as Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) and Human Immunodeficiency Virus (HIV) DNA polymerases as well as variants thereof can be used.
  • the DNA polymerase contained in the one-step RT-PCR reaction solution is a thermostable DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium, and Taq, Tth, KOD, Pfu and variants thereof can be used, but the DNA polymerase is limited thereto. Not done.
  • Hot-start DNA polymerase may be used to avoid non-specific amplification by DNA polymerase.
  • a hot-start DNA polymerase is, for example, a DNA polymerase to which an anti-DNA polymerase antibody is bound or a DNA polymerase in which an enzyme active site is heat-sensitively chemically modified. In PCR, the DNA polymerase is activated after the first denaturation step (90 ° C. or higher). It is an enzyme that is converted.
  • the one-step RT-PCR reaction solution contains all the components for performing the reverse transcription reaction and PCR under appropriate conditions.
  • the components include at least the reverse transcriptase, the reverse transcription reaction primer, the heat-resistant DNA polymerase, the PCR primer, the dNTP mix (deoxyribonucleotide 5'-triphosphate; a mixture of dATP, dGTP, dCTP and dTTP) and a buffer solution. ..
  • the reaction solution comprises tris and magnesium.
  • An RNA-degrading enzyme inhibitor can also be added to the reaction solution.
  • As the reverse transcription reaction primer a primer specific to the sequence of the target RNA, an oligo (dT) primer, or a random primer can be used.
  • PCR primer primer pairs (forward and reverse) specific for the sequence of cDNA generated by the reverse transcription reaction are used.
  • the PCR primer may be the same as the reverse transcription reaction primer specific for the sequence of the target RNA.
  • two or more types of PCR primers may be added to the one-step RT-PCR reaction solution depending on the DNA region to be amplified, that is, the number of target sequences.
  • an RT-PCR reaction solution obtained by mixing the reagents contained in the norovirus detection reagent kit (probe method) (Shimadzu Corporation) according to the kit instruction manual can be used.
  • Non-Patent Document 3 When detecting norovirus RNA, for example, by using the PCR primers described in Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 3 and JP-A-2018-788806, genogroup I (GI) and genogroup II in the norovirus genotype are used. (GII) can be detected, but is not limited to these.
  • the norovirus detection reagent kit (probe method) contains the PCR primers described in Non-Patent Document 3.
  • reaction temperature conditions for the reverse transcription reaction in RT-PCR and the PCR conditions (temperature, time, and number of cycles).
  • the step (5) of the present invention is a step of detecting the product from RT-PCR performed in the step (4).
  • PCR products are detected by real-time measurement.
  • the RT-PCR step (4) and the step of detecting the RT-PCR product in step (5) are performed in the same container.
  • step (3) is carried out in a non-closed container that does not use a lid, a one-step RT-PCR reaction solution is used for the container containing the mixed solution obtained in step (3). Can be directly added as it is, so that steps (3) and (4) can be carried out in the same container. Therefore, in one embodiment of the present invention, steps (3) to (5) can be performed in the same container.
  • Real-time measurement of PCR products is also called real-time PCR.
  • PCR amplification products are usually detected by fluorescence.
  • Fluorescence detection methods include a method using an intercalator fluorescent dye and a method using a fluorescently labeled probe.
  • the intercalator fluorescent dye SYBR® Green I is used, but is not limited thereto.
  • the intercalator fluorescent dye binds to the double-stranded DNA synthesized by PCR and fluoresces when irradiated with excitation light. By measuring this fluorescence intensity, the amount of PCR amplification product produced can be measured.
  • Fluorescently labeled probes include, but are not limited to, TaqMan probe, Molecular Beacon, cycling probe, etc.
  • the TaqMan probe is an oligonucleotide with a fluorescent dye at the 5'end and a quencher at the 3'end.
  • the TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the PCR annealing step, but the presence of a quencher on the probe suppresses the generation of fluorescence even when irradiated with excitation light.
  • the fluorescent dye is released from the probe and fluorescence is generated by the quencher.
  • PCR is performed using two or more types of oligonucleotide probes (for example, TaqMan probe) to which different fluorescent dyes are bound.
  • step (5) the amplification curve of the RT-PCR product is measured using a fluorescent filter corresponding to the fluorescent dye used. If the fluorescence intensity increases with the number of PCR cycles, the presence of the RNA virus to be analyzed in the sample is determined to be positive, while if the fluorescence intensity does not increase in PCR, it is determined to be negative. ..
  • an RNA virus detection kit containing a sample treatment solution containing one or more surfactants and a one-step RT-PCR reaction solution containing reverse transcriptase and DNA polymerase is provided.
  • Specimen Treatment with Heat Treatment As a comparison, a sample was treated with a sample treatment solution containing 15 mM NaOH but not SDS.
  • sample treatment solution As the sample treatment solution, the sample treatment solution (Sample Treatment Reagent) contained in the norovirus detection reagent kit (probe method) (Shimadzu Corporation, product number 241-09325-91) was used. 9 ⁇ L of the sample treatment solution was taken in a PCR reaction tube, 1 ⁇ L of the sample was placed therein, stirred and mixed, spun down by a small centrifuge, placed in a constant temperature device at 90 ° C., and heat-treated for 5 minutes. After this heat treatment, the PCR reaction tube was spun down by a small centrifuge and ice-cooled as it was.
  • sample Treatment Reagent contained in the norovirus detection reagent kit (probe method) (Shimadzu Corporation, product number 241-09325-91) was used. 9 ⁇ L of the sample treatment solution was taken in a PCR reaction tube, 1 ⁇ L of the sample was placed therein, stirred and mixed, spun down by a small centrifuge, placed in a constant temperature device at 90 ° C
  • the reagents (NoV Reagents A, B and C) contained in the norovirus detection reagent kit (probe method) (Shimadzu Corporation, product number 241-09325-91) were mixed with 10 ⁇ L of the treatment solution obtained in 3-2 above.
  • the 1-step RT-PCR reaction solution prepared in the above was added.
  • the composition during the reaction was as follows.
  • Table 1 shows the photometric results. Table 1 compares the case where the sample is treated with the sample treatment solution according to the present invention and the case where the sample is heat-treated according to the conventional method, and shows the Ct value. The Ct value is the number of cycles at which the amplification curve and the threshold intersect in real-time PCR. From Table 1, it was shown that the Ct value was almost the same for all the samples between the case of heat treatment according to the conventional method and the case of treatment with the sample treatment solution according to the present invention. This result shows that the initial amount of the template is almost the same in all the treatments. That is, it can be seen that the sample treatment according to the present invention, in which the heat treatment can be omitted by using the surfactant and the hydroxide, has the same virus RNA exposure effect as the conventional method of performing the heat treatment.

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Abstract

本発明は、逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ－ＰＣＲ）によるＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体を、水酸化物の存在下、界面活性剤と混合し、さらにＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによりＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。

Description

ＲＮＡウイルス検出方法
　本発明は、逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ－ＰＣＲ）によるＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体を、水酸化物の存在下、界面活性剤と混合し、さらにＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによりＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。
　ＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルスなどに分類され、病原性のものも多い。
　ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。このウイルスは、電子顕微鏡で観察される形態学的分類により小型球形ウイルス（Small Round Structured Virus, SRSV）とも呼ばれ、またノーウォーク様ウイルス（Norwalk-like virus）という属名で呼ばれてきたウイルスである。ノロウイルスに属するウイルスは、ジェノグループ（Genogroup）（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に分類され、さらにそれぞれ１４および１７またはそれ以上の遺伝子型（genotype）に分類される。
　ノロウイルスがヒトに感染すると、嘔吐、下痢などの急性胃腸炎症状を起こす。本邦における年間の食中毒患者の約半数はノロウイルスに起因し、このうち約７割は１１月～２月に発生しており、ノロウイルスは冬型の胃腸炎および食中毒の原因ウイルスとして知られている。ノロウイルスによる食中毒は、主に、調理者を通じた食品の汚染により発生する。ノロウイルスは感染力が強く、大規模な食中毒など集団発生を起こしやすい。ヒトへの感染経路は、主に経口感染である。感染者の糞便または吐物およびこれらに直接的または間接的に汚染された物品類、また、ノロウイルスにより汚染されたカキまたはその他の二枚貝類などの食品類が感染源の代表的なものとして挙げられる。このため、ノロウイルス感染患者や該ウイルスによる汚染物を特定することは、ウイルス感染の拡大を防止するために重要である。
　ウイルスによる感染や汚染を検出するためのウイルス検査としては、ウイルス抗原を検出する免疫学的測定法やウイルス遺伝子増幅法が用いられる（特許文献１～３、非特許文献１）。ノロウイルスを高感度に測定する手段としては、ノロウイルスのＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる。例えば、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課による通知（非特許文献２および３）に準拠して、ＲＴ－ＰＣＲ法によるノロウイルスの検出およびリアルタイムＰＣＲ法によるノロウイルスの定量的検出が広く行われている。
　ＲＮＡウイルス粒子は、ＲＮＡゲノムとタンパク質からなるコアが、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻に封入された基本構造を持つ。このため、遺伝子増幅法によりウイルスＲＮＡを検出するためには、ウイルス粒子よりＲＮＡを抽出する必要がある。検体として糞便中のノロウイルスを検出するには、例えば、糞便検体を蒸留水または生理食塩水に５～１０％（ｗ／ｖ）の濃度で懸濁し、その遠心上清から、市販のウイルスＲＮＡ抽出キット（例えば、QIAamp（登録商標） Viral RNA Mini、QIAGEN社）を用いてＲＮＡを抽出・精製する（非特許文献２）。しかしながら、多段階のＲＮＡの抽出・精製操作の後にＲＴ－ＰＣＲを行う検出過程は煩雑である。このため、糞便懸濁液を検体処理液と混合し、短時間熱処理することにより殻タンパク質を除去し、内部のＲＮＡを遊離させて、遊離させたＲＮＡを直接ＲＴ－ＰＣＲに供する簡易な検出法が提案されている（非特許文献４）。一方、糞便懸濁液と検体処理液との混合物を熱処理するためには、該混合物の突沸や蒸散を防ぐために反応容器を蓋により密閉し、熱処理後に蓋を外してＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する手間を要する。この点を改善するため、検体をグアニジン塩などのカオトロピック剤と混合することにより、熱処理を行うことなくＲＴ－ＰＣＲによりウイルスを検出する方法が提案されている（特許文献４）。
ＷＯ２００２／０２９１１９ ＷＯ２００２／０２９１２０ 特開２００４－３０１６８４ 特開２０１７－２０９０３６
Kageyama T, et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 2003 Apr;41(4):1548-57. 厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課　食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発０５１４００４号（平成１９年５月１４日） 厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課　食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発１０２２第１号（平成２５年１０月２２日） Nishimura N, et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. J Virol Methods. 2010 Feb;163(2):282-286.
　本発明の目的は、簡便なＲＮＡウイルスの検出方法を提供することにある。具体的には、１種以上の界面活性剤を用いて、ノロウイルスなどのＲＮＡウイルス粒子からのＲＮＡ抽出を熱処理することなく行い、それに続く遊離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ反応によるウイルス検出操作を簡便に行う方法を提供することにある。また、ＲＮＡウイルス粒子からのＲＮＡ抽出と、ＲＴ－ＰＣＲを、同一容器内で、容器の蓋を開閉することなく行うことにより、より簡便なＲＮＡウイルスの検出方法を提供する。
　本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
　検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（１）検体を蒸留水、生理食塩水または緩衝液に懸濁する行程、
（２）工程（１）で生成した懸濁液の遠心上清を抽出する行程、
（３）工程（２）で抽出した遠心上清と、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液とを混合する工程、
（４）工程（３）で得られた混合液と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程、および、
（５）前記ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程、
を含む方法。
〔２〕
　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
　前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
　前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
　前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
　前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕
　前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕
　前記界面活性剤の濃度が、０．０２～０．５％（w/v）である、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕
　前記検体処理液が、水酸化物を含む、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕
　前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕
　前記水酸化物の濃度が、１０～１００ｍＭである、〔１２〕または〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
　前記工程（３）における遠心上清と検体処理液との混合比が、体積比として１：３～６である、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕
　前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕
　前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
　前記工程（５）が、リアルタイム測定によって行われる、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕
　前記工程（３）が、１～６０℃の温度下で行われる、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕
　前記工程（３）～（５）が、同一容器内で行われる、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕
　前記工程（５）において、蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定し、検体におけるＲＮＡウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕
　１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キット。
〔２３〕
　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、〔２２〕に記載のキット。
〔２４〕
　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、〔２２〕に記載のキット。
〔２５〕
　ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、〔２４〕に記載のキット。
〔２６〕
　前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔２２〕～〔２５〕のいずれかに記載のキット。
〔２７〕
　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕
　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔２６〕に記載のキット。
〔２９〕
　前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔２８〕に記載のキット。
〔３０〕
　さらにキットの操作手順書を含む、〔２２〕～〔２９〕のいずれかに記載のキット。
　本発明によれば、ノロウイルスなどのＲＮＡウイルス粒子を含む検体懸濁液の遠心上清と、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液とを混合することによって、熱処理することなく、ウイルス粒子から効率よくＲＮＡを遊離させることができる。このため、ＲＮＡを遊離させる処理と、その後に、ウイルスの存在を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する一連の操作とを、同一容器内で連続的に行うことができ、簡便にＲＮＡウイルスを検出することができる。さらに、本発明では、ウイルス粒子からのＲＮＡの遊離効率が高いためウイルス検出感度が高く、ウイルス排出期間を精度よく検出することができる。そのため、不顕性感染の検出、特に感染後の回復期にある感染患者の特定に有用である。
　本発明は、検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法を提供する。該方法は、（１）検体を蒸留水、生理食塩水または緩衝液に懸濁する行程、（２）工程（１）で生成した懸濁液の遠心上清を抽出する行程、（３）工程（２）で抽出した遠心上清と、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液とを混合する工程、（４）工程（３）で得られた混合液と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程、および、（５）前記ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程を含む。
　本発明において、検体中の検出対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。エンベロープは主成分が脂質であるため、アルコールなどの有機溶媒や界面活性剤により容易に破壊されるが、このようなエンベロープを持たないノロウイルスなどのＲＮＡウイルスは、一般的に有機溶媒や界面活性剤に対して抵抗性を示す。
　本発明における検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料としては、貝類の中腸腺などを含む動植物組織および血液、唾液、鼻汁、組織分泌液などの体液が含まれる。特に貝類は、ノロウイルスによる食中毒の原因食品として最も重要視されている。生物由来試料としては、前記生体試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。
　本発明の別の実施態様として、検体としては、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料などが挙げられる。排泄物試料および嘔吐物試料は、そのまま使用してもよいが、工程（１）として、蒸留水、生理食塩水または緩衝液に、例えば１０％（w/v）で懸濁して乳剤としてもよい。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。前記試料の乳剤は、腸内細菌などの混在物を除去するため、工程（２）として、例えば10000～12000 rpmで２～２０分間遠心分離し、遠心上清を検体として使用してもよい。排泄物由来試料および嘔吐物由来試料には、拭き取り試料が含まれる。拭き取り試料とは、ウイルス汚染の確認を目的として、手指、食器、まな板、包丁、調理設備、トイレ設備、住宅設備などを綿棒、カット綿などで拭き取ったものをリン酸緩衝液などに溶出させたものである。得られた溶出液は超遠心分離し、遠心沈渣を懸濁または溶解したものを検体として使用することができる（宗村佳子ら、食品衛生学雑誌、2017 年 58 巻 4 号 p.201-204）。
　本発明の工程（３）は、検体を１種以上の界面活性剤を含む検体処理液と混合する工程である。本明細書において「界面活性剤」とは、物質の境界面に作用し、性質を変化させる物質の総称である。界面活性剤は、分子内に親水性部分と疎水性部分の両方を持つ構造を有するである。界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン界面活性剤に分類される。陰イオン界面活性剤としては、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルサルフェートとしては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）およびドデシル硫酸アンモニウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムがより好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate、ＳＬＳ）とも称される。陽イオン界面活性剤としては、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性界面活性剤としては、例えば、ベタインおよびアルキルアミノ脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン界面活性剤としては、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標））などが挙げられるが、これらに限定されない。
　界面活性剤は、水溶液中で一定濃度以上を添加すると、界面活性剤モノマーが集合してミセルを形成する。界面活性剤がミセルを形成するようになる濃度は、臨界ミセル濃度と呼ばれる。水溶液中で、界面活性剤ミセル内部の疎水性領域に、タンパク質や脂質の疎水性領域が取り込まれ、タンパク質や脂質は可溶化される。ＲＮＡウイルス粒子において、タンパク質の殻であるカプシドや脂質からなるエンベロープは、臨界ミセル濃度以上の界面活性化剤の存在下で可溶化され、変性され、または破壊される。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。界面活性剤の臨界ミセル濃度は界面活性剤の種類によって異なるが、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での界面活性剤の濃度が０．０２～０．５％（w/v）であることが好ましく、０．０５～０．２％（w/v）がより好ましく、０．１％（w/v）がさらに好ましい。
　検体と検体処理液との混合比は、好ましくは体積比として１：３～６であり、より好ましくは１：４である。検体と界面活性化剤を含む検体処理液とを混合することにより、混合液中の界面活性剤の濃度が低下するが、界面活性剤の上記濃度は、臨界ミセル濃度を維持するものである。
　本発明の一実施態様において、前記検体処理液は水酸化物を含む。本明細書において「水酸化物」とは、陽イオンとして金属イオンと、陰イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ－）とがイオン結合した物質を指す。金属は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である。水酸化物としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムおよび水酸化バリウムが例示されるが、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが好ましい。水酸化物は強塩基性を示し、水に溶解すると水酸化物イオンを生じるため、アルカリとも呼ばれる。水酸化物は、水溶液中でタンパク質分子中の、アスパラギン酸、グルタミン酸などの解離性アミノ酸の荷電状況を変化させ、タンパク質を変性させる。この作用により、ＲＮＡウイルス粒子をアルカリ処理するとカプシドの破壊が生じる。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での水酸化物濃度は、好ましくは１０～１００ｍＭであり、より好ましくは４０～６０ｍＭであり、５０ｍＭがさらに好ましい。
　カプシドや脂質からなるエンベロープを可溶化させ、変性させ、または破壊し、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、前記検体処理液において界面活性剤と水酸化物とが共存することが好ましい。
　カプシドよりウイルスＲＮＡを効率よく露出させるための本発明の工程（３）は、１～６０℃の温度下で行うことが好ましく、１～５０℃で行うことがより好ましく、１～４０℃で行うことがさらに好ましく、１～３０℃の室温で行うことが最も好ましい。検体と検体処理液とを混合した後は、３分間以上放置することが好ましい。本発明の工程（３）は、熱処理が不要であるため、反応容器内の検体と検体処理液との混合液の突沸や蒸散の危険性が低く、反応容器を蓋等により密閉せず、開放して行うことができる。
　本発明の工程（４）は、工程（３）で得られた混合液と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程である。本発明の一実施態様において、工程（３）が蓋を使用しない非密閉容器内で行われるため、工程（３）で得られた混合液を含む容器に対して、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液をそのまま直接添加することにより、工程（３）および（４）を同一容器内で行うことができる。工程（３）で得られる混合液に含まれる界面活性剤の中で、特にＳＤＳはタンパク質に対する変性効果が強い。このため、工程（４）にＳＤＳが高い濃度で持ち込まれると、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害し、ＲＴ－ＰＣＲが進行しない可能性がある。同様に、工程（３）で得られる混合液に含まれる水酸化物も、工程（４）に持ち込まれる濃度が高いと、高ｐＨによる前記酵素活性の低下を招く。このため、工程（３）で得られる混合液と前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液との混合比は、好ましくは体積比として１：２～６であり、より好ましくは１：４である。
　本発明の工程（４）では、多検体を短時間で分析するため、１ステップＲＴ－ＰＣＲを採用する。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ混合されており、逆転写反応（１本鎖ｃＤＮＡ合成）およびＰＣＲを同一容器内で行うことができる。
　前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡを鋳型として、１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。
　前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートDNAポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、例えば抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲにおいて、最初の変性ステップ（９０℃以上）を経た後にＤＮＡポリメラーゼが活性化される酵素である。
　前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、逆転写反応およびＰＣＲが適切な条件で遂行されるためのすべての成分が含まれる。該成分として、少なくとも前記逆転写酵素、逆転写反応プライマー、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）および緩衝液が含まれる。本発明の一実施態様において、前記反応液はトリスおよびマグネシウムを含む。前記反応液には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することもできる。逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。ＰＣＲプライマーとしては、逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマー対（フォワードおよびリバース）が使用される。ＰＣＲプライマーは、標的ＲＮＡの配列に特異的な前記逆転写反応プライマーと同一であってもよい。また、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、増幅するＤＮＡ領域、すなわち標的配列の数に応じて２種類以上のＰＣＲプライマーを添加してもよい。前記成分を含んだ組成物として、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所）に含まれる試薬を、キット取扱説明書にしたがって混合したＲＴ－ＰＣＲ反応液を使用することができる。
　ノロウイルスＲＮＡを検出する場合、例えば、特許文献１および２、非特許文献３ならびに特開２０１８－７８８０６に記載のＰＣＲプライマーを使用することにより、ノロウイルス遺伝子型におけるジェノグループＩ（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）を検出することができるが、これらに限定されない。前記ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）には、非特許文献３に記載のＰＣＲプライマーが含まれる。
　ＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
　本発明の工程（５）は、工程（４）で行われるＲＴ－ＰＣＲからの産物を検出する工程である。本発明の一実施態様において、ＰＣＲ産物をリアルタイム測定により検出する。該リアルタイム測定を行う場合、工程（４）のＲＴ－ＰＣＲおよび工程（５）の該ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程は同一容器内で行われる。本発明の一実施態様において、工程（３）が蓋を使用しない非密閉容器内で行われるため、工程（３）で得られた混合液を含む容器に対して、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液をそのまま直接添加することにより、工程（３）および（４）を同一容器内で行うことができる。したがって、本発明の一実施態様において、工程（３）～（５）を、同一容器内で行うことができる。
　ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイム ＰＣＲ では、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
　蛍光標識プローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beacon、サイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。TaqManプローブは、5’末端が蛍光色素で、また3’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。TaqManプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、TAMRA（登録商標）およびMGBが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばTaqManプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
　工程（５）において、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定する。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象のＲＮＡウイルスの存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。
　本発明の一実施態様において、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キットが提供される。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
〔検体中のウイルスＲＮＡ露出に及ぼす界面活性化剤および水酸化物の効果〕
（１）検体
　ノロウイルスを含むヒト糞便（１０例）をそれぞれ１００ｍｇ採取し、１ｍＬの蒸留水に懸濁して、約１０％（w/v）の糞便乳剤とした。該糞便乳剤を、１００００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離し、遠心上清を検体とした。
（２）検体処理液
　下記の成分を含む検体処理液を調製した。
５０ｍＭ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、
０．１％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および
６２５μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）
（３－１）検体処理
　蓋なしＰＣＲ反応チューブに上記検体処理液４μＬを取り、そこへ上記検体１μＬを加えた後、室温で３分間放置した。
（３－２）熱処理を伴う検体処理
　比較として、１５ｍM ＮａＯＨを含むが、ＳＤＳを含まない検体処理液を用いて検体を処理した。該検体処理液として、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325-91）に含まれる検体処理液（Sample Treatment Reagent）を使用した。ＰＣＲ反応チューブに前記検体処理液９μＬを取り、そこへ上記検体１μＬを入れて撹拌混合し、小型遠心分離器によりスピンダウンした後、９０℃の恒温装置内に置き、５分間加熱処理した。この熱処理後、ＰＣＲ反応チューブを小型遠心分離器によりスピンダウンし、そのまま氷冷した。
（４）１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応
　上記３－１で得られた処理液５μＬを含むＰＣＲ反応チューブに、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液２０μＬを添加し、または、上記３－２で得られた処理液１０μＬを含むＰＣＲ反応チューブに、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液１５μＬを添加し、撹拌混合した後、小型遠心分離器によりスピンダウンした。この後、リアルタイムＰＣＲ装置（GVP-9600、島津製作所）を用いて直ちに反応を開始した。
（５）１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液の組成
　上記３－１で得られた処理液５μＬには、下記反応液組成になるように１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加した。上記３－２で得られた処理液１０μＬには、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325-91）に含まれる試薬（NoV Reagent A、B及びC）を混合して調製した１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加した。反応中の組成は以下の通りとした。
４０ｍＭ トリス
０．０２５ユニット／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ
１ユニット／μＬ 逆転写酵素　
３．７５ｍＭ 塩化マグネシウム
４００ｎＭ ＰＣＲプライマーセット（ＣＯＧ１Ｆ／ＣＯＧ１ＲおよびＣＯＧ２Ｆ／ＣＯＧ２Ｒ）（非特許文献３、表１１を参照）
２００ｎＭ 蛍光標識プローブ（TaqManプローブ：Ｇ１Ａ、Ｇ１ＢおよびＧ２）
（６）ＲＴ－ＰＣＲの設定条件
　「４５℃／５分」の逆転写反応後、「９５℃／３分」の初期変性を行い、次いで「９５℃／１秒 － ５６℃／１０秒」のＰＣＲを４５サイクル行った。測光は、５６℃／１０秒のステップで行った。
（７）結果と考察
　測光結果を表１に示した。表１は、検体を、本発明に係る検体処理液により処理した場合と、従来法である熱処理した場合を比較したものであり、Ct値を示している。Ct値は、リアルタイムＰＣＲにおいて、増幅曲線と閾値（Threshold）が交差するサイクル数のことである。表１より、従来法である熱処理した場合と本発明に係る検体処理液により処理した場合との間で、すべての検体についてCt値は、ほぼ同じであることが示された。この結果は、いずれの処理においても初期鋳型量がほぼ同じであることを示す。すなわち、界面活性化剤および水酸化物を用いることにより熱処理を省くことができる本発明に係る検体処理により、熱処理を行う従来法と同等のウイルスＲＮＡ露出効果があることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (30)

  1. 　検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
    （１）検体を蒸留水、生理食塩水または緩衝液に懸濁する行程、
    （２）工程（１）で生成した懸濁液の遠心上清を抽出する行程、
    （３）工程（２）で抽出した遠心上清と、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液とを混合する工程、
    （４）工程（３）で得られた混合液と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程、および、
    （５）前記ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程、
    を含む方法。
  2. 　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１～４のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１～４のいずれか1項に記載の方法。
  7. 　前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項１～６のいずれか1項に記載の方法。
  8. 　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項７に記載の方法。
  10. 　前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記界面活性剤の濃度が、０．０２～０．５％（w/v）である、請求項１～１０のいずれか1項に記載の方法。
  12. 　前記検体処理液が、水酸化物を含む、請求項１～１１のいずれか1項に記載の方法。
  13. 　前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記水酸化物の濃度が、１０～１００ｍＭである、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　前記工程（３）における検体と検体処理液との混合比が、体積比として１：３～６である、請求項１～１４のいずれか1項に記載の方法。
  16. 　前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１～１５のいずれか1項に記載の方法。
  17. 　前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１～１６のいずれか1項に記載の方法。
  18. 　前記工程（５）が、リアルタイム測定によって行われる、請求項１～１７のいずれか1項に記載の方法。
  19. 　前記工程（３）が、１～６０℃の温度下で行われる、請求項１～１８のいずれか1項に記載の方法。
  20. 　前記工程（３）～（５）が、同一容器内で行われる、請求項１～１９のいずれか1項に記載の方法。
  21. 　前記工程（５）において、蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定し、検体におけるＲＮＡウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する、請求項１～２０のいずれか1項に記載の方法。
  22. 　１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キット。
  23. 　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、請求項２２に記載のキット。
  24. 　前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項２２に記載のキット。
  25. 　ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、請求項２４に記載のキット。
  26. 　前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項２２～２５のいずれか1項に記載のキット。
  27. 　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、請求項２６に記載のキット。
  28. 　前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項２６に記載のキット。
  29. 　前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項２８に記載のキット。
  30. 　さらにキットの操作手順書を含む、請求項２２～２９のいずれか1項に記載のキット。
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