CN113789332B - 与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用 - Google Patents

与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核酸适配体是单链DNA，由76个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=‑15.08；基于氧化石墨烯荧光法对核酸适配体的特异性、亲和力等的评估，结果显示核酸适配体解离常数Kd=31.85±1.33，能与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合；该核酸适配体具有高特异性、高亲和力的特点，能够应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中。

Description

与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用
技术领域
本发明公开了一种能够与硫磺熏蒸后天麻产生的标志物对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
天麻又名赤箭、定风草、独摇芝，为兰科植物天麻（GastrodiaelataBl.）的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，可用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风、头痛眩晕、手足不遂、肢体麻木、风湿痹痛等症。由于天麻富含多糖，在加工和储存过程中易发霉变质，故药农或经销商在加工和储存中常采用硫磺熏蒸处理来提高天麻的外观质量和方便储藏。硫熏后天麻的药效成分会显著降低，同时可能出现严重的SO2残留量超标现象。中药材中的SO2遇水可解离成亚硫酸，SO2在肠内能部分转化为硫化氢，引起硫化氢中毒。此外，还可能存在重金属残留，危害人体健康。近年来，随着天麻药用价值和食用价值的不断挖掘，天麻越来越受到公众关注。天麻作为硫熏较为严重的品种之一，其药用质量和食用品质问题受到广泛关注。为了保障天麻药效质量和消费者安全，研制快速准确鉴定硫磺熏蒸天麻的技术十分重要也异常紧迫。
天麻经硫磺熏蒸后会形成一种丰度高、性质稳定的标志性产物“对羟基苄亚硫酸氢(p-Hydroxybenzyl hydrogen sulfite)”。其分子式为C7H8O4S，是一种淡黄色粉末状固体，无毒，能溶于水和50%甲醇，分子量181。目前，对羟基苄亚硫酸氢的主要检测方法为超高液相色谱法，虽然该方法结果可靠、灵敏度高，但是由于设备昂贵一次投入成本高，还要进行复杂的前处理，测试成本也随之提高，只能在实验室中使用，无法满足市场快速鉴定之需求。因此发展一种适合现场快速检测、操作简单、成本低廉且稳定性和灵敏性均较高的对羟基苄亚硫酸氢检测方法十分必要。
核酸适配体（aptamer），又称为“适配子”“适体”等，是一小段能特异性识别靶标分子的寡核苷酸分子。核酸适配体作为一种分子识别元件在分析检测中展现出无可替代的优点：①筛选周期短，一般筛选周期为2~3个月；②稳定性高，核酸适配体通常以粉末保存，变性和复性可逆，可常温保存运输，在高温下亦可稳定存在；③筛选简单，核酸适配体是在体外筛选的，不依赖生物体即可筛选出无免疫原性或低免疫原性靶目标的核酸适配体；④靶标目标范围广，包括小分子、金属离子、生物毒素和蛋白质大分子等；⑤易于修饰，通过合成核酸适配体，可以在其末端连接一些活性基团或者修饰一些指示基团；⑥对靶标物质的亲和力和特异性强。因此本发明拟采用核酸适配体技术建立一种快速、直接、有效、高特异性、高灵敏度的对羟基苄亚硫酸氢的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种能够与对羟基苄亚硫酸氢（p-Hydroxybenzyl hydrogensulfite，p-HS）特异性结合的核酸适配体SEQ9，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核酸适配体为单链DNA，由76个核苷酸组成，其预测的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=-15.08。
本发明另一目的是将上述能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体SEQ9应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中。
本发明目的通过以下技术方案实现：
1、对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体的筛选、测序
采用指数富集的配体系统进化技术（SELEX），通过链霉亲和素（SA）磁珠固定文库的方法筛选出能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体，经高通量测序得到与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体序列，通过软件DNAMNA对序列进行同源性分析，获得进化树分析图，挑选不同家族的序列作为候选序列；
2、利用氧化石墨烯(GO)荧光法对核酸适配体SEQ9进行表征
合成在5’端带6-羧基荧光素（FAM）标记的核酸适配体，基于氧化石墨烯荧光法（GO）对候选核酸适配体的亲和力进行检测，结果显示核酸适配体SEQ9的解离常数Kd=31.85±1.33，因此将核酸适配体SEQ9作为对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体；利用氧化石墨烯(GO)荧光法检测核酸适配体SEQ9的特异性，结果显示含有对羟基苄亚硫酸氢溶液的荧光值明显高于含有其他结构类似物的溶液荧光值，表明本发明核酸适配体SEQ9具有很高的特异性和亲和力；
3、核酸适配体SEQ9单链DNA二级结构表征
使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/q）对能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体SEQ9的单链DNA分子进行二级结构预测；其二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=-15.08，二级结构式如下，该结构具有较高的稳定性；
本发明具有的有益效果是：
1、本发明核酸适配体与对羟基苄亚硫酸氢具有高亲和力，同时具有高特异性，对硫磺熏蒸天麻中对羟基苄亚硫酸氢的结构类似物如天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等物质无亲和性；
2、本发明获得的具有特殊序列的核酸适配体能作为对羟基苄亚硫酸氢识别分子，应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫熏天麻的试剂盒中。
附图说明
图1为SELEX筛选过程中核酸适配体文库保留率结果示意图；
图2为20条序列同源性分析结果示意图；
图3为20条序列进化树分析结果示意图；
图4为核酸适配体SEQ9亲和力表征的非线性拟和结合曲线；
图5为核酸适配体SEQ9的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，使用材料均为常规市购材料或按常规方法配制的材料；为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文将对本申请的实施例进行详细说明。
实施例1：对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体的筛选和二级结构分析
1、采用磁珠-SELEX法筛选，将靶标对羟基苄亚硫酸氢固定在磁珠（DynabeadsMyOne Streptavidin C1磁珠）上，然后将靶标-磁珠复合物与寡核苷酸文库孵育，能与靶标结合的寡核苷酸会与靶标-磁珠复合物结合，生成寡核苷酸-靶标-磁珠复合物，最后通过磁力架的磁吸作用即可将寡核苷酸-靶标-磁珠复合物和未与靶标结合的寡核苷酸分开，经过多轮筛选获得对对羟基苄亚硫酸氢具有亲和力、特异性的ssDNA富集文库；
其中单链适配体文库、引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，76个碱基的随机ssDNA文库如下：
5’-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT-(N36)-TGACACATCCAGCAGCACGA-3’，其中N36代表36个随机核苷酸；
引物如下：
Lib 26 S1-FAM FAM-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT
Lib 26 A2-ployA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Spacer 18-TCGTGCTGCTGGATGTGTCA
DPBS 缓冲液：(pH 7.2~7.4) ：137mmol/L NaCl、 2.7mmol/LKCl、1.5mmol/LKH2PO4、8mmol/LNa2HPO4、1mmol/L CaCl2、0.5mmol/LMgCl2；
核酸适配体的筛选由上海生工生物工程股份有限公司完成，核酸适配体文库筛选共筛选8轮，从第三轮开始每轮都进行反筛，并用荧光定量PCR监测各项数据，各轮筛选条件如下:
结果显示第4-8轮筛选文库的正筛保留率高于反筛保留率（图1），SELEX筛选8轮后，得到对对羟基苄亚硫酸氢具有高亲和力、高特异性的ssDNA富集文库，经过Q-PCR验证次级文库的亲和力，结果表明文库富集良好；由上海生工生物工程股份有限公司对文库8进行高通量测序；使用DNAMNA软件对高通量测序获得的文库8富集频次在前20的序列进行对比分析，高通量测序获得的20条核酸适配体序列如下：
通过DNAMNA软件对序列1-20之间的同源性进行分析，结果见图2，结果显示获得的适配体富含GC序列；另外，通过序列的进化树分析（图3），根据它们的同源性和最低自由能（dG）将这些序列分成5个不同家族：L1（SEQ1、SEQ7、SEQ14、SEQ19、SEQ20），L2（SEQ2、SEQ9、SEQ5），L3（SEQ3、SEQ13、SEQ15、SEQ6、SEQ11），L4（SEQ8、SEQ16），L5（SEQ4、SEQ10、SEQ17、SEQ18）；
每个家族选择一条序列作为候选适配体，分别是SEQ1、SEQ9、SEQ13、SEQ16和SEQ17；
2、取适量浓度为100μmol/L 5’端荧光基团FAM修饰的核酸适配体SEQ1、SEQ9、SEQ13、SEQ16和SEQ17（上海生工生物工程股份有限公司合成）分别加入到200μL结合缓冲液（pH=7.2的Tris-HCl缓冲液）中配制成不同浓度的核酸适配体溶液（10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L），不同浓度的核酸适配体溶液在95℃沸水浴中预变性10min后，立即冰浴10min防止适配体复性，最后常温下放置10min，然后加入100μg/mL氧化石墨烯溶液200μL在室温条件下孵育2h，再将2μL对羟基苄亚硫酸氢（10μg/mL）加入到孵育后的混合液中，轻微震荡，室温反应2h后，以13000rpm/min离心10min，最后取200μL上清液用多功能酶标仪测定其荧光强度（发射波长520nm，激发波长485nm），以无菌水代替靶标对羟基苄亚硫酸氢作为阴性对照；通过Origin 2018软件对不同浓度适配体的相对荧光强度（△F）进行非线性拟和，获得非线性拟和结合曲线（图4），并计算解离常数（Kd值），其中相对荧光强度（△F）=试验组的荧光强度-阴性对照组的荧光强度；
结果显示：核酸适配体SEQ1、SEQ17两条适配体与阴性对照结果无明显差异，核酸适配体SEQ9的Kd= 31.85±1.33；SEQ13的Kd=26.75±6.48，SEQ16的Kd=32.12±2.91；本发明对核酸适配体SEQ9进一步分析，通过MFOLD软件在温度为26℃、Na+浓度为150mmol/L、Mg2+浓度为1mmol/L（http://mfold .rna .albany .edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）的条件下对核酸适配体SEQ9进行二级结构预测；结果表明该核酸适配体SEQ9是单链DNA，由76个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，其中SEQ9吉布斯自由能DG=-15.08，吉布斯自由能低、结构稳定。
实施例2：利用氧化石墨烯(GO)荧光法检测对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体SEQ9的特异性
本实验选取与对羟基苄亚硫酸氢结构相似的化合物对羟基苯甲醇、对羟基苯磺酸、天麻素、对羟基苯甲醛、巴利森苷A验证核酸适配体SEQ9对对羟基苄亚硫酸氢的特异性。
将适量100μmol/L FAM修饰的核酸适配体SEQ9加入到200μL结合缓冲液（pH=7.2的Tris-HCl缓冲液）中配置成终浓度为200nmol/L的核酸适配体溶液，在95℃沸水浴中预变性10min后立即冰浴10min，常温下放置10min；然后加入100μg/mL氧化石墨烯水溶液200μL在室温条件下孵育2h；将浓度10μg /mL的对羟基苄亚硫酸氢、对羟基苯甲醇、对羟基苯磺酸、天麻素、对羟基苯甲醛、巴利森苷A分别取2μL加入到孵育后的混合液中，轻微震荡，室温反应2h后，以13000 rpm/min离心10min；最后取200μL上清液用多功能酶标仪测其荧光强度（发射波长520nm，激发波长485nm），计算其相对荧光强度；结果见图5。从图中可以看出添加有对羟基苄亚硫酸氢（p-HS）的混合溶液的荧光值明显提高，结果表明核酸适配体SEQ9可以特异性结合对羟基苄亚硫酸氢。
本发明通过SELEX技术筛选出了能结合天麻硫熏标志物对羟基苄亚硫酸氢的核酸适配体SEQ9，通过氧化石墨烯（GO）荧光法证明了该核酸适配体SEQ9特异性结合对羟基苄亚硫酸氢。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gttcgtggtg tgctggatgt gccgcaaacg ggacatccta aggcatgctc gagcagtgac 60
acatccagca gcacga 76
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatcgtg ctgctggatg tgtca 45
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tcgtgctgct ggatgtgtca 20

Claims (2)

1.一种与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体在制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂或制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中的应用。
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