CN115877008A - 用于膀胱癌检测的光学分子成像探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物探针领域，具体涉及一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针及其制备方法和应用，该光学分子成像探针，为靶向膜蛋白单抗偶联荧光染料的荧光分子探针，所述探针的结构式中包括：包含细胞膜响应的膜蛋白单抗段和荧光染料段。本发明提供的光学分子成像探针，能够用于膀胱癌的肿瘤检测试剂，能够用于膀胱癌的癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测和成像，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。所以，本发明肿瘤检测试剂在肿瘤探测中，包括膀胱癌检测，具有非常大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物探针领域，具体涉及一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针及其制备方法和应用。
背景技术
目前，膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的肿瘤，发病率高，未经及时治疗预后差，早期诊断和治疗十分重要。膀胱癌中约70％为非肌层浸润性膀胱癌，其主要治疗方式为微创膀胱镜下经尿道前列腺切除术。但是，非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤病灶边缘常常与正常膀胱粘膜组织分辨不清，手术医师在肿瘤切除过程中难以把控切除的边缘范围，此外还有一些微小癌前病变的病灶在术中难以通过膀胱镜直接观察到，给疾病的诊治带来困难。因此，提高膀胱癌在术中的可视化是膀胱癌微创手术的重要命题。
随着荧光分子成像技术的高速发展，研发高效地用于膀胱癌术中成像的分子探针药物，提高膀胱癌在术中的成像能力，有利于手术医师及时在术中准确辨认肿瘤病灶边缘，明确手术切除范围，同时发现肉眼难以识别的微小癌前病变，这对于改善病人的治疗效果、延长术后生存周期以及生活质量十分重要。
近年来，一些新型的分子探针类药物的研发取得了一些的研究进展，但是许多分子探针类药物的适应症范围有限，且价格昂贵，临床应用存在一定距离。
发明内容
为了解决上述或者其他方面的至少一种技术问题，本发明的实施例提供了一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针及其制备方法，在正常组织中相对低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信噪比，精确显示癌灶边界。
本发明提供了一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，为靶向膜蛋白单抗偶联荧光染料的荧光分子探针，所述探针的结构式中包括：包含细胞膜响应的膜蛋白单抗段和荧光染料段。
进一步的，所述靶向膜蛋白单抗在膀胱癌细胞的细胞膜上表达。
进一步的，所述荧光染料段为吲哚菁绿荧光染料。
进一步的，所述探针的结构为：
本发明进一步提供了一种由上述光学分子成像探针制备得到的膀胱肿瘤成像试剂，用于癌灶边缘以及微小癌灶的检测。
进一步的，所述肿瘤包括恶性的以及癌前病变组织。
本发明进一步提供了一种上述膀胱肿瘤成像试剂在制备肿瘤在体检测或肿瘤组织体外病理染色的试剂或试剂盒中的应用。
本发明进一步提供了一种上述的光学分子成像探针的方法，包括：
S100:将含吲哚菁绿活化脂的二甲基亚砜溶液与含靶向膜蛋白单抗的缓冲液混合，得到反应液；
S200:将反应液用液相凝胶色谱进行纯化，得到所述光学分子成像探针。
进一步的，S100中吲哚菁绿活化脂与含靶向膜蛋白单抗的摩尔质量比为5:1至25:1。
进一步的，S100中需要采用避光反应。
从上述技术方案可以看出，本发明提供的用于膀胱癌检测的光学分子成像探针及其制备方法和应用具有以下有益效果：
(1)本发明提供的用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，能够用于膀胱癌的肿瘤检测试剂，能够用于膀胱癌的癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测和成像，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。所以，本发明肿瘤检测试剂在肿瘤探测中，包括膀胱癌检测，具有非常大的作用。
(2)本发明提供的用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，在膀胱癌的在体与离体检测过程中将会产生十分重要且显著的效果。本发明由于Nectin-4单抗具有高度的肿瘤特异性，其目标分子在正常组织中低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信噪背比，精确显示癌灶边界。成像转移灶及微小癌灶，直径≤2mm。且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明提供的光学分子成像探针的探针与ICG小分子的紫外吸收与荧光发射光谱；
图2为实施例3激光共聚焦显微镜观察mAbNectin-4-ICG探针对不同膀胱癌细胞系的靶向效果；
图3为实施例3中mAbNectin-4-ICG对小鼠新鲜离体肿瘤组织荧光成像结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
Nectin-4(Nectin cell adhersion molecule 4)是一种Ⅰ型膜蛋白，主要表达于细胞膜上。多项研究已证实Nectin-4在膀胱癌等多种肿瘤中，相对于正常组织均呈高表达状态。Nectin-4单抗是一种靶向Nectin-4的单克隆抗体，可与Nectin-4特异性结合。吲哚菁绿(ICG)是一种临床应用十分广泛的荧光染料，在发射波长840nm左右的近红外光激发下，可以产生增强荧光并应用与特定组织或器官的成像，作为成像介质已经在临床使用超过50年，具有很好的安全性和稳定性，在肝脏、肺脏等基本的诊断具有广泛的用途。
根据本发明总体上的发明构思，提供了一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，为靶向膜蛋白单抗(Nectin-4单抗)偶联荧光染料(ICG)的荧光分子探针(mAbNectin-4-ICG)，探针的结构式中包括：包含细胞膜响应的膜蛋白单抗段和荧光染料段。
发明人研发了一种新型的Nectin-4单抗偶联ICG探针检测试剂，经发明人研究发现，检测试剂在膀胱癌的检测过程中将会产生十分重要且显著的效果。
本发明提供的用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，能够用于膀胱癌的肿瘤检测试剂，能够用于膀胱癌的癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测和成像，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。所以，本发明肿瘤检测试剂在肿瘤探测中，包括膀胱癌检测，具有非常大的作用。
本发明提供的用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，在膀胱癌的在体与离体检测过程中将会产生十分重要且显著的效果。本发明由于Nectin-4单抗具有高度的肿瘤特异性，其目标分子在正常组织中低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信噪背比，精确显示癌灶边界。成像转移灶及微小癌灶，直径≤2mm。且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。
进一步的，靶向膜蛋白单抗在膀胱癌细胞的细胞膜上表达。
进一步的，荧光染料段为吲哚菁绿荧光染料。
进一步的，探针的结构为：
本发明进一步提供了一种由上述光学分子成像探针制备得到的膀胱肿瘤成像试剂，用于癌灶边缘以及微小癌灶的检测。
本发明提供的光学分子成像探针，在膀胱癌的在体与离体检测过程中将会产生十分重要且显著的效果。本发明由于Nectin-4单抗具有高度的肿瘤特异性，其目标分子在正常组织中低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信噪背比，精确显示癌灶边界。成像转移灶及微小癌灶，直径≤2mm。且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。
进一步的，肿瘤包括恶性的以及癌前病变组织。
本发明进一步提供了一种上述膀胱肿瘤成像试剂在制备肿瘤在体检测或肿瘤组织体外病理染色的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供的光学分子成像探针，能够用于膀胱癌的肿瘤检测试剂，能够用于膀胱癌的癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测和成像，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。所以，本发明肿瘤检测试剂在肿瘤探测中，包括膀胱癌检测，具有非常大的作用。
本发明进一步提供了一种上述的光学分子成像探针的方法，包括：
S100:将含吲哚菁绿活化脂的二甲基亚砜溶液与含靶向膜蛋白单抗的缓冲液混合，得到反应液；
S200:将反应液用液相凝胶色谱进行纯化，得到光学分子成像探针，其具体反应路线如下式所示：
进一步的，S100中
吲哚菁绿活化脂与含靶向膜蛋白单抗的摩尔质量比为5:1至25:1。
进一步的，吲哚菁绿活化脂与含靶向膜蛋白单抗的摩尔质量比可以为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1等比例，可以根据需求进行选择，其中优选的范围为10:1至15:1。
进一步的，S100中需要采用避光反应。
进一步的，S100具体为：将含ICG-NHS(150nmol)的DMSO溶液100μL，与含mAbNectin-4(10nmol)的PBS(1×)溶液混合，避光下温和震荡3h。
以下通过较佳实施例来对本发明的技术方案作详细说明，需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。
需要指出的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规商业途径获得。
下述实施例中的肿瘤细胞系T24、5637、MB49以及正常细胞系SV-HUC-1的出处如下：
T24、5637、SV-HUC-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
MB49购自通派(上海)生物科技有限公司。
下述实施例中的动物出处如下：
Balb/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
下述实施例中的主要仪器及耗材的来源如下：
12-well白色底透细胞培养板(Costar产品，产品编号为No.3513)；
Fetal Bovine Serum(Gibco产品，产品编号为10099141)；
100mm培养皿(Corning产品，产品编号为430167)；
Ham's F-12K medium(Gibco产品，产品编号为121127030)；
RPMI-1640medium(Gibco产品，产品编号为1049101)；
DMSO(Sigma产品，产品编号为No.D4540)；
激光共聚焦显微镜(Leica产品，产品型号DMI3000B，German)；
高检测灵敏度的光学成像系统(PerkinElmer产品，产品型号IVIS Spectrum，USA)。
实施例1：mAbNectin-4-ICG探针的制备
(1)按照本发明提供的制备方法mAbNectin-4-ICG探针：
将含ICG-NHS(150nmol)的DMSO溶液100μL，与含mAbNectin-4(10nmol)的PBS(1×)溶液混合，避光下温和震荡3h。随后将反应液用SE-HPLC进行纯化，除去聚合物及未反应的染料，得到mAbNectin-4-ICG探针。
(2)mAbNectin-4-ICG探针的表征
图1为本发明提供的光学分子成像探针的探针与ICG小分子的紫外吸收与荧光发射光谱。
如图1所示，可以看出纯化后Nectin-4单抗偶联ICG探针与ICG荧光分子的紫外吸收与荧光发射光谱，可知确实得到了本发明提供的mAbNectin-4-ICG探针。
实施例2：细胞培养和空无模型的创建
(1)细胞样品的培养
配制各细胞所需的完全培养基
具体地，基本培养基Ham's F-12K或1640占80～90％，胎牛血清占10～20％，按1％的体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使用青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/mL和100μg/mL。
实验开始前，确认标记在100mm培养皿上的细胞系的名字、培养基以及传代时间、代次等信息，确保实验无误。
利用无菌吸管吸取细胞培养基。
用3～5mL的无菌PBS溶液润洗细胞表层，再用无菌吸管吸出PBS废液。
向培养基中加入1mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化细胞，轻轻混匀，使溶液覆盖住细胞表层，在显微镜下观察，等细胞完全脱离培养皿底部且细胞连接较松散时加入5～10mL完全培养基并进行吹打。
将细胞分离成单个后，将此细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，800rpm离心5min。
利用无菌吸管吸出上清培养基，并加入5mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。
用细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞悬液的浓度并接种到12孔培养板中进行铺板实验，细胞密度为2×105个细胞/孔，培养过夜，使细胞充分贴壁，得到可以用于mAbNectin-4-ICG探针检测的细胞样品。
(2)膀胱原位小鼠模型的建立
取MB49肿瘤细胞，800rpm离心5min，再用无菌PBS洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，用血球计数板进行计数制成浓度为5×105个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠膀胱内接种肿瘤细胞悬液50μL。
接种完成后，逐日观察接种部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，用luc荧光成像观察小鼠膀胱体内肿瘤形成情况，当荧光强度达到108Epi-fluorescence认为模型成熟。
实施例3：mAbNectin-4-ICG探针的靶向性和精确性检测
(1)激光共聚焦显微镜观察细胞mAbNectin-4-ICG探针的靶向性和精确性。
图2为实施例3激光共聚焦显微镜观察mAbNectin-4-ICG探针对不同膀胱癌细胞系的靶向效果。
利用无菌吸管将培养板中的培养基吸除。
加入IR820标记的小分子抑制剂到12孔培养板中，放入37℃培养箱中继续培养4h。
利用无菌吸管吸出培养基废液，并加入1～2mL无菌PBS/孔清洗细胞表层2～3次，再用无菌吸管吸出PBS废液。
将细胞置于激光共聚焦显微镜中进行观察。
图2为激光共聚焦显微镜观察不同肿瘤细胞系对探针的摄取情况的结果，该结果提示，在体外情况下，Nectin-4单抗偶联ICG探针对肿瘤细胞具有良好的靶向性和精确性。
(2)动物模型中靶向性验证
图3为实施例3中mAbNectin-4-ICG对小鼠新鲜离体肿瘤组织荧光成像结果。
动物模型成熟以后，处理小鼠取出新鲜膀胱癌瘤体组织，PBS冲洗肿瘤组织3次，讲肿瘤组织浸泡在1mL 0.1mg/mL的Nectin-4单抗偶联ICG探针溶液10min，PBS冲洗肿瘤组织3次，用高检测灵敏度的光学成像系统分析仪检测肿瘤的成像信号。
图3为使用Nectin-4单抗偶联ICG探针溶液后，小鼠新鲜肿瘤组织的荧光图像的结果。如图3所示，在体内新鲜肿瘤组织样本的情况下，Nectin-4单抗偶联ICG探针对肿瘤细胞具有良好的靶向性和精确性。
综上所述，本发明中的探针复合物无论是在细胞水平还是动物水平都体现了很好的靶向性，解决了肿瘤特异性成像问题，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。
本发明提供的光学分子成像探针，能够用于膀胱癌的肿瘤检测试剂，能够用于膀胱癌的癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测和成像，而且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。所以，本发明肿瘤检测试剂在肿瘤探测中，包括膀胱癌检测，具有非常大的作用。
本发明提供的光学分子成像探针，在膀胱癌的在体与离体检测过程中将会产生十分重要且显著的效果。本发明由于Nectin-4单抗具有高度的肿瘤特异性，其目标分子在正常组织中低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信噪背比，精确显示癌灶边界。成像转移灶及微小癌灶，直径≤2mm。且无毒副作用，安全可靠，制备工艺简单。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于膀胱癌检测的光学分子成像探针，为靶向膜蛋白单抗偶联荧光染料的荧光分子探针，所述探针的结构式中包括：包含细胞膜响应的膜蛋白单抗段和荧光染料段。
2.根据权利要求1所述的光学分子成像探针，所述靶向膜蛋白单抗在膀胱癌细胞的细胞膜上表达。
3.根据权利要求1所述的光学分子成像探针，所述荧光染料段为吲哚菁绿荧光染料。
4.根据权利要求1所述的光学分子成像探针，所述探针的结构为：
5.一种由权利要求1-4任一所述的光学分子成像探针制备得到的膀胱肿瘤成像试剂，用于癌灶边缘以及微小癌灶的检测。
6.一种权利要求5所述的膀胱肿瘤成像试剂，所述肿瘤包括恶性的以及癌前病变组织。
7.一种权利要求5-6任一所述的膀胱肿瘤成像试剂在制备肿瘤在体检测或肿瘤组织体外病理染色的试剂或试剂盒中的应用。
8.一种制备权利要求1-4任一所述的光学分子成像探针的方法，包括：
S100:将含吲哚菁绿活化脂的二甲基亚砜溶液与含靶向膜蛋白单抗的缓冲液混合，得到反应液；
S200:将反应液用液相凝胶色谱进行纯化，得到所述用于膀胱癌检测的光学分子成像探针。
9.根据权利要求8所述的光学分子成像探针的制备方法，S100中吲哚菁绿活化脂与含靶向膜蛋白单抗的摩尔质量比为5:1至25:1。
10.根据权利要求8所述的光学分子成像探针的制备方法，S100中需要采用避光反应。
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