CN101392285A - 多发性骨髓瘤的检测方法及抑制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通过对多发性骨髓瘤等癌症中表现出特征性表现的基因进行鉴定来提供一种癌症检测方法和细胞增殖抑制剂。本发明提供一种癌症检测方法，该方法包括以检体中第11号染色体q23区域的基因扩增为指标来对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。

Description

多发性骨髓瘤的检测方法及抑制方法
技术领域
本发明涉及一种以通过观察多发性骨髓瘤的基因型来早期诊断多发性骨髓瘤为目的、通过检测人11号染色体q23.1区域的基因组扩增而检测癌症的方法。而且，本发明还涉及一种基于对POU结构域第2类相关因子1(POU domain，class 2，associating factor 1(POU2AF1))基因与多发性骨髓瘤的关系的认识来抑制肿瘤增殖的方法。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)起因于来源于B细胞的浆细胞的异常增殖，据报道，其开始治疗以后的平均生存期约为3年，5年生存率为10％左右，10年以上的生存率为约3-5％左右，是一种长期预后不良的疾病。关于多发性骨髓瘤的详细情况记载于非专利文献1中。关于癌基因与该疾病的关系，很早即已报道与c-myc、Bcl-1/2有关；而且也有报道认为与N-ras、K-ras的点突变、IgH基因群的多个基因转座异常等有关。但是，骨髓瘤特异的基因异常尚不清楚。根据在此之前的研究，一般认为，在细胞分化、增殖的过程中，连锁引发了基因的变化，并最终造成肿瘤化。从这点看来，到底是哪些基因的变化引发了多发性骨髓瘤目前还不清楚，所以关于多发性骨髓瘤的检测方法以及其分型(typing)方法，目前还不存在一种利用基因进行的检测方法。
非专利文献1：Bhawna Sirohi，et al.，Lancet，363，875-87，2004.
发明内容
发明所要解决的技术问题
如果能在基因水平上阐明多发性骨髓瘤的机理，在基因水平上就可以做到多发性骨髓瘤的肿瘤化过程的早期发现并可以进行其恶性程度的诊断，进一步，根据该机理，也可以筛选、开发药剂以及确立治疗方法。具体来说，通过鉴定出显示多发性骨髓瘤的特征性表现的基因，并以该基因为中心进行技术上的研究，即可以解决该课题。即，本发明通过鉴定显示多发性骨髓瘤等癌症的特征性表现的基因，以提供一种癌症检测方法和细胞增殖抑制剂为本发明所要解决的课题。
解决课题的技术手段
以DNA微阵列(DNA microarray)为对象进行的比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization(CGH))、也即阵列CGH法是一种用于解析随着基因组DNA中的多个基因的扩增以及缺失所致的基因异常的一种简便、迅速、优良的方法。因此，为了解析与肿瘤化以及肿瘤恶化有关的基因组上的基因异常，通过筛选CGH阵列上载有的800种BAC/PAC DNA(Takada H.，et al.，Cancer Sci.96，100-105，2005)，成功鉴定了促进多发性骨髓瘤的肿瘤化的癌症基因，即POU2AF1基因。然后，又成功地发现，POU2AF1基因的扩增，即POU2AF1蛋白质的增加能够显著促进多发性骨髓瘤细胞的增殖，而且，当抑制POU2AF1基因的转录产物时，多发性骨髓瘤细胞的增殖显著降低，由此完成了本发明。
即，根据本发明，提供一种癌检测方法，其包括：以检体中第11号染色体q23区域的基因的扩增为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
优选的是，所述基因是RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中的任意一个。
优选的是，所述扩增指标是指：同正常检体相比，为1.32倍以上。
优选的是，所述检体是多发性骨髓瘤的检体。
优选的是，癌为多发性骨髓瘤。
优选的是，提供一种多发性骨髓的检测方法，包括：在多发性骨髓瘤的检体中，以POU2AF1基因的扩增为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
优选的是，基因扩增可以采用DNA芯片法、Southern印迹法、Northern印迹法、PCR法、实时RT-PCR法、FISH法、CGH法、基因扩增法、RFLP检测法、核苷酸测序法以及阵列CGH法中的任意一种方法来检测。
根据本发明的另外一个方面，提供一种癌检测方法，其包括：在检体中，以RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中的任意一个基因的表达增强为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
根据本发明的另外一个方面，提供一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因从体外导入到肿瘤细胞中。
根据本发明的另外一个方面，提供一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质在体外导入到肿瘤细胞中。
根据本发明的另外一个方面，提供一种细胞增殖抑制剂，其包含从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。
根据本发明的另外一个方面，提供一种细胞增殖抑制剂，其包含从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质。
根据本发明的另外一个方面，提供一种激活细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因在体外导入到该细胞中。
根据本发明的另外一个方面，提供一种细胞增殖的激活剂，其包括从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中所选择的基因。
发明效果
根据本发明，可以切实地掌握多发性骨髓瘤细胞检体中的肿瘤分类、肿瘤化的症候以及肿瘤的恢复程度。而且，通过抑制多发性骨髓瘤细胞中扩增的POU2AF1基因的转录产物，可以抑制该多发性骨髓瘤细胞的增殖。即，根据本发明，新提供了一种抗肿瘤药物，其对显现出肿瘤化功能的POU2AF1基因的转录具有抑制作用或含有功能缺失型的由该基因编码的POU2AF1蛋白质。无论是从根据肿瘤性质的不同而采取不同的治疗方法、或者从肿瘤的预后改善等临床角度考虑，还是从肿瘤的基础研究角度考虑，这些药物都是非常有用的。而且，通过测定POU2AF1基因的信使RNA的表达量、或者通过确认基因组DNA中的该基因的量，或者通过测定POU2AF1蛋白质的量，可以对多发性骨髓瘤患者的肿瘤进行遗传学的分类。
附图说明
图1表示使用由28种多发性骨髓瘤细胞制备的基因组DNA、采用MGC Cancer Array-800型CGH阵列进行分析的CGH阵列分析结果。作为对照，使用的是来源于正常人淋巴细胞株的基因组DNA；在扩增或缺失的染色体区域，相对于全部细胞种类(28种)的频率以在纵轴上的扩增(绿色)、缺失(红色)、在横轴上的UCSC作图位置(http://genome.ucsc.edu/[version May，2004])作为参照的染色体位置的形式被示出。
图2表示在用CGH阵列法确定的11q23区域的染色体区域中，采用RP11-792p2的BAC克隆对AMO1和MOLP-2细胞进行FISH分析的分析结果。箭头表示在原本染色体位置上的FISH信号，楔形表示多拷贝的强扩增信号，显示发生了基因扩增。
图3表示采用11q23区域的15种BAC克隆进行AMO1和MOLP-2细胞的FISH分析，由其荧光信号强度计算对应的基因组DNA区域的拷贝数并做图(左图)。纵轴表示在11q23区域的BAC克隆ID与它们的相对位置。两种细胞的平均染色亮度最高的区域(均质染色区，homogenously staining regions，HSRs)几乎一致，这两个区域均被定位于RP11-25I9与708L7之间约3Mb(megabase)的位置上。右图表示对存在于已定位的11q23区域的AMO1、RDX、ARHGAP20、POU2AF1、SNF1LK2、PPP2R1B、ALG9基因(mRNA)进行以简易定量为目的的PCR反应，然后进行3％琼脂糖凝胶电泳的结果。最下方表示作为表达量对照的GAPDH的结果。所采用的细胞株为在11q23区域有扩增的AMO1、MOLP-2，还有在该区域没有观察到扩增的KMM1、KM-5以及作为对照的来源于正常人的LCL(淋巴细胞克隆)。
图4表示用Western印迹法对8种多发性骨髓瘤细胞株的POU2AF1蛋白质的表达量进行定量。上部分表示作为蛋白质量检测对照的β-肌动蛋白的Western印迹结果。图中，在POU2AF1中观察到的2条带表示同功异构体P34和p35。图的下半部分示出了由FISH测定的POU2AF1基因在基因组DNA上的拷贝数。
图5中A表示将2种POU2AF1的siRNA—POU2AF1-A和POU2AF1-B导入到AMO1和KMS-21BM细胞后的Western印迹法分析结果。下半部分表示作为蛋白质量检测对照的β-肌动蛋白的Western印迹结果。B、C表示在1×104个AMO1和KMS-21BM细胞中导入POU2AF1的siRNA以后、将细胞接种于96孔板中、用WST分析按照一定时间测定活细胞数的结果。试验平行3份，重复进行两次，星号表示在非配对t检验(Unpaired Student′s t test)中有显著性差异(p<0.05)。
图6A表示将全长POU2AF1基因(p34)的N末端结合Myc，构建用于表达的表达载体(pCMV-Tag3-p34-POU2AF1)，将其导入原本内源性POU2AF1基因表达很低的KMS-11细胞中，进行药剂筛选3周，用细胞裂解液、经Western印迹法和抗Myc抗体检测是否有POU2AF1蛋白质表达的结果。阴性对照采用在KMS-11细胞中导入无外源基因的pCMV-3B的细胞，将其作为空白对照(Mock)。B表示将上述转化细胞在玻璃板上培养、用抗Myc多克隆抗体、Alexa488标记的羊抗兔抗体(Molecular Probes公司生产)进行染色、然后用荧光显微镜进行观察的结果。同时，左边表示用DAPI进行核染色的结果。将两者的色调重叠后表示为“叠加”。下方表示的是空白对照的结果。C表示的是用WST分析活细胞数的形式检测了空白对照和表达POU2AF1基因的两种细胞的细胞增殖速度的结果。
图7表示对2×106个AMO1和KMS-21BM细胞株的细胞，将POU2AF1-A和POU2AF1-B的各个siRNA(对KMS-21BM细胞仅用POU2AF1-B)进行基因导入。48小时以后，用实时RT-PCR分析TNFRSF17基因的表达的结果。将作为阴性对照的在随机序列的siRNA存在下的TNFRSF17基因的表达设定为100，表达的相对量以数值来表示。B表示对由外部基因导入而建立的表达POU2AF1基因的KMS-11细胞株与空白对照细胞同时采用实时RT-PCR对其进行TNFRSF17基因表达的比较分析的结果。在空白对照细胞中TNFRSF17基因的表达设定为100，表示相对的表达量。C表示利用数据库对基因组DNA上的人TNFRSF17基因的5′区域搜索转录因子结合部位，从而发现从转录起始点(+1)上游3642位碱基开始存在有促进POU2AF1转录的八核苷酸序列(下文称为“octamer”)位点。箭头表示在以后的试验中使用的检出上述octamer位点的PCR引物。D表示对AMO1和KMS-11细胞(空白对照、表达POU2AF1基因的细胞)的染色质来说，对使用抗POU2AF1蛋白质的抗体的免疫沉淀物进行PCR验证以检测其是否含有octamer位点。PCR引物如图7C的箭头所示使用了夹有octamer位点的引物，用抗POU2AF1抗体将各细胞裂解液免疫沉淀以后，将免疫沉淀物的1/100作为PCR反应的模板。图中“Input”为免疫沉淀前的染色质材料，(-)表示没有免疫沉淀抗体状态下的阴性对照。箭头表示检测出的octamer位点。
图8表示将包含TNFRSF17基因上游的octamer位点的DNA区域的荧光素酶启动子-报告基因载体与POU2AF1的异构型p34或p35表达载体同时导入KMS-11细胞中、测定的发光结果，其中所述TNFRSF17基因上游的octamer位点的DNA区域含有野生型(wt)和突变型(Mut)的octamer位点。将TNFRSF17-wt octamer设定为1，显示相对的荧光素酶活性。
图9表示用定量PCR法测定多发性骨髓瘤细胞以及由多发性骨髓瘤临床检体建立的初级细胞中的POU2AF1、TNFRSF17的基因表达。用相对于β-肌动蛋白以及β2-微球蛋白(β2M)的比值来表示(A为细胞株；B为初级细胞)。相关系数和P值如各图右上所示。
图10中的A、B表示采用AMO1细胞与KMS-21BM细胞，首先以非特异性序列构成的siRNA作为对照，将POU2AF1基因、TNFRSF17基因的siRNA进行基因导入，以β-肌动蛋白为指标，用定量PCR测定POU2AF1基因、TNFRSF17基因的表达，对照为100，显示相对表达值(A为POU2AF1；B为TNFRSF17)。C表示用WST法检测AMO1细胞与KMS-21BM细胞中由TNFRSF17基因的siRNA所导致的抑制后(0、2、4、6日后)的活细胞数。星号表示在非配对t检验中与对照相比有显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面，针对本发明进一步详细说明。
(1)癌症检测方法
本发明的癌症检测方法的特征是：以检体中第11号染色体q23区域的基因扩增为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
根据在此之前的研究，人POU2AF1基因(别名也称为OBF-1(OCT结合因子1，OCT binding factor 1)、BOB-1(B细胞特异性共活化剂-1，B-cell-specific coactivator OBF-1)、OCA-B等)的转录产物已经为人所知，是存在于染色体11q23.1上的基因(Junker，S.et al.，Genomics33：143-145，1996)。人POU2AF1基因的碱基序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库的编号是NM-006235号。且人POU2AF1蛋白质的氨基酸序列在同一数据库中被登记为NP-006226号。人POU2AF1基因的碱基序列如序列编号1(SEQ ID NO：1)所示。POU2AF1蛋白质由SEQ ID NO：1的碱基序列的第524位至第1294位区域的碱基编码构成，其氨基酸序列如序列编号2(SEQ ID NO：2)所示。
在本说明书中，所谓“POU2AF1基因”是指由上述碱基序列所定义的来源于人的基因；所谓“POU2AF1蛋白质”是指由该POU2AF1基因编码构成的、由上述氨基酸序列所定义的蛋白质。人POU2AF1基因编码构成的蛋白质具有POU结构域(POU结构域蛋白质在其序列中具有被称为POU特异性结构域和POU同源结构域的共同的DNA结合序列，用作转录调节因子)，已知与转录因子OCT1或者OCT2结合后会增强其活性。但是，还不知道该人POU2AF1基因是一种与人多发性骨髓瘤的发病有关的重要的癌基因。
同样，存在于第11号染色体q23区的基因已知有RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因。在NCBI的数据库中，各基因的Ref Seq ID分别被登记为：RDX(radixin)为NM-002906；FDX1(ferredoxin1，核基因编码的腺粒体蛋白质(nuclear gene encoding mitochondrial protein))为NM-004109；ARHGAP20(Rho GTPase激活蛋白20)为NM-020809；LAYN(layilin)为NM-178834；SNF1LK2(SNF1-样激酶2)为NM-015191；PPP2R1B存在2种剪切变型体(蛋白磷酸化酶2(proteinphosphatase2)(以前为2A)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))、调节亚单元A(regulatory subunit A)(PR65)、β同功型(βisoform)(PPP2R1B)、转录变体1，或者，蛋白磷酸化酶2(protein phosphatase2)(以前为2A)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))、调节亚单元A(regulatory subunit A)(PR 65)、β同功型(βisoform)(PPP2R1B)、转录变体2)，分别为NM-002716或NM-181699；ALG9(天门冬氨酸连接的糖基化9同系物，asparagine-linked glycosylation 9 homolog(α-1，2-甘露糖转移酶，S.cerevisiae，alpha-1，2-mannosyltransferase))为NM-024740。
如上所述，作为本发明的癌症检测方法的一个示例，可以列举在多发性骨髓瘤细胞中以检测人POU2AF1基因扩增为特征的一种方法。作为人POU2AF1基因扩增的检测对象的多发性骨髓瘤细胞，最合适的是检体提供者的活检细胞。该检体细胞不拘是正常人的骨髓细胞、血液细胞还是多发性骨髓瘤患者的肿瘤细胞，在实际中主要是以下述细胞为对象：经检查结果怀疑认为骨髓有肿瘤化征兆的该病变细胞，或者，已经确定为多发性骨髓瘤而需要判定其进展程度或恢复程度的多发性骨髓瘤细胞等。
当由本发明的检测方法而认为在“据检查结果怀疑有骨髓肿瘤化病变部位时的病变细胞”中，发现人POU2AF1扩增时，其表示该病变细胞正在向肿瘤化发展或已经处于肿瘤化状态、而且恶性程度在持续增高，需要立即进行实质治疗(实质的化学疗法等)。而认为在“虽然已经确定为多发性骨髓瘤，但是需要判定其类型的多发性骨髓瘤细胞”中，发现人POU2AF1扩增时，其表示需要进行该肿瘤细胞的分类、进行适当的实质治疗(实质的化学疗法等)。可对作为检体而采集的多发性骨髓瘤细胞进行必要的处理，例如对采集的细胞进行调节其DNA或RNA，作为进行本检测方法的对象。
本发明中，如上所述，可以通过检测多发性骨髓瘤细胞中的人POU2AF1基因的扩增，对该细胞的肿瘤化进行检测和/或分类。
本发明中，以检体中第11号染色体q23区域的基因的扩增为指标来对检体的肿瘤化进行检测和/或分类。对需进行所述检测和/或分类的癌的种类不做特别限定，只要其第11号染色体q23区域的基因显示扩增即可。例如为恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、输尿管肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝癌、胰腺癌、睾丸肿瘤、上颌癌、舌癌、唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、皮肤多发性出血性肉瘤、血管瘤、白血病、真性多血症、神经胚细胞瘤、视网膜胚细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附件癌、皮肤转移癌、皮肤黑色素瘤等等，但并不仅仅限于这些。上述中特别优选的作为适用对象的癌是骨髓癌。
本发明方法中，作为扩增的指标而使用的11号染色体q23区域的基因，例如可以列举为RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因和ALG9基因。在本发明的方法中，同正常检体比较，上述基因的扩增量为大于等于1.32倍、优选为大于等于1.5倍、更优选为大于等于2倍、更优选为大于等于3倍、再进一步优选为大于等于4倍、特别优选为大于等于5倍时，可以判断为其显示肿瘤化。
可以直接进行所述人POU2AF1基因等的11号染色体q23区域的基因的扩增检测的代表性的方法可以列举CGH(comparative genomichybridization，比较基因组杂交)法、FISH(Fluorescence In SituHybridization，荧光原位杂交)法。这些形式的本发明的检测方法可以对具有人POU2AF1基因的BAC(Bacterial Artificial Chromosome，细菌人工染色体)DNA、YAC(Yeast Artificial Chromosome，酵母人工染色体)DNA或PAC(Phage Artificial Chromosome，噬菌体人工染色体)DNA(下面也称为BAC DNA等)进行标记后，进行FISH时，即可以检测到人POU2AF1基因的扩增部分。具体来说，含有人POU2AF1基因的BAC DNA可以列举RP11-262A12、RP11-686G14、RP11-792P2等。
采用基因组DNA被固定在其上的基质来进行上述方法是合适的，而且是现实的。
对于批量制造其中基因组DNA被固定于其上的基质并将该基质投入实际应用来说，由于通常所得到的BAC DNA的量很少，所以就需要将该DNA作为基因扩增产物而获得(该基因扩增过程也称为“无穷化”)。在该无穷化过程中，首先将BAC DNA等用识别4碱基的酶例如RsaI、DpnI、HaeIII等消化以后，加入接头进行连接。接头为10-30个碱基、特别合适的是15-25个碱基组成的寡核苷酸，具有2条互补序列的链，经退火以后，形成平末端的3′-末端的寡核苷酸需要磷酸化。接下来，采用与所述接头的寡核苷酸具有相同序列的引物，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)法进行扩增，即可以实现无穷化。另一方面，可以将各BAC DNA等中的特征性的50-70个碱基的氨基化寡核苷酸作为检测用探针。
这样，通过将无穷化的BAC DNA等固定于基质上、特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的DNA固定化基质。所述固体基质优选为玻璃板。玻璃等固体基质更优选通过聚-L-赖氨酸、氨基硅烷、金·铝等的沉积将该基质进行包被。
点接于基质上的上述无穷化的DNA的浓度优选为10pg/μl～5μg/μl。更优选为1ng/μl～200ng/μl。点接量优选为1nl～1μl，更优选为10nl～100nl。对固定于基质上的各个样点的大小和形状不作特别限定，例如，大小可以为直径0.01～1mm，从上面看的形状可以为圆形～椭圆形。对干燥样点的厚度也不作特别限定，为1～100μm。进一步，对样点的个数不作特别限定，一般每个基质具有10～50,000个样点，更优选为100～5,000个样点。虽然各个DNA的点接次数在一次至四次的范围内，但优选两次重复或三次重复点接。
干燥点的制备可以通过采用点样仪将无穷化的BAC DNA等滴接于基质上，形成多个点以后，将点干燥而制得。点样仪可以使用喷墨式打印机、针式阵列打印机、双喷射式(注册商标)打印机，优选使用喷墨式打印机。例如，可以使用Geneshot(日本名古屋市的ガイシ株式会社生产)等。
这样，通过将无穷化的BAC DNA等固定于基质上，特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的DNA固定化基质。
另外，作为直接检测人POU2AF1基因扩增的手段之一，可以列举Sorthern印迹法。Sorthern印迹法是将从试样得到的基因组DNA分离、固定，通过检测该基因组DNA与人POU2AF1基因的杂交来检测试样中该基因存在的方法。而且，作为直接检测人POU2AF1基因扩增的手段之一，也可以使用PCR法。由被检检体中分离基因组DNA，用可以全部或局部扩增该基因的引物进行扩增以后，通过定量手段即可以进行检测。
而且，还可以通过Northern印迹法、实时RT-PCR法进行人POU2AF1基因的扩增检测。Northern印迹是一种将由检体中获得的mRNA分离、固定，通过检测该mRNA与人POU2AF1基因的杂交、从而检测该检体中该基因的mRNA存在的一种方法。实时RT-PCR法是通过逆转录反应和聚合酶链式反应进行目标基因扩增、并实时测定的一种方法，根据扩增倍率即可以对作为模板的mRNA进行定量。该定量可以采用荧光色素来进行，有两种方法。即：采用在双链DNA中特异性插入(intercalate)发出荧光的色素(例如，SYBR绿)的方法和采用在扩增的DNA序列中的特异性寡核苷酸上结合有荧光色素的探针的方法。
在本发明方法中，还可以在检体中以RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因的任意一个基因的表达增强为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类，从而检测癌症。
例如，在本发明中，采用针对POU2AF1蛋白质的抗体或抗体片断来分析检测检体中的POU2AF1蛋白质的量，以POU2AF1基因的表达增强为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类，从而检测癌症。对于POU2AF1基因以外的其它基因表达，也可以采用针对该基因编码的蛋白质的抗体或抗体片断来进行同样的分析。下面，以POU2AF1基因的表达增强为指标时的情况为例进行说明。
本方法中所使用的针对POU2AF1蛋白质的抗体(下面称为POU2AF1抗体)可以以POU2AF1蛋白质的全部或一部分作为抗原、按通常的方法制备而成。所谓“POU2AF1蛋白质的一部分”是指由序列编号2(SEQ ID NO：2)中所示POU2AF1蛋白质的氨基酸序列中的例如至少6个连续氨基酸、优选至少约8～10个氨基酸、进一步更优选至少约11～20个氨基酸所组成的多肽。作为抗原的POU2AF1蛋白质的全部或一部分的制备方法可以是生物学方法或化学合成方法中任意一种。
例如，可以通过将上述抗原多次接种于小鼠、豚鼠、兔等动物的皮下、肌肉内、腹腔内、静脉内等，充分免疫以后，从该动物采血、分离血清，制备多克隆抗体。例如，可以通过将采用上述抗原免疫后的小鼠脾细胞与市售的小鼠骨髓瘤细胞通过细胞融合制得杂交瘤以后，从该杂交瘤的培养液上清液中或给予该杂交瘤的小鼠的腹水中制得单克隆抗体。
通过采用按上述方法制得的POU2AF1蛋白质抗体或其片断，可以分析受试检体中POU2AF1蛋白质的表达量。测定时，可以使用免疫印迹法、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光抗体法、免疫细胞染色等等免疫学方法、或者Western印迹法等等。这里，所谓“POU2AF1蛋白质抗体的片段”是指该抗体的单链抗体片段(scFV)等。受试检体可以采用疑似肿瘤的骨髓检体、组织切片、血液、淋巴液、咳痰、肺清洗液、尿液、粪便、组织培养上清液等等。
(2)抑制细胞增殖的方法以及细胞增殖抑制剂
根据本发明，提供一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。并且，本发明提供一种细胞增殖抑制剂，其包括上述siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。进一步，根据本发明，提供一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质在体外导入到肿瘤细胞中；而且，提供一种包含上述功能缺失型蛋白质的细胞增殖抑制剂。
siRNA为约20个碱基(例如为约21～23个碱基)或者不足20个碱基长度的双链RNA。通过在细胞中表达这种siRNA，即可以抑制作为该siRNA的靶标的基因(在本发明中是RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因)的表达。
只要能够引发RNAi，本发明中所使用的siRNA可以是任何形式。这里，所谓“siRNA”是“短干扰RNA(short interfering RNA)”的简称，或者是人工化学合成的，或者是生物化学方法合成的，或者是在生物体内合成的，或者是40个碱基以上的双链RNA在体内分解为10个碱基对以上的短双链RNA。通常，其具有5′-磷酸、3′-OH的结构，3′末端有约2个突出的碱基。该siRNA与特异性蛋白质结合，形成RISC(RNA-induced-silencing-complex，RNA诱导的沉默复合物)。该复合物能够识别与该siRNA具有相同序列的mRNA并与之结合，发挥RNaseIII样的酶活性，在siRNA的中央部将mRNA切断。
优选的是，siRNA的序列与作为被切割靶标的mRNA的序列100％一致，但是，在siRNA的中央位置以外的碱基不一致的情形下，多数情况下RNAi的切断活性还会部分残留，所以也可不必100％一致。
优选的是，siRNA的碱基序列与表达应该被抑制的RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因的碱基序列之间具有相同性的区域不包含该基因的翻译起始区。原因在于：由于预想到在翻译起始区中siRNA会与各种转录因子、翻译因子结合，从而在效果上就会不能与mRNA结合，可以预测其效果会降低。因此，具有相同性的序列，优选为距离该基因翻译起始区20个碱基，更优选为距离该基因翻译起始区70个碱基。具有相同性的序列例如可以是该基因3′末端附近的序列。
根据本发明的另外一种实施形式，作为通过RNAi抑制目标基因表达的因子，其还可以使用3′末端具有一个突出部的短的发卡式结构的shRNA(short hairpin RNA)。所谓“shRNA”是指通过在单链RNA中包含部分回文结构的碱基序列、从而在分子内形成双链结构、形成类似于发卡一样的结构的约20个碱基对以上的分子。这样的shRNA被导入细胞内以后，在细胞内被分解为约20个碱基(代表性地为例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，与siRNA一样可以引发RNAi。如上所述，shRNA由于可以与siRNA一样引发RNAi，在本发明中也可以有效地加以应用。
shRNA优选具有3′突出末端。虽然对双链部分的长度并不做特别限定，但优选为约10个核苷酸以上，更优选为约20个核苷酸以上。这里，3′突出末端优选为DNA，更优选为至少2个核苷酸以上的DNA，进一步更优选为2～4个核苷酸的DNA。
如上所述，在本发明中，作为可以通过RNAi来抑制RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因的表达的因子，可以使用siRNA或者shRNA。siRNA的优点在于：(1)即便是导入到细胞内部，RNA本身也不会重组入正常细胞的染色体中，所以其不是一种能够引起遗传给后代的变异的治疗方法，安全性较高；和，(2)短双链RNA的化学合成比较容易，形成双链形式比较稳定，等等。而shRNA的优点是：通过长期抑制基因表达进行治疗时，可以在细胞内形成转录有shRNA的载体，然后将其导入到细胞内部。
通过本发明中所使用的RNAi来抑制RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因表达的siRNA或者shRNA可以是人工化学合成，也可以将由正义链和反义链的DNA序列反向连接形成的发卡结构的DNA通过T7RNA聚合酶在体外合成RNA而制备。体外合成时，使用T7RNA聚合酶和T7启动子，由模板DNA可以合成反义和正义的RNA。将它们在体外退火以后导入细胞内，即可以引发RNAi，抑制目标基因的表达。这里，可以采用例如磷酸钙法、或者各种转染试剂(例如oligofectamine、lipofectamine和lipofection)将那些RNA导入细胞内。
上述siRNA或者shRNA可以作为细胞增殖抑制剂使用。本发明的细胞增殖抑制剂的给药方法可以是经口给药或非经口给药(例如静脉给药、肌肉给药、皮下给药、皮内给药、粘膜给药、直肠给药、阴道给药、患病部位的局部给药、皮肤给药等等)、患部直接给药等。本发明的制剂作为药物组合物使用时，必要时可以添加药学上许可的添加剂。药学上许可的添加剂的具体例子可以列举抗氧化剂、保存剂、着色剂、调味剂、以及稀释剂、乳化剂、悬浊剂、溶剂、填料、增量剂、缓冲剂、传输介质、稀释剂、载体、赋形剂和/或药学佐剂等。但并不仅限于这些。
对本发明的药剂的制剂形式不作特别限定。例如可以列举口服液剂、注射剂、缓释剂等等。将本发明的药剂作为上述制剂而用于处方时的溶剂可以是水性溶剂也可以是非水性溶剂。
进一步，本发明的细胞增殖抑制剂的有效成分siRNA或者shRNA可以以非病毒载体或病毒载体的形式给药。当为非病毒载体的形式时，可以使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、HVJ-脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法、Lipofectamine法等)、显微注射法、用基因枪与载体(金属颗粒)一起将核酸分子转入细胞内的方法等。而当将siRNA或者shRNA以病毒载体形式对生物体给药时，可以使用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。在无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中导入能够表达siRNA或者shRNA的DNA，使细胞或组织被该重组病毒感染，即可以将基因导入细胞或组织中。
根据使用目的、疾病的严重程度、患者年龄、体重、性别、既往史、或者有效成分siRNA或者shRNA的种类，本领域技术人员可以决定本发明的细胞增殖抑制剂的给药量。虽然siRNA或者shRNA的给药量不作特别限定，例如可为约0.1ng/kg/日～约100mg/kg/日，优选为约1ng/kg/日～约10mg/kg/日。一般是给药后1～3日可见RNAi的效果。因此，优选以1日一次～3日一次的频率给药。使用表达载体时，可以按一周左右给药一次。
本发明中，也可以将反义寡核苷酸作为细胞增殖抑制剂使用。本发明中所使用的反义寡核苷酸为与RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因的DNA序列中的连续5～100个碱基序列互补的、或杂交的核苷酸，也可以是DNA或RNA任意一个，或者，只要在功能上没有损害，也可以是它们的修饰物。在本说明书中，所谓“反义寡核苷酸”，不仅指与构成DNA或mRNA的预定区域的核苷酸相对应的核苷酸完全互补的核苷酸，只要DNA或mRNA与寡核苷酸能够稳定杂交，也可以存在一些错配。
也可以对反义寡核苷酸进行修饰。通过适当的修饰，该反义寡核苷酸在生物体内很难分解，更加稳定，从而可以阻碍ITIIα。这种修饰后的寡核苷酸可以列举为S-oligo型(硫代磷酸酯型)、C-5噻唑型、D-oligo型(磷酸二酯型)、M-oligo型(甲基磷酸酯型)、肽核酸型、磷酸二酯键型、C-5丙烯基嘧啶型、2-O-丙基核糖、2′-甲氧基乙氧基核糖型等修饰型的反义寡核苷酸。而且，反义寡核苷酸也可以是通过将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰。这种反义寡核苷酸的核酸酶耐受性、水溶性、对RNA的亲和性特别优异。将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰的反义寡核苷酸例如可以是S-Oligo型等的寡核苷酸。
反义寡核苷酸的碱基数优选为小于等于50个，更优选为小于等于25个。碱基数过多会导致寡核苷酸的合成的工夫与成本大大增加，收率也会降低。而反义寡核苷酸的碱基数为大于等于5个，优选为大于等于9个。碱基数小于等于4个时，对目标基因的特异性降低，所以是不优选的。
反义寡核苷酸(或其衍生物)可以通过通常的方法合成，例如，通过市售的DNA合成装置(例如Applied Biosystems公司制造的等等)即可以很容易地合成。作为合成法，采用Phosphoroamidite的固相合成法、采用氢膦酸酯的固相合成法等等均可以获得。
在本发明中，当反义寡核苷酸用作细胞增殖抑制剂时，一般是以包含反义寡核苷酸和制剂用添加物(载体、赋形剂等)的药物组合物的形式提供的。可以对包括人在内的哺乳动物以药物形式给予反义寡核苷酸。对反义寡核苷酸的给药途径不作特别限定，经口给药或非经口给药(例如肌肉给药、静脉给药、皮下给药、腹腔给药、鼻腔等粘膜给药、或者吸入给药等)中的任意一种均可。
对反义寡核苷酸的制剂形式不作特别限定。经口给药的制剂例如可以列举片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、口服液剂、糖浆剂等；非经口给药的制剂例如可以列举注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、黏膜吸收剂、皮肤吸收剂、滴鼻剂、滴耳剂等等。包含反义寡核苷酸的药剂的形式、可使用的制剂用添加物、制剂的制造方法等本领域技术人员均可适当地选择。
反义寡核苷酸的给药量可以综合考虑患者的性别、年龄、体重、疾病的严重程度、给药目的为预防还是治疗、或者其它合并症状的有无等等而适当地选择，但一般给药量为约0.1μg/kg体重/日～100mg/kg体重/日，优选为约0.1μg/kg体重/日～10mg/kg体重/日。
本发明中，也可以将RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因的功能缺失型基因作为细胞增殖抑制剂使用。所谓“功能缺失型基因”是指在该基因中导入变异以使其功能缺失的基因。具体来说，与此相对应的基因是翻译成一般被称为突变蛋白质的基因，突变蛋白质是指由该基因形成的氨基酸序列中至少一个组成氨基酸缺失、至少一个组成氨基酸被别的氨基酸取代、至少一个氨基酸被附加等原本固有的功能丧失了的蛋白质。
当功能缺失型基因作为细胞增殖抑制剂使用时，可以通过将作为有效成分的上述基因与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合而制备。而且，当将上述基因重组入病毒载体时，制备含有该重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合。
上述基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钾与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式配制成注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备成用时溶解的制剂。
功能缺失型基因的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等全身给药，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。
功能缺失型基因的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成年人每日摄入的重组基因的重量在1μg/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内。优选为从10μg/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。对给药次数不作特别限定。
上述本发明的各种基因治疗剂也可以在按常法制备的脂质体悬浊液中添加基因、通过冷冻后融解而制得。制备脂质体的方法有薄膜震荡法、超声波法、逆相蒸发法、表面活性剂去除法等。优选的是，在超声波处理脂质体悬浮液以后，添加基因可以提高基因的包封率。包封有基因的脂质体可以直接或与水、生理盐水等混悬后静脉给药。
进一步，本发明还可以将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质用作细胞增殖抑制剂(即，蛋白质制剂)。例如，将POU2AF1基因的功能缺失型蛋白质作为细胞增殖抑制剂使用时，可以以药物组合物的形式使用，该药物组合物包含作为有效成分的功能缺失型POU2AF1蛋白质或其功能缺失型的等同蛋白质、制剂用添加物(例如载体、赋形剂等)。
对上述蛋白质制剂的形式不作特别限定。经口给药的制剂例如可以列举片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、口服液剂、糖浆剂等；非经口给药的制剂例如可以列举注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、黏膜吸收剂、皮肤吸收剂等等。
对上述蛋白质制剂的给药途径不作特别限定，经口给药或非经口给药(例如肌肉给药、静脉给药、皮下给药、腹腔给药等粘膜给药、或者吸入给药等等)中的任意一种均可。
上述蛋白质治疗剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成年人每日的摄入量在0.001μg/kg体重～1000μg/kg体重左右的范围内。优选为在0.001μg/kg体重～100μg/kg体重左右的范围内。对给药次数不作特别限定。
上述本发明的细胞增殖抑制剂可以以其有效剂量通过对包括人在内的哺乳动物进行给药用于抑制肿瘤。而且，上述抗肿瘤剂也可以以其预防和/或治疗有效剂量通过对包括人在内的哺乳动物进行给药用于预防和/或治疗肿瘤。
(3)细胞增殖的激活方法以及细胞增殖激活剂
根据本发明，进一步提供一种激活细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因在体外导入到细胞中。而且提供一种包括上述基因的细胞增殖激活剂。
在处理POU2AF1基因时，基因也可以是本领域技术人员采用公知的技术从培养细胞等中获得的cDNA，或者也可以是基于本说明书SEQ ID NO：1所述的碱基序列，通过PCR法等进行酶学合成得到的DNA。当通过PCR法来获取具有SEQ ID NO：1所述碱基序列的DNA的时候，使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板，设计可以扩增SEQ ID NO：1所述碱基序列的引物，使用该引物进行PCR扩增，PCR扩增的DNA片断在大肠杆菌等宿主体内可以克隆进入能够扩增的适当的载体中。
POU2AF1基因的检测探针或引物的制备、以及目的基因的克隆等等操作对于本领域技术人员来说均是已知的，例如，可以参照1989年冷泉港实验室(冷泉港，纽约)编著的“分子克隆实验手册(第2版)”，或John Wiley & Sons 1987～1997年出版的“Current Protocolsin Molecular Biology，Supplement 1～38”等记载的方法进行制备。
而当处理的是POU2AF1基因以外的其它基因时，可以按与POU2AF1基因的情形同样进行。
从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因可以重组入载体中以重组载体的形式使用。载体为病毒载体或动物细胞表达用载体，优选使用病毒载体。作为病毒载体，可以列举逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体等。其中，由于逆转录病毒载体在感染细胞以后病毒基因组整合进入宿主染色体内，从而可以使整合进入载体内的外源基因能够稳定、长期地表达，所以特别优选使用逆转录病毒载体。
动物细胞表达用载体例如可以采用pCXN2(Gene，1991年第108卷第193-200页)或PAGE207(日本特开平6-46841号公报)或其变体等。
将上述重组载体导入到适当的宿主中进行转化，对得到的转化体进行培养即可以进行生产。当重组载体为病毒载体时，导入该载体的宿主可以采用具有产生病毒能力的细胞，例如，COS-7细胞、CHO细胞、BALB/3T3细胞、HeLa细胞等等。逆转录病毒载体的宿主可以使用
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CRE、
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CRIP、MLV等；腺病毒载体及腺病毒伴随病毒载体的宿主可以是来源于人胎儿肾脏的293细胞等。可以采用磷酸钙法等将病毒载体导入到动物细胞内。而重组载体为动物细胞表达用载体时，导入该载体的宿主可以使用大肠杆菌K12菌株、HB101菌株、DH5α菌株等，大肠杆菌的转化是本领域技术人员公知的。
所得到的转化体分别在合适的培养基、培养条件下培养。例如，大肠杆菌转化体的培养可以使用含有生长发育所必需的碳源、氮源、无机物以及其它物质的pH5～8左右的液体培养基来进行培养。通常在15～43℃培养约8～24小时左右。此时，在培养结束以后，目的重组载体可以通过通常的DNA分离纯化方法制得。
动物细胞转化体的培养例如可以使用含有约5～20％胎牛血清的199培养基、MEM培养基、DMEM培养基等进行培养。培养基的pH优选为约6～8。通常在30～40℃培养约18～60小时。此时，由于含有该载体的病毒粒子释放于培养上清中，目的重组载体可以经病毒粒子浓缩、氯化铯离心纯化法、聚乙二醇沉淀法、过滤浓缩法等等进行制备。
本发明的细胞增殖激活剂可以通过将作为有效成分的上述基因或其等同基因与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合而制得。而且，当将上述基因或其等同基因重组整合进入病毒载体中时，制备含有重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合。
本发明中的所谓“等同基因”是指：在某个特定基因的碱基序列中有1个至多个碱基被缺失、被添加或被取代的碱基序列的基因；或者是具有与某个特定基因的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列的基因。本发明所述的“等同基因”优选的是具有对肿瘤化活性的蛋白质进行编码的碱基序列的基因。而且，某一基因的等同基因也包括该基因的片段。
上述“在碱基序列中1个至多个碱基被缺失、被添加或被取代的碱基序列”中，对“1个至多个”的范围并不作特别限定，例如，其意指1个至60个，优选为1个至30个，更优选为1个至20个，进一步优选为1个至10个，特别优选为意指1个至5个左右。
上述“在某一特定的碱基序列中具有1个至多个碱基被缺失、被添加或被取代的碱基序列的基因”可以通过化学合成、基因工程方法或诱发突变等本领域技术人员已知的任意方法进行制备。具体而言，利用上述特定的基因，通过在这些DNA中导入变异即可以获得上述基因。例如，对于上述特定基因，可以采用与作为变异原的药剂接触的方法、采用紫外线照射的方法、采用基因工程的方法等等来进行。作为基因工程的方法之一，定点特异诱变法由于可以在特定位置上引入特定变异而非常有用，可以参照1989年冷泉港实验室(冷泉港，纽约)编著的“分子克隆试验手册(第2版)”或John Wiley & Sons 1987～1997年出版的“Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1～38”等记载的方法进行制备。
上述“在严谨条件下杂交的碱基序列”是指将DNA作为探针使用、采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或者Southern印记杂交法等而得到的DNA的碱基序列。例如，可以列举的是，采用固定有来源于菌落或噬菌斑的DNA或该DNA片段的滤膜，在0.7～1.0M的NaCl存在下，在65℃进行杂交以后，使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC溶液含有150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65℃条件下清洗膜，以此来鉴定获得的DNA等。杂交可以参照1989年冷泉港实验室(冷泉港，纽约)编著的“分子克隆试验手册(第2版)”等记载的方法进行。
在严谨条件下杂交的DNA可以列举与作为探针使用的DNA碱基序列具有一定程度以上的同源性的DNA，例如，具有70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，进一步优选93％以上，特别优选95％以上同源性的DNA。
上述的所谓“具有与某一特定碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列的基因”，如上所述，可以在一定严谨度杂交条件下通过采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或者Southern印记杂交法等而得到。
为了配合作为有效成分的上述基因或其等同基因，所使用的基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钾与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式调制为注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备为用时溶解的制剂。
本发明的细胞增殖激活剂的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等的全身给药方式，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。当细胞增殖激活剂在给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。
本发明的细胞增殖激活剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成年人每日摄入的重组基因的重量在1μg/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内。优选为从10μg/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。对给药次数不作特别限定。
下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不特别限定于以下这些实施例。
实施例
试验材料：
所使用的28种来源于多发性骨髓瘤的细胞株为由临床检体建立的：AMO1、KMM1、KM-1、KM-4、KM-5、KM-6、KM-7、KM-11、KMS-5、KMS-11、KMS-18、KMS-20、KMS-26、KMS-27、KMS-34、KMS-12BM、KMS-12PE、KMS-21BM、KMS-21PE、KMS-28BM、KMS-28PE、HS、ILKM-10、ILKM-12、ILKM-13、MOLP-2、MOLP-6、OPM-2以及一种用Epstein-Barr病毒转化的来源于正常健康人淋巴细胞的细胞株。这些细胞株在10％胎牛血清的存在下在RPMI-1640培养基中进行培养。来源于临床检体中的32人的骨髓检体获自名古屋市立大学医院，取得了各患者的同意且得到了该医院的伦理委员会的认可。通过采用抗CD-138抗体珠的自动磁性细胞分选系统(德国美天旎生物技术公司生产)进行阳性分选来筛选诊断时的来源于多发性骨髓瘤的细胞。
实施例1：多发性骨髓瘤细胞中的人基因区域的扩增及缺失
为了扩增检测出多发性骨髓瘤中的新型基因，采用由28种多发性骨髓瘤细胞制备的基因组DNA，采用MCG Cancer Array-800型分析仪来分析CGH阵列。以来源于正常人淋巴细胞的细胞株的基因组DNA为研究对象用Cy5进行标记；以由上述多发性骨髓瘤细胞制备的基因组DNA为被检DNA采用Cy3进行标记。具体地讲，是将DpnII消化基因组DNA(0.5μg)、分别在0.6mM dATP、0.6mM dTTP、0.6mMdGTP、0.3mM dCTP、0.3mM Cy3-dCTP(多发性骨髓瘤细胞)或者0.3mM Cy5-dCTP(正常细胞)的存在下，用BioPrime Array CGHGenomic Labeling System(Invitrogen公司生产)进行标记。Cy3和Cy5标记的dCTP购自Amersham Biosciences公司。在Cot-1DNA(Invitrogen公司生产)的存在下将两种标记的基因组DNA加入乙醇中使其沉淀，然后溶解于120μl的杂交混合液(50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)、2×SSC(1×SSC：150mM NaCl/15mM柠檬酸钠)、4％SDS、pH7.0)中，在37℃孵育30分钟以后，加到设于杂交室中的CGH阵列上，在37℃下以3rpm(转/分钟)的速度边震荡边孵育48～72小时。然后，将CGH阵列在50％甲酰胺/2×SSC溶液(pH7.0)中在50℃下清洗15分钟，接下来在2×SSC/0.1％SDS中于50℃下清洗15分钟。风干以后，将CGH阵列用GenePix 4000B扫描仪(美国加利福尼亚州Axon Instruments公司制造)监测来源于Cy3和Cy5的荧光。得到的结果用GenePix Pro 6.0成像软件(美国加利福尼亚州Axon Instruments公司制造)进行分析。将来源于Cy3的荧光强度的平均值和来源于Cy5的荧光强度的平均值调整为相同值，通过求得的Cy3/Cy5的比值来检测出各个基因的由阵列CGH所得到的量的变化。当在基因组中没有异常时，Cy3/Cy5的比值为1，而该比值以2为底的log值为正或负偏离0.4以上时被判定为基因异常(扩增或缺失)。关于扩增和缺失的染色体区域的异常，参照在纵轴上的扩增(绿色)、缺失(红色)、在横轴上的UCSC作图位置(http://genome.ucsc.edu/[version May，2004])，相对于全部细胞株的异常细胞频率以染色体位置的形式被示出(图1)。在1q、7q、8q上出现扩增的频率为50％以上，而在1p、13q、14q、17p、22q上出现缺失的频率为50％以上。在14q32观察到了最大频率的缺失，是随着在众多的白血病、骨髓瘤中观察到的免疫球蛋白重链恒定区γ1基因(immunoglobulin heavy constant gamma 1 gene，IGHG1)的转座的缺失所致。
进一步，将其分类为高水平扩增(log2比值>2.0)、和同源缺失(log2比值<-2.0)，将变化大的基因与被观察的细胞一同列出(表1)。
表1：根据阵列CGH分析(MCG Cancer Array-800)，在多发性骨髓瘤细胞中显示高水平扩增(log2比值>2.0)、和同源缺失(log2比值<-2.0)的基因群
Figure A200710140650D00291
a根据UCSC Genome Browser(2004年5月装)
b代表性候选的与肿瘤有关的基因或位于BAC附近的标记物在28个细胞株中，11株观察到了同源缺失的基因，在KMS-5细胞中观察到9p21.3区域的MTAP和CDKN2A/p16的缺失。另外，在28株细胞株中有11株观察到了高水平扩增的16个基因。其中，在AMO1和MOLP-2两株细胞中，11q23区的POU2AF1和PPP2R1B基因表现扩增。由于基因扩增在肿瘤病理学、临床上的意义很大，与治疗方法密切相联，所以对该11q23区域进行了进一步分析。
实施例2：AMO1和MOLP-2细胞中的FISH分析
对实施例1用CGH阵列法确定的11q23区域的染色体区域，采用RP11-792p2的BAC克隆，按已知方法(Inoue J，Otsuki T，HirasawaA，等在Am J Pathol.2004年第165卷第71～81页)进行FISH分析(图2)。两个细胞株在原本染色体位置上的FISH信号(箭头)以外，还观察到了由多拷贝构成的强扩增信号(楔形)，从而证实了确实发生了基因扩增。
实施例3：由AMO1和MOLP-2细胞中的FISH分析进行扩增区域的精细定位与构成基因的表达分析
采用以RP11-792P2为大致中心的15种BAC克隆进行FISH分析，由其荧光信号强度将对应的基因组区域的拷贝数做图(图3左)。纵轴表示在11q23区域BAC克隆ID和它们的相对位置。平均染色亮度最高的区域(均质染色区，HSRs)在两种细胞间几乎一致，这两个区域被定位于RP11-25I9与708L7之间约3Mb(megabase)的位置上。
接下来，对存在于已定位的11q23区域的AMO1、RDX、ARHGAP20、POU2AF1、SNF1LK2、PPP2R1B、ALG9基因进行以简易定量为目的的PCR反应。作为RT-PCR的表达量对照，采用已知道表达量不会随细胞种类、条件变化而变化的GAPDH。从对数增长期的各细胞提取总RNA以后，按照常法制备cDNA。预先设定好各基因的特异的引物和条件，进行PCR反应后进行3％琼脂糖凝胶电泳。用LAS-3000(富士写真胶卷株式会社生产)测定凝胶图像，用Multi Gauge软件(富士写真胶卷株式会社生产)进行图像分析(图3右)。所采用的细胞株除了在11q23区域有扩增的AMO1、MOLP-2以外，还有在该区域没有观察到扩增的KMM1、KM-5以及作为对照的来源于正常人的LCL(淋巴细胞克隆)。其定量结果汇总于表2。
表2 在11q23区域中观察到基因组DNA有扩增的区域的细胞以及没有扩增的细胞中，存在于该区域的基因的表达分析比较
Figure A200710140650D00311
a每个细胞株中每个基因的表达水平被KMM1和KM-5细胞株中每个基因表达水平的平均值(参考值)相除后作为表达水平的增加倍数。用GAPDH标准化，KMM1和KM-5细胞株具有标准的11q拷贝数。相对表达水平的增加倍数>2.0时可以认为是显著的，以黑粗体表示出。11q23区域作为扩增结果的显著过表达的单个基因以灰色背景示出。
b N.T.表示表达水平低于定量的下限。
结果发现，在AMO1和MOLP-2细胞所定位的区域中POU2AF1的基因表达比在基因没有扩增的细胞(KMM1、KM-5)中的平均表达量升高4.5～5.0倍。
实施例4：多发性骨髓瘤细胞中的POU2AF1基因的蛋白质表达水平的验证
用Western印迹法对8种多发性骨髓瘤细胞株的POU2AF1蛋白质的表达量进行了定量(图4)。将各细胞溶解于含有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断公司生产)的RIPA缓冲液(10mM Tris-HCl，150mMNaCl，1mM EDTA，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Triton X-100，pH7.4)中以后，用BCA array(Pierce chemical公司生产)测定蛋白质浓度，将各10μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后，将其复印于difluoride膜上，用抗POU2AF1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司生产)、作为对照的抗β-肌动蛋白抗体(Sigma公司生产)进行第一次检测以后，用结合了过氧化物酶的二抗、经enhancedelectrochemiluminescence system(Amersham公司产生)进行显色检测。图中，POU2AF1蛋白质可以观察到2条带，除分子量较小的p34以外，还有p35。p34是p35的转录后修饰的同功异构型，据报道，对OCT结合因子1的转录激活的增强效果较高(Yu X，等，Immunity，2001年第14卷第157～167页)。图的下半部分示出了由FISH测定的POU2AF1基因在基因组DNA上的拷贝数。与预想的相同，在基因组DNA中发现有POU2AF1基因扩增的AMO1和MOLP-2细胞中，相较其它细胞，观察到了强的POU2AF1蛋白表达。
实施例5：通过向细胞中添加POU2AF1基因的siRNA对POU2AF1蛋白质的表达抑制和细胞增殖的抑制效果
将POU2AF1的siRNA设计为POU2AF1-A：CACCUUACACCGAGUAUGU(SEQ ID NO：3)、POU2AF1-B：GGUUCUGUGUCUGCAGU(SEQ ID NO：4)，购入(日本Bio service)以后，用Nucleofector(德国)将200nM的各个引物导入到发现有2×106个POU2AF1基因表达的AMO1和KMS-21BM细胞的基因中。用荧光标记的pmaxGFP分析仪一边监测其效率，一边同实施例4一样进行Western印迹分析(图5A)。对照采用抗β-肌动蛋白抗体。与预想的相同，观察到了由于siRNA的添加，POU2AF1的表达被抑制。在1×104个AMO1和KMS-21BM细胞中导入POU2AF1基因的siRNA以后，将细胞接种于96孔板中，用水溶性四氮唑盐(WST)分析(Cell countingkit-8试剂盒，日本同仁堂生产)随时地测定活细胞个数(图5B、C)。试验平行3份，重复进行两次，星号表示在采用没有对应的Student’s ttest法时两者有显著性差别。两种细胞也都由于导入了POU2AF1的siRNA而增殖被抑制。
实施例6：KMS-11细胞的POU2AF1基因表达细胞株的建立、分布、以及对活细胞数的影响的观察
在全长POU2AF1基因(p34)的N末端结合Myc，构建用于表达的表达载体(pCMV-Tag3-p34-POU2AF1)。将其用Nucleofector导入原本内源性POU2AF1基因表达很低的KMS-11细胞中，用G418(50μg/ml)进行药剂筛选3周。用细胞裂解液、经Western印迹法和抗Myc抗体检测POU2AF1基因表达的有无(图6A)。同时也准备了在KMS-11细胞中导入无外源基因的pCMV-3B的细胞，将其作为空白对照。与预想的相同，仅在有基因导入的细胞中检测到了重组POU2AF1蛋白质。将上述转化细胞在Shandon Cytospin(美国Thermo公司生产)玻璃板上培养、离心以后，用10％甲酰胺固定，用抗Myc多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司生产)染色一晚，将反应后的抗体用Alexa 488标记的羊抗兔抗体(Molecular Probes公司生产)进行染色，用荧光显微镜进行观察。同时，用DAPI进行核染色。两者的色调重合后表示为merge(图6B)。结果确认，POU2AF1为核内蛋白质与DAPI同样都能被核染色，其显示POU2AF1原本的分布。通过用WST分析活细胞数，测定了空白对照细胞和POU2AF1基因表达细胞这两种细胞的细胞增殖速度(图6C)。由于POU2AF1基因的导入，细胞增殖速度显著加快，由此确认了该基因的显著促进细胞增殖的效果。
实施例7：POU2AF1基因的调控基因TNFRSF17
根据采用POU2AF1基因敲除的小鼠试验，已报道POU2AF1基因与免疫球蛋白基因以外的基因表达有关(Teitell MA等，TrendsImmunol.2003年第24卷第546～553页)。与癌的发生、进展、细胞增殖、细胞粘连、转移等有关的基因已知有BAFFR、TNFRSF17(tumornecrosis factor receptor superfamily，member17)、Bcl-2、cyclin D3、osteopontin等，通过实时RT-PCR分析发现，在多发性骨髓瘤细胞株中与POU2AF1基因的表达和表现唯一同步的基因就是TNFRSF17(数据没有示出)。因此，对TNFRSF17的基因表达情况进行了详细分析(图7)。首先，对2×106个AMO1和KMS-21BM细胞株的细胞，用Nucleofector将200nM的POU2AF1-A和POU2AF1-B的各个siRNA(KMS-21BM细胞中仅为POU2AF1-B)进行基因导入。48小时以后，用实时RT-PCR分析TNFRSF17基因的表达(图7A)。结果证实，由于两种细胞中的POU2AF1基因均被敲除，TNFRSF17基因的表达降低。
同时制备了实施例6中的KMS-11细胞的POU2AF1基因表达细胞株与空白对照，采用实时RT-PCR对它们进行了TNFRSF17基因表达的比较分析(图7B)。在这种情况下，发现在POU2AF1基因被强制表达的细胞中，TNFRSF17基因的表达增强。利用数据库(RecGroup Scan；http://www.mgs.bionet.nsc.ru/mgs/programs/yura/Rec Group ScanStart.html)对基因组DNA上的人TNFRSF17基因的5′区域搜索转录因子结合部位，从而发现从转录起始点(+1)上游3642位碱基开始存在有促进POU2AF1转录的octamer位点(图7C)。接下来，对AMO1和KMS-11细胞(空白对照、表达POU2AF1基因的细胞)的染色质来说，对使用抗POU2AF1蛋白质的抗体的免疫沉淀物进行PCR以验证其是否含有octamer位点(图7D)。所使用的PCR引物如图7C的箭头所示，使用了夹有octamer位点的引物。用抗POU2AF1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司生产)的免疫沉淀物的1/100作为PCR反应的模板，Input为免疫沉淀前的染色体材料，(-)表示没有免疫沉淀抗体状态下的阴性对照。如箭头所示，在表达POU2AF1基因的细胞株中与在表达内源性POU2AF1基因的AMO1细胞中，均检测出了与POU2AF1蛋白质结合的octamer位点。
施例8：使用包含了TNFRSF17基因上游的octamer位点的区域的POU2AF1表达载体和重组的启动子-报告基因分析
用PCR克隆获得了含有TNFRSF17基因上游的octamer位点的307个碱基对的DNA区域，将包含野生型(wt：TTTAGCAT)和突变型(Mut：TTCCGCAT)的octamer位点的区域导入到载体pGL3-启动子(Promega)中，分别命名为pGL3-TNFRSF17-野生型octamer和pGL3-TNFRSF17-突变型octamer。采用lipofectamine2000(Invitrogen公司生产)将上述两种荧光素酶启动子-报告基因载体与pCMV-Tag3-POU2AF1的p34或p35以及校正基因导入效率的内标载体phRL-TK(Promega公司生产)一起导入KMS-11细胞中。48小时以后，采用Dual-Luciferase Reporter Assay system(Promega公司生产)进行发光测定。将基因导入的pGL3-TNFRSF17-野生型octamer和pCMV-Tag3(空白对照)的值设定为1，表示相对的荧光素酶活性(图8)。POU2AF1的异构型p34和p35都为野生型的octamer位点时，虽然其相较于对照显示出较高的报告基因活性，但由于结合区域的变异导致其活性降低，其证实POU2AF1通过与转录因子OCT1或OCT2结合使其活性增强，从而对TNFRSF17基因的表达进行调节。
实施例9：POU2AF1、TNFRSF17两基因的信使RNA的表达相关性
用定量PCR法测定多发性骨髓瘤细胞以及由多发性骨髓瘤临床检体建立的初级细胞中的POU2AF1、TNFRSF17的基因表达。用相对于β-肌动蛋白以及β2-微球蛋白(β2M)的比值来表示(图9A：细胞株；B：初级细胞)。无论是在细胞株中还是在初级细胞中，POU2AF1、TNFRSF17两基因的表达均高度相关，两者均显示显著的p值(在非配对t检验中表现出显著性差异(p<0.05))。由此可以看出，在细胞株中当然不用说，即便是在临床检体中，TNFRSF17基因的表达由POU2AF1基因的表达量按正相关的方式进行调控。
实施例10：使用siRNA后抑制了TNFRSF17基因表达，所引起的对细胞增殖的抑制效果
采用高表达POU2AF1基因的AMO1细胞与可见有表达的KMS-21BM细胞，首先将非特异性序列作为对照siRNA，将200nMPOU2AF1基因、TNFRSF17基因的siRNA(Dharmacon公司生产，M-011217-00)进行基因导入，48小时以后，以β-肌动蛋白为指标，用定量PCR测定POU2AF1基因、TNFRSF17基因的表达(图10A：POU2AF1；B：TNFRSF17)。与预想一致，由于POU2AF1的siRNA所导致的抑制，POU2AF1基因的表达当然被抑制，但由TNFRSF17基因的siRNA并不能抑制POU2AF1基因的表达，而由POU2AF1的siRNA所导致的抑制能够抑制TNFRSF17基因的表达。这就说明，POU2AF1基因是在TNFRSF17基因的上游，调控TNFRSF17基因的表达。同时，用WST法检测了AMO1细胞与KMS-21BM细胞中由TNFRSF17基因的siRNA所导致的抑制后的活细胞数(图10C)。两种细胞都是在由TNFRSF17基因的siRNA导入4天后观察到了细胞增殖的显著被抑制(星号是非配对t检验(p<0.05))。由这些结果可以看出，TNFRSF17基因的表达受POU2AF1基因表达的正调控，其效果就是显现出细胞增殖效果。
实施例的总结
(1)通过阵列CGH法进行筛选，将28种来源于多发性骨髓瘤细胞的DNA的基因扩增的筛选与表达分析数据结合起来，确认POU2AF1基因表现异常。
(2)POU2AF1基因的表达位于TNFRSF17基因表达的上游位置，对TNFRSF17基因的表达进行正调控，其效果表现为对细胞增殖的正向调控，具有促进细胞增殖的功能。
序列表
<110>  富士胶片株式会社
       国立大学法人东京医科齿科大学
<120>  多发性骨髓瘤的检测方法及抑制方法
<130>  FI-071154-59
<150>  JP No.255155/2006
<151>  2006-09-21
<160>  4
<170>  Patentln version3.3
<210>  1
<211>  3314
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Figure A200710140650D00361
<210>    2
<211>    256
<212>    PRT
<213>    Homo sapiens
<400>    2
Figure A200710140650D00401
<210>   3
<211>   19
<212>   RNA
<213>   人工序列
<220>
<223>   人工序列的描述：合成RNA
<400>   3
Figure A200710140650D00402
<210>   4
<211>   17
<212>   RNA
<213>   人工序列
<220>
<223>   人工序列的描述：合成RNA
<400>   4
Figure A200710140650D00403

Claims (14)

1、一种癌症检测方法，其包括：以检体中第11号染色体q23区域的基因扩增为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
2、权利要求1所述的癌症检测方法，所述基因是RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中的任意一种。
3、权利要求1或2所述的癌症检测方法，所述扩增的指标是：同正常检体相比，为大于等于1.32倍。
4、权利要求1～3任意一项中所述的癌症检测方法，所述检体是多发性骨髓瘤的检体。
5、权利要求1～4任意一项中所述的癌症检测方法，所述癌症为多发性骨髓瘤。
6、一种多发性骨髓瘤的检测方法，其包括：在多发性骨髓瘤的检体中，以POU2AF1基因的扩增为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
7、权利要求1～6任意一项中所述的癌症检测方法，所述基因的扩增可以采用DNA芯片法、Southern印迹法、Northern印迹法、PCR法、实时RT-PCR法、FISH法、CGH法、基因扩增法、RFLP检测法、核苷酸测序法或阵列CGH法中的任意一种方法来检测。
8、一种癌症检测方法，其包括：在检体中，以RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中的任意一种基因的表达增强为指标，对该检体的肿瘤化进行检测和/或分类。
9、一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。
10、一种抑制细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质在体外导入到肿瘤细胞中。
11、一种细胞增殖抑制剂，其包含从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。
12、一种细胞增殖抑制剂，其包含从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因的功能缺失型蛋白质。
13、一种激活细胞增殖的方法，其包括：将从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中选择的基因在体外导入到细胞中。
14、一种细胞增殖的激活剂，其包含从RDX基因、FDX1基因、ARHGAP20基因、POU2AF1基因、TNFRSF17基因、LAYN基因、SNF1LK2基因、PPP2R1B基因或ALG9基因中所选择的基因。
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