CN112979805A - 用于循环肿瘤细胞检测的vegfr2荧光标记抗体、其检测方法和应用 - Google Patents

用于循环肿瘤细胞检测的vegfr2荧光标记抗体、其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体，所述VEGFR2荧光标记抗体通过Cy5荧光分子标记VEGFR2抗体；其中，所述Cy5荧光分子的荧光基团与CK和CD45的荧光基团无干扰。还提供了其在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2蛋白表达的方法和应用。本发明荧光标记抗体在捕获检测血液中CTCs之后可以用来检测细胞中VEGFR2表达量。本发明为循环肿瘤细胞标准检测方法中引入VEGBFR2检测提供有力手段。

Description

用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体、其检测方法 和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体、其检测方法和应用。
背景技术
胃癌在中国发病率和死亡率均居高不下。而多数本来在非小细胞肺癌和结直肠癌中非常有效的药物对胃癌不起作用。近年来发现VEGFR2作为胃癌的新型靶点，期临床试验前景非常好，已经被FDA审批，商品名为雷莫卢单抗。VEGF家族目前一直是癌症研究热点，大量与VEGF相关的药物开发，但是和其他药物一样，绝大多数药物在胃癌治疗中折戟沉沙。但是VEGFR2抗体在众多VEGF相关抗体中脱颖而出，抗体联合紫杉醇可以将中位数生存期提升两个月以上，所以2014年FDA便批准了VEGFR2应用于胃癌患者，目前中国CFDA还没有引进该药物，由于目前全球对于仍然没有一个专一胃癌的靶向药物，所以相信在短期内该药物将引入国内。
靶向药物的治疗一定需要患者的该靶点蛋白是高表达的。检测方法一般需要组织活检，穿刺取样，而组织活检的创伤可能会造成肿瘤的进一步恶化和转移，所以非侵入性的取样方法更有利于多次取样和降低取样风险。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体、其检测方法和应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文红所使用的术语如下：
术语“CTC”是指：circulating tumor cell，循环肿瘤细胞。
术语“VEGF”是指：vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子。
术语“VEGFR2”是指：Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，血管内皮细胞生长因子受体2。
术语“HUVEC”是指：Human Umbilical Vein Endothelial Cells，人脐静脉内皮细胞。
术语“CK”是指：Creatine Kinase，肌酸激酶。
术语“CD45”是指：白细胞共同抗原。
术语“HEX”是指：Hexachlorofluorescein，六氯－6－甲基荧光素。
术语“TET”是指：Tetrachlorofluorescein，四氯－6－羧基荧光素。
术语“GFP”是指：绿色荧光蛋白。
术语“CY3”是指：3H-吲哚菁。
术语“CY5”是指：5H-吲哚菁。
术语“1640培养基”是指：RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640培养基，含10％胎牛血清。
术语“DMEM培养基”是指：dulbecco's modified eagle medium培养基，含各种氨基酸和葡萄糖。
术语“F-12培养基”是指：F-12基础培养基，含L-谷氨酰胺。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体，所述VEGFR2荧光标记抗体通过Cy5荧光分子标记VEGFR2抗体；其中，所述Cy5荧光分子的荧光基团与CK和CD45的荧光基团无干扰。
根据本发明第一方面的荧光标记抗体，其中，所述荧光基团激发光和发射光范围选自红外区和近红外区；
优选地，所述Cy5荧光分子的荧光基团选自以下一种或多种：HEX、TET、GFP、CY5、CY3。
根据本发明第一方面的荧光标记抗体，其中，所述荧光标记抗体可进一步与具有光学和/或磁学性质纳米材料结合。
本发明的第二方面提供一种在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2蛋白表达的方法，所述方法包括在循环肿瘤细胞抗体荧光检测时加入如第一方面所述的VEGFR2荧光标记抗体。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述VEGFR2荧光标记抗体通过培养基稀释，所述培养基中血清含量为1～10％，优选为1～5％，最优选为2％；
优选地，所述培养基选自以下一种或多种：1640培养基、DMEM培养基、F-12培养基；优选为1640培养基。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述VEGFR2抗体的工作浓度为0.1～10μg/mL，优选为0.5～2μg/mL，最优选为1μg/mL。
本发明的第三方面提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂，所述试剂包括如第一方面所述的VEGFR2荧光标记抗体。
本发明的第四方面提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的VEGFR2荧光标记抗体和循环肿瘤细胞标准检测试剂；
优选地，所述循环肿瘤细胞标准检测试剂包括：荧光标记的CK，CD45检测抗体，Hoechst33342细胞核染料，细胞固定液和多肽纳米磁珠。
本发明的第五方面提供了第一方面所述的荧光标记抗体在制备用于检测血液中循环肿瘤细胞VEGFR2表达的产品中的应用。
本发明提供一种在细胞中检测VEGFR2的方法，该方法必须快速，有效，能够。该方法还进一步适配于循环肿瘤细胞标准方法流程并在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2的表达量。
本发明构思如下：取得商品化VEGFR2药物，分析其抗体的有效性，之后标记Cy5荧光分子并纯化，选取多种胃癌细胞进行VEGFR2的抗体孵育，测定荧光强度变化，将优化好的抗体浓度应用于循环肿瘤细胞标准检测方法。
为了实现本发明目的，一方面，本发明提供一种VEGFR2抗体活性检测方法，所述方法利用VEGF刺激HUVEC细胞产生VEGF依赖性，之后加入不同浓度的抗体，用以检测半数杀伤浓度(EC50)。
优选地，所述VEGF刺激浓度为20ng/mL。
优选地，所述VEGFR2抗体为2％血清含量的1640培养基稀释。
优选地，EC50检测算法使用4参数法进行，公式为：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
其中，x为样品浓度，y为OD值，A、B、C、D为拟合曲线所需参数，其中C值为EC50值。
本发明方法在应用循环肿瘤细胞检测时，只需要在抗体检测环节(CK和CD45)加入VEGFR2抗体即可进行检测，荧光拍照时需要加入Cy5通道(650nm激发，670nm发射)。
优选的，抗体工作浓度为1μg/mL。
优选地，所述荧光基团可选自HEX、TET、GFP、CY5、CY3中的任意一种，需要荧光基团与原有的CK，CD45的荧光基团无干扰。
优选地，所述分子探针可以与具有光学，磁学性质的金纳米颗粒和氧化铁等纳米材料组合实现更灵敏的检测。
另一方面，本发明提供含有所述的检测试剂或试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括循环肿瘤细胞标准检测试剂，包括荧光标记的CK，CD45检测抗体，Hoechst33342细胞核染料，细胞固定液和多肽纳米磁珠。
此外，本发明还提供所述VEGFR2荧光抗体应用于病人血液中循环肿瘤细胞VEGFR2表达检测研究。
本发明的荧光标记抗体可以具有但不限于以下有益效果：
(一)本发明选择的商品化抗体需要对靶细胞(HUVEC)具有很好的检测能力。
(二)本发明提供的荧光标记抗体对VEGFR2阳性的胃癌细胞具有靶向识别作用，具有高效、灵敏、特异性强的特点。
(三)本发明提供的荧光标记抗体对血液中循环肿瘤细胞内的VEGFR2有识别作用，可利用荧光值对VEGFR2的表达强弱进行分类。所得检测结果在患者分型和临床用药等方面具有一定的指导意义。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明实施例1中VEGF对HUVEC细胞的诱导能力评价。
图2示出了本发明实施例1中VEGFR2抗体对HUVEC亲和力检测结果。
图3示出了本发明实施例2中体荧光标记后HPLC检测结果。
图4示出了本发明实施例3中荧光抗体对SNU5细胞和293T细胞检测结果。
图5示出了本发明实施例4中荧光抗体在CTCs标准检测方法中适配结果。
图6示出了实施例4中实际胃癌患者外周血通过CTCs标准检测方法中应用本方法后检测结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
VEGF，HUVEC细胞，FBS，1640培养基，碳酸氢钠，SNU-5细胞，GES-1细胞，多聚甲醛，PBS，乙醇，pan-CK、CD45抗体、VEGFR2抗体，Hoechst33342，购自中科纳泰生物技术有限公司；
Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒，购自日本同仁公司；
Alexa Fluor 647NHS Ester(A20186)试剂盒，购自生命科技公司(LifeTechnologies)；
BCA蛋白含量检测试剂盒，购自碧云天生物技术(Beyotime Biotechnology)；
EPCAM多肽磁珠，购自中科纳泰生物技术有限公司。
仪器：
酶标仪，购自珀金埃尔默仪器公司(perkinelmer)、型号EnSight；
高效液相色谱仪，购自沃特世公司(Waters)、型号2695；
激光共聚焦显微镜，购自蔡司公司、型号710；
荧光显微镜，购自奥林巴斯公司、型号IX71；
流式细胞仪，购自美国BD公司，型号C6。
实施例1
本实施例选取商品化抗体进行亲和性验证，主要采用VEGF依赖性的HUVEC进行检测。
首先选择不同浓度的VEGF刺激细胞，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁)检测试剂盒进行活性检测。
基本方法如下：
接种HUVEC细胞以5000个/孔于96孔板中，使用10％FBS的1640培养基进行培养。第二天使用2％FBS的1640培养基配制VEGF含量为0.625-40ng/mL。24h后使用CCK-8试剂盒检测其活性，最后使用酶标仪检测其CCK-8激活吸光值。本实施例测定的VEGF依赖型HUVEC活性见图1。
之后，选取VEGF预先处理过的HUVEC细胞加入2％FBS的1640培养基配制0.01-5000μg/mL的抗体处理细胞24h，之后CCK-8试剂盒加测其细胞活性。使用以下公式进行拟合计算EC50值(等同于C值)。拟合结合及公式计算结果见图2。
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
其中，x为样品浓度，y为OD值，A、B、C、D为拟合曲线所需参数，其中C值为EC50值。
实施例2
采用Alexa Fluor 647NHS Ester(A20186,life)试剂盒进行荧光标记。
首先制备1M碳酸氢钠溶液，取1.5mL微量离心管，加入100μL碳酸氢钠溶液，1mg抗体及100μL溶解好的Alexa Fluor647NHS Ester(1mL/tube)，室温反应1h，之后使用超滤进行纯化，使用30kDa的超滤管以8000rpm超滤30min，补充纯水后继续超滤出，要求将原有体积液体置换3遍以上，将纯化后的荧光抗体使用BCA蛋白含量检测试剂盒检测浓度并最终稀释至1mg/mL。最后将荧光抗体和常规抗体进行HPLC-SEC检测，观察其峰形和出峰时间的变化。结果见图3。明显可见出峰时间向前(高分子量)移动，与纯抗体本身的峰形有着明显变化。SEC为分子排阻色谱，分子量越大出峰时间越靠前，所以荧光抗体出峰时间前移说原有抗体的分子量增加，继而说明抗体连接上荧光分子。
实施例3
采用SNU-5作为VEGFR2阳性细胞，GES-1作为VEGFR2阴性细胞。
首先将细胞接种在confocal专用玻璃底皿上，待完全贴壁后加入4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗涤3遍后加入实施例2制备的VEGFR2荧光抗体(1μg/mL)，37℃孵育1h，之后加入Hoechst33342(1μg/mL)染色10min。采用激光共聚焦显微镜进行检测拍照。结果如图4所示。结果发现SNU-5细胞和293T中VEGFR2通道结果有着明显区别。而293T细胞可为上皮样细胞，无VEGFR2蛋白表达。所以该实验能够证明抗体具有很好地结合专一性。
之后通过流式细胞检测实验确定GES-1(VEGFR2阴性细胞)，HUVEC(VEGFR2阳性细胞)，SNU-5(VEGFR2阳性的胃癌细胞)几个细胞对VEGFR2荧光抗体的检测能力。简单来说，对1mg/mL的抗体进行1：500-3000稀释，之后采用稀释好的工作液替换细胞皿中的培养基，染色37℃1小时，之后将细胞消化后至于流式细胞仪自动检测，读取第四通道(识别Cy5荧光)。如图5所述，对比各个数据后发现由实施例2制得的VEGFR2荧光抗体对阴性细胞无结合，而对VEGFR2阳性的HUVEC细胞和SNU-5细胞有结合，且1：1000(即1μg/mL)的稀释比小结合后荧光明显与未处理组有差异。说明1μg/mL的工作浓度对于VEGFR2荧光抗体是适合的。
实施例4
本实施例用于说明VEGFR2荧光抗体应用于循环肿瘤细胞检测，联合方法用于肿瘤细胞中VEGFR2表达测定和分类。
首先采用标准CTCs检测方法，主要流程为EPCAM多肽磁珠(购买于中科纳泰)孵育样本，之后采用磁力架吸附磁珠用于阳性细胞的富集，之后对细胞进行洗涤和固定，最后为染色步骤，分为抗体染色和核染色。在抗体检测步骤加入VEGFR2荧光抗体孵育，之后PBS洗涤细胞即可上机检测。
具体方法为：方法操作在荧光显微镜上进行，首先应用EpCAM多肽纳米磁珠抓取上皮样的肿瘤细胞，37℃孵育1小时，经过2次清洗和30min孵育步骤后将其吸附于玻璃板底，对细胞进行多聚甲醛固定30min，在乙醇洗涤步骤后加入封闭液(5％BSA的PBS溶液)后更换为pan-CK(1：800)、CD45抗体(1：200，以上抗体由中科纳泰生物有限公司提供)和实施例2制备的VEGFR2抗体(工作浓度为1μg/mL)染色60min，之后Hoechst33342(1：200,中科纳泰生物有限公司提供)染色2min并洗涤后上机拍照，采用20或40倍镜检测每一个视野。最后将所有图片进行汇总分析。
试剂盒包括：VEGFR2检测抗体，稀释液(PBS)，CTCs标准方法试剂(hoechst33342，pan-CK抗体，CD45抗体，多肽纳米磁珠)，固定液(4％多聚甲醛)，检测用玻璃载玻片和盖玻片。
最后选取胃癌病人1名，抽取血液2mL，采用实施例4方法对其循环肿瘤细胞进行捕获和VEGFR2检测。图6示出了实际胃癌患者外周血通过CTCs标准检测方法中应用本方法后检测结果。根据结果发现，胃癌患者外周血中明显循环肿瘤细胞(DAPI+，CK+，CD45-)，在这些细胞中，有VEGFR2通道激活的细胞，定义为VEGFR+的CTC，也有VEGFR2通道未激活的细胞，定义为VEGFR2-的CTC。以上结果可以很好对循环肿瘤细胞进行再分类
综上，本发明提供的荧光抗体可用于VEGFR2在细胞水平定性分析。本发明涉及检测试剂、试剂优化、细胞水平检测方法，在此基础上在循环肿瘤细胞检测中加入本检测试剂可进行联合检测，能够对循环肿瘤细胞内的VEGFR2进行识别。该方法简单快速，利用荧光定量检测，因此在CTCs标准检测方法的基础上无需增加任何设备，大大降低了检测成本和分析难度。该方法可高度适配于CTCs标准方法。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种用于循环肿瘤细胞检测的VEGFR2荧光标记抗体，其特征在于，所述VEGFR2荧光标记抗体通过Cy5荧光分子标记VEGFR2抗体；其中，所述Cy5荧光分子的荧光基团与CK和CD45的荧光基团无干扰。
2.根据权利要求1所述的荧光标记抗体，其特征在于，所述荧光基团激发光和发射光范围选自红外区和近红外区；
优选地，所述Cy5荧光分子的荧光基团选自以下一种或多种：HEX、TET、GFP、CY5、CY3。
3.根据权利要求1或2所述的荧光标记抗体，其特征在于，所述荧光标记抗体可进一步与具有光学和/或磁学性质纳米材料结合；
优选地，所述纳米材料为金纳米颗粒和/或氧化铁纳米颗粒。
4.一种在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括在循环肿瘤细胞抗体荧光检测时加入如权利要求1至3中任一项所述的VEGFR2荧光标记抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述VEGFR2荧光标记抗体通过培养基稀释，所述培养基中血清含量为1～10％，优选为1～5％，最优选为2％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基选自以下一种或多种：1640培养基、DMEM培养基、F-12培养基；优选为1640培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述VEGFR2抗体的工作浓度为0.1～10μg/mL，优选为0.5～2μg/mL，最优选为1μg/mL。
8.一种循环肿瘤细胞检测试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求1至3中任一项所述的VEGFR2荧光标记抗体。
9.一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至3中任一项所述的VEGFR2荧光标记抗体和循环肿瘤细胞标准检测试剂；
优选地，所述循环肿瘤细胞标准检测试剂包括：荧光标记的CK，CD45检测抗体，Hoechst33342细胞核染料，细胞固定液和多肽纳米磁珠。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的荧光标记抗体在制备用于检测血液中循环肿瘤细胞VEGFR2表达的产品中的应用。
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