CN110988355B - 基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用 - Google Patents

基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用，本发明将外泌体与包被抗体CD63的磁珠共孵育，通过磁性分离法分离富集外泌体，以AptEpCAM‑T作为外泌体的识别元件及催化反应启动元件，然后与发夹结构H1及发夹结构H2共同构建成检测平台，可实现外泌体双膜蛋白共表达的定性检测。本发明采用磁性分离法有效排除了游离或杂质蛋白的干扰，提高检测的准确性和特异性；并采取催化发夹组装技术将单一的目标蛋白转化为大量可检测荧光信号，提高了检测灵敏度，同时，外泌体双膜蛋白检测的设计还提升了检测效率和诊断效能。

Description

基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测 平台及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种外泌体膜蛋白检测技术，特别是涉及一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用，可采用免超离荧光方法同步检测外泌体两种膜蛋白。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。外泌体可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用；外泌体可能通过调控免疫功能，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。外泌体携带的膜蛋白被认为是新型癌症诊断的生物标志物，其最常规的鉴定方法是蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)，但该方法检测耗时长、操作步骤复杂、检测灵敏度低，且需要多重抗体与大量外泌体，不利于外泌体膜蛋白的快速鉴定和临床疾病早期诊断应用。
近年来，研究人员利用不同的传感机制专门设计适用于纳米级尺寸外泌体检测的生物传感技术，由于这些技术需要样品体积少、样品处理简便且设备经济小巧，有望实现外泌体的快速床旁检测(Point-of-care Testing,POCT)。例如Yu等开发并优化了基于磁性分离和CD63适配体识别外泌体的竞争检测新方法(参见An aptamer-based new method forcompetitive fluorescence detection of exosomes[J].Xiaocheng Yu,Lei He；Nanoscale,2019,11(33):15589-15595.)，但该方法只能检测单一膜蛋白，且因目标分子和荧光信号是一对一关系，无放大效应，检测灵敏度低。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用，用于解决现有技术中外泌体膜蛋白检测方法检测灵敏度低、耗时长、操作复杂及只能检测单一膜蛋白等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台的制备方法，包括如下步骤：用抗体CD63包被磁珠，与外泌体孵育，通过磁性分离法分离富集外泌体，以AptEpCAM-T作为外泌体的识别元件及催化反应启动元件，然后与发夹结构H1及发夹结构H2共同构建组成检测平台。
可选地，所述发夹结构H1的序列为：
AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGG GTTCTTCCGTTTCCGTA。
可选地，所述发夹结构H2的序列为：
AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATCC TAAAGCATGAC。
可选地，所述AptEpCAM-T的序列为：
TCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AGGGTTAGGGTTAGGGTT。
可选地，所述发夹结构H1以FAM作为荧光报告基团、以BHQ1作为荧光猝灭基团，所述发夹结构H1的序列为：
FAM-AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT-BHQ1-CTTCCGTTTCCGTA。
可选地，所述磁性分离法包括如下步骤：1)吸取50ul包被CD63抗体的磁珠于PE管中，置于磁力架磁性分离，留取沉淀磁珠；
2)用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液洗涤1次磁珠，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降，留取沉淀，最后用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液重悬沉淀；
3)加入5ul外泌体，摇床孵育18-22h；
4)样品置于磁力架磁性分离，留取沉淀，用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液洗涤2次样品，留取沉淀，即得外泌体。
本发明第二方面提供一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台，所述检测平台包括磁珠包被的抗体CD63、外泌体、外泌体催发链、发夹结构H1及发夹结构H2，所述检测平台能够实现外泌体双膜蛋白共表达的定性检测。
可选地，所述外泌体催发链为AptEpCAM-T，其序列为：
TCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AGGGTTAGGGTTAGGGTT。
可选地，所述发夹结构H1的序列为：
FAM-AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT-BHQ1-CTTCCGTTTCCGTA。
可选地，所述发夹结构H2的序列为：
AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATCC TAAAGCATGAC。
本发明第三方面提供上述检测平台在荧光定性检测外泌体两种膜蛋白上的应用。
可选地，所述检测平台采用荧光定性检测外泌体两种膜蛋白，具体包括如下步骤：(1)将外泌体与包被CD63抗体的磁珠一起孵育；(2)然后用0.1％BSAPBS缓冲液洗涤2次及以上，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降，留取沉淀，加入AptEpCAM-T孵育一段时间，随后用Tris-HCl缓冲液洗涤除去游离未结合的AptEpCAM-T；(3)再加入CHA反应缓冲液、发夹结构H1、发夹结构H2，进行催化发夹组装反应(CHA)；(4)最后磁性分离吸取上清液，检测其荧光信号，判断外泌体上膜蛋白。
可选地，步骤(1)中，所述外泌体与包被CD63抗体的磁珠的用量比为1：10(v/v)。
可选地，步骤(1)中，孵育时间为18-22小时。
可选地，步骤(1)中，所述AptEpCAM-T的浓度为1-5μM。AptEpCAM-T浓度越高，CHA的荧光响应值越大。
可选地，步骤(3)中，所述CHA反应缓冲液为PBS缓冲液、TNAK缓冲液、Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲液；优选地，所述CHA反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
可选地，步骤(3)中，所述CHA反应缓冲液的pH为7-8；优选地，所述CHA反应缓冲液的pH为7.4。
可选地，步骤(3)中，催化发夹组装反应的孵育时间为0.25-2h；优选地，催化发夹组装反应的孵育时间为1h。
可选地，步骤(3)中，催化发夹组装反应的温度为4-42℃；优选地，催化发夹组装反应的温度为37℃。
如上所述，本发明的基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用，具有以下有益效果：
本发明以适配体(AptEpCAM)为识别元件，结合磁性分离和催化发夹组装技术，建立一种免超离的同步检测外泌体两种膜蛋白的荧光方法，可高效鉴别癌细胞来源外泌体上的CD63和EpCAM的共表达。
本检测平台可同时鉴定两种外泌体蛋白的存在，结果直观且检测灵敏度高，因此非常适合于临床标本的快速便携式检测，同时为外泌体多靶标膜蛋白临床快速检测提供新的思路。
本检测平台无需昂贵的大型仪器，采用磁性分离法有效排除游离或杂质蛋白的干扰，提高检测的准确性和特异性；其次，采取催化发夹组装技术将单一的目标蛋白转化为大量可检测荧光信号，提高了检测灵敏度；同时外泌体双膜蛋白检测的设计提升了检测效率和诊断效能，为具有诊断价值的外泌体膜蛋白的双重检测提供了一个通用平台，也为多靶标膜蛋白检测提供可能性，有望成为肿瘤液体活检早期诊断新方法。
附图说明
图1显示为本发明的检测原理图。
图2显示为本发明实施例1中超分辨成像技术对MDA-MB-231细胞外泌体中CD63表征结果图。
图3显示为本发明实施例1中超高速离心法提纯细胞上清液中的外泌体经TEM(A)、NanoSight纳米颗粒粒度分析仪(B)、WB(C)的鉴定结果图。
图4显示为本发明实施例1中外泌体与AptEpCAM-T催发链反应的电泳结果图。
图5显示为本发明实施例2中不同浓度AptEpCAM-T的CHA的荧光光谱图。
图6显示为本发明实施例2中CHA各组分及反应电泳结果图。
图7显示为本发明实施例3中反应缓冲液、反应pH、反应温度和反应时间条件优化图。
图8显示为本发明实施例4中基于磁性分离法和CHA的外泌体双膜蛋白共表达检测平台检测特异性结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用。图1显示为本发明的检测原理图。
如图1所示，本检测平台，是用抗体CD63包被磁珠，与外泌体孵育后，通过磁性分离法分离富集外泌体，然后以AptEpCAM-T作为外泌体的识别元件及催化反应启动元件，与以FAM作为荧光报告基团、BHQ1作为荧光猝灭基团的发夹结构H1及发夹结构H2共同构建而成。本检测平台能够实现外泌体双膜蛋白共表达的定性检测。
其中，发夹结构H1的序列为：
FAM-AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT-BHQ1-CTTCCGTTTCCGTA；
发夹结构H2的序列为：
AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATCC TAAAGCATGAC；
AptEpCAM-T的序列为：
TCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AGGGTTAGGGTTAGGGTT。
具体实施过程如下：
实施例1
基于磁性分离法富集和催化发夹组装(CHA)的外泌体双膜蛋白检测平台的可行性分析
1、采用超分辨显微镜成像与免疫印迹实验验证CD63蛋白在外泌体膜上的表达
利用超分辨成像技术表征CD63蛋白与外泌体膜的共定位，从而验证CD63在细胞系来源外泌体膜上的表达。
(1)超分辨成像技术的实验方法如下：
1)PLL-coated coverslip(多聚赖氨酸包被爬片)，用50μl 1mg/ml的Poly-L-lysine覆盖在拍摄皿上，常温30min孵育，适量PBS洗涤3次。
2)10μL样品+40μL PBS中(设置不同浓度)，50μL加在拍摄皿，常温孵育30min。
3)在遮光的EP管中加入50μL Dilution C(稀释液C)和0.25μL PKH67染料，混匀。
4)将混匀的PKH67悬液加入到拍摄皿中，室温孵育4min，轻摇。
5)吸去溶液后加入100μL的1％BSA孵育2min，适量PBS清洗三次。
6)加入50μL 1：400的CD63抗体孵育1h，适量PBS清洗三次。
7)使用1：2000稀释的羊抗兔Alexa Fluor 647标记荧光二抗孵育40min，PBS清洗3次。
8)PBS覆盖样品区，4℃保存。
9)将PBS吸弃后，换成超分辨成像缓冲液覆盖整个样品区域。
10)使用超分辨率显微镜系统在488nm和647nm波长激光下进行照射后捕获图像。
(2)免疫印迹实验方法(WB)如下：
1)WB上样准备：4份外泌体/细胞蛋白样品与1份上样缓冲液(Loading buffer)混匀，100℃水煮10min，-20℃冰箱储存备用。
2)WB胶准备：
①配制12％下胶：吸取H2O 4ml，30％丙烯酰胺3.3ml，10％SDS 100ul，AP 100ul，TEMED100ul(最后加入混匀)于50mlPE管。盖上盖子混匀，迅速加入至距离切角玻璃上约2cm，避免产生气泡。
②配制5％上胶：吸取H2O 2ml，30％丙烯酰胺0.75ml，10％SDS 45ul，AP 45ul，最后加入TEMED 6ul于50mlPE管，盖上盖子混匀数次，迅速加入至满。
③插入梳子(梳子需干净，以免有气泡。如有气泡，稍拔出梳子，驱赶气泡)，室温静置(也可放37℃水浴箱)。
④待约45分钟，上胶完全凝固后(也可查看旁边PE管配置的上胶液体凝固状态)，拔出梳子，玻璃板装进WB装置槽，加入SDS缓冲液至离顶5mm，查看液体是否外漏。
3)样品加样：
WB装置槽无液体外漏，装入电泳槽，倒入1X缓冲液至第一个或第二个槽液体水平线(根据WB装置槽个数)；微量注射器使用前需来回拉动，不能太紧或太松，吸取预染蛋白Marker5ul，样品10μg，针尖伸入加样孔底部加样，缓慢推样品。
4)电泳：
电泳槽盖上电源盖，设置电泳电压80v，20min，样品浓缩条带将要移到分离胶时，暂停电泳，设置电泳参数：120v，继续电泳至溴酚蓝到达WB装置槽底部。
5)转膜
①切胶：取下胶板，缓慢打开大小玻璃板，按照marker电泳条带所标分子大小，切下目标蛋白分子电泳条带，准备PVDF膜(做好标志以明白那面是转膜面)和N张滤纸根据切胶大小。
②膜和滤纸预处理：准备10ml甲醇、10ml蒸馏水、10ml转膜缓冲液，PVDF膜依次处理时间：10秒、3分钟、5分钟；滤纸也需在转膜缓冲液处理5分钟。
③转膜夹制作：转膜夹打开，制作“三明治”，黑面底层：海绵垫+4张滤纸，中间层：标本切胶+PVDF膜，上层：4张滤纸+另一边海绵垫，整个过程在转移液中进行操作，每次操作逐层铺并处理掉气泡,。固定好后合上转膜夹，按颜色顺序配对放入转膜槽中，在转膜槽中加足够的转膜缓冲液和冰袋，盖上电源盖子，设置电流200A，电泳时间1h。整个转膜槽置在冷水盘中(冰袋保持低温)。
6)封闭、一抗、二抗孵育
电泳结束，如PVDF膜上出现marker条带，可说明蛋白电转成功。封闭处理：膜置于PE管(含封闭液)，常温环境，摇床80rpm/min封闭2h(对于抗体特异性较差的试验可置于4℃冰箱孵育过夜)，以封闭膜上的非特异性位点。
一抗孵育处理：4℃冰箱，摇床孵育过夜；二抗孵育处理：室温摇床孵育1-2小时，每次抗体孵育结束用TBST洗膜3次，一抗清洗时间：5分钟，二抗清洗时间：10分钟。
7)曝光液配置
1ml曝光液A和1ml曝光液B液混合，混匀，置于平皿中；把膜放在滤纸面上轻轻滤干，然后浸入平皿中完成曝光程序；取出膜，ChemiDocXRS仪器和软件分析各条带的蛋白含量。
图2显示为超分辨成像技术对MDA-MB-231细胞外泌体中CD63的表征结果图。(比例尺为200nm)(MDA-MB-231细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。)
如图2所示，A、B、C图是2D模式，D、E、F图是3D模式，红色通道(A、D图)与绿色通道(B、E图)荧光分别代表CD63抗体-AF647荧光二抗及PKH67染色的外泌体膜，两者共定位良好(C、F图为A-B图、D-E图的融合图像)，说明MDA-MB-231细胞来源外泌体上有表达CD63蛋白。
图3显示为超高速离心法提纯细胞上清液中的外泌体经TEM(A)、NanoSight纳米颗粒粒度分析仪(B)、WB(C)的鉴定结果图。免疫印迹实验显示，外泌体CD63蛋白表达明显，结果见图3C。
2、外泌体与AptEpCAM-T催发链反应电泳
1、实验方法：1AptEpCAM-T催发链与不同数量(1.33×109、3.99×109、7.98×109)外泌体常温反应1h(总体积10l,Tris-HCl补齐)，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2、实验结果：
图4显示为外泌体与AptEpCAM-T催发链反应的电泳结果图。其中泳道1：Marker；泳道2：1μM AptEpCAM-T；泳道3:外泌体；泳道4:1μM AptEpCAM-T+1μL外泌体；泳道5:1μM AptEpCAM-T+3μL外泌体；泳道6:1μMAptEpCAM-T+6μL外泌体；泳道7:5μM AptEpCAM-T。
从图4中可以得知，外泌体属于大分子，电泳时在原点(泳道3)，泳道无条带。1μMAptEpCAM-T+1μL外泌体(泳道4)有条带，1μM AptEpCAM-T+3μL外泌体(泳道5)无条带，说明随着外泌体量增加，适配体AptEpCAM-T与外泌体完全结合,泳道无条带，验证了AptEpCAM序列能够识别并结合外泌体。
实施例2
基于磁性分离法和催化发夹组装(CHA)的外泌体双膜蛋白检测平台的可行性验证
为了验证基于磁性分离法和CHA的外泌体双膜蛋白检测平台的可行性，我们进行了以下实验：
1)吸取50ul包被CD63抗体的磁珠于1.5ml PE管，置于磁力架磁性分离，留取沉淀磁珠。
2)用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液洗涤1次磁珠，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降(PE管先侧放30秒，立放60秒)，留取沉淀，最后用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液重悬沉淀。
3)加入5ul外泌体(4.01×1011/mL)，摇床孵育18-22h。
4)样品置于磁力架磁性分离，留取沉淀；用200ul0.1％BSA PBS缓冲液洗涤2次样品，留取沉淀。
5)加入3μL，5μM的AptEpCAM-T摇床孵育60min。
6)随后用Tris-HCl缓冲液洗涤除去游离未结合的AptEpCAM-T，加入54μL，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液、3μL，5μM的发夹结构H1、3μL，5μM的发夹结构H2摇床孵育60min(避光)，磁性分离吸取上清液，检测其荧光信号。
图5显示为不同浓度AptEpCAM-T的CHA的荧光光谱图，其中，(a)H1+H2；(b)1μMAptEpCAM-T+H1+H2；(c)3μM AptEpCAM-T+H1+H2；(d)5μM AptEpCAM-T+H1+H2。
从图5中可以得知，随着AptEpCAM-T浓度的增加，CHA的荧光响应值明显增加，与对照组(图5-a)相比，实验组(图5-d)的荧光响应值信噪比(S/N)约为对照组(图5-a)的7.5倍。
图6显示为CHA各组分及反应电泳结果图，其中，泳道1：Marker；泳道2：H1；泳道3：H2；泳道4：AptEpCAM-T；泳道5：H1+H2；泳道6：AptEpCAM-T+H1；泳道7：AptEpCAM-T+H1+H2。
从图6中可以得知，CHA各组分纯度高，发夹结构H1+H2自反应程度低，发夹结构H1合H2在AptEpCAM-T存在的条件下能发生有效的链置换反应，生成新的核酸条带。
上述结果说明，本发明的基于磁性分离法和CHA的外泌体双膜蛋白检测平台具有可行性。
实施例3
催化发夹组装(CHA)条件优化试验
验证本发明实验原理具有可行性后，我们进行一系列的条件优化摸索。
1、条件优化实验：
1)发夹结构H1、发夹结构H2、催发链T的浓度调为5uM。
2)催化发夹组装反应体积和各组分用量如下：
实验组：3ul发夹结构H1+3ul发夹结构H2+3ul催发链T+51ul缓冲液
对照组：3ul发夹结构H1+3ul发夹结构H2+54ul缓冲液
3)上机LS-55荧光分光光度计检测两组荧光，计算信噪比。
4)缓冲液优化试验：缓冲液(PBS、TNAK、Hepes和Tris-HCl)分别进行1)至3)的实验，常温反应时间1小时，避光。不同时段重复进行两次实验。
5)反应pH优化试验：缓冲液Tris-HCl不同PH(7.2、7.4和7.6)分别进行1)至3)的实验，常温反应时间1小时，避光。不同时段重复进行两次实验。
6)反应时间优化试验：PH7.4缓冲液Tris-HCl进行1)至3)的实验，反应时间设计为0.25h、0.5h、1h和2h，常温反应，避光。不同时段重复进行两次实验。
7)反应温度优化试验：PH7.4缓冲液Tris-HCl进行1)至3)的实验，反应温度设计为4℃、25℃、37℃和42℃，反应时间1小时，避光。不同时段重复进行两次实验。
2、实验结果：
图7显示为反应缓冲液、反应pH、反应温度和反应时间条件优化图。
如图7所示，图7-A为CHA缓冲液为PBS、TNAK、Hepes和Tris-HCl时的荧光信号响应值；图7-B为缓冲液Tris-HCl在pH 7.2、7.4和7.6条件下的荧光信号响应值；图7-C表示反应时间为0.25h、0.5h、1h和2h的荧光响应值；图7-D分别是反应温度为4℃、25℃、37℃和42℃的荧光响应值。
根据条件优化结果选取最佳条件进行后续实验。本方法在Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，37℃的条件下反应60min即可到达荧光响应最大值。
实施例4
基于磁性分离法和催化发夹组装(CHA)的外泌体双膜蛋白检测平台特异性试验
对两种细胞来源外泌体进行本检测平台特异性验证。
1、试验方法：
在最优反应条件下，我们用本检测平台对不同细胞来源的外泌体膜蛋白EpCAM进行荧光检测，同时记录乳腺癌细胞外泌体(MDA-MB-231exo)、人正常乳腺上皮细胞外泌体(MCF-10a exo)的荧光响应值信噪比，本实验重复进行两次。
1)50μL包被CD63抗体的磁珠放入1.5mlPE管，置于磁力架磁性分离，留取沉淀，200ul0.1％BSA PBS缓冲液洗涤1次，最后200ul 0.1％BSA PBS缓冲液重悬沉淀。
2)加入5μL外泌体，摇床孵育18h。
3)样品置于磁力架上磁性分离，留取沉淀，200ul 0.1％BSAPBS缓冲液洗涤2次，200ul Tris-HCl缓冲液(PH7.4)重悬沉淀。
3)加入3μL，5μM的AptEpCAM-T摇床孵育60min。
4)样品磁力架上磁性分离取沉淀，Tris-HCl缓冲液(PH7.4)洗涤2次除去游离未结合的AptEpCAM-T，留取沉淀。
5)54μL，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，依次加入3μL，5μM的发夹结构H2和3μL，5μM的发夹结构H1，摇床孵育60min，避光。
6)磁性分离吸取上清液，上机LS-55荧光分光光度计检测两组荧光，计算信噪比。
图8显示为基于磁性分离法和CHA的外泌体双膜蛋白共表达检测平台检测特异性结果图。
如图8所示：人正常乳腺上皮细胞(MCF-10a exo)荧光检测响应值信噪比:1.10±0.01，乳腺癌细胞外泌体(MDA-MB-231exo)荧光检测响应值信噪比:2.09±0.08，说明本检测平台对于不同种类的细胞来源外泌体膜蛋白检测荧光检测信号有识别度。
综上所述，本发明以适配体(AptEpCAM)为识别元件，结合磁性分离和催化发夹组装技术，建立一种免超离的同步检测外泌体两种膜蛋白的荧光方法，可高效鉴别癌细胞来源外泌体上的CD63和EpCAM的共表达，结果直观且检测灵敏度高，非常适合于临床标本的快速便携式检测，同时为外泌体多靶标膜蛋白临床快速检测提供新的思路。
本检测平台无需昂贵的大型仪器，采用磁性分离法可有效排除游离或杂质蛋白的干扰，提高检测的准确性和特异性；采取催化发夹组装技术将单一的目标蛋白转化为大量可检测荧光信号，提高了检测灵敏度；同时外泌体双膜蛋白检测的设计提升了检测效率和诊断效能，为具有诊断价值的外泌体膜蛋白的双重检测提供了一个通用平台，也为多靶标膜蛋白检测提供可能性，有望成为肿瘤液体活检早期诊断新方法。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方
法与应用
<130> PCQNF198534
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发卡结构H1
<400> 1
aaccctaacc ctaaccctcc atgtgtagaa gggttagggt tcttccgttt ccgta 55
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发卡结构H2
<400> 2
aacccttcta cacatggagg gttagggttc catgtgtaga tcctaaagca tgac 54
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AptEpCAM-T
<400> 3
tcactacaga ggttgcgtct gtcccacgtt gtcatggggg gttggcctga gggttagggt 60
tagggtt 67

Claims (7)

1.一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：用抗体CD63包被磁珠，与外泌体孵育，通过磁性分离法分离富集外泌体，以AptEpCAM-T作为外泌体的识别元件及催化反应启动元件，然后与发夹结构H1及发夹结构H2共同构建组成检测平台，所述检测平台能够实现外泌体双膜蛋白CD63和EpCAM共表达的定性检测；
所述发夹结构H1以FAM作为荧光报告基团、以BHQ1作为荧光猝灭基团，所述发夹结构H1的序列为：
FAM-AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT-BHQ1-CTTCCGTTTCCGTA；
所述发夹结构H2的序列为：
AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATCCTAAAGCATGAC；
所述AptEpCAM-T的序列为：
TCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-AGGGTTAGGGTTAGGGTT；
所述磁性分离法包括如下步骤：
1)吸取50ul包被CD63抗体的磁珠于PE管中，置于磁力架磁性分离，留取沉淀磁珠；
2)用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液洗涤1次磁珠，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降，留取沉淀，最后用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液重悬沉淀；
3)加入5ul外泌体，摇床孵育18-22h；
4)样品置于磁力架磁性分离，留取沉淀，用200ul 0.1％BSA PBS缓冲液洗涤2次样品，留取沉淀，即得外泌体；
所述检测平台采用荧光定性检测外泌体两种膜蛋白，包括如下步骤：
(1)将外泌体与包被CD63抗体的磁珠按照1：10(v/v)的用量比一起孵育18-22小时；
(2)然后用0.1％BSA PBS缓冲液洗涤2次及以上，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降，留取沉淀，加入浓度为1-5μM的AptEpCAM-T孵育一段时间，随后用Tris-HCl缓冲液洗涤除去游离未结合的AptEpCAM-T；
(3)再加入CHA反应缓冲液、发夹结构H1、发夹结构H2，进行催化发夹组装反应，催化发夹组装反应的孵育时间为0.25-2h，温度为4-42℃；所述CHA反应缓冲液为PBS缓冲液、TNAK缓冲液、Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为7-8；
(4)最后磁性分离吸取上清液，检测其荧光信号，判断外泌体上膜蛋白。
2.一种根据权利要求1所述的方法制备得到的基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。
3.一种非疾病诊断或治疗目的的外泌体双膜蛋白共表达检测方法，其特征在于：采用权利要求2所述的检测平台进行，所述检测平台采用荧光定性检测外泌体两种膜蛋白，包括如下步骤：
(1)将外泌体与包被CD63抗体的磁珠按照1：10(v/v)的用量比一起孵育18-22小时；
(2)然后用0.1％BSA PBS缓冲液洗涤2次及以上，每次洗涤将样品置于磁力架上使其充分沉降，留取沉淀，加入AptEpCAM-T孵育一段时间，随后用Tris-HCl缓冲液洗涤除去游离未结合的AptEpCAM-T；
(3)再加入CHA反应缓冲液、发夹结构H1、发夹结构H2，进行催化发夹组装反应，催化发夹组装反应的孵育时间为0.25-2h，温度为4-42℃；所述CHA反应缓冲液为PBS缓冲液、TNAK缓冲液、Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为7-8；
(4)最后磁性分离吸取上清液，检测其荧光信号，判断外泌体上膜蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述CHA反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述CHA反应缓冲液的pH为7.4。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，催化发夹组装反应的孵育时间为1h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，催化发夹组装反应的温度为37℃。
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