CN106520764B - 一种纳米-双环状适配体探针及其应用 - Google Patents

一种纳米-双环状适配体探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米‑双环状适配体探针及其应用。该纳米‑双环状适配体探针（G‑dApR）极其稳定，不会被体内DNA降解酶所降解。同时，可特异性识别并与血癌细胞表面高表达的生物标记物相结合，且能有效抑制目标细胞的生物活性。本探针的设计是基于适配体技术和纳米技术这两项肿瘤领域的先进技术而研发的。首先，采用核酸修饰手段将常规的线性适配体结构改造成包含功能区（特异性）和双环DNA区（稳定性）的结构，大大提高了其生物稳定性。然后，通过将环状适配体和树枝状纳米材料PAMAM相结合，最终构建出本探针。本发明大大改善了适配体不稳定的缺点，为血癌检测提供了有效手段，并且有望实现高灵敏度的诊疗一体化临床应用。

Description

一种纳米-双环状适配体探针及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种纳米-双环状适配体探针及其应用。
背景技术
肿瘤因其发生率高、危害性大、难以治愈、疾病症状严重影响生存质量、且治疗费用昂贵等特点，已经成为目前人类急需攻克的一大类疾病。据世界卫生组织最近公布的统计资料显示，目前全世界癌症患者约达1400万，每年新发病人数约700万，每年约有500万人死于癌症，也就是说，约每6秒钟就有1人死于癌症。同时，中国国家癌症登记中心（NCCR)发布的2015年中国癌症的统计数据也显示出，2015 年中国预计有429.2 万例新增癌症病例和 281.4万例癌症死亡病例。
在癌症的众多分型中，血癌，也叫做白血病，作为临床上较为常见的血液恶性疾病，也是最为多发的肿瘤之一。据报道，我国各地区血癌的发病率在各种肿瘤中占第六位。
作为一类造血干细胞恶性克隆性疾病，克隆性血癌细胞主要表现为通过增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等，通过在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能来影响人的健康。主要症状包括发热、炎症以及出血等，但因为血癌具有极高的异质性，所以患者病情的临床表现也是多样化的,在诊断中主诉症状有较大差异,进而易引起漏诊或误诊,而延误患者的治疗。虽然近年来,随着细胞学、分子生物学及免疫学的不断发展和应用，血癌的临床确诊率得到大幅提升。对于典型血癌，因其具有特殊的形态学特点,通常可通过血常规和细胞形态学予以确诊。但对于不具典型的血癌，则因发病较为特殊,临床表现多样而又复杂,所以要实现即时准确的诊断有较大难度。有报道称,血癌的临床误诊率高达25%。并且由于分型和预后分层复杂，在血癌的治疗方案上，并没有一个统一化的治疗方法，而是需要结合细致的分型和预后分层制定治疗方案。目前主要几类治疗方法为，化学治疗﹑放射治疗﹑靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等。
综上所述，开发一种基于靶向诊疗于一体的、高灵敏度并且高特异性诊断血癌的探针意义重大。
对于靶向识别肿瘤细胞，适配体探针作为能够特异性和肿瘤细胞标志物相结合的一段单链寡核苷酸DNA，就是一项非常好的新型的技术，其具有分子量小，稳定性好，低毒性并且检测灵敏度高等优点，已经被广泛用于对体内肿瘤细胞的检测研究。但由于环境中大量核酸酶的存在，线性适配体会发生降解。如人们熟知的T4 DNA聚合酶就具有单链DNA特异性的3'到5'端的外切酶活性。而环状DNA独特的闭合结构赋予其缺乏酶识别端口的特点，因此可以避免被DNA剪切酶的识别，从而免于酶解，而最终维持稳定性。同样，利用DNA的碱基互补配对原理，来控制DNA二级结构的研究在核酸领域也有报道。
另一方面，在纳米技术这一相对成熟的研究领域，有报道表明，适配体探针和纳米材料相结合能够提升其特异性，并且，纳米材料作为性能良好的小体积容器，具有同时承载多个元件的特点，可以为后续的进一步研究提供基础。
基于上述研究背景，本发明根据线性适配体探针易降解这一缺陷，提出了环状适配体的概念，将一段已经筛选到的能够特异性识别血癌细胞株Rccf-CEM的线性适配体探针进行闭环结构改造，利用其独特的双环杂交结构使得其在形成闭环结构从而隐藏端口的同时，也能够控制二级结构，使其功能段的序列暴露出来，进而维持了特异性。然后，将上述双环适配体探针和修饰有羧基的纳米材料PAMAM-G4.5相结合，以进一步增强其特异性，并为下一步连接更多原件和有效抑制被捕获细胞的活性提供可能。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种极其稳定的纳米-双环状适配体探针，并用于血癌细胞的特异性检测和活性抑制。
为解决上述技术问题本发明所采取的技术方案如下：
一种极其稳定的纳米-双环状适配体探针（G-dApR），它以由羧基修饰的树枝状纳米PAMAM分子，与FAM基团和biotion基团修饰的具有双环结构的环状适配体探针（dApR）通过streptavidin抗体相结合所组成；
其中，环状适配体探针dApR的合成，是由碱基数目不同的一个单环状适配体和一个单环状寡核苷酸杂交互补得到的，同时包含赋予探针特异性的功能区和改善探针稳定性的双环DNA区的环状结构。
其中，单环状适配体和单环状寡核苷酸均由与之相对应的线性单链DNA闭环反应得到：
线性单链DNA包括线性适配体链（Ap）和线性寡核苷酸链(C1)。
其中，所述的线性适配体链（Ap）为：
5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAATCTACGACTCGAT（FAM）C TAACTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3'；
线性适配体链闭环所需要的模板（T- Ap）为：
5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3'；
其中，线性寡核苷酸链(C1)为：
5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3'；
所述的线性寡核苷酸链闭环所需要的模板（T-C1）为：
5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。
其中，上述具有高特异性的线性适配体链（Ap）的设计是基于Cell-SELEX技术，以血癌细胞Rccf-CEM细胞表面高表达的蛋白PTK7为识别靶标，并借助序列结构分析的权威科研软件(http://mfold.rna.albany.edu/)设计的；
并且，依据碱基互补配对原则，设计可使线性适配体探针Ap闭环的模板寡核苷酸T- Ap、可与闭环后的Ap部分序列互补配对形成双环结构的小环的线性寡核苷酸C1、以及C1闭环所需模板T-C1，其中，T- Ap和Ap的3’端和5’端两个端口的部分序列互补，C1和T-C1的3’端和5’端两个端口的部分序列互补，C1和部分Ap部分序列互补，并且，Ap含有Biotin和FAM两个基团；
上述纳米-双环状适配体探针的制备方法包括具有双环结构的环状适配体探针（dApR）的合成，以及将具有双环结构的环状适配体探针（dApR）和纳米材料PAMAM相结合两大步骤：
其中，所述具有双环结构的环状适配体探针dApR的合成方法，包括如下步骤：
（1）将线性适配体 Ap或线性寡核苷酸C1（10nM）加入到含有其1/3体积的 ATP 和1/2体积的Polynucleotide Kinase（T4 PNK）酶的缓冲液体系中，用dd H2O稀释十倍后，置于37℃金属浴中，震荡反应30 min后，90℃退火5min，降至室温，得到磷酸化的Ap或C1；
（2）将T- Ap或T-C1（10nM）按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反应摩尔比为1：1.3的比例分别加入到步骤（1）得到的溶液中，并加入步骤（1）Ap或C1体积的2倍的10×LigaseBuffer 及4倍体积的dd H2O ，混匀，置于恒温金属浴中90℃退火5min后，55 ℃振荡反应2h，待反应产物冷却至室温后，加入步骤（1）Ap或C1体积的1/3体积T4 DNA Ligase ，于金属浴中16 ℃反应2 h，反应结束后，65℃失活10min，降至室温，得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相杂交互补而形成的环状DNA；
（3）向步骤（2）得到的体系中分别加入步骤（1）Ap或C1体积的6倍体积的dd H2O 、4倍体积的10×T4 DNA Polymerase Buffer、1/3体积的及T4 DNA Polymerase，混匀后于恒温金属浴中37℃振荡反应16 h，结束后85 ℃失活10 min，降至室温，得到单链的环状适配体ApR或单链环状寡核苷酸C1；
（4）向上述体系中分别加入其体积1/10的3 M醋酸钠溶液（20 μL）和其体积2.5倍无水乙醇（500 μL），充分混匀后，竖直于-20 ℃放置1 h，结束后离心弃去上清，保留底部沉淀。沉淀用500 μL 的70% 乙醇（-20℃）打散，于4℃离心弃去上清，保留底部沉淀，将产物干燥。得到纯化后的单链的环状适配体ApR或单链环状寡核苷酸C1。
（5）将步骤（4）得到的碱基数目较多的单链的环状适配体ApR和碱基数目较少的单链环状寡核苷酸C1进行互补杂交，得到含功能区（特异性）和双环DNA区（稳定性）的适配体探针dApR。
其中，所述的纳米-双链环状适配体探针G-dApR制备方法，包括如下步骤：
（1）取末端为128个羧基的4.5代聚酰胺-胺型树枝状分子（G4.5）溶于 dd H2O中，并按照10倍于G4.5 的摩尔比例加入过量EDC、NHS后，温和搅拌活化反应2 h。将上述反应得到的体系置于10,000 MWCO透析袋中，透析24h，得到末端羧基活化的G4.5溶液；
（2）向步骤（1）得到的溶液中加入链霉亲和素（Stre），温和搅拌反应过夜，次日加入环状结构适配体探针dApR，温和搅拌反应2 h，G4.5、dApR和Stre的摩尔比（2-4）：（2-4）：1。反应结束后，用50,000超滤管离心，最终得到G-dApR纳米-适配体探针。
制备得到的纳米-双环状适配体探针可用于特异性捕获高表达肿瘤标志物蛋白PTK7的血癌细胞，实现可视化检测，并且能有效抑制被捕获细胞的活性。
其中，将目标肿瘤细胞Rccf-CEM分别与上述的线性适配体Ap、具有双环状结构的适配体探针dApR、以及纳米-双链环状适配体探针G-dApR共孵育，探针的和靶蛋白相结合则使得被识别的细胞具有荧光信号，以此判断G-dApR捕获识别目标血癌细胞的水平。
本发明的有益效果：本发明提出的将常规的线性适配体探针改造成具有双环结构的适配体探针，在序列不发生改变的情况下，适当控制适配体的二级结构：首先，形成的环状结构可以有效躲避多种酶的降解；其次，双环结构的存在限制了功能功能段序列和非功能段的自身折叠等可能，进一步提高稳定性的同时，更维持甚至提升了探针的特异性。除此之外，本发明将适配体探针和纳米材料相结合的实践，不仅改善了探针的特异性，更有效抑制了被捕获血癌细胞的活性。
综上所述，本发明的优点在于：G-dApR探针具有以下优点：1.特异性强；2.稳定性好：3.有效抑制被捕获到的血癌细胞的活性。本发明在大大改善稳定性的同时实现高特异性捕获血癌细胞并抑制其活性，在血癌的诊断和治疗中表现出一定的优势，有望于突破血癌临床诊断难的技术瓶颈。
附图说明
图1：为本发明所述的单环状DNA闭环反应电泳验证结果图。图中：1泳道为：Ap；2泳道为：ApR；3泳道为：线性C1；4泳道为：环状C1。
图2：为本发明所述的具有双环结构的的探针闭环的电泳验证结果。图中：1泳道为：Ap；2泳道为：ApR；3泳道为：具有双环结构的适配体探针dApR。
图3：为本发明的探针构建过程中得到的几个改造结构后的环状适配体探针和阴性对照相比对目标血癌细胞的特异性捕获的能力的流式验证结果图。
图4：为验证本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR是否构建成功的电泳检测结果图。图中：Maker泳道的DNA分子量标准（Low Molecular Weight DNA Ladder）；1泳道为：dApR；2泳道为：G-dApR。
图5：为激光共聚焦显微镜下三个不同通道模式下观察到的纳米-双环状适配体探针G-dApR的形态。其中，Photo为明场模式下拍摄到的图像，FAM为明场同一视野和焦距下FAM通道所拍摄的图像，代表探针中荧光基团FAM被激发后所发射出的荧光，Merge代表上述两个通道的叠加。
图6：为本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR的Zeta电位检测结果，其中样本1、2、3分别代表G、dApR和G-dApR。
图7：为本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR在三个不同PH值缓冲液环境中放置不同时间后检测到的其中G-dApR的残余量（% G-dApR ramaining）所绘制的柱状结果图；
图8：为本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR分别与目标细胞Rccf-CEM和非目标细胞Ramos共孵育后用激光共聚焦显微镜检测观察其于目标细胞特异性结合的结果图。图中：分别展示了在相同拍摄条件的得到的DAPI通道、FAM通道，以及代表上述两个通道相叠加的图像。
图9：为不同浓度的本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR，与目标细胞Rccf-CEM和非目标细胞Ramos共培养24h后，用MTT检测法得到的，G-dApR对目标细胞以及非目标细胞的活性抑制的程度的柱形图。
图10：为不同浓度的本发明所述的纳米-双环状适配体探针G-dApR、以及本发明所用的纳米材料G与目标细胞Rccf-CEM和非目标细胞Ramos共培养24h后，用AO/EB染色法处理后的细胞在荧光显微镜下的观察结果图，反映G-dApR促使目标细胞和非目标细胞凋亡的程度。
图11：为本发明所述的纳米-双链环状适配体探针G-dApR，在用裸鼠构建的模拟的体内循环肿瘤细胞条件下对其检测结果。其中Photo代表在明场模式下拍摄到的图像，Hochest以及FAM通道分别代表和明场模式相同拍摄条件、这两种荧光检测模式下，拍摄到的照片。Merge1代表Hochest和FAM两个通道图像的叠加，Merge2代表Photo、Hochest以及FAM三个通道下的图像叠加。
图12双环结构的环状适配体探针dApR的合成示意图。
图13纳米-双链环状适配体探针G-dApR的合成示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：线性适配体的设计
以目标血癌细胞RccF-CEM细胞膜表面高表达的肿瘤生物标记物蛋白PTK7为模板，基于Cell-SELEX技术，设计可与PTK7蛋白高特异性结合的适线性配体Ap；
依据碱基互补配对原则，设计可使线性Ap闭环的模板T-Ap、可与闭环后的Ap部分序列互补配对形成双环结构的小环的线性C1、以及C1闭环所需模板T-C1，其中，T-Ap和Ap的3’端和5’端两个端口的部分序列互补，C1和T-C1的3’端和5’端两个端口的部分序列互补，C1和部分Ap部分序列互补，并且，Ap含有Biotin和FAM两个基团。
所用到的引物序列如下：
其中，线性适配体链（Ap）为：
5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAATCTACGACTCGAT（FAM）C TAACTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3'；
线性适配体链闭环所需要的模板（T-Ap）为：
5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3'；
其中，线性寡核苷酸链(C1)为：
5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3'；
所述的线性寡核苷酸链闭环所需要的模板（T-C1）为：
5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。
实施例2：将线性适配体改造为具有功能区和双环区的适配体探针
将稀释为10μM的Ap经形单环成环反应。反应步骤为：（1）于恒温金属浴37℃中振荡反应30 min进行磷酸化反应；（2）55 ℃振荡反应2 h进行ligase连接反应；（3）去模板；（4）产物纯化，；最终得到单一的、闭合环状ApR，按照同法得到C1，并且C1的较ApR小。然后将ApR和C1进行互补杂交，得到具有双环结构和功能区域的适配体探针。
具体包括如下步骤：
（1）将线性适配体 Ap或线性寡核苷酸C1（10nM）加入到含有其1/3体积的 ATP 和1/2体积的Polynucleotide Kinase（T4 PNK）酶的缓冲液体系中，用dd H2O稀释十倍后，置于37℃金属浴中，震荡反应30 min后，90℃退火5min，降至室温，得到磷酸化的Ap或C1；
（2）将T- Ap或T-C1（10nM）按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反应摩尔比为1：1.3的比例分别加入到步骤（1）得到的溶液中，并加入步骤（1）Ap或C1体积的2倍的10×LigaseBuffer 及4倍体积的dd H2O ，混匀，置于恒温金属浴中90℃退火5min后，55 ℃振荡反应2h，待反应产物冷却至室温后，加入T4 DNA Ligase ，于金属浴中16 ℃反应2 h，反应结束后，65℃失活10min，降至室温，得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相杂交互补而形成的环状DNA；（3）向步骤（2）得到的体系中分别加入步骤（1）Ap或C1体积的6倍体积的dd H2O 、4倍体积的10×T4 DNA Polymerase Buffer、1/3体积的及T4 DNA Polymerase，混匀后于恒温金属浴中37℃振荡反应16 h，结束后85 ℃失活10 min，降至室温，得到单链的环状适配体ApR或单链环状寡核苷酸C1；
（4）向步骤（3）获得的体系中分别加入其体积1/10的3 M醋酸钠溶液（20 μL）和2.5倍体积无水乙醇（500 μL），充分混匀后，竖直于-20 ℃放置1 h，结束后离心弃去上清，保留底部沉淀。沉淀用500 μL 的70% 乙醇（-20℃）打散，于4℃离心弃去上清，保留底部沉淀，将产物干燥。得到纯化后的单链的环状适配体ApR或单链环状寡核苷酸C1。
（5）将步骤（4）得到的碱基数目较多的单链的环状适配体ApR和碱基数目较少的单链环状寡核苷酸C1进行互补杂交，得到含功能区（特异性）和双环DNA区（稳定性）的适配体探针dApR。
实施例3：变性胶电泳验证具有功能区和双环区的适配体探针构建成功
第一部分为采用变性胶电泳技术验证单环闭环产物的成功合成，首先，制备10%变性大块凝胶（Urea-PAGE），将合成的单环状适配体ApR和用于双环结构构建的内环C1，以及与之相对应的线性单链DNA，在相同条件下，经行变性胶电泳，根据环状DNA的泳动速度相对于线性DNA较慢的定论来验证单环状适配体的构建工作是否成功。如图1所示，环状DNA的条带明显高于线性DNA的，说明泳动速度更慢，证明单环状DNA的成功构建。
第二部分，在验证单环闭环合成成功之后，以第一部分相同的方法来验证双环适配体的构建工作是否成功。如图2所示，具有双环结构的dApR的条带一次高于单环状的ApR、和线性适配体Ap，证明具有双环结构的适配体探针的成功构建。
实施例4:用流式细胞仪考察双环状适配体探针特异性捕获目标细胞的能力
为了验证经过结构改造的适配体仍然具有特异性识别捕获目标肿瘤细胞的能力，采用流式细胞术的方法，来观察将环状适配体探针和目标细胞共孵育后的细胞被捕获的情况。
具体方法为：于常规条件下培养实验所需细胞悬浮株Rccf-CEM，待细胞生长至对数生长期，取约8×105个细胞加入到200 μL结合缓冲液（由含有20% FBS和0.1 mg/mLyeast tRNA的PBS组成），而后，在避光条件下，分别加入5 μL线性适配体Ap、单环适配体ApR和双环适配体dApR（10 μM），充分混匀，于37 °C孵育过夜。将上述适配体与细胞孵育液，1000 g离心10 min，弃上清留细胞沉淀。加入新鲜1 mL PBS，再次1000 g离心10 min，目的是去除未与细胞结合的游离适配体。同样步骤重复两次后，加入500 μL PBS悬浮细胞，于流式细胞仪测试。
结果如图3所示，与对照相比，Ap、ApR、与dApR结合Rccf-CEM 后的荧光强度均有明显增加，其中dApR的荧光强度最高，ApR和Ap的荧光强度相当，结果表明环状适配体均能特异性识别目标细胞，其中具有双环结构的dApR的特异性最强。
实施例5：纳米-双环状适配体探针的制备
首先，称取3g末端为128个羧基的第4.5代聚酰胺-胺型高分子（G4.5 PAMAMdendrimers，本发明中简称G），用N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）和1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）对其末端羧基进行活化反应反应2 h，置于10,000 MWCO透析袋中，透析24h，然后加入0.2 nmoL的Stre，温和搅拌反应过夜，次日加入0.4 nmoL实施例2获得的双环适配体dApR，温和搅拌反应2 h。反应结束后，产物用50,000超滤管于低速离心机3500 g，离心10 min，重复离心两次，最终得到纳米-双链环状适配体探针G-dApR。
实施例6:联合电泳检测、激光共聚焦显微镜观察、以及Zata电位检测等技术手段来确定纳米-双环状适配体探针构建成功
为了验证本纳米-双链环状适配体探针的成功构建，采用了多种手段来对所得产物的理化性质进行表征。根据纳米-双链环状适配体探针G-dApR与其构成部分适配体探针dApR以及纳米材料G的多处理化性质差异，其中包括：（1）dApR以及G的分子量均远远小于G-dApR的分子量；（2）G-dApR以及dApR具有荧光基团FAM而G没有；（3）G的Zata电位为正值，而dApR以及G-dApR为负值，等等。根据上述差异，采用的方法分别为变性胶电泳手段、激光共聚焦显微镜下成像观察的手段，以及zata电位检测的手段，来检测G-dApR是否成功构建。
如图4所示，表示G-dApR的条带位置在电泳泳道口的位置，表明起分子量远远大于dApR，；如图5所示，可以看到G-dApR具有FAM基团的吸收特性；如图6所示，G-dApR的Zata值为负值。上述结果均符合G-dApR应该具有的特性。证明纳米-双链环状适配体探针G-dApR构建成功。
实施例7：在不同PH值缓冲液条件下考察纳米-双链环状适配体探针的稳定性
取等量G-dApR，置于事先制备好的相同体积的PH值分别为9.0、7.0、4.0的三种磷酸盐缓冲液缓冲液中，同样条件下，在室温温度放置，分别在第0、1、2、3、4、5、6天的相同时间点检测各缓冲液中G-dApR的含量。如图7所示，随着时间的变化，在不同PH环境下放置一周时间内G-dApR无明显降解，说明稳定性良好。
实施例8：用激光共聚焦显微镜下观察纳米-双环状适配体探针和目标血癌细胞的特异性结合
为了检测纳米-双环状适配体探针特异性捕获目标肿瘤细胞的能力，本发明采用了激光共聚焦显微镜的方法观察的手段。
具体方法为：于常规条件下培养本发明所需目标肿瘤细胞，悬浮细胞株CCRF-CEM，以及也可作为阴性对照的不表达肿瘤标志物PTK7蛋白的悬浮细胞株Ramos，待细胞生长至对数生长期，按照每个实验组105个细胞的量，取相应细胞，用无菌PBS洗涤干净后，置于经过灭菌的500微升EP管中，并与1% BSA封闭液溶液作用30 min，离心弃掉封闭液并用无菌PBS清洗干净后，按照每样品500 μL的量，向样品加入孵育液，之后分别向各实验组加入5 μL G-dApR（10 μM）；于37℃、5% CO2的培养箱中共培养1 h 后，洗涤除去未结合的探针G-dApR，用4%多聚甲醛在常温条件下固定细胞，固定时间为15min，最后弃去甲醛并清洗干净，然后用DAPI染色液避光标记细胞核15 min；用PBS反复洗涤后，取出一点细胞悬液，滴加到激光共聚焦专用小皿上，并覆盖上载玻片使形成均匀的单细胞层。
如图8所示，本纳米-双环状适配体探针G-dApR和不表达把蛋白PTK7的阴性对照细胞Ramos无特异性结合，而表达把蛋白PTK7目标肿瘤细胞CCRF-CEM的识别和捕获性能良好。
实施例9：MTT法检测纳米-双环状适配体探针对血癌细胞存活率的影响
本发明也采用MTT了法检测细胞活性的方法，来反应纳米-双链环状适配体探针G-dApR对目标肿瘤细胞活性的调控。
具体方法为取处于对数生长期的CCRF-CEM和Ramos细胞株，经过计数后，以104个细胞/孔的量，分别悬浮于事先制得的，含有G-dApR浓度不同的无菌的培养基和细胞混合，并接种到96孔板中，置于5% CO2或无CO2培养箱中37 ℃培养24 h，离心弃掉含探针的培养基，于每孔中加入100 μL无血清、无酚红的1640培养基，并于每孔加入10 μL MTT溶液，继续孵育4 h，弃各孔上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡摇匀10 min，使蓝紫色结晶全部溶解，用酶标仪（570 nm）测定各孔光吸收值（OD值），并计算纳米-双链环状适配体探针G-dApR对不同细胞的抑制率：抑制率（%）=（1-探针组平均OD值/空白对照组的平均OD值）×100%。
如图9所示，G-dApR对目标血癌细胞CCRF-CEM的活性有轻微的抑制作用。说明本发明能够下调目标血癌细胞的活性。
实施例10:AO/EB染色法观察纳米-双环状适配体探针促使目标血癌细胞凋亡
取对数生长期的肿瘤细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，按1.5 mL/孔接种六孔培养板，其中每孔加入不同浓度的G-dApR，共培养24 h，离心收集细胞并洗涤3次，用100~500 μL PBS悬浮细胞，并调整浓度为1×105个/mL；然后加入1 μL AO/EB染色液，混匀后于室温避光孵育15 min后，将少量染色后的细胞悬液滴加到载玻片上，并盖上盖玻片，于荧光显微镜的GFP模块（λex 510 nm）下观察拍照。
如图10所示，随着探针浓度的增加，目标肿瘤细胞CCRF-CEM细胞所呈现的颜色为逐渐产生黄绿色的代表凋亡的颜色，而非目标细胞Ramos则无明显变化，说明本发明能够下调目标血癌细胞的活性。
实施例11:模拟体内条件下对血癌细胞的检测
为了进一步评估纳米-双环状适配体探针G-dApR在动物体内，动态条件下捕获血癌细胞的能力，构建了体内含有血癌细胞的裸鼠模型来模拟临床肿瘤病人的体内环境。
具体方法为：首先用Hoechst 33258将目标血癌细胞CCRF-CEM染色15 min后，静脉注射到裸鼠体内，而后将纳米-双环状适配体探针G-dApR注射到裸鼠体内30 min后，抽取裸鼠的血液，裂解红细胞并离心分离得到WBCs和目标血癌细胞并进行PBS洗涤，而后进行共聚焦显微镜分析。
如图12所示，其中因为未对WBCs 进行荧光标记，故只有在明场下才能观察到它们，呈现亮灰色圆球状形态（Photo）；蓝色（Hoechst）代表血癌细胞的细胞核；绿色（FAM）代表G-dApR与血癌细胞的结合；Merge1是蓝色、绿色叠加，其代表G-dApR与CTCs的结合；Merge2是明场、蓝色、绿色和明场三个通道叠加。由此，从图中Merge 2可看出，G-dApR可以特异性地捕获裸鼠体内的血癌细胞，而对WBCs无任何识别能力。证明本发明对目标血癌细胞的特异性即使在体内环境下也能得以维持。
综上所述，本发明可以所构建的纳米-双环状适配体探针G-dApR具有良好稳定性，可特异性捕获目标血癌细胞，并且有效抑制其活性。有望于运用到血癌病的临床诊断，并把靶向地抑制血癌细胞的活性，达到诊疗于一体化的目的。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种纳米-双环状适配体探针及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttagattt ctagactcat atagctcaat caatctacga ctcgatctaa ctgctgcgcc 60
gccgggaaaa tactgtac 78
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtctagaaat ctaaccgtac agtattttcc 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agctatatga gtctaggtcg tagattgatt g 31
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atatagctca atcaat 16

Claims (4)

1.一种纳米-双环状适配体探针，其特征在于：所述的探针由纳米材料和具有双环结构的环状适配体组成；
该探针是由羧基修饰的树枝状纳米PAMAM分子，与FAM基团和biotion基团修饰的具有双环结构的环状适配体探针dApR通过streptavidi相结合所组成的；
环状适配体探针dApR的合成，是由碱基数目不同的一个单环状适配体和一个单环状寡核苷酸杂交互补得到的，其中，单环状适配体和单环状寡核苷酸均由与之相对应的线性单链DNA闭环反应得到；线性单链DNA包括线性适配体链Ap和线性寡核苷酸链C1；其中，所述的线性适配体链Ap为：
5'-GGTTAGATTTCTAGACTCATAT(biotin)AGCTCAATCAAT
CTACGACTCGAT（FAM）C TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTAC-3'；
线性适配体链闭环所需要的模板T-Ap为：
5'-GTC TAG AAA TCT AAC CGT ACA GTA TTT TCC-3'；
其中，线性寡核苷酸链C1为：
5'- AGCTATATGAGTCTA GGTCGT AGATTGATTG -3'；
所述的线性寡核苷酸链闭环所需要的模板T-C1为：
5'- ATA TAG CTC AAT CAA T -3'。
2.根据权利要求1所述的的一种纳米-双环状适配体探针，其特征在于，所述的环状适配体探针dApR的合成方法包括如下步骤：
（1）将线性适配体链 Ap或线性寡核苷酸C1加入到含有 ATP 和PolynucleotideKinase酶的缓冲液体系中，37℃金属浴条件下震荡反应30 min后，90℃退火5min，降至室温，得到磷酸化的Ap或C1溶液；
（2）将步骤（1）的得到的T- Ap或T-C1按照Ap和T- Ap或C1和T-C1的反应摩尔比为1：1.3的比例分别加入到步骤（1）得到的溶液中，并分别加入10×Ligase Buffer 及dd H2O，混匀，置于恒温金属浴中90℃退火5min后，55 ℃振荡反应2 h，待反应产物冷却至室温后，加入T4 DNA Ligase ，于金属浴16 ℃反应2 h，反应结束后，65℃失活10min，降至室温，得到Ap和T- Ap或C1和T-C1相杂交互补而形成具有双链结构的环状DNA；
（3）向步骤（2）得到的体系中分别加入dd H2O 、10×T4 DNA Polymerase Buffer 及T4DNA Polymerase，混匀后于恒温金属浴中37℃振荡反应16 h，结束后85 ℃失活10 min，降至室温，得到单链的环状适配体ApR和单链环状寡核苷酸C1；
（4）向步骤（3）获得的体系中分别加入其体积1/10的3 M醋酸钠溶液和2.5倍体积无水乙醇，充分混匀后，竖直于-20 ℃放置1 h，结束后离心弃去上清，保留底部沉淀；沉淀用500μL 的70% 乙醇在-20℃下打散，于4℃离心弃去上清，保留底部沉淀，将产物干燥；得到纯化后的单链的环状适配体ApR和单链环状寡核苷酸C1；
（5）将步骤（4）得到的碱基数目较多的单链的环状适配体ApR和碱基数目较少的单链环状寡核苷酸C1进行互补杂交，得到含功能区和双环DNA区的环状结构适配体探针dApR。
3.一种如权利要求1所述的的一种纳米-双环状适配体探针制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取末端为128个羧基的4.5代聚酰胺-胺型树枝状分子溶于 ddH2O中，并按照10倍于4.5代聚酰胺-胺型树枝状分子的等摩尔比例加入EDC、NHS后，温和搅拌活化反应2 h；将上述反应得到的产物置于10000 MWCO透析袋中，透析24h，得到末端羧基活化的4.5代聚酰胺-胺型树枝状分子溶液；
（2）向步骤（1）得到的溶液中加入链霉亲和素，温和搅拌反应过夜，次日加入环状结构适配体探针dApR，温和搅拌反应2 h，4.5代聚酰胺-胺型树枝状分子、dApR和链霉亲和素的摩尔比（2-4）：（2-4）：1；反应结束后，用50,000超滤管离心，最终得到纳米-双环状适配体探针G-dApR。
4.如权利要求1 所述的纳米-双环状适配体探针在制备检测血癌细胞并抑制其活性方面试剂的应用。
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