CN109554370A - 一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体序列为5’‑ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT‑3’。本发明所述的核酸适配体具有高特异性、高亲和力，在4℃，25℃，37℃均能保持良好活性。本发明的核酸适配体可作为分子探针，对人低分化胃癌细胞进行特异性成像和检测。在低分化胃癌的预测和诊治方面具有良好的应用前景。

Description

一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用。
背景技术
胃癌是常见高发的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的第三大原因。根据腺体的分化程度，胃癌可分为分化型和未分化型。临床研究显示，中高分化胃癌，恶性程度较低，预后较好；而低分化胃癌，恶性程度较高，预后较差。此外，胃癌的分化状态还与化疗效果具有相关性。因此，准确区分胃癌组织的分化状态，对于判断预后以及指导低分化胃癌的治疗具有重要意义。但目前对胃癌组织分化状态的判断主要基于对病理切片的形态学观察，缺少基于分子标志物的高灵敏度、高特异性检测探针及方法。
核酸适配体（aptamer）是采用指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX）从大容量RNA/单链DNA随机文库中筛选得到的能与靶标物质特异性结合的寡核苷酸序列，被称为化学抗体。与传统的抗体相比，具有特异性强，亲和力高，稳定性好，易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。消减Cell-SELEX是以完整细胞作为靶标进行核酸适配体筛选的技术，由于使用具有功能表型差异的靶细胞和非靶细胞进行消减筛选，可获得针对特定功能表型细胞的核酸适配体。由于筛选出的核酸适配体主要与细胞表面分子结合，特别适合用来制备分子探针进行靶细胞靶向成像分析以及作为靶向载体等。有研究将高转移细胞与低转移细胞进行消减筛选，得到能与转移细胞特异性结合的核酸适配体；有研究将病毒感染细胞与非感染细胞进行消减筛选，制备了可以特异性检测病毒感染的核酸适配体分子探针。
但目前未见以低分化胃癌细胞为靶细胞，以中高分化胃癌细胞为非靶细胞，筛选人低分化胃癌细胞特异性核酸适配体的报道。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种以人低分化胃癌细胞BGC-823为靶细胞，以中分化胃癌细胞SGC-7901为非靶细胞，经过消减Cell-SELEX技术筛选得到的能够与人低分化胃癌细胞特异性结合的核酸适配体，可以制备成分子探针进行人低分化胃癌细胞/组织的靶向成像等应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列如SEQ ID NO .1所示：5’-ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT-3’。
所述的核酸适配体在人低分化胃癌细胞特异性成像中的应用。
所述肿瘤包括胃癌、低分化胃癌。
所述的核酸适配体在鉴定核酸适配体靶标中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
1. 提供了一种新的能够靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体序列。所述核酸适配体具有高亲和力和高特异性：对靶细胞的解离常数Kd值为纳摩尔级（35.2 ± 1.1 nM）；对靶细胞及其它低分化胃癌细胞结合能力强，对非靶细胞及其它中高分化胃癌细胞结合能力弱或不结合，对正常细胞不结合。
2. 由于对靶细胞的结合具有高亲和力和高特异性，以及良好的温度稳定性，所述核酸适配体特别适合作为分子探针进行组织的靶向成像。采用所述核酸适配体结合量子点构建量子点探针进行胃癌患者组织的成像分析，结果显示了明显的低分化组织特异性，荧光强度为低分化组织＞中高分化组织＞正常癌旁组织。
附图说明
图1为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的特异性结合结果。
图2为实施例中荧光显微镜技术分析所述核酸适配体与靶细胞BGC-823的特异性结合结果。
图3为实施例中流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的解离常数结果。
图4为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体对不同细胞的结合能力。
图5为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性结果。
图6为实施例中荧光显微镜技术分析所述核酸适配体对混合细胞中靶细胞的靶向成像结果。
图7为实施例中所述核酸适配体对临床组织标本的靶向成像结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
洗涤缓冲液（pH=7.4）是溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在溶剂中的浓度为：4.5g/L 葡萄糖、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、5mM MgCl2、1mM CaCl2。结合缓冲液（pH=7.4）是含有1mg/ml BSA和0.1 mg/ml 鲱鱼精DNA的洗涤缓冲液。
实施例1 核酸适配体的筛选。
(1)随机筛选文库的准备。
委托生工生物工程股份有限公司合成随机单链DNA文库（5’-AAGGAGCAG CGTGGAGGATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT -3’）；取1管10OD的随机单链DNA文库，加入结合缓冲液，涡旋震荡溶解，盖好离心管盖，95℃水浴5min，迅速加入冰上8min，备用。
(2)人胃癌细胞BGC-823正筛：BGC-823细胞(购于上海中科院细胞库)培养至对数生长期，洗涤缓冲液洗涤两次，将步骤(1)准备的随机文库加入BGC-823细胞中，4℃摇床震荡1h；弃上清；洗涤缓冲液洗涤BGC-823细胞三次；用细胞刮将BGC-823细胞刮下，用1mL洗涤缓冲液将BGC-823细胞重悬，移入至离心管中，95℃水浴5min，1000rpm室温离心5min，留取上清。
(3)PCR扩增：取100µL步骤(2)所得的上清样品，加入到1mL PCRmix液中；涡旋振荡混匀后，按每管50µL分装进行PCR扩增，扩增条件为：94℃加热预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，12个循环。其中1mL PCRmix液中含有：ddH2O 865µL；10×PCR缓冲液100µL；上游引物：5’-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’ ；下游引物。5’-biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’ 各5µL；rTaq酶5µL；dNTP 20µL。所述上下游引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。
(4)单链DNA的制备：将60µL链霉亲和素琼脂糖珠悬液(购于GE Healthcase公司)在5000rpm转速下离心取上清，沉淀用PBS洗涤，离心取上清；重复洗涤一次。将步骤(3)中PCR扩增所得的扩增产物与洗涤后的链霉亲和素琼脂糖珠在常温下孵育30min，通过扩增产物双链DNA上的生物素与琼脂糖珠上的链霉亲和素发生亲和作用，得到结合有双链DNA的琼脂糖珠上，5000rpm转速下离心去上清，沉淀用PBS离心洗涤两次；然后加入200µL 0.1MNaOH溶液常温下与沉淀孵育10min，使琼脂糖珠上的双链DNA变性。将碱变性反应得到的反应液在5000rpm离心2min，收集上清。
(5)脱盐：将脱盐柱(购于GE Healthcase公司)用15mL无菌水洗涤后，加入步骤(4)中经过碱变性后得到的上清液，自然滴完，然后加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，此即为单链DNA文库。
(6)重复筛选：将步骤(5)得到的单链DNA文库替代步骤(2)中的随机文库，重复上述步骤(2)-(5)所示的正筛、PCR扩增、单链DNA的制备及脱盐过程。
(7)人胃癌细胞SGC7901反筛：经过步骤(6)重复筛选2轮后，以人胃癌细胞SGC7901为对照，将经过步骤(6)的两轮筛选得到的单链DNA文库进行反向筛选，反向筛选的具体操作为：将SGC-7901细胞(购于上海中科院细胞库)培养至对数生长期，洗涤缓冲液洗涤两次，将步骤(6)得到的单链DNA文库加入SGC-7901细胞中，4℃摇床震荡1h；将上清液1000rpm室温离心5min，收集上清液。
(8)多轮筛选：将步骤(7)中收集的上清液替代步骤(6)中的单链DNA文库，继续重复进行上述步骤(6)-(7)的操作过程。重复筛选过程中用流式细胞仪(美国BD公司)监测所得单链DNA文库与BGC-823细胞结合能力的请款，直至15轮筛选后单链DNA文库与与BGC-823细胞结合能力处于饱和状态，将所得产物经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到一条与BGC-823细胞结合能力最强的序列。
5’-ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT-3’。
实施例2 流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的特异性结合。
分别取处于对数生长期的人胃癌细胞BGC-823和SGC-7901，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。然后加入含250nM核酸适配体的结合缓冲液200µl，于4℃摇床上轻摇孵育30min，1000rpm室温离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。最后加入300µl PBS用于流式细胞仪检测，随机文库序列为对照。核酸适配体与靶细胞BGC-823和反筛细胞SGC-7901的流式细胞仪检测结果如图1所示，核酸适配体能与靶细胞BGC-823稳定结合，而不能与反筛细胞结合，说明所述的核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性。
实施例3 荧光显微技术分析所述核酸适配体与靶细胞BGC-823的特异性结合。
将人胃癌细胞BGC-823和SGC-7901分别培养于共聚焦培养皿中，培养24h后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后将含有250nM核酸适配体的结合缓冲液与上述两种细胞在4℃条件下轻摇孵育30min。孵育后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，最后加入300µl PBS用于流式细胞仪检测，随机文库序列作为对照，结果如图2所示。共聚焦荧光显微镜下观察显示，BGC-823细胞表面呈现明显的荧光，而SGC-7901细胞表面未见荧光显示，提示所述核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性，具有作为分子探针进行靶细胞特异性成像的能力。
实施例4 流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的解离常数。
合成并配制不同浓度的所述核酸适配体，分别与等量的靶细胞进行孵育，依实施例1操作分别进行流式细胞术检测，测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合曲线，得到核酸适配体的解离曲线，如图3所示。由解离曲线得到的核酸适配体的解离常数Kd为35.2 ± 1.1nM。结果表明：所述核酸适配体对靶细胞BGC-823具有高亲和结合特性。
实施例5 流式细胞术检测所述核酸适配体对不同细胞的结合选择性。
取处于对数生长期的不同种类细胞系，包括人胃癌细胞BGC-823，人胃癌细胞SGC-7901，人胃癌细胞MGC-803(购于上海中科院细胞库)，人胃癌细胞MKN28(购于上海中科院细胞库)，人结肠癌细胞SW620(购于上海中科院细胞库)，人结肠癌细胞HT29(购于ATCC)，人大肠癌细胞CL187(购于ATCC)，人乳腺癌细胞MDA-MB-436(购于上海中科院细胞库)，人乳腺癌细胞MDA-MB-468(购于上海中科院细胞库)，人乳腺癌细胞MCF-7(购于ATCC)，人乳腺癌细胞SK-BR-3(购于上海中科院细胞库)，人胃正常上皮细胞GES-1(购于上海中科院细胞库)，人胚肾细胞HEK-293(购于ATCC)，中国仓鼠卵巢细胞CHO(购于ATCC)，小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3(购于ATCC)和非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7(购于上海中科院细胞库)，分别与所述核酸适配体孵育，依实施例1操作，采用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，依据荧光强度划分核酸适配体与细胞的结合强度，如图4所示。结果表明：所述核酸适配体与低分化细胞系具有较强的结合能力，对中高分化细胞系具有不同程度的结合，而与被检的正常细胞均无结合活性。结果提示，所述核酸适配体具有良好的低分化细胞特异结合活性，具有应用前景。
实施例6流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性。
将处于对数生长期的转移性人胃癌细胞系BGC-823用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，与所述核酸适配体分别在不同温度（4℃，25℃和37℃）下孵育，依实施例1操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图5所示，在所使用的不同温度条件下，核酸适配体均显示了与靶细胞的结合能力，为在不同条件下进行核酸适配体的应用提供了可能。
实施例7 荧光显微镜技术分析所述核酸适配体对混合细胞中靶细胞的靶向成像。
为区分靶细胞与非靶细胞，使用活体荧光染料(购于Invitrogen公司)，将非靶细胞SGC-7901染成绿色。将靶细胞BGC-823和染色成绿色的SGC-7901混合共培养于共聚焦培养皿中，培养24h后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后将含有250nM生物素标记核酸适配体的结合缓冲液与上述混合培养细胞在4℃条件下轻摇孵育30min。孵育后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后加入量子点标记的链霉亲和素QD-SA，室温中孵育15min。孵育后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，最后加入300µl PBS用于检测，随机文库序列作为对照，结果如图6所示。共聚焦荧光显微镜(Carl Zeiss，Axiovert 200)观察显示，没有被活染的靶细胞BGC-823表面呈现明显的红色荧光，而被活染成绿色的非靶细胞SGC-7901表面未见红色荧光显示，提示所述核酸适配体具有较强的在非靶细胞背景下特异性识别靶细胞的能力，具有作为分子探针进行靶细胞特异性成像的潜力。
实施例7荧光显微镜技术分析所述核酸适配体对临床肿瘤组织标本的靶向成像。
采用量子点QD标记所述核酸适配体作为分子探针，进行胃癌组织切片标本的特异性成像。将包含有15例胃癌患者配对的癌组织和癌旁组织（其中8例是中高分化，7例是低分化）的组织芯片放置60℃烘箱中烘烤4h，然后在100%二甲苯中脱蜡，2次×15min。然后将芯片以5min的间隔浸入梯度乙醇中，顺序为100%→95%→90%→80%→70%。用PBS洗涤三次后，置于0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，在高压锅中加热100s。待组织芯片降温至室温后，向芯片组织上滴加含20%FBS和20%BSA的4℃预冷的结合缓冲液，于4℃中封闭1h，弃掉液体后，加入含有250nM生物素标记核酸适配体的结合缓冲液，在4℃过夜孵育。孵育后用PBS洗涤三次，加入量子点标记的链霉亲和素QD-SA，室温中孵育15min。孵育后用PBS洗涤三次，最后使用中性树脂封片，在共聚焦荧光显微镜下观察组织荧光。随机文库序列作为对照。结果如图7A所示，与随机文库孵育的癌旁组织和胃癌组织均没有观察到荧光；与核酸适配体孵育的组织中，癌旁组织基本上没有荧光，而胃癌组织上能够观察到不同程度的荧光显示；其中，如图7B所示，低分化胃癌组织上的荧光强度明显高于中高分化的胃癌组织。提示所述核酸适配体具有低分化组织结合特异性，具有作为分子探针进行低分化组织靶向成像的能力。
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<120> 一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaccaaaat cgtccgtttc gttttagtcc gtctctttag ggtgt 45

Claims (4)

1.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：
5’-ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT-3’。
2.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体的应用，其特征在于，在人低分化胃癌细胞或组织特异性成像中的应用。
3.如权利2要求所述的靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、低分化胃癌。
4.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体的应用，其特征在于，在鉴定核酸适配体靶标中的应用。
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