CN106520776B

CN106520776B - 一种乳腺癌筛查试剂盒

Info

Publication number: CN106520776B
Application number: CN201710026825.4A
Authority: CN
Inventors: 付尚颐; 付俊江; 成竞梁; 魏春莉; 杨璐全
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-01-14
Filing date: 2017-01-14
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2037-01-14
Also published as: CN106520776A

Abstract

本发明提供了SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列，本发明还提供了所述核苷酸序列的用途及一种乳腺癌筛查试剂盒。本发明提供的核苷酸序列及乳腺癌筛查试剂盒，可用于临床乳腺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。

Description

一种乳腺癌筛查试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种乳腺癌筛查试剂盒。

背景技术

乳腺癌(breast cancer，BC)是最常见的女性恶性肿瘤，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，是全球女性中发病率及致死率最高的恶性肿瘤，内分泌激素失调、遗传因素、饮食习惯、环境致癌物等均是诱发乳腺癌的关键因素。

目前对乳腺癌仍缺乏有效的治疗手段，乳腺癌筛查是公认的能够有效提高女性乳腺癌生存率的主要方法，乳腺癌已被WHO列为应开展人群筛查的癌症类别之一。合理的筛查能够早期发现乳腺癌，提高治愈率，增加“保乳”手术的机会，减少术后辅助治疗，节省医疗费用，提高患者生活质量。

目前国内外常用的乳腺癌筛查手段包括乳房X线摄影术(钼靶X线摄影)、超声成像、临床乳腺检查和磁共振成像等，但筛查效果均不理想，寻找新的、可靠的筛查手段对于发现早期乳腺癌具有非常重要的意义。

生物标记物是生理或病理过程中可供客观测定和评价的某种特征性的生化指标，在疾病的鉴定、早期诊断和治疗的监控中起帮助作用。如果可以找到乳腺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳腺癌筛查试剂盒。

本发明提供了SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了检测SEQ ID NO.1或2所示核苷酸序列的试剂在制备乳腺癌筛查用试剂中的用途。

其中，所述检测的试剂包括扩增乳腺组织SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列的试剂；

和/或，所述检测的试剂为定量PCR、半定量PCR、Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

本发明还提供了检测DPEP1基因或HPKG2基因表达水平的试剂在制备乳腺癌筛查用试剂中的用途。

其中，所述检测的试剂包括扩增乳腺组织DPEP1基因和/或HPKG2基因的试剂；

其中，所述检测的试剂包括SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种乳腺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、DPEP1基因和/或HPKG2基因表达水平的试剂。

其中，所述检测的试剂包括扩增乳腺组织SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列、DPEP1基因和/或HPKG2基因的试剂。

其中，所述检测扩增试剂为定量PCR、半定量PCR、Western Blot或ELISA检测方法用试剂。

进一步的，所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列。

本发明试剂盒，通过检测乳腺异常者的乳腺异常部位与正常部位的基因组BC10-1或BC13-4片段、DPEP1、或PHKG2基因表达水平，可以判断二者表达水平差异，进而判断待检者患乳腺癌的风险：若异常部位基因组BC10-1或BC13-4片段、DPEP1、或PHKG2的表达水平高，则患乳腺癌的风险高，反之，则患乳腺癌的风险低，可用于临床乳腺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.为改良RAPD PCR扩增乳腺癌组织及其附近的正常组织图；

a.高GC引物FY-10.b.高GC引物FY-13.c.高GC引物FY-31.5对扩增乳腺癌组织及其附近的正常组织的基因组DNA用于RAPD扩增.蓝色箭头指示从胶中切割下来用于DNA克隆.通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000 DNA标记。通道1,3,5,7和9是扩增表1的乳腺癌组织DNA，而通道2,4,6,8和10是扩增癌旁的正常组织DNA。

图2.为RAPD片段的分子克隆图；

a.从高GC引物FY-10,FY-13和FY-31获得的纯化的RAPD DNA片段10,13和31的琼脂糖电泳检测,T为T载体0.5μl。b.RAPD片段10的阳性克隆酶切鉴定。c.RAPD片段13的阳性克隆酶切鉴定。d.RAPD片段31的阳性克隆酶切鉴定。通道1显示未经酶切的质粒DNA，而通道2显示质粒经EcoR I消化。蓝色显示的克隆10-1,13-4和31-2挑选出来做Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。

图3.为SCAR标记BC10-1,BC13-4和BC31-2在乳腺癌患者中的基因组DNA扩增分析图；

a.SCAR标记BC31-2在5对乳腺癌组织及其邻近正常组织的基因组DNA扩增。通道1,3,5,7和9是扩增乳腺癌组织DNA(see Table 1)，而通道2,4,6,8和10是扩增癌旁的正常组织DNA。b.实时PCR检测SCAR标记BC10-1.c.实时PCR检测SCAR标记BC13-4。“Cancer”：乳腺癌组织；“Adjacent”：相应的癌旁正常组织；“Ctrl”,正常女性血液DNA；“**”,p value≤0.05。

图4.为DPEP1和PHKG2基因在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的mRNA表达分析图；

a.在6个乳腺癌细胞系中的实时PCR检测DPEP1的mRNA表达量。b.乳腺癌组织及其邻近正常组织的实时PCR检测DPEP1的mRNA表达量。C.在6个乳腺癌细胞系中的实时PCR检测PHKG2的mRNA表达量。d.乳腺癌组织及其邻近正常组织的实时PCR检测PHKG2的mRNA表达量。“MDA231”,MDA-MB-231细胞；“MDA435”,MDA-MB-435细胞。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器如下：

pGM-T载体(批号：VT202)、质粒小提试剂盒、胶DNA回收试剂盒、总RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。RT-PCR试剂盒购买自TIANGEN公司。PCR 2×Mix，DNA分子大小标记DL2000购买自TIANGEN公司(TIANGEN公司，北京)。实时荧光定量PCR试剂盒购买自ABI公司。Taqman探针:Universal Probe Library，Roche。

Nanodrop，ND1000；PCR仪(Applied Biosystems96-Well ThermalCycler，Life Technology,USA)；0.1ml薄壁PCR板(The Applied Optical 96-Well Reaction Plate,USA)；荧光定量PCR仪(ABI steponeplus,Applied Biosystems,USA)；电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMIDIcell；凝胶分析系统使用BIO-RAD公司(Universal Hood Ⅱ)。

实施例1 RAPD方法特异扩增得到本发明检测乳腺癌的标记物(SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列)

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)--即随机扩增多态性DNA，主要用于动植物基因组信息未知的情况下的分子检测。RAPD技术依赖于PCR，选用10个碱基的单链随机引物，对生物个体、居群或物种基因组的DNA进行PCR扩增，检测其遗传位点的差异。

一、实验方法

(一)肿瘤组织DNA获取

1.取乳腺癌组织及癌旁正常组织(取病变部位旁2cm的组织区域)5对(表1)。每个取乳腺癌组织5mg，剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入2-3ml的细胞核裂解缓冲液匀浆至不见组织块；

2.将匀浆器全部转入5ml离心管中，加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl，混匀。在56℃恒温水浴锅中水浴4-5小时或者37℃过夜；

3.加等体积的饱和酚，用力颠倒混匀5-10min，12000rpm离心10min；

4.取上清液至另一5ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min。若水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5.取上清液全部至另一5ml离心管中，加入100％酒精3倍体积以上，出现絮状物(若无絮状物，12000rpm离心5min)。

6.用钩针将DNA钩出，倒置。

7.用500μl 70％乙醇洗涤沉淀物1-2次。要小心，不要将DNA冲洗掉。

8.室温干燥1-2分钟。不要太长，否则DNA难溶解。

9.加300μl 1×TE重新溶解沉淀物，室温转动溶解DNA 1-2小时。吸取适量样品检测浓度和纯度后，4℃使用或-20℃长期保存。

注意事项：根据需要，DNA的纯化也可采用商业销售的各种DNA纯化试剂盒纯化。

10、DNA质量检测和浓度分析

(1)电泳法：1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

(2)NANO DROP法：(测OD值法)

·打开分光光度计图标，选择Nuncli Acid；(Nanodrop，ND1000)

·加入ddH2O 4μl，点击OK，初始化仪器；

·再次加入ddH2O 4μl，选择DNA-50，点击BLANK；

·加入样本1μl，点击Measure，测出值后作好详细记录。

·滴入ddH2O 4μl洗涤两次。

11、将DNA用1×TE稀释到10～20ng/μl,保存在-20℃备用。

12、动物组织或者细胞样本中DNA提取采用酚/氯仿法，部分详细见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)

表1. 5个乳腺癌标本的组织病理信息

(二)改良RAPD技术进行PCR扩增

1、设计并合成3条长度为10个核苷酸的高GC含量的引物，90％的GC含量。各条高GC含量引物的名称、序列见下表2：

表2.各个高GC引物序列

2、用改良RAPD技术进行PCR扩增：

(1)用ramp率0.125℃/s(5％)条件下的RAPD：取乳腺癌组织及癌旁正常组织5对DNA作为模板，分别用RAMP率为0.125℃/s和高GC含量的引物FY-10、FY-13和FY-31做RAPD扩增，PCR体系如下所示。

PCR体系(10μl)

模板(10ng/μl)1μl

引物 1μl

2×Mix(天根，KT207) 5μl

ddH2O 3μl

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology,USA)。

(2)RAPD PCR条件如下：

注意事项：

(1)ramp rate是指退火温度上升到延伸温度的速率。对于Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler而言，5％ramp rate(0.125℃/s)、10％ramp rate(0.25℃/s)、20％ramp rate(0.5℃/s)、40％ramp rate(1℃/s)、100％ramp rate(2.5℃/s)。常规的RAPD即100％ramp rate。

(2)不同的PCR仪器，RAMP rat可能不一样，一旦选定了特定的PCR仪器，就在同一款项仪器上完成所有的PCR扩增。

3、DNA电泳：详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×Mix中就预加了相关成分。

(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压110V，电泳时间30min即可，也可根据实际情况进行相应的调整。

4、凝胶分析并照相(使用(BIO-RAD，Universal Hood Ⅱ)凝胶系统观察结果和照相。

5、结果：RAPD扩增结果见图1。

(三)GC含量引物改良RAPD扩增条带的分离

1、将上述用高GC含量引物在乳腺癌组织及癌旁正常组织5对DNA中进行改良RAPD扩增获得电泳产物，割取目的条带(如图1蓝色箭头所示)，用胶回收试剂盒(天根，DP209)回收目的片段(常用20-30μl洗脱)；

割取目的条带：

片段10：FY-10引物扩增片段

片段13：FY-13引物扩增片段

片段31：FY-31引物扩增片段

注意事项：

割取目的条带时要迅速，长时间的紫外线照射可能会使DNA降解。切胶条带较多时，应注意标记，勿要混淆。

2、将胶回收产物和T载体分别为2μl和0.5μl进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择110V，20min，EB染色确定连接时加入目的片段与T载体的各自的量)，见图2a。

(四)克隆

应用A/T克隆法(T载体克隆)

1、连接反应(反应体系10μl)：两EP管分别加入：

充分混匀后，12000rpm离心15s，于4℃连接过夜(或者16℃8～12h)。

2、DH5α感受态细菌的制备：

(1)取1.5ml EP管，加入500μl无Amp(无氨苄青霉素)的LB培养基，挑取一DH5α感受态细菌，于37℃震荡培养过夜(不超过16h)；

(2)取一100ml锥形瓶，加入10无Amp(无氨苄青霉素)的LB培养基，按照1：50或者1:100加入培养过夜的DH5α菌液，37℃震荡培养2-3h达OD值0.6-0.8(具体时间根据菌液的浑浊度而定)；

(3)将10ml菌液全部转入预冷的50ml管中，冰浴15min；

(4)4000rpm离心5min(Thermo公司，Legend Micro 21R)，弃去上清(将上清弃干净，残留的培养基可能会影响感受态细胞的活性)；

注意：

a.不同的离心机，离心条件不一样严格掌物离心力和离心时间；

b.离心过了会严重影响感受态细菌的活性；

(5)加入1ml 4℃100mmol/L的CaCl2溶液，轻轻混匀后再加入9ml于4℃预冷100mmol/L的CaCl2溶液，冰浴30min(此步骤操作应轻柔，勿用Tip吹打，利用手腕的力量使其混匀，整个操作应在冰上完成)；

(6)4000rpm离心5min，弃去上清；

(7)加入2ml 4℃100mmol/L的CaCl2溶液，轻轻混匀后置于4℃冰箱备用。

3、转化：

(1)连接过夜的两管分别加入50μl DH5α感受态细胞，手指轻弹管底混匀。另取一空白预冷EP管加入50μl DH5α感受态细胞作为空白对照，冰浴30min。

(2)42℃热激45s～90s，冰浴2-3min，不要摇动离心管。

(3)加入300μl LB无Amp(无氨苄青霉素)的液体培养基，于37℃振荡培养45min，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(4)将离心管中的菌液混匀，全部铺皿(涂布用量可根据具体实验作相应的调整)，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃CO2孵箱中孵育12-16h。

4、阳性克隆的鉴定

(1)蓝白筛选法

①首先LB Amp﹢固体培养板配制方法：称取LB肉体粉末5g、3.75g琼脂粉(1.5％)于一干净锥形瓶中，加入250ml ddH2O充分混匀后，于121kpa高压灭菌30min，放入水浴锅中降到60℃，加入250μl氨苄青霉素(100mg/μl)，250μl IPTG(50mg/μl，Solarbio，No.I8070)、1000μl X-gal(20mg/μl，Solarbio，No.924B035)充分混匀后，于超净工作台中倒制固体培养板(20ml/板)，待其冷却后置于4℃保存。另外，IPTG、X-gal也可使用前30min铺皿后于CO2孵箱中烤干备用[20ml培养板使用20μl IPTG(50mg/μl)、40μl X-gal(20mg/μl)即可]。

②将转化产物全部涂布到上述固体培养板上，37℃孵箱孵育16h，可见固体板上蓝白菌落，白色可能为阳性克隆。

③挑取白色菌落，振荡培养用于下述PCR鉴定、酶切鉴定以及测序测定。

(2)PCR鉴定：设计pGM-T载体引物(T7与SP6的引物对，

T7引物:5’-TAA TACGACTCACTATAGGG-3’,

SP6引物:5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’。)进而进行PCR鉴定(反应体系10μl)。扩增的片段大小与目的片段大小一致即为阳性克隆。

①取1.5ml EP管，加入500μl含有Amp(有氨苄青霉素)的LB液体培养基，挑取一阳性克隆菌，于37℃震荡培养4-5h；

②待菌液稍浑浊，取0.2-0.5μl进行PCR扩增；

③菌液PCR：

菌液PCR体系(总体积10μl)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。PCR条件：

PCR结束后，琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

④PCR鉴定为阳性，大小相符的，可以选择测序。

(3)酶切鉴定法：EcoRI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，出现目的片段(大小相符的)即为阳性克隆。

①取1.5ml EP管，加入500μl A+(有氨苄青霉素)的LB培养基，挑取一阳性克隆菌，于37℃震荡培养4-5h；

②待菌液浑浊，将其全部转入加有0.2ml菌液的10-20ml管中，37℃震荡培养过夜；

③取2-3ml菌液，用质粒小提试剂盒(天根，DP103)提取质粒DNA,60-100μl的ddH2O洗脱；

④质粒DNA含量的测定(测OD值)

·打开分光光度计图标，选择Nuncli Acid；(Nanodrop，ND1000)

·加入ddH2O 4μl，点击OK，初始化仪器；

·再次加入ddH2O 4μl，选择DNA-50，点击BLANK；

·加入样本1μl，点击Measure，测出值后作好详细记录。

·滴入ddH2O 4μl洗涤两次。

⑤质粒DNA进行酶切：

酶切体系(10μl)：

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s。

⑥37℃水浴2-3h；

⑦酶切结束后，琼脂糖凝胶电泳(胶的浓度根据其目的片段的大小而定)。酶切鉴定显示图2b,c,d的克隆10-1，13-4，31-2分别为片段10，13，31 的阳性克隆并进行Sager测序。

二、结果分析

将酶切鉴定提示的图2b,c,d为阳性克隆的BC10-1、BC13-4和BC31-2进行Sanger测序分析(如图2通道用蓝色所示)，序列如下：

乳腺癌BC10-1克隆的序列：1027bp(SEQ ID NO.1)

CCCGCCGGTTCCATCCTCTGAGAGCCTCACCCTTCACTGCCCGTGATGGCACGAGCTGAGGCCCCCCACCCGGTTCCATCCTCTGAGACTCTCGCCCTTCACTGCCTGTGATGGTGCTCCATGCTATGCTGTAGATGCCTACTCTCTGAGGTTCTCCCTCGCTGACGGTGGATCACAGGCAGTCAGAGAGGAGAGGGGCTTTCCGCCCTCATTACAGCCCTGGGCCTCAACCTGGCTGCACGCTCCCCAAAACCACAACCCCTGGCTCCCGGCTCCCCGCTCCCCGAGACTCACCATGCGCGGGACAGGGTCCCGAGTACCTCGGCTCAGCCACCCAAGTCCCAGGGAGACAGACCCGCCTCCTGCCTCCCAGGTCACAAGGCTTGGGGGTTGTTTCTGGTGTTCAAGTTCAGTCCTGCCACCCACGGAGCTCTCCAGCTACAGAACAGCCACCTCCTTGAGGGCTCGCACAGTACCCCAGGGAGAGCCGGGCTAAAGCCTCACACATGTCAGCTGGTTCTTGTTTCCGAAGATACGCATGCCCTCAGTGAGGCCTTGAGCATCCGGCCAGCCCAGGGGCTTCTGGGACTCTCGGTCCCAGGCCAGGCAGGAGAGCTTGTGCTGGGTGATCACCCTTTGAGGCCCCCCAGGCAGTAGTGTAGGGTATCTGCCTTAGGTGGCAGCAGGTTGAGAAATGGAGAGGAGGGGGCCTGGGAGCTTGGGCCCAGCCCAACGAGCCCAGAGAGTCTCAAGTGGCCTGGGGGTCCCAGGTCGTGTGTCCCCCCCAATGGCAGACCCCAGCCACCTCCCTGACTCCCTCGGAGGACACTGACCCTGGCCCCGGAGTTGGGACAAACTCCGTCCTCAGTTTCTTTATCTGTAAGTGCGATGGGTTGATCTCCCTCCATCCCCAGCCACAATCGAGGATTGGAATGTCCTCTGGCAAAGCCACACGGGCTTTCGAAATCCAAGGAGGGTCTGCGTGTGGACCGCACTGAGCTGGAGACCAGGCTGGCTTTGGAATTCT

乳腺癌BC13-4克隆的序列：663bp(SEQ ID NO.2)

GTCCCGCCACTCGGGTCCTCTGGCTTCTTCCCAAACACCTCCTCTTTCTCTCGGTGATTGGCCAAGAGGCAGTTCCCATAGTAACTGACACCGCGCTCCCACTTCCCAGCCTGGAGGACAGCACCGGCCCTCGTATTAGCAACCTGGAAGAGAGGGCGCCCAGGTGGGCACTCGCAACTTCTCACGTATCTGCGCGTTCTCTTCGCTCCCACTGGCGTGAGCCTGCGCTTTCCGCCTTCCTTCCCTCACAAGCCCCCTTGGCAACCGTCGCCGTTGAGACGGAGGGAGACGCCCCCACGGATTCGCCCCGCCGCGCCTCTCCGCGCGTAGATTGGCCGGAGCGAGGCGAACGGGCCCGGCCTTGGTAGCCGCCGACCGAGCGCTGGCTGTCCTGGAACCTAGGCGGCGGGAGCCCGGGGCGCCTCGCGGCACGGAAGAGCGGCGAGATGCTCAACCGCAAGACCAGCCACTTTTTGGGAATGAGGGTGCAGTCGGAGCTTGAACATCTCTCCGAGCTGCGGCGGGAAGCGGGGAAGGATCGCAGCTCAGTGCATGGGTCGGCCGCGCGGACGCGTGCGAGTGTGCGGACTCAGTGGACGACGGCGGCGGCGGCGAAAGCGGATGAAGACCCCGGAGCCAACTTGTTTCCGGTGAGGGCGGGAC

乳腺癌BC31-2克隆的序列：1104bp(SEQ ID NO.21)

CCCCGAATGAAGTACACAACATCTTCCATGATGCAGCTGTGACAAAGAAAGAAAAAAATTGTTCCTAAACCGTATGAGCTTCTGGAGCTAAGTCCCAGGTTACAGAAACGCAGGGGACAGAGAACATGTCAAACACCACCAAAAAGACACAGTCAACAAAACCCACACCATGGGAAACCCTACAGGACAAACGGCCCCATTTCTTTGATAGATAATTTACTAGGAAAAAATAAAAGATGAAAGAGCAATCAACCAATTGCAATTATGGACTTCTGTTTGGATCTCATTCAAACAAACCGTAAAACCTATGCATATTTATAGCACAAATTAGAAATTAGAACAATTACTGGATATTTGATGATATTAAGAGATTATTTTATAAGTTGGTATTATGGTTTTTTTTTTTTGAGCCCTTATCTTTCAGAGATGCATCCGGAAATATTTACAGATGAAATGAGATGCTGTCTGGGCAAAGTGCAGGGGTGTGTAGAGGAAATAAGACTAGCCATAGGCTGGCAAGTGTCAAAGTGAAGGGATGGGTGCGAGGAGTCCATCAGGCTGTGCTCGCTACCCTCTCGCTGTCTACAGTAGAAATTCCCCATCACCACGGACACCAGCCACCTGGCCCGGCAGTCCACGCTCTCAGCCTCATCCCTCCAACGCTCCCTCCTTCGGGTCCCATCTACCACAACCACCAAACACCCATGCCACTTCAAGCCACCTCCCCCACGCACATGTGGCTCCCTCTGCCTCCTTCCCTTGTCTCTTAGGGGCCAGCTGAGCAGCAGCTTTGAGGCACCTTCTGCTGAGCACCCCCCCAACAGTCAGGCAGCCCCTTTCCTGGCACCCCAGCATGGCTCTCTTTTCCCTGCCCACTGGGAGGAGCTCCTTGGGGACAGGGGCCAAGTCTGACTAATTCTCAGATCTCCAGCACCCAGCACAGGGCCTGGCCCAGCTCCAAAGCTGGCTGGAGTCTTCCTGGGAGGAAAATCCCCCACACTGGTCACAGGGCAGCCTTGACCGGCTGGTGACCTGTACACACTACTTAATACCACATTACCCACTGCGGTGCATGGCAGTGACTTCACTTTCAACGGGGCCACG

实施例2 SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列表达水平与乳腺癌的关系(基因组水平)

一、实验方法

(一)测序分析后，根据测定的序列，用Primer3.0软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)设计特异性引物，并合成引物(表3)，这些引物用于扩增肿瘤和正常人的基因组DNA，GAPDH为内参对照，它们可以用于半定量PCR。

BC10-1L(SEQ ID NO.3)，BC10-1R(SEQ ID NO.4)；

BC31-2L(SEQ ID NO.5)，BC31-2R(SEQ ID NO.6)；

GAPDH5G(SEQ ID NO.15)，GAPDH3G(SEQ ID NO.16)。

同时设计实时荧光定量PCR分析引物(表4)。表4引物用于扩增肿瘤和正常人的基因组DNA，β-actin为内参对照，并标明了所使用的Taqman探针号(Universal ProbeLibrary，Roche)。

BC10-1L87(SEQ ID NO.7)，BC10-1R87(SEQ ID NO.8)；

BC13-4L34(SEQ ID NO.9)，BC13-4R34(SEQ ID NO.10)；

Q-b-actin55LG(SEQ ID NO.17)，Q-b-actin55RG(SEQ ID NO.18)。

(二)根据新合成的引物，建立合适PCR条件，进行PCR半定量和实时荧光定量扩增。

1.取肿瘤组织、癌旁组织和外周血白细胞的样本DNA66例(其中各种正常人白细胞DNA10例、乳腺癌组织30例及其邻近正常组织22例)，稀释成10ng/μl备用，即为荧光定量PCR的gDNA模板；

2.根据新合成的引物进行半定量PCR扩增：

(1)PCR体系(10μl)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR扩增条件

3.琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

4.图像摄取：(BIO-RAD，Universal Hood Ⅱ)。

(三)根据新合成的引物进行实时荧光定量PCR扩增：

1.取0.1ml薄壁PCR板(The AppliedOptical 96-Well Reaction Plate)，各孔加入：

内参对照组：

实验组：

充分混匀后离心、扩增；每个反应重复三次。

2.将加好样的薄壁PCR板放入荧光定量PCR仪(ABI stepone plus,AppliedBiosystems)内进行PCR反应，反应程序为95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环扩增。

二、实验结果

1、SCAR标记BC10-1在各种正常人白细胞DNA(10例)、乳腺癌组织(30例)及其邻近正常组织(22例)的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，结果见图3b。

由图3b可见，乳腺癌组织中的基因组BC10-1表达量显著高于癌旁正常组织，二者具有统计学意义。说明BC10-1的高表达会显著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺组织的BC10-1片段水平可反映正常人乳腺组织的BC10-1水平，因此，可以通过检测待检者的BC10-1的表达水平，将乳腺癌的易感人群筛查出来。

2、SCAR标记BC13-4在各种正常人白细胞DNA(10例)、乳腺癌组织(30例)及其邻近正常组织(22例)的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，结果见图3c。

由图3c可见，乳腺癌组织中的基因组BC10-1片段表达量显著高于正常人白细胞DNA，癌旁组织的基因组BC10-1片段表达量显著高于正常人白细胞DNA，二者具有统计学意义。

说明SCAR标记BC13-4在乳腺癌组织和癌旁组织均有异常DNA扩增，因此，BC13-4片段可以对乳腺组织进行鉴定；并且可以通过检测待检者的BC13-4片段的表达水平，将乳腺癌的易感人群筛查出来。

3、SCAR标记BC31-2在5对乳腺癌组织及其邻近正常组织的基因组DNA的半定量PCR扩增，结果见图3a。

由图3a可见，与同一患者的癌旁正常组织相比，通道3-8中的乳腺癌组织的BC31-2片段表达量均无明显区别，仅在通道1和9的肿瘤组织显示出BC31-2片段表达量升高。

SCAR标记BC31-2片段的表达不能完全体现出乳腺癌组织及其邻近正常组织的差异，无法用来筛查乳腺癌易感人群，不能作为乳腺癌患者诊断的分子标记。

因此，SCAR标记BC10-1和BC13-4可以用于检测肿瘤患者肿瘤组织和癌旁组织的异常DNA扩增，对乳腺癌进行基因组水平的检测，可以作为乳腺癌肿瘤诊断的分子标记。

实施例3 DPEP1和PHKG2表达水平与乳腺癌的关系(mRNA水平)

一、实验方法

(一)细胞和肿瘤组织总RNA提取

细胞总RNA提取

1.使用miRNeasy Mini Kit或者RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司(Cat#217004或Cat No.74104)

2.取生长良好的密度达95％以上的乳腺癌细胞(6孔板)，吸净培养基残液，用预冷的1×PBS飘洗2次；

3.加入700μl的QIAzol Lysis(miRNeasy Mini Kit)，用1ml注射器抽吸5次，静置5min；

4.加入140μl氯仿，用力摇晃15s再室温静置2-3min；

5.4℃离心10000rpm离心15min；

6.小心吸取上清液于另一EP管中，加入1.5倍体积无水乙醇，上下颠倒数次；

7.取700μl样品加入到吸附柱中，10000rpm离心30s,超过700μl的重复一次；

8.加入700μl RWT，10000rpm离心30s；

9.加入500μl RPE，10000rpm离心30s；

10.加入500μl RPE，12000rpm离心2min；

11.换一新的收集管，12000rpm离心1min；

12.用40μl RNease Free水洗脱和收集RNA，测定RNA浓度后，置于-80℃保存备用。

13.RNA质量检测

(1)紫外仪测RNA的OD值：在紫外分光光度计上检测RNA的纯度和浓度OD260/OD280＝1.8～2.0(260、280nm)下的吸光度分别代了蛋白和核酸值,表示优质在微量核酸检测仪上检测RNA的纯度和浓度，OD260/OD280＞2.0(260、280nm下的吸光度分别代了蛋白和核酸值)，表示RNA优质。

(2)琼脂糖凝胶电泳

⑴制备1％的琼脂糖凝胶，备用；

⑵分别取RNA样品(400ng)，分别加入5×Loading Buffer电泳上样缓冲液各1μl，混匀后点样；

⑶电泳条件：120V电压下电泳30min；

⑷用凝胶成像仪观察结果、照相并保存，RNA呈现28S和18S两条明亮条带。

肿瘤组织总RNA提取

1.取乳腺癌组织5mg，剪碎后置于玻璃匀浆器中，匀浆，肿瘤组织总RNA提取同细胞总RNA提取。

2.RNA质量检测同“细胞总RNA提取”的步骤13。

(二)RT(反转录)

1.配置反转录20ul反应体系：将0.2ml微量离心管中置于冰上，各管中加入：

充分混匀后离心；

2.将上一步骤中配置好的微量离心管放入PCR仪器内进行反转录(反应程序：30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min，4℃保存)；

3.反应结束后取出微量离心管，每管中加入80ul灭菌ddH₂O稀释产物，-20℃保存，即为荧光定量PCR的cDNA模板。

(三)DPEP1和PHKG2的mRNA表达的荧光定量PCR分析

内参对照组：

实验组：

充分混匀后离心，扩增；每个反应重复三次

注：荧光定量PCR分析的试剂等见表5：其中，探针来自(Universal ProbeLibrary，Roche)

Q-PHKG2-L2(SEQ ID NO.11)，Q-PHKG2-R2(SEQ ID NO.12)；

Q-DPEP1-13L(SEQ ID NO.13)，Q-DPEP1-13R(SEQ ID NO.14)；

18S48R(SEQ ID NO.19)，18S48L(SEQ ID NO.20)。

二、实验结果

1、在4株乳腺癌细胞T47D，MCF7，BT549，MDA-MB-231中，DPEP1基因的mRNA表达明显比正常乳腺细胞MCF10A高(如图4a)。

说明乳腺癌中DPEP1基因的表达量显著升高。

2、乳腺癌组织(33例)及其邻近正常组织(11例)的实时荧光定量PCR检测，结果见图4b。

可见，乳腺癌组织DPEP1基因的mRNA表达比癌旁正常组织高11.6倍以上，乳腺癌组织中DPEP1基因表达量显著升高，说明DPEP1基因的高表达会显著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺组织的DPEP1基因表达水平可反映正常人乳腺组织的DPEP1基因表达水平，因此，可以通过检测待检者乳腺组织中的DPEP1基因表达水平，将乳腺癌的易感人群筛查出来。

3、在5株乳腺癌细胞T47D，MCF7，BT549，MDA-MB-231，MDA-MB-435中，PHKG2基因的mRNA表达明显比正常乳腺细胞MCF10A高；而高侵袭性乳腺癌细胞BT549，MDA-MB-231，MDA-MB-435的表达又比低侵袭性乳腺癌细胞T47D，MCF7高(图4c)。

说明乳腺癌中PHKG2基因的表达量显著升高，而且PHKG2基因在乳腺癌肿瘤中，特别是肿瘤转移中起重要作用。

4、乳腺癌组织(33例)及其邻近正常组织(11例)的实时荧光定量PCR检测，结果见图4d。

可见，乳腺癌组织PHKG2基因的mRNA表达比癌旁正常组织高3倍以上，乳腺癌组织中PHKG2基因表达量显著升高，说明PHKG2基因的高表达会显著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺组织的PHKG2基因表达水平可反映正常人乳腺组织的PHKG2基因表达水平，因此，可以通过检测待检者乳腺组织中的PHKG2基因表达水平，将乳腺癌的易感人群筛查出来。

综上，与癌旁邻近正常组织相比，乳腺癌癌组织的DPEP1和HPKG2基因表达水平显著升高，说明乳腺癌与DPEP1、HPKG2表达水平呈正相关，DPEP1、HPKG2的高表达会显著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁邻近正常组织的DPEP1、HPKG2水平可反映正常人乳腺癌组织的DPEP1、HPKG2水平，因此，可以通过检测待检者的DPEP1、HPKG2的表达水平，将乳腺癌癌的易感人群筛查出来。

因此，DPEP1和HPKG2基因可以作为乳腺癌诊断的分子标记。

实施例4 本发明乳腺癌筛查试剂盒的组成及待检样本的检测

一、基因组DNA水平的半定量PCR检测试剂盒

1、试剂盒的组成

(1)BC10-1检测时的半定量PCR试剂(每份总体积25μl，50人份的相应用量)

(2)BC13-4检测时的半定量PCR试剂(每份总体积25μl，50人份的相应用量)

2、试剂盒的使用方法

(1)取待检样本，按照酚/氯仿法提取总DNA。

(2)DNA扩增

以步骤(1)得到的DNA为模板，用上述半定量检测试剂进行PCR扩增。

PCR扩增条件：

(3)数据分析，获得扩增片段的表达情况。

二、基因组DNA水平的定量PCR检测试剂盒

1、试剂盒的组成

(1)BC10-1检测时的荧光定量PCR试剂(每份总体积20μl，50人份的相应用量)

(2)BC13-4检测时的荧光定量PCR试剂(每份总体积20μl，50人份的相应用量)

2、试剂盒的使用方法

(1)取待检样本，按照酚/氯仿法提取总DNA。

(2)DNA扩增

以步骤(1)得到的DNA为模板，用上述定量检测试剂进行PCR扩增。在荧光定量PCR仪(ABI stepone plus,Applied Biosystems)内的反应程序为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环扩增。

(3)数据分析，获得扩增片段的表达情况。

三、mRNA水平的定量PCR检测试剂盒

1、试剂盒的组成

(1)DPEP1检测时的荧光定量PCR试剂(每份总体积20μl，50人份的相应用量)

(2)HPKG2检测时的荧光定量PCR试剂(每份总体积20μl，50人份的相应用量)

2、试剂盒的使用方法

(1)取待检样本，按照RNA提取试剂盒说明书的方法提取总RNA。

(2)反转录：

以步骤(1)得到的总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书的方法，得cDNA。

(3)cDNA扩增

以步骤(2)得到的cDNA为模板，用上述荧光定量检测试剂进行荧光定量PCR扩增。在荧光定量PCR仪(ABI stepone plus,Applied Biosystems)内的反应程序为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环扩增。

(4)数据分析，获得DPEP1、HPKG2基因表达情况。

对乳腺组织异常者，可分别取异常部位、正常部位组织，比较基因表达水平，进而评价其患乳腺癌的可能性，作为临床乳腺癌的辅助诊断手段。

综上，本发明试剂盒通过检测相应的基因表达水平，可以判断乳腺异常者的异常部位与正常部位的基因表达水平差异，进而筛查待检者患乳腺癌的风险，可用于临床乳腺癌的辅助诊断，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成竞梁

<120> 一种乳腺癌筛查试剂盒

<130> GY185-17P1014

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1027

<212> DNA

<213> BC10-1序列

<400> 1

cccgccggtt ccatcctctg agagcctcac ccttcactgc ccgtgatggc acgagctgag 60

gccccccacc cggttccatc ctctgagact ctcgcccttc actgcctgtg atggtgctcc 120

atgctatgct gtagatgcct actctctgag gttctccctc gctgacggtg gatcacaggc 180

agtcagagag gagaggggct ttccgccctc attacagccc tgggcctcaa cctggctgca 240

cgctccccaa aaccacaacc cctggctccc ggctccccgc tccccgagac tcaccatgcg 300

cgggacaggg tcccgagtac ctcggctcag ccacccaagt cccagggaga cagacccgcc 360

tcctgcctcc caggtcacaa ggcttggggg ttgtttctgg tgttcaagtt cagtcctgcc 420

acccacggag ctctccagct acagaacagc cacctccttg agggctcgca cagtacccca 480

gggagagccg ggctaaagcc tcacacatgt cagctggttc ttgtttccga agatacgcat 540

gccctcagtg aggccttgag catccggcca gcccaggggc ttctgggact ctcggtccca 600

ggccaggcag gagagcttgt gctgggtgat caccctttga ggccccccag gcagtagtgt 660

agggtatctg ccttaggtgg cagcaggttg agaaatggag aggagggggc ctgggagctt 720

gggcccagcc caacgagccc agagagtctc aagtggcctg ggggtcccag gtcgtgtgtc 780

ccccccaatg gcagacccca gccacctccc tgactccctc ggaggacact gaccctggcc 840

ccggagttgg gacaaactcc gtcctcagtt tctttatctg taagtgcgat gggttgatct 900

ccctccatcc ccagccacaa tcgaggattg gaatgtcctc tggcaaagcc acacgggctt 960

tcgaaatcca aggagggtct gcgtgtggac cgcactgagc tggagaccag gctggctttg 1020

gaattct 1027

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> BC13-4序列

<400> 2

gtcccgccac tcgggtcctc tggcttcttc ccaaacacct cctctttctc tcggtgattg 60

gccaagaggc agttcccata gtaactgaca ccgcgctccc acttcccagc ctggaggaca 120

gcaccggccc tcgtattagc aacctggaag agagggcgcc caggtgggca ctcgcaactt 180

ctcacgtatc tgcgcgttct cttcgctccc actggcgtga gcctgcgctt tccgccttcc 240

ttccctcaca agcccccttg gcaaccgtcg ccgttgagac ggagggagac gcccccacgg 300

attcgccccg ccgcgcctct ccgcgcgtag attggccgga gcgaggcgaa cgggcccggc 360

cttggtagcc gccgaccgag cgctggctgt cctggaacct aggcggcggg agcccggggc 420

gcctcgcggc acggaagagc ggcgagatgc tcaaccgcaa gaccagccac tttttgggaa 480

tgagggtgca gtcggagctt gaacatctct ccgagctgcg gcgggaagcg gggaaggatc 540

gcagctcagt gcatgggtcg gccgcgcgga cgcgtgcgag tgtgcggact cagtggacga 600

cggcggcggc ggcgaaagcg gatgaagacc ccggagccaa cttgtttccg gtgagggcgg 660

gac 663

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1L

<400> 3

gatcacaggc agtcagagag g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1R

<400> 4

caggccactt gagactctct g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> BC31-2L

<400> 5

acaaacggcc ccatttcttt g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> BC31-2R

<400> 6

ttggtggttg tggtagatgg g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1L87

<400> 7

cccaggcagt agtgtagggt a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> BC10-1R87

<400> 8

ccctcctctc catttctcaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> BC13-4L34

<400> 9

tctggcttct tcccaaacac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> BC13-4R34

<400> 10

cgcggtgtca gttactatgg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Q-PHKG2-L2

<400> 11

caatatgcag atccgacttt ca 22

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Q-PHKG2-R2

<400> 12

ggggtcccac acaactctc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Q-DPEP1-13L

<400> 13

tgcactgcag acttctttcg 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Q-DPEP1-13R

<400> 14

gccaggggag gtcattgt 18

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH5G

<400> 15

acccagaaga ctgtggatgg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH3G

<400> 16

tgacaaagtg gtcgttgagg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Q-b-actin55LG

<400> 17

aagtcccttg ccatcctaaa a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Q-b-actin55RG

<400> 18

atgctatcac ctcccctgtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S48R

<400> 19

gcaattattc cccatgaacg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S48L

<400> 20

gggacttaat caacgcaagc 20

<210> 21

<211> 1104

<212> DNA

<213> BC31-2序列

<400> 21

ccccgaatga agtacacaac atcttccatg atgcagctgt gacaaagaaa gaaaaaaatt 60

gttcctaaac cgtatgagct tctggagcta agtcccaggt tacagaaacg caggggacag 120

agaacatgtc aaacaccacc aaaaagacac agtcaacaaa acccacacca tgggaaaccc 180

tacaggacaa acggccccat ttctttgata gataatttac taggaaaaaa taaaagatga 240

aagagcaatc aaccaattgc aattatggac ttctgtttgg atctcattca aacaaaccgt 300

aaaacctatg catatttata gcacaaatta gaaattagaa caattactgg atatttgatg 360

atattaagag attattttat aagttggtat tatggttttt tttttttgag cccttatctt 420

tcagagatgc atccggaaat atttacagat gaaatgagat gctgtctggg caaagtgcag 480

gggtgtgtag aggaaataag actagccata ggctggcaag tgtcaaagtg aagggatggg 540

tgcgaggagt ccatcaggct gtgctcgcta ccctctcgct gtctacagta gaaattcccc 600

atcaccacgg acaccagcca cctggcccgg cagtccacgc tctcagcctc atccctccaa 660

cgctccctcc ttcgggtccc atctaccaca accaccaaac acccatgcca cttcaagcca 720

cctcccccac gcacatgtgg ctccctctgc ctccttccct tgtctcttag gggccagctg 780

agcagcagct ttgaggcacc ttctgctgag caccccccca acagtcaggc agcccctttc 840

ctggcacccc agcatggctc tcttttccct gcccactggg aggagctcct tggggacagg 900

ggccaagtct gactaattct cagatctcca gcacccagca cagggcctgg cccagctcca 960

aagctggctg gagtcttcct gggaggaaaa tcccccacac tggtcacagg gcagccttga 1020

ccggctggtg acctgtacac actacttaat accacattac ccactgcggt gcatggcagt 1080

gacttcactt tcaacggggc cacg 1104

Claims

1.检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的引物在制备乳腺癌筛查用试剂中的用途；

所述引物为半定量PCR引物，序列如SEQ ID NO.3-4所示；

或，所述引物为定量PCR引物，序列如SEQ ID NO.7-8所示。

2.一种乳腺癌筛查试剂盒，其特征在于：它包括用于检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物；

所述引物为半定量PCR引物，序列如SEQ ID NO.3-4所示；

或，所述引物为定量PCR引物，序列如SEQ ID NO.7-8所示。